CN105586273B - 一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法 - Google Patents

一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法，步骤包括，(1)母种扩增，无菌条件下剖取小块鹿角灵芝菌的母钟，移接到斜面培养基上，加塞，至恒温培养箱内，25‑29℃中培养7天；(2)种子液制备，在斜面培养基上取菌丝体，接种于种子液培养基中，置于摇床中25‑29℃、140‑160r/min培养7天；(3)发酵罐发酵，将种子液按10％接种量接种到发酵罐中，25‑29℃恒温培养80h，其中0‑36小时搅拌速度90‑110r/min，36‑70小时搅拌速度110‑130r/min，70‑80小时搅拌速度90‑110r/min。通过本发明发酵后，鹿角灵芝发酵液中含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。

Description

一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法
技术领域
本发明提供了一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法，属于微生物领域。
背景技术
灵芝别名万年蕈或灵芝草，属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝菌属，其中的鹿角灵芝(Ganoderma amboinense)生长中会形成类似鹿角的形态，属于灵芝中的名贵品种。近代医学研究发现鹿角灵芝有增强免疫，促进新陈代谢，抗肿瘤，延缓衰老等作用，其关键活性成分是灵芝多糖和灵芝三萜。
传统人工栽培灵芝，周期长，生产效率低，受环境影响大。而通过灵芝液体发酵技术，不但能短时间内培养出大量菌丝体，缩短生产时间，而且能获得质量好且稳定的目标活性产物，营养和药用价值都不低于子实体，正逐步应用于药物，食品，美容化妆品等领域。灵芝液体发酵技术的关键在于寻找适合的菌株，一方面要有较高的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物产量，一方面要能适应简单的培养方法和廉价的培养基成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法，通过本发明发酵后，鹿角灵芝发酵液中含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。
灵芝多糖具有广泛的药理活性，能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白质能力，延长寿命，灵芝多糖还具有刺激宿主非特异性抗性、免疫特异反应以及抑制移植肿瘤生理活性的特性。对心血管疾病、气喘、过敏、神经衰弱、胃热等有显著效果。还具有降血压、降血脂、降血瘀、改善血液循环、皮肤美容等作用。
灵芝三萜类化合物的药理作用为：保肝作用；抗肿瘤作用；抗HIV-1`及HIV-1蛋白酶活性；抑制组胺释放；抑制血管紧张素转化酶(ACE)；抑制胆固醇合成；镇痛作用；对血小板聚氯的影响；对蛋白金合欢酯转移酶的抑制作用；抗氧化作用；抑制真核细胞DNA多聚酶活性。
一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)母种扩增
无菌条件下剖取小块鹿角灵芝菌的母钟，移接到斜面培养基上，加塞，至恒温培养箱内，25-29℃中培养7天；优选的，菌株NCPSLZ1移接到斜面培养基上，27℃中培养7天；
斜面培养基：马铃薯洗净，去皮，称取200g，切成小块，与30g麦麸，加水1000mL煮沸，保持30min，过滤，滤液中加入琼脂20g，加热使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，pH为7.0，分装入试管，放入高压灭菌锅灭菌，温度为121℃，时间为30min，制成试管斜面(18mm×180mm)备用；
(2)种子液制备
在斜面培养基上取1cm2的菌丝体，接种于种子液培养基中，置于摇床中25-29℃、140-160r/min培养7天；优选为，菌丝体接种于种子液培养基中，置于摇床中27℃、150r/min培养7天
种子液培养基，按质量分数计：15％土豆汁，3％麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0，培养液分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，121℃灭菌30min，冷却后取出备用。
(3)发酵罐发酵
将种子液按10％(v/v)接种量接种到发酵罐中，25-29℃恒温培养80h，其中0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度90-110r/min，36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度110-130r/min，70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度90-110r/min；优选的，0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度100r/min；36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度120r/min，70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度100r/min。
发酵罐培养基(质量分数)：20％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0。
利用上述培养方法培养鹿角灵芝菌株NCPSLZ1，菌株NCPSLZ1的保藏编号为CCTCCNo.M2015796；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏日期为2015年12月29日；保藏地址为中国武汉武汉大学，该鹿角灵芝菌株NCPSLZ1为Ganoderma amboinense NCPSLZ1。
菌株NCPSLZ1由金唯智生物科技(北京)有限公司进行18sDNA菌种鉴定，结果表明该菌株属于鹿角灵芝(Ganoderma amboinense NCPSLZ1)，并与已公开的鹿角灵芝菌株18sDNA序列有区别，同源性低于100％。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
