CN110396531A - 生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法 - Google Patents

生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法，包括以下步骤：S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25‑30℃培养箱中培养5‑7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3‑6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7‑10d得一级种；按照10％的接种量接入液体培养基中；酵母菌发酵法生物降解灵芝大分子多糖的方法，结合乙醇沉淀获得制备活性低分子量多糖组分的方法，添加的酵母将胞外液中的大分子量的多糖降解为分子量较低的多糖。并确定了灵芝活性多糖组分通过与Dectin‑1受体结合激活NF‑κB途径来增强机体免疫活性的用途。

Description

生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法
技术领域
本发明涉及到生物工程的领域，特别涉及生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma spp.)是我国著名的药用真菌，具有广泛的药理作用和极低的毒性，临床上可用于辅助治疗各种疾病，包括肿瘤、支气管炎症、神经衰弱等。现代药理学研究已经证明灵芝的药用价值主要包括调节免疫、抗肿瘤、抗辐射以及辅助治疗心血管疾病等。灵芝已经逐渐成为保健类功能食品和中药产品研发领域的重要资源。
灵芝中的化学成分非常复杂，现在已经分离出的成分达数十种之多，多糖是灵芝最主要的活性成分之一，在抗肿瘤、调节机体免疫等方面效果显著。前期研究表明，灵芝子实体和发酵胞外液中均主要包含分子量为百万级的大分子多糖组分和分子量为1万-10万级的低分子量多糖组分。大分子量多糖组分具有易于分离且活性较好的特点，但由于其分子量大、粘度大且难溶于水，使其进一步开发应用受到极大限制。传统方法采用酸碱水解及超声波、微波破碎等来降低多糖的相对分子质量，以提高其水溶性，增强多糖的生物活性，但由于效果不佳及产物安全性问题而难以推广。近年来生物酶法降解日益受到重视，但多糖是一类分子结构紧密的大分子物质，在分子内部很难进行酶解反应，效率较低。因此选择合适的降解方法是开发利用灵芝多糖的关键。
酵母菌是一种天然的发酵剂，有一套自身的胞内和胞外酶系统，用以维持有机体正常的生长和代谢活动。有研究发现：中药在经过酵母菌发酵之后，有效成分的含量以及药效得到了明显的提升，并且生成了新的化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法，发酵所得各多糖组分均具有显著的活性，并确定了灵芝活性多糖组分通过与Dectin-1受体结合激活NF-κB途径来增强机体免疫活性的用途，为其后续的开发利用提供基础。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：生物发酵降解制备灵芝活性多糖，包括以下步骤：
S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10d得一级种；按照10％的接种量接入液体培养基中，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，然后放入摇床内，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃，培养7-10d，结束发酵；
S2：灵芝发酵胞外液的分离：待发酵培养结束后，收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下离心，取上清液进行高压灭菌处理；
S3：酵母菌发酵降解：将酵母在平板培养基上进行活化，于26℃培养3d左右，待长满平板之后，挑取4mm2大小的菌块接入250mL摇瓶液体培养基，于150r/min，26℃的摇床上培养3d，按照10％的接种量接入上述灭过菌的灵芝胞外液中培养至24h、72h和120h取样，6000-8000r/min转速条件下离心分离酵母菌与胞外液；
S4：多糖组分的分离制备：分别向灵芝发酵胞外液中和经酵母菌发酵培养的胞外液中加入95％的乙醇，使其终浓度为20％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心(8000-10000r/min)后分离沉淀和上清；
S5：在上清液中继续加入乙醇使其终浓度为50％，按照上述步骤分离沉淀和上清，继续往上清中加入乙醇使其终浓度为70％，分离获得沉淀；以上20％、50％和70％乙醇沉淀分别以对应醇沉浓度的乙醇洗涤1-2次后，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到多糖组分20E(20％乙醇沉淀)、50E(50％乙醇沉淀)和70E(70％乙醇沉淀)组分；
S6：多糖的特征分析：随着添加酵母培养时间的增加，多糖总得率有了一定的提升，从不添加酵母时的2.62g/L增加到了2.79g/L(添加酵母培养120h)；
S7：多糖活性检测：HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。
进一步地，针对步骤S1中，种子液培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然。
