CN108341856A - 一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物来源的抗菌蛋白，具体涉及一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法；它是由鸡腿菇菌株产生的，具有抗氧化活性，能清除羟基自由基；所述的鸡腿菇抗菌蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)取鸡腿菇菌株进行发酵，制备鸡腿菇菌丝发酵液；(2)将步骤(1)所得的发酵液分离纯化即得到鸡腿菇抗菌蛋白；本发明抗菌蛋白抑制枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达21.14mm，鸡腿菇抗菌蛋白还具有抗氧化能力，对羟基自由基(·OH)有较强的清除作用，其抗氧化能力随着抗菌蛋白质量浓度的增加而增强，本发明提供的鸡腿菇抗菌蛋白的制备方法简单，成本低；抑菌性能良好，具有工业化应用前景，可被应用于替代抗生素及食品防腐保鲜等领域。

Description

一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物来源的抗菌蛋白，具体涉及一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法。
背景技术
鸡腿菇，别名毛头鬼伞，美味可口，富含多种营养物质，是十分理想的有益于健康的食物。鸡腿菇包含了大量人体必须的营养物质。通过液体发酵生产鸡腿菇液体菌种和菌丝体，不仅可以避免常规固体培养，产量低，易污染等缺点，而且发酵后得到的发酵液和菌丝在蛋白质，脂肪，纤维等营养成分上一般优于或与子实体的营养成分相当。此外，具有多种生物学功能，如抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂作用、降血脂、提高免疫活性、抗肿瘤、抗病毒等作用。
采用不同的方法可以从鸡腿菇内提取出多糖，然后将该多糖以一定量注射到小鼠体内，探究其是否能够提高小鼠的免疫能力。经过实验证实，该多糖作用于小鼠后，明显增强了其免疫能力，说明鸡腿菇多糖的确具有提高免疫活性的作用。鸡腿菇具有抗菌功效，还可产生某种对真菌具有抑制作用的抗菌物质，其有可能代替部分抗生素成为新型的抗菌物质。刘凤珠等人报道研究了鸡腿菇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑制作用，同时以鸡腿菇为主要组分制成涂被液进行樱桃保鲜实验测定了樱桃失重率、烂果率、Vc含量等指标，表明处理组的樱桃好果率比对照提高38％。
抗菌蛋白是一类具有抗菌作用的蛋白类物质，普遍存在于自然界中，具有相对分子量小、等电点高、热稳定性好、杀菌范围广、作用机制独特等特性及特点，在生理条件下多数带正电荷，并且具有广谱抗菌的优点，随着抗生素的大量使用，耐药性的问题越来越严重，寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一问题最有效的途径。抗菌蛋白具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生耐药性等优点，是理想的抗生素替代品。同时抗菌蛋白还可用于食品防腐保鲜，在食品防腐中具有较好的防腐效果，使食用的保存周期延长。
发明内容
本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是提供一种鸡腿菇抗菌蛋白及其制备方法，所述抗菌蛋白可被应用于替代抗生素及食品防腐保鲜等领域。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种鸡腿菇抗菌蛋白，它是由鸡腿菇菌株产生的，抗菌蛋白的蛋白表观分子量为23.0kD。
所述的抗菌蛋白具有抗氧化活性，能清除羟基自由基。
一种制备所述的鸡腿菇抗菌蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)取鸡腿菇菌株进行发酵，制备鸡腿菇菌丝发酵液；
(2)将步骤(1)所得的发酵液分离纯化即得到鸡腿菇抗菌蛋白。
步骤(1)中鸡腿菇发酵液的制备方法为用接种环挑取一环鸡腿菇母种菌丝体接入装有150mLPDA种子培养基的三角瓶中于24℃，100r/min，摇床培养5d，即可得到种子培养液，用无菌吸管吸取一定量的种子培养液加入到装有30mL PDA加富培养基的三角瓶里，然后将该三角瓶放入恒温摇床内发酵培养，即可得到鸡腿菇菌丝发酵液。
