CN103549428A - 一种提高酵素中活性sod酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高酵素中活性SOD酶的制备方法。包括：分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液；制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液；虫草发酵菌液和云芝发酵菌液依次连续在食用菌酵素中发酵；机械破碎挤压，收集发酵液体步骤。本发明结合酵素生产实际，在发酵工艺中增加虫草菌液和云芝菌液两步发酵，在经过机械强力破碎细胞，更有益于SOD酶从细胞内向外流出，本发明工艺制备方法提高了通过发酵制备的活性SOD酶含量。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其属于一种通过发酵方法提高酵素中活性SOD酶含量的制备方法。
背景技术
超氧化歧化酶Orgotein（Superoxide Dismutase,SOD），别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果，SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。
超氧化歧化酶是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。
SOD在生物体内的高低意味着衰老的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。SOD可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！
近年来，经过各国科学家们的不懈努力研究、实验、一致证明，外源SOD一旦进入人体内血液后，进入微循环，就能有效地保护机体细胞里的脂质、蛋白质、DNA、细胞膜等生命物质，使它们免受人体内多余的超氧阴离子自由基氧离子和羟自由基的破坏，增强机体细胞和各种重要器官的免疫功能，对治疗自身免疫性疾病，病毒性疾病，心血管疾病，如各种炎症、高血压、血栓病、糖尿病、风湿关节炎、红斑狼疮和癌症等，有特殊功效，对辐射有防护作用。所以，SOD被称为是21世纪最有开发前途的药用酶。
目前，SOD的生产主要是从动物血液或肝脏中提取，由于资源有限而且容易造成污染。鉴于动物血液来源困难，许多研究者开始利用微生物的大规模培养优势以制备，因此，不少学者也积极探索用微生物发酵生产SOD。
现有制取SOD技术有多种，包括从动物血液中、植物及果实中制取SOD，用微生物发酵方法制取SOD，以及用基因重组的方法制备Rh-SOD。植物中更多存在的是Cu-Zn-SOD，Mn-SOD较少。利用微生物发酵的方法制备出的SOD含量低，因此，在微生物发酵工程安全的制备方法中，需要进一步研究如何通过自然发酵方式提高SOD含量，获得SOD含量更高的有益物质。
发明内容
本发明根据现有技术的不足公开了一种提高酵素中活性SOD酶的制备方法。本发明要解决的问题是提供一种通过微生物发酵工程安全制备更高含量活性SOD的方法，本发明还提供了一种制备活性SOD的微生物发酵酵素复合菌剂。
本发明通过以下技术方案实现：
提高酵素中活性SOD酶制备方法，包括以下步骤：
1）分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液；
2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液；
3）虫草发酵菌液和云芝发酵菌液依次连续在食用菌酵素中发酵；
4）机械破碎挤压，收集发酵液体。
进一步所述步骤包括：
1）分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液：
培养基按以下重量比例制备：葡萄糖10份，蛋白胨5份，MgSO4.7H2O1份，KH2PO42份，柠檬酸铵1份，水1000份；在121℃下灭菌30分钟，冷却；
制备虫草发酵菌液，取虫草原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在18℃黑暗的环境下培养7-10天，得到虫草菌液；
制备云芝发酵菌液，取云芝原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在温度25-28℃的环境下培养7-10天，制备得到云芝菌液；
2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液；
3）将步骤2）制得的水果蔬菜食用菌酵素发酵液在发酵后30-35天后，加入步骤1）制备的虫草菌液，加入量是为酵素发酵液重量的2-5%，然后在自然室温下继续发酵60-70天；然后继续加入步骤1）制备的云芝菌液，加入量是原酵素发酵液重量的2-5%，然后在温度25-28℃下继续发酵60-70天；
4）将步骤3）得到的发酵液和发酵渣经过机械破碎挤压，收集液体得到SOD酶发酵液。
