CN111635924A - 一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法 - Google Patents

一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：在灵芝菌丝体液体发酵24h后，在灵芝菌丝体发酵中加入布拉氏酵母菌发酵液；布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体进行共发酵培养，共发酵培养1～5天后，得发酵液和灵芝菌丝体；分离灵芝菌丝体后的发酵液，提取灵芝胞外多糖。本发明利用布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体共发酵提高灵芝多糖产量，通过在发酵的特定阶段添加布拉氏酵母菌，大大提高了灵芝的生物量和灵芝多糖的产量。本发明与固态发酵相比发酵周期短，与纯灵芝液态发酵相比灵芝多糖产量显著提高。经过与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养后灵芝多糖产量可至少提高220％，具有广泛的应用价值和经济效益。

Description

一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其是一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法。
背景技术
益生菌发酵技术中，益生菌可以发挥对动物健康有益的作用，还可以在发酵中草药中提高中草药的营养价值和活性成分，缩小用药成本。随着益生菌发酵技术的深入研究和中草药的发展，益生菌发酵技术可以作为灵芝液体深层发酵的突破口，进一步研究灵芝液体深层发酵产生活性物质的变化。
灵芝多糖具有很多有利于人体的活性功能。它可以提高机体耐受缺氧能力，增强机体免疫力，清除自由基，对抗放射，增强骨髓、肝脏、DNA、RNA、血液以及多种蛋白质的活性，从而延长寿命。药用价值和保健价值在医药界和食品行业获得密切关注，深受人们的喜爱和认可，具有广阔的应用前景。灵芝的药效已经得到了广泛的认可，但是灵芝多糖的产量限制了市场的应用不能满足人们的需要。
布拉氏酵母菌(Sacoharomyces boulardii)是从自然状态下的印尼荔枝中分离得到的一种酵母菌，且是一种活性益生菌，具有天然、无毒副作用和安全可靠的优点。布拉氏酵母菌的生长发酵条件较灵领菌丝体的相近，如均可在pH4.5～8.0偏酸性环境中、温度28～40℃中生长，所摄取的营养物质除必须生长所需的也不需其他特殊物质，二者生长条件相适宜。布拉氏酵母菌菌体在生长过程中会分泌一些代谢物质，此类物质会使发酵液的环境有一定的改变，近而影响灵芝的生长及活性物质的产生。故选择布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体进行共发酵，以观察灵芝胞外多糖的产量变化。
现阶段，由于液体深层发酵技术生产灵芝具有生产周期短等特点，目前已成为获取灵芝及其活性物质的最有效方法。有文献和专利公开报道了各种方法，授权公开号CN105907812B公开了一种灵芝的多阶段液态深层发酵方法，从发酵的前期、中期、中后期和后期把控发酵条件，从而提高灵芝多糖的产量。授权公开号CN126474A公开了一种液体发酵法生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺。以灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss exFr.)Karst.的菌种，采用液体好氧发酵法、液体好氧发酵－液体静置培养法或液体静置培养法进行生产。此方法是需要静置培养诱导合成产物，总发酵时间周期长，需要20天以上，整体上生产效率较低。授权公开号CN105483180B公开一种提高薄芝多糖产量的方法,具体为在薄芝菌丝体的发酵培养基中添加L-半胱氨酸,进一步的,为缩短生产周期,所述薄芝菌丝体在发酵培养之前对所述一级种子液进行旋转式培养,对所述二级种子液进行往返式培养。授权公开号CN101880700A公开了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法。该方法是利用灵芝细胞的液体培养,通过在培养基中添加稀土元素镨、钕或镧,提高灵芝多糖的产量。授权公开号CN104286827A公开了一种利用益生菌发酵灵芝孢子粉的方法，该发明以枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌对灵芝孢子粉进行液态发酵,然后进行冷冻喷雾干燥而成。这些公开的报道中未见与灵芝液态发酵过程中添加布拉氏酵母菌乃至添加益生菌进行共发酵的相关内容。
通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，在灵芝菌丝体液体发酵过程中加入布拉氏酵母菌共发酵。
而且，发酵步骤为：在灵芝菌丝体液体发酵24h后，在灵芝菌丝体发酵中加入布拉氏酵母菌(Sacoharomyces boulardii)发酵液；布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体进行共发酵培养，共发酵培养1～5天后，得发酵液和灵芝菌丝体；分离灵芝菌丝体后的发酵液，提取灵芝胞外多糖。
而且，所述加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值即吸光度介于0.9～1.1。
而且，所述布拉氏酵母菌发酵液与灵芝菌丝体发酵液之间的体积比为1～30：100。
而且，所述添加布拉氏酵母的时间，在灵芝菌丝体液体发酵的24～72h。
而且，所述胞外多糖的提取步骤如下：