步骤(2)中发酵液分离纯化方法包括吸取制备好的鸡腿菇菌丝发酵液转移至EP管中离心，在4℃、3 000r/min条件下离心15min去除沉淀，经孔径0.22μm细菌过滤器过滤，得无菌体培养滤液；向滤液中缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，用磁力搅拌器搅拌，4℃静置2h，8 000r/min、离心30min，收集沉淀蛋白，用原发酵液1/10体积的0.02mol/L pH 6.8的Tris缓冲液溶解，装入透析袋后采用浓度相同的Tris缓冲液透析过夜，得粗制的鸡腿菇抗菌蛋白，将粗制的鸡腿菇抗菌蛋白过DEAE Sepharose FastFlow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化得鸡腿菇抗菌蛋白。
一种鸡腿菇抗菌蛋白在食品防腐保鲜方面的应用。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果。
本发明抗菌蛋白抑制枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达21.14mm。鸡腿菇抗菌蛋白还具有抗氧化能力，对DPPH、ABTS自由基有一定的清除作用，对羟基自由基(·OH)有较强的清除作用，其抗氧化能力随着抗菌蛋白质量浓度的增加而增强。本发明提供的鸡腿菇抗菌蛋白的制备方法简单，成本低。抑菌性能良好，具有工业化应用前景，可被应用于替代抗生素及食品防腐保鲜等领域。
附图说明
图1为发酵时间对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力影响的折线图。
图2为发酵温度对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力影响的折线图。
图3为pH对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力影响的折线图。
图4为接种量对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力影响的折线图
图5摇床转速对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力影响的折线图
图6为抗菌蛋白和无菌水对比的抑菌活性示意图。
图7为不同浓度抗菌蛋白对DPPH自由基的清除作用折线图。
图8为不同浓度抗菌蛋白对ABTS自由基的清除作用折线图。
图9为不同浓度抗菌蛋白对羟自由基的清除作用折线图。
图10为抗菌蛋白SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明中用于制备鸡腿菇抗菌蛋白的鸡腿菇菌种可从市面上购买，任何鸡腿菇菌种均可用于制备鸡腿菇抗菌蛋白。
本实施例1中的鸡腿菇(Coprinus comatus)由山西中医药大学制药与食品工程实验室供。
一种制备所述的鸡腿菇抗菌蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取一环鸡腿菇母种菌丝体接入装有150mLPDA种子培养基的三角瓶中于24℃，100r/min，摇床培养5d，即可得到种子培养液，用无菌吸管吸取一定量的种子培养液加入到装有30mL PDA加富培养基的三角瓶里，然后将该三角瓶放入恒温摇床内发酵培养，即可得到鸡腿菇菌丝发酵液。
(2)用移液枪吸取制备好的鸡腿菇菌丝发酵液转移至EP管中离心，在4℃、3 000r/min条件下离心15min去除沉淀，经孔径0.22μm细菌过滤器过滤，得无菌体培养滤液；向滤液中缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，用磁力搅拌器搅拌，4℃静置2h，8 000r/min、离心30min，收集沉淀蛋白，用原发酵液1/10体积的0.02mol/L pH 6.8的Tris缓冲液溶解，装入透析袋后采用浓度相同的Tris缓冲液透析过夜，得粗制的鸡腿菇抗菌蛋白，将粗制的鸡腿菇抗菌蛋白过DEAE Sepharose FastFlow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化得鸡腿菇抗菌蛋白。
将上述粗制的鸡腿菇抗菌蛋白和分离纯化得鸡腿菇抗菌蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测鸡腿菇抗菌蛋白分子量。
如图10所示，M为标准蛋白，鸡腿菇菌株培养上清液经硫酸铵沉淀获得的粗蛋白含有多种蛋白组分(条带1)，即抗菌粗制蛋白；粗制蛋白进一步经DEAE与Sephadex G-200凝胶柱层析纯化得到(条带2)，获得单一蛋白组分，蛋白表观分子量约为23.0kD。
实施例2
鸡腿菇抗菌蛋白的抑菌活性测定方法为：
以枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯法测定实施例1-2中的所制备的鸡腿菇抗菌蛋白的抑菌活性。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由山西中医药大学制药与食品工程实验室供。