上述步骤2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液可以采用水果，蔬菜及食用菌为原料通过自然发酵得到。
上述步骤2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液还可以采用水果，蔬菜及食用菌为发酵原料，加入相对于发酵原料10-15%重量份的酵素复合菌剂，密封放于自然室温下保存发酵二个月以上得到；所述酵素复合菌剂由以下结构数量比例的成分组成，酵母菌︰乳酸菌︰醋酸菌︰双歧杆菌︰嗜热链球菌=18～25︰35～45︰15～22︰18～25︰8～10。采用上述提供的酵素复合菌剂制备的发酵液制备活性SOD酶，可以进一步提供活性SOD酶的含量。
本发明采用虫草菌液和云芝菌液两步发酵。虫草菌：虫草是北冬虫草的简称，也叫蛹虫草或蛹草，俗名不老草，是虫，菌结合的药用真菌，现代珍稀中草药，北冬虫夏草属于真菌门，子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属。它主要生长在我国的北方增加地区。主要成分是虫草素、虫草多糖、虫草酸、SOD酶、多肽(蛋白质)，特别是能产生高含量的SOD酶活性物质。云芝菌：云芝以其生长周期相对较短，菌丝体生物量较高，发酵液中SOD总活力相对较高，且在发酵过程中可以产生浓郁果香味的特点。
本发明有益性，实验检测证明：本发明结合酵素生产实际，在发酵工艺中增加虫草菌液和云芝菌液两步发酵，在经过机械强力破碎细胞，更有益于SOD酶从细胞内向外流出，本发明工艺制备方法提高了通过发酵制备的活性SOD酶含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。
提高酵素中活性SOD酶制备：
1）分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液：
培养基按以下重量比例制备：葡萄糖10份，蛋白胨5份，MgSO4.7H2O1份，KH2PO42份，柠檬酸铵1份，水1000份；在121℃下灭菌30分钟，冷却；
制备虫草发酵菌液，取虫草原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在18℃黑暗的环境下培养7-10天，得到虫草菌液；
制备云芝发酵菌液，取云芝原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在温度25-28℃的环境下培养7-10天，制备得到云芝菌液；
2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液：
本例采用水果，蔬菜及食用菌为发酵原料，加入相对于发酵原料10-15%重量份的酵素复合菌剂，密封放于自然室温下保存发酵二个月以上得到；所述酵素复合菌剂由以下结构数量比例的成分组成，酵母菌︰乳酸菌︰醋酸菌︰双歧杆菌︰嗜热链球菌=18～25︰35～45︰15～22︰18～25︰8～10。采用上述提供的酵素复合菌剂制备的发酵液制备活性SOD酶，可以进一步提供活性SOD酶的含量。
3）将步骤2）制得的水果蔬菜食用菌酵素发酵液在发酵后30-35天后，加入步骤1）制备的虫草菌液，加入量是为酵素发酵液重量的2-5%，然后在自然室温下继续发酵60-70天；然后继续加入步骤1）制备的云芝菌液，加入量是原酵素发酵液重量的2-5%，然后在温度25-28℃下继续发酵60-70天；
4）将步骤3）得到的发酵液和发酵渣经过机械破碎挤压，收集液体得到SOD酶发酵液。
本发明方法制备活性SOD酶对比实验
实验生产方法：在酵素制备工艺中，总共四批酵素生产原液，其中有一批为对照组，定期进过时间段进行SOD酶的检测。
四批酵素原液的原料是用水果、蔬菜食用菌等为原料混合后，平均分成四份制成。在第一批、第二批、第三批中按本发明方法操作进行发酵处理，第四批为空白对照组，自然发酵处理，然后定期同时测定每批次的SOD酶的活性含量。
检测方法：采用NBT（四唑氮蓝）光化还原法测定SOD的活力。
检测结果如下：
| 酵素发酵液 | 发酵时间 |
| 30天 | 60天 | 90天 | 120天 | 发酵终点 | |
| 第一批含量（U/mL） | 5.07 | 14.21 | 19.42 | 22.24 | 28.54 |
| 第二批含量（U/mL） | 4.48 | 14.53 | 18.93 | 22.63 | 27.72 |
| 第三批含量（U/mL） | 5.21 | 15.41 | 19.74 | 24.52 | 31.43 |
| 第四批对照（U/mL） | 5.42 | 8.52 | 9.82 | 9.65 | 11.57 |
从以上结果可以得出，采用本发明方法制备的酵素液中SOD的含量比对照组的酵素中SOD的含量提高1-3倍，效果明显，具有一定的实用性。
本发明采用的酵素复合菌剂可以通过以下方法的制备
1、制备培养基及菌液：