进一步地，针对步骤S1中，发酵培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％、的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然。
进一步地，针对步骤S3中，液体培养基的组成是：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠200mg/L。
本发明提供另一技术方案，生物发酵降解制备灵芝活性多糖的分析方法，包括以下步骤：
S1：表观粘度测定方法：取所得各菌株发酵胞外液，以微型流变仪对其进行表观粘度测定，以剪切速率为自变量，其变化范围0.1～1000s-1采用型号为PP50的平行平板进行检测，板间距设定为1mm；
S2：联用分析胞外液中多糖分子量：以高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法(HPSEC-MALLS-RI System)对灵芝胞外液中多糖组分的分子量分布进行分析；
S3：酵母发酵不同时间所得灵芝胞外液表观粘度分析：灵芝发酵胞外液分离后经酵母培养不同时间所得的产物，各胞外液表观粘度均呈现出随剪切速率增加而下降的趋势，属于典型的剪切变稀非牛顿流体，相同剪切速率下，不同胞外液表观粘度大小存在明显差异，在添加酵母培养之后，胞外液的表观粘度明显降低；
S4：多糖的单糖组成特征分析：对灵芝发酵胞外液以及胞外液中添加酵母培养不同时间后所得产物进行多糖的单糖组成特征分析，分别取2mg样品(来源是上述过程制备得到的各部分乙醇沉淀组分)加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h，采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成在单糖组成上20E组分基本都是以葡萄糖和甘露糖为主，同时也含有少量的岩藻糖，木糖和半乳糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法，酵母菌发酵法生物降解灵芝大分子多糖的方法，结合乙醇沉淀获得制备活性低分子量多糖组分的方法，添加的酵母将胞外液中的大分子量的多糖降解为分子量较低的多糖，发酵所得各多糖组分均具有显著的活性。并确定了灵芝活性多糖组分通过与Dectin-1受体结合激活NF-κB途径来增强机体免疫活性的用途，为其后续的开发利用提供基础。
附图说明
图1为本发明的酵母培养不同时期所得胞外液的表观粘度随剪切速率变化曲线图；
图2为本发明的酵母降解不同时间所得多糖的分子量分布分析图；
图3为本发明的多糖组分的分离制备图；
图4为本发明的酵母菌培养不同时间所得灵芝胞外多糖组分激活NF-κB活性测定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚；完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，生物发酵降解制备灵芝活性多糖，包括以下步骤：
步骤一：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10d得一级种，种子液培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然；按照10％的接种量接入液体培养基中，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％、的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然，然后放入摇床内，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃，培养7-10d，结束发酵；
步骤二：灵芝发酵胞外液的分离：待发酵培养结束后，收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下离心，取上清液进行高压灭菌处理；
步骤三：酵母菌发酵降解：将酵母在平板培养基上进行活化，于26℃培养3d左右，待长满平板之后，挑取4mm2大小的菌块接入250mL摇瓶液体培养基，液体培养基的组成是：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠200mg/L，于150r/min，26℃的摇床上培养3d，按照10％的接种量接入上述灭过菌的灵芝胞外液中培养至24h、72h和120h取样，6000-8000r/min转速条件下离心分离酵母菌与胞外液；
步骤四：多糖组分的分离制备：分别向灵芝发酵胞外液中和经酵母菌发酵培养的胞外液中加入95％的乙醇，使其终浓度为20％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心(8000-10000r/min)后分离沉淀和上清；
步骤五：在上清液中继续加入乙醇使其终浓度为50％，按照上述步骤分离沉淀和上清，继续往上清中加入乙醇使其终浓度为70％，分离获得沉淀；以上20％、50％和70％乙醇沉淀分别以对应醇沉浓度的乙醇洗涤1-2次后，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到多糖组分20E(20％乙醇沉淀)、50E(50％乙醇沉淀)和70E(70％乙醇沉淀)组分。
在乙醇浓度上，多糖组分20E、50E和70E组分分别对应20％、50％和70％乙醇沉淀。
在单糖组成上20E组分基本都是以葡萄糖和甘露糖为主，同时也含有少量的岩藻糖，木糖和半乳糖等。