取分离灵芝菌丝体后的发酵液1体积与4倍体积95体积％乙醇静置，醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在50-70℃以下溶解5-15h，即得胞外多糖。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法利用布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体共发酵提高灵芝多糖产量，通过在发酵的特定阶段添加一定的布拉氏酵母菌，大大提高了灵芝的生物量和灵芝多糖的产量。添加的布拉氏酵母菌属于益生菌范畴，益生菌无毒副作用且稳定性高。本发明与固态发酵相比发酵周期短，与纯灵芝液态发酵相比灵芝多糖产量显著提高，具有广泛的应用价值和经济效益。
2、本发明方法通过在灵芝菌丝体液体发酵阶段添加布拉氏酵母菌发酵液共发酵，促使灵芝菌丝体生物量和胞外多糖产量变化，显著提高灵芝发酵所产生多糖的产量。益生菌发酵技术安全且对于活性物质稳定性高，从而为工业化生产灵芝多糖奠定基础。
附图说明
图1为未接种布拉氏酵母发酵液的参数变化，(a)为灵芝多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为菌液pH变化图。
图2为在发酵0h接种的参数变化。在灵芝菌丝体进入发酵阶段的同时加入布拉氏酵母菌发酵液，灵芝不能得到很好的生长且灵芝多糖产量较低。故不建议在此时进行布拉氏酵母菌发酵液接种。(a)为灵芝多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为菌液pH变化图。
图3为在发酵24h接种的参数变化。经过24h发酵后添加外源菌发酵液使灵芝多糖产量明显提高，继续发酵多糖产量有小幅下降。发酵至结束时，葡萄糖几乎耗尽，得到充分利用。pH整体变化不大，但相对于没有添加布拉氏酵母菌的灵芝液体深层发酵的发酵液pH值略高。(a)为灵芝多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为菌液pH变化图。
图4为在发酵96h接种的参数变化。在菌丝体发酵至96h加入布拉氏酵母发酵液，其共发酵可以使灵芝多糖的产量提高，但影响效果逐渐减弱。(a)为灵芝多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为菌液pH变化图。以上图中数据在不同的时间加入布拉氏酵母菌发酵液，并均从48h开始测量记录。数据中包括后灵芝菌丝体液体发酵和共发酵两个过程。同时，可从中计算出共发酵时长较优范围。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明中，所述的灵芝的活化、种子液培养、发酵液培养，布拉氏酵母的种子液培养、发酵液培养所用到的培养基和培养条件均为灵芝培养和布拉氏酵母菌培养中的常规培养基和常规培养条件，这些都是本领域技术人员所公知的。
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
⑴在灵芝菌丝体液体发酵24h后，加入布拉氏酵母菌(Sacoharomyces boulardii)发酵液；
⑵布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体进行共发酵培养，共发酵培养1～5天后，得发酵液和灵芝菌丝体；
⑶分离灵芝菌丝体和发酵液后，提取胞外多糖。
较优地，在灵芝进入发酵阶段的24h后至灵芝发酵结束前，加入布拉氏酵母菌发酵液进行共发酵。
较优地，所述步骤⑴中加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值即吸光度介于0.9～1.1之间。
较优地，所述步骤⑴中加入的布拉氏酵母菌发酵液与灵芝菌丝体发酵液之间的体积比为1～30：100。
较优地，所述步骤⑴中添加布拉氏酵母的时间，在灵芝菌丝体液体发酵的24～72h。
较优地，所述步骤⑶中胞外多糖的提取步骤如下：
取共发酵液1体积与4倍体积95％乙醇静置，醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下溶解8h，即得胞外多糖。
更具体地，相关制备及检测如下：
本发明所述的方法适用于任何灵芝菌种液体深层发酵。
胞外多糖测定可以为：取上述共发酵液1体积与4倍体积95％乙醇静置，醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下恒温溶解8h，采用苯酚-硫酸法对灵芝胞外多糖进行测定。
实施例1(对照组)
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
灵芝发酵培养120h，发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中灵芝多糖的提取方法和测定方法为：
取上述发酵液5mL与4倍体积95％乙醇混合，4℃静置12h后，10000rpm离心20min，收集沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到胞外多糖溶液。
采用苯酚-硫酸法对灵芝胞外多糖溶液进行测定多糖含量。
测定灵芝胞外多糖含量为(0.25±0.048)g/L。
实施例2
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第72h，添加总体积5％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养48h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(0.373±0.005)g/L。
实施例3