制备酵母培养基：按如下重量比例配制：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，水1000毫升。向酵母培养基中加入大小在2cm×2cm大小的脱脂棉，作为固定吸纳菌体，然后121℃灭菌30分钟后冷却。无菌下接种酿酒酵母或卡氏酵母的一种或两种，在室温下培养3-5天。
制备培养乳酸菌的培养基，按如下重量比例制备：牛肉膏1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、柠檬酸铵0.2%、硫酸镁0.02克、水1000毫升。然后于121℃灭菌30分钟后冷却。无菌下接种发酵乳杆菌或嗜酸乳杆菌或保加利亚乳杆菌的一种或多种纯菌体，在温度28-30℃下培养2-3天，得到A液备用。
制备醋酸菌培养基，按如下重量比例制备：葡萄糖1%，酵母膏1%，水1000毫升，然后于121℃灭菌30分钟后冷却。然后接入醋酸菌，在温度28-30℃下培养48-60小时，得到B液备用。
制备嗜热链球菌培养基，按如下重量比例制备：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.2%，水1000毫升。然后于121℃灭菌30分钟后冷却。无菌下接种嗜热链球菌，然后在37℃下培养24小时，得到C液备用。
2、在培养好的酵母培养基中加入原体积10-15%已灭菌冷却后的乳酸菌营养液，同时接入原体积20%-30%培养好的乳酸菌液A液，然后在28-30℃的温度下一起共发酵培养2-3天，使脱脂棉球变大。
3、培养3天后，在原液中加入原液体积10-15%已灭菌冷却后的醋酸菌营养液：同时接入原液体积20%-30%培养好的醋酸菌菌液B液，然后在28-30℃的温度下一起螯合培养48-60小时，使脱脂棉周围的菌系变大。
4、螯合48-60小时后，在原液中加入原液体积10-15%已灭菌冷却后的嗜热链球菌营养液：同时接入原液体积20%-30%培养好的嗜热链球菌菌液C液，然后在28-30℃的温度下螯合培养24-48小时，使脱脂棉周围的菌系变得更大。
5、在原发酵的脱脂棉中接入2—5%重量份的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）或动物双歧杆菌（Bifidobacteriumanimalis）的一种或两种菌体，再次培养48-60小时。
6、将所得的脱脂棉菌球体取出，通过分离、流化床快速干燥，得到有活性的酵素复合干菌体。
7、将冷冻干燥好的菌体保存在4℃的环境中，得到酵素复合菌体物。
Claims (4)
1.一种提高酵素中活性SOD酶制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液；2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液；3）虫草发酵菌液和云芝发酵菌液依次连续在食用菌酵素中发酵；4）机械破碎挤压，收集发酵液体。
2.根据权利要求1所述的提高酵素中活性SOD酶制备方法，其特征在于所述步骤是：
1）分别制备虫草发酵菌液和云芝发酵菌液：
培养基按以下重量比例制备：葡萄糖10份，蛋白胨5份，MgSO4.7H2O1份，KH2PO42份，柠檬酸铵1份，水1000份；在121℃下灭菌30分钟，冷却；
制备虫草发酵菌液，取虫草原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在18℃黑暗的环境下培养7-10天，得到虫草菌液；
制备云芝发酵菌液，取云芝原种，在无菌环境下按重量比5%的接种量接种到制备的液体培养基中，然后放于转速180r/min的摇床上，在温度25-28℃的环境下培养7-10天，制备得到云芝菌液；
2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液；
3）将步骤2）制得的水果蔬菜食用菌酵素发酵液在发酵后30-35天后，加入步骤1）制备的虫草菌液，加入量是为酵素发酵液重量的2-5%，然后在自然室温下继续发酵60-70天；然后继续加入步骤1）制备的云芝菌液，加入量是原酵素发酵液重量的2-5%，然后在温度25-28℃下继续发酵60-70天；
4）将步骤3）得到的发酵液和发酵渣经过机械破碎挤压，收集液体得到SOD酶发酵液。
3.根据权利要求2所述的提高酵素中活性SOD酶制备方法，其特征在于所述2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液是采用水果，蔬菜及食用菌为原料通过自然发酵得到。
4.根据权利要求2所述的提高酵素中活性SOD酶制备方法，其特征在于所述2）制备水果蔬菜食用菌酵素发酵液是采用水果，蔬菜及食用菌为发酵原料，加入相对于发酵原料10-15%重量份的酵素复合菌剂，密封放于自然室温下保存发酵二个月以上得到；所述酵素复合菌剂由以下结构数量比例的成分组成，酵母菌︰乳酸菌︰醋酸菌︰双歧杆菌︰嗜热链球菌=18～25︰35～45︰15～22︰18～25︰8～10。
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