50E和70E组分中的单糖组成均以甘露糖为主，70E组分中甘露糖的比例超过75％。
各醇沉组分得率及多糖含量见表1。
结果显示，随着添加酵母培养时间的增加，大分子量20E多糖组分的得率随着添加酵母培养时间的延长呈现出下降的趋势，从不添加酵母时2.43g/L下降到了培养120h时的0.98g/L；而50E和70E组分的多糖得率却随着添加酵母后培养时间的增加而有不同程度的增加，如不添加酵母时未发现70E组分，到添加酵母培养120h后70E组分达到了1.87g/L。
表1 酵母培养不同培养时期醇沉所得胞外多糖得率与含量
步骤六：多糖的特征分析：随着添加酵母培养时间的增加，多糖总得率有了一定的提升，从不添加酵母时的2.62g/L增加到了2.79g/L(添加酵母培养120h)，但是20E组分的多糖得率随时间延长呈现出下降的趋势，从不添加酵母时2.43g/L下降到了培养120h时的0.98g/L，其分子量有所下降，从3.5×106g/mol下降到1.8×106g/mol，而50E和70E组分的多糖得率却随着添加酵母后培养时间的增加而有不同程度的增加，如不添加酵母时未发现70E组分，到添加酵母培养120h后70E组分达到了1.87g/L；
单糖组成分析方法：
分别取2mg样品(来源是上述过程制备得到的各部分乙醇沉淀组分)加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h。采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA。用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成。
表2 流动相梯度洗脱比例
结果分析：各多糖组分的单糖组成分析结果见表3。在单糖组成上20E组分基本都是以葡萄糖和甘露糖为主，同时也含有少量的岩藻糖，木糖和半乳糖等。
表3 酵母不同培养时期单糖组成及摩尔百分比(％)
ND:未检测出ND:not detected
不添加酵母培养的组分为20E和50E，经过酵母培养之后未得到50E组分，而获得了70E组分，进一步说明添加的酵母将胞外液中的大分子量的多糖降解为分子量较低的多糖。20E组分葡萄糖所占比例最高，均超过70％。经过酵母培养后所得70E组分中的单糖组成均以甘露糖为主，比例均超过76％
步骤七：多糖活性检测：HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性，结果显示经过此方法获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF-κB的活性，且经过发酵降解的组分，活性明显增加，酵母培养24h收集到的组分活性最好。
测定方法：分别将各组分(来源是上述过程制备得到的各部分乙醇沉淀组分)均配制成2mg/mL的混悬液，进行均质粉碎处理，所得样品液在121℃条件下灭菌30min，取对数生长期的HEK-Blue hDectin-1b细胞，用检测培养基调节其细胞密度为3×105个/mL，在96孔板中每孔加入180μL的细胞悬液和20μL不同样品液，以无菌水为阴性对照，终浓度为100μg/mL的葡聚糖标准品(SG)为阳性对照，样品终浓度为200μg/mL，每个样品设置三个重复，置于培养箱中培养24h，用酶标仪在630nm波长处测定其吸光度值。
HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。
请参阅图2，结果显示，发酵所得各多糖组分均具有显著的活性，经过酵母培养24h之后，胞外多糖20E和70E组分的活性均有提升，70E多糖组分的活性要高于20E。
生物发酵降解制备灵芝活性多糖的分析方法，包括以下步骤：
步骤一：表观粘度测定方法：取所得各菌株发酵胞外液，以微型流变仪对其进行表观粘度测定，以剪切速率为自变量，其变化范围0.1～1000s-1采用型号为PP50的平行平板进行检测，板间距设定为1mm；
步骤二：联用分析胞外液中多糖分子量：以高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法(HPSEC-MALLS-RI System)样品，样品采用发酵结束离心后的胞外液在8000r/min，15℃条件下离心30min，取1.5mL用0.22μm水相微孔膜过滤，对灵芝胞外液中多糖组分的分子量分布进行分析，8角度激光光散射仪的光源波长选用623.8nm，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算；
步骤三：酵母发酵不同时间所得灵芝胞外液表观粘度分析：请参阅图3，灵芝发酵胞外液分离后经酵母培养不同时间所得的产物，各胞外液表观粘度均呈现出随剪切速率增加而下降的趋势，属于典型的剪切变稀非牛顿流体，相同剪切速率下，不同胞外液表观粘度大小存在明显差异，在添加酵母培养之后，胞外液的表观粘度明显降低；
步骤四：多糖的单糖组成特征分析：对灵芝发酵胞外液以及胞外液中添加酵母培养不同时间后所得产物进行多糖的单糖组成特征分析，分别取2mg样品(来源是上述过程制备得到的各部分乙醇沉淀组分)加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h，采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成在单糖组成上20E组分基本都是以葡萄糖和甘露糖为主，同时也含有少量的岩藻糖，木糖和半乳糖，并用Astra软件对各多糖峰的分子量进行计算。