指示菌菌悬液的制备：
用接种针挑取一环枯草芽孢杆菌接入装有5mL灭菌生理盐水的试管中稀释102倍后制成浓度为1.0×10 6个/mL的孢子悬液，备用。
鸡腿菇抗菌蛋白的抗菌能力测定牛津杯法：在无菌操作条件下，向已灭过菌的干燥的培养皿中倾倒15－20mL指示菌固体培养基(NA)，待其凝固后，用移液枪向上述培养皿中加入0.2mL枯草芽孢杆菌指示菌菌悬液，用无菌涂布器涂匀。在培养皿中放置牛津杯，每个牛津杯中加0.2mL的供试菌鸡腿菇抗菌蛋白。将培养皿平稳置于4℃冰箱，扩散24h后再置于25℃恒温培养箱中培养3－5d后取出培养皿测量抑菌圈直径(mm)并记录。每组试验重复3次取平均值，抑菌圈直径的大小来表征抑菌活性，以无菌水为对照。
单因素影响试验：
选择不同发酵时间、温度、pH、接种量、摇床转速进行单因素试验，制得的抗菌蛋白进行抗菌能力的测定，记录抑菌圈直径作为指标。不同因子梯度条件见表1。
表1单因素水平设计表
响应曲面法试验设计基于单因素试验结果，选用中心组合试验Box-Behnken设计方案，选取发酵时间(d)、接种量(％)以及转速(r/min)三个变量，以A、B、C来表示，并以+1、0、-1分别代表其变量的水平，按方程x＝(X－X 0)/△X对自变量进行编码，其中，x表示变量的编码值，X表示变量的真实值，X 0表示试验中心点变量的真实值，△X表示变量的步长变化，抗菌蛋白的抑菌圈直径Y表示响应值，见表2。
表2中心组合试验Box-Behnken设计因素和水平编码值
1、发酵时间对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影响由图1所示，在培养初期发酵产物较少，随培养时间的延长，鸡腿菇抗菌蛋白的抑菌圈直径先增后降，发酵时间对其影响极显著(P<0.01)，在5d时达到最大(20.54±1.26)mm。培养时间继续延长，该菌株由稳定期进入降速期，菌数量逐渐减少，分泌抗菌蛋白能力降低导致抑菌活性逐渐减弱。
2、发酵温度对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影响由图2所示，随温度升高，抗菌能力由弱到强，接着又变弱，发酵温度对其影响显著(P<0.05)，当温度达到24℃时抗菌能力最强，抑菌圈直径(18.72±0.9)mm。这是由于鸡腿菇菌丝的生长增殖与产物积累随温度的升高而减少，因此温度过高对鸡腿菇菌丝的生长不利。
3、pH对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影响由图3所示，抗菌能力随pH值增加呈现先增后降的趋势，pH值对其影响显著(P<0.05)。在pH 3－5之间，抗菌蛋白抗菌能力相对较弱；在pH6－7之间，抑菌圈直径明显增大，pH7时抗菌能力最强，抑菌圈直径(17.43±051)mm；此后，抗菌能力随着pH的继续增加开始减弱。结果表明，鸡腿菇菌丝抗菌蛋白对过酸和过碱的条件都比较敏感，抗菌能力受到抑制。
4、接种量对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影响由图4所示，鸡腿菇抗菌蛋白的抗菌能力随接种量提高呈现不断增强并缓慢减弱的趋势，接种量对其影响极显著(P<0.01)，接种量为5％时抗菌能力最强，抑菌圈直径达(20.14±1.06)mm。随着接种量的继续增大，抗菌能力开始出现减弱的趋势，这是由于在培养基内，菌数量的增大导致分泌的抗菌蛋白随之增多。但当接种量达到一定值后再继续增加其接种量，会导致菌群过于密集产生空间与营养竞争，从而影响生长发育。
5、摇床转速对鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影响由图5所示，鸡腿菇抗菌蛋白抗菌能力随着摇床转速的加快呈现出先升后降的趋势，摇床转速对其影响极显著(P<0.01)，在转速为100r/min抗菌能力最强，抑菌圈直径为(20.74±0.74)mm。这是由于摇床发酵培养可增加通气量，所以随着摇床转速的增大，菌丝生长愈加旺盛。但当摇床转速达到一定值后再继续增大摇床转速则会导致一部分菌体溶解，影响菌丝数量，导致抗菌蛋白产量随之减少，影响了其抗菌能力。
响应面试验设计与结果如表3所示，17个试验点由12个析因点和5个零点组成，析因点是自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点，零点表示区域的中心点，其中重复零点试验5次，用来估算试验中的误差。
抗菌蛋白的抑菌试验在单因素试验基础上，采用响应面设计得到提取鸡腿菇菌丝发酵液抗菌蛋白的最佳条件为：pH 7、接种量5％、温度24℃、时间5d、转速为100r/min。在上述条件下培养鸡腿菇菌丝发酵液，经离心过滤，盐析，透析后得到鸡腿菇抗菌蛋白，设置三个重复。培养后，抑菌圈直径均值为21.14mm，与预测值21.54mm拟合度良好，与无菌水对照见图6。