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第72h，添加总体积10％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养48h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(0.533±0.043)g/L。
实施例4
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第72h，添加总体积15％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养2天。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(0.401±0.062)g/L。
实施例5
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第72h，添加总体积20％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养48h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(0.395±0.15)g/L。
实例2～5与实例1相比，灵芝液体深层发酵均为120h，添加了布拉氏酵母菌发酵液进行共培养的的实例2～5的灵芝多糖产量，经测定均比实例1显著提高。
添加10％的布拉氏酵母菌发酵液的实施例3与未添加布拉氏酵母菌发酵液的实施例1相比，灵芝多糖产量可至少提高60％。
实施例6
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第24h，添加总体积10％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养96h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(1.02±0.142)g/L。
实施例7
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第48h，添加总体积10％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养72h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(1.176±0.213)g/L。
实施例8
一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灵芝菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
布拉氏酵母菌进行种子液培养和深层发酵培养。
灵芝发酵培养第72h，添加总体积10％的布拉氏酵母菌发酵液(加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值为1.0)。
灵芝菌丝体发酵液与布拉氏酵母菌发酵液共发酵培养48h。
发酵结束，获得灵芝菌丝体并提取菌丝体中的灵芝多糖。
其中，灵芝多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，从测定灵芝胞外多糖含量为(0.533±0.043)g/L。
实例6～8，在不同发酵阶段与相同添加量的布拉氏酵母菌发酵液进行共发酵培养，并且灵芝的液体深层发酵的总时长不变的条件下，所产生的灵芝多糖均比实例1液体发酵所得的灵芝多糖产量增加。
实例6～8中，最优的选择在发酵48h添加10％布拉氏酵母菌发酵液的实例7。此时，相对于未添加布拉氏酵母菌发酵液的实施例1的灵芝胞外多糖产量相比可至少提高220％。
综上所述，在灵芝的发酵阶段添加布拉氏酵母菌发酵液进行共发酵，可有效提高灵芝液体深层发酵产生灵芝多糖的产量。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (6)

1.一种提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：在灵芝菌丝体液体发酵过程中加入布拉氏酵母菌共发酵。
2.根据权利要求1所述提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：步骤如下：
在灵芝菌丝体液体发酵24h后，在灵芝菌丝体发酵中加入布拉氏酵母菌(Sacoharomyces boulardii)发酵液；布拉氏酵母菌与灵芝菌丝体进行共发酵培养，共发酵培养1～5天后，得发酵液和灵芝菌丝体；分离灵芝菌丝体后的发酵液，提取灵芝胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：所述加入的布拉氏酵母菌发酵液的OD值即吸光度介于0.9～1.1。
4.根据权利要求2所述的提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：所述布拉氏酵母菌发酵液与灵芝菌丝体发酵液之间的体积比为1～30：100。
5.根据权利要求1或2所述的提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：所述添加布拉氏酵母的时间，在灵芝菌丝体液体发酵的24～72h。
6.根据权利要求2所述的提高灵芝胞外多糖产量的液体发酵方法，其特征在于：所述胞外多糖的提取步骤如下：
取分离灵芝菌丝体后的发酵液1体积与4倍体积95体积％乙醇静置，醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在50-70℃以下溶解5-15h，即得胞外多糖。
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