请参阅图4，结果发现胞外液中主要含有两个峰，出峰时间分别为22min和37min左右；分子量测定结果显示，第一个多糖组分的分子量达到了百万以上，第二个多糖组分的分子量为3.9万-7.1万之间；相较于未添加酵母菌培养的灵芝胞外液多糖，经过酵母菌培养之后的胞外液多糖的分子量有所下降，从3.5×106下降到1.8×106g/mol，但都处于106的水平。
综上所述，本生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法，酵母菌发酵法生物降解灵芝大分子多糖的方法，结合乙醇沉淀获得制备活性低分子量多糖组分的方法，添加的酵母将胞外液中的大分子量的多糖降解为分子量较低的多糖，发酵所得各多糖组分均具有显著的活性。并确定了灵芝活性多糖组分通过与Dectin-1受体结合激活NF-κB途径来增强机体免疫活性的用途，为其后续的开发利用提供基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.生物发酵降解制备灵芝活性多糖，其特征在于，包括以下步骤：
S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10d得一级种；按照10％的接种量接入液体培养基中，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，然后放入摇床内，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃，培养7-10d，结束发酵；
S2：灵芝发酵胞外液的分离：待发酵培养结束后，收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下离心，取上清液进行高压灭菌处理；
S3：酵母菌发酵降解：将酵母在平板培养基上进行活化，于26℃培养3d左右，待长满平板之后，挑取4mm2大小的菌块接入250mL摇瓶液体培养基，于150r/min，26℃的摇床上培养3d，按照10％的接种量接入上述灭过菌的灵芝胞外液中培养至24h、72h和120h取样，6000-8000r/min转速条件下离心分离酵母菌与胞外液；
S4：多糖组分的分离制备：分别向灵芝发酵胞外液中和经酵母菌发酵培养的胞外液中加入95％的乙醇，使其终浓度为20％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心(8000-10000r/min)后分离沉淀和上清；
S5：在上清液中继续加入乙醇使其终浓度为50％，按照上述步骤分离沉淀和上清，继续往上清中加入乙醇使其终浓度为70％，分离获得沉淀；以上20％、50％和70％乙醇沉淀分别以对应醇沉浓度的乙醇洗涤1-2次后，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到多糖组分20E(20％乙醇沉淀)、50E(50％乙醇沉淀)和70E(70％乙醇沉淀)组分；
S6：多糖的特征分析：随着添加酵母培养时间的增加，多糖总得率有了一定的提升，从不添加酵母时的2.62g/L增加到了2.79g/L(添加酵母培养120h)；
S7：多糖活性检测：HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。
2.根据权利要求1所述的生物发酵降解制备灵芝活性多糖，其特征在于，针对步骤S1中，种子液培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然。
3.根据权利要求1所述的生物发酵降解制备灵芝活性多糖，其特征在于，针对步骤S1中，发酵培养基的组成是：碳源为2-3％的葡萄糖、氮源为0.2-0.3％、的酵母粉、0.2％KH2PO4和2％MgSO4·7H2O、pH自然。
4.根据权利要求1所述的生物发酵降解制备灵芝活性多糖，其特征在于，针对步骤S3中，液体培养基的组成是：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠200mg/L。
5.如权利要求1所述的生物发酵降解制备灵芝活性多糖的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：表观粘度测定方法：取所得各菌株发酵胞外液，以微型流变仪对其进行表观粘度测定，以剪切速率为自变量，其变化范围0.1～1000s-1采用型号为PP50的平行平板进行检测，板间距设定为1mm；
S2：联用分析胞外液中多糖分子量：以高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法(HPSEC-MALLS-RI System)对灵芝胞外液中多糖组分的分子量分布进行分析；
S3：酵母发酵不同时间所得灵芝胞外液表观粘度分析：灵芝发酵胞外液分离后经酵母培养不同时间所得的产物，各胞外液表观粘度均呈现出随剪切速率增加而下降的趋势，属于典型的剪切变稀非牛顿流体，相同剪切速率下，不同胞外液表观粘度大小存在明显差异，在添加酵母培养之后，胞外液的表观粘度明显降低；
S4：多糖的单糖组成特征分析：对灵芝发酵胞外液以及胞外液中添加酵母培养不同时间后所得产物进行多糖的单糖组成特征分析，分别取2mg样品(来源是上述过程制备得到的各部分乙醇沉淀组分)加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h。采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成在单糖组成上20E组分基本都是以葡萄糖和甘露糖为主，同时也含有少量的岩藻糖，木糖和半乳糖。
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