食用菌液体发酵培养往往受温度、Ph、摇床振荡频率及接种量等因素影响，因此，液态发酵条件优化无疑一个关键步骤。
抗菌蛋白的抗氧化活性的测定：
将鸡腿菇抗菌蛋白冷冻浓缩干燥，进行不同质量浓度梯度的稀释，采用DPPH法、ABTS法、fenton法清除·OH，测定抗菌蛋白的抗氧化活性，以VC做阳性对照。
数据分析，本试验所有的试验数据均使用Origin和Design-Expert(version8.0.6)统计软件进行数据处理，运用最小差异显著法(LSD)进行差异显著性检验。
DPPH自由基清除率的测定如图7所示，随着抗菌蛋白质量浓度的增大，对DPPH自由基的清除能力逐渐增大，当抗菌蛋白质量浓度为0.1－0.4mg/mL范围内，对DPPH自由基的清除率显著增大。当质量浓度大于0.4mg/mL时，对DPPH自由基的清除率随质量浓度增加而减弱，但与同质量浓度的VC标准品相比，抗菌蛋白清除DPPH自由基的能力明显较弱。通过方差分析表明，各质量浓度间对DPPH自由基的清除能力的差异显著，在一定质量浓度范围内抗菌蛋白与清除能力表现出剂量(质量浓度)-效应关系。
ABTS自由基清除率如图8所示，抗菌蛋白对ABTS自由基的清除能力随质量浓度的增大呈现出先增后减趋势。当质量浓度为0.4mg/mL时，清除率达到最大值42.63％，统计分析表明，此时的清除率显著高于其他质量浓度；质量浓度继续增大，ABTS自由基清除率则呈下降趋势。与同质量浓度的VC标准品相比，抗菌蛋白清除ABTS自由基能力相对较弱。
·OH清除率如图9所示，在浓度0.1－0.6mg/mL范围内服从线性分布y＝3.6786+64.929x,(R2＝0.9872)，质量浓度0.1－0.6mg/mL的抗菌蛋白对羟自由基清除率随着其质量浓度的增加而增加，说明抗菌蛋白对羟自由基清除力的大小与其质量浓度呈现正相关。与同质量浓度的VC标准品相比，抗菌蛋白清除羟自由基能力相对较弱，但是呈现出一定的线性关系。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (6)

1.一种鸡腿菇抗菌蛋白，其特征在于：它是由鸡腿菇菌株产生的，抗菌蛋白的蛋白表观分子量为23.0kD。
2.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇抗菌蛋白，其特征在于：所述的抗菌蛋白具有抗氧化活性，能清除羟基自由基。
3.一种制备如权利要求1所述的鸡腿菇抗菌蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取鸡腿菇菌株进行发酵，制备鸡腿菇菌丝发酵液；
(2)将步骤(1)所得的发酵液分离纯化即得到鸡腿菇抗菌蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种制备鸡腿菇抗菌蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中鸡腿菇发酵液的制备方法为用接种环挑取一环鸡腿菇母种菌丝体接入装有150mLPDA种子培养基的三角瓶中于24℃，100r/min，摇床培养5d，即可得到种子培养液，用无菌吸管吸取一定量的种子培养液加入到装有30mL PDA加富培养基的三角瓶里，然后将该三角瓶放入恒温摇床内发酵培养，即可得到鸡腿菇菌丝发酵液。
5.根据权利要求3所述的一种制备鸡腿菇抗菌蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中发酵液分离纯化方法包括吸取制备好的鸡腿菇菌丝发酵液转移至EP管中离心，在4℃、3000r/min条件下离心15min去除沉淀，经孔径0.22μm细菌过滤器过滤，得无菌体培养滤液；向滤液中缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，用磁力搅拌器搅拌，4℃静置2h，8 000r/min、离心30min，收集沉淀蛋白，用原发酵液1/10体积的0.02mol/L pH 6.8的Tris缓冲液溶解，装入透析袋后采用浓度相同的Tris缓冲液透析过夜，得粗制的鸡腿菇抗菌蛋白，将粗制的鸡腿菇抗菌蛋白过DEAE Sepharose FastFlow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化得鸡腿菇抗菌蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种鸡腿菇抗菌蛋白在食品防腐保鲜方面的应用。
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