通过本发明培养方法，鹿角灵芝菌发酵后，发酵液中含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。通过鹿角灵芝菌株NCPSLZ1的检测试验，利用本发明培养方法发酵，生物量为12.5g/L，胞内多糖为137mg/L，三萜类化合物为55mg/L，产量较未优化前的摇瓶发酵又有了很大的提高。
附图说明
图1为不同碳源对本发明鹿角灵芝菌丝体生物量的影响；
图2为不同氮源对本发明鹿角灵芝菌丝体生物量的影响；
图3为本发明鹿角灵芝菌丝体生长曲线图；
图4为初始pH对本发明鹿角灵芝菌丝体生物量的影响；
图5为土豆汁浓度对本发明鹿角灵芝菌丝体生物量的影响；
图6为接种量对本发明鹿角灵芝菌丝体生物量的影响；
图7为本发明鹿角灵芝菌丝球形态图；
图8为本发明鹿角灵芝在奥林巴斯光电显微镜AH-2油镜下的菌丝形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种鹿角灵芝菌液体培养的方法，具体步骤如下：
(1)母种扩增
无菌条件下剖取小块鹿角灵芝菌的母钟，移接到斜面培养基上，加塞，至恒温培养箱内，27℃中培养7天；
斜面培养基：马铃薯洗净，去皮，称取200g，切成小块，与30g麦麸，加水1000mL煮沸，保持30min，过滤，滤液中加入琼脂20g，加热使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，pH为7.0，分装入试管，放入高压灭菌锅灭菌，温度为121℃，时间为30min，制成试管斜面(18mm×180mm)备用；
(2)种子液制备
在斜面培养基上取1cm2的菌丝体，接种于种子液培养基中，置于摇床中27℃、150r/min培养7天。
种子液培养基，按质量分数计：15％土豆汁，3％麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0，培养液分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，121℃灭菌30min，冷却后取出备用。
(3)发酵罐发酵
将种子液按10％(v/v)接种量接种到发酵罐中，25-29℃恒温培养80h，其中0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度100r/min，36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度120r/min，70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度100r/min。
发酵罐培养基(质量分数)：20％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0。
实施例2鹿角灵芝菌产灵芝多糖和三萜类化合物能力评估
鹿角灵芝菌选用鹿角灵芝菌株NCPSLZ1，菌株NCPSLZ1的保藏编号为CCTCCNo.M2015796；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏日期为2015年12月29日；保藏地址为中国武汉武汉大学。
评估时使用的液体发酵培养基，培养基的配方(按质量百分比计)为15％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0。接种量为5％(V/V)，500mL摇瓶(装液250mL)，150r/min，27±2℃恒温培养70h得评估用发酵液，进一步得冻干菌丝粉。
菌株NCPSLZ1菌丝体生物量的测定采用干重法：将发酵液在4℃，8000r/min条件下高速离心10min；将沉淀用蒸馏水多次洗涤，冻干，计算灵芝菌丝体的生物量(菌丝体干重g/L发酵液或菌丝体干重/g)，各指标测定两次，取平均值。
本发明中灵芝多糖定量检测采用苯酚-硫酸法：以葡萄糖绘制标准曲线；将菌株发酵液减压浓缩至原体积的五分之一，用4倍体积的无水乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置12h，离心，沉淀加蒸馏水溶解，高速离心，上清液冻干后为灵芝胞外多糖粉；将1g灵芝冻干菌丝粉与50mL蒸馏水，沸水浴1h，过滤，沉淀再与50mL蒸馏水沸水浴1h，合并两次滤液，与4倍体积的无水乙醇混合，于4℃冰箱中静置12h，离心，沉淀加蒸馏水溶解，高速离心，上清液冻干得灵芝胞内多糖粉；使用上述标准曲线和多糖粉测定灵芝多糖含量。
三萜类化合物检测采用香草酸—冰醋酸法：使用齐墩果酸绘制标准曲线；取1g菌丝粉与25mL无水乙醇混合，超声1.5h后，过滤，收集滤液。78℃水浴浓缩，定容至10mL；使用上述标准曲线和所定容的溶液测定三萜类化合物含量。
结果：在未进行任何优化的情况下，鹿角灵芝菌株NCPSLZ1液体发酵产胞外多糖，胞内多糖和三萜类化合物含量也分别达到了4.07g/L，85mg/L和28.8mg/L，在类似灵芝菌株中处于较高水平。
实施例3液体发酵条件优化
3.1母种扩增
马铃薯洗净，去皮，称取200g，切成小块，与30g麦麸，加水1000mL煮沸，保持30min，过滤，滤液中加入琼脂20g，加热使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，pH为7.0，分装入试管，放入高压灭菌锅灭菌(温度121℃，时间30min)，制成试管斜面(18mm×180mm)备用。
无菌条件下剖取小块菌株NCPSLZ1的母种，移接到斜面培养基上，加塞，至恒温培养箱内，27℃培养，待菌丝长满斜面后，将扩大培养后的母种放置4℃冰箱中保存待用。
3.2种子液制备
15％土豆汁，3％麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0，培养液分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，121℃灭菌30min，冷却后取出备用。
从母种试管中切蚕豆大小的菌丝块接种于斜面培养基的中部，27±2℃中培养7天。
活化后的灵芝菌种切成1cm2大小的斜面菌丝体，接种于种子液培养基中，置于摇床中27±2℃、150r/min培养7天。
3.3营养因子筛选
以选好的培养基配比为基础(15％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0，探讨单一因素对灵芝深层发酵的影响。
为保证接种量一致，一代种子液培养接种量和培养条件相同。选长满菌球的灵芝液体培养基，分别接5％种子液于筛选培养基中，置于摇床中，转速150r/min，27±2℃恒温培养70h，见图7和图8。
实验中一切重量单位都以500mL摇瓶(装液250mL)培养液产出的灵芝菌丝重量计算和处理。
3.3.1碳源
将种子液中的葡萄糖分别换成单糖(山梨醇)、双糖(蔗糖、麦芽糖、乳糖)、多糖(玉米粉、可溶性淀粉)，其余成分不变。
结果：如图1所示，菌株NCPSLZ1液体发酵最适合的碳源为葡萄糖，对发酵中常见的廉价多糖玉米粉、可溶性淀粉适应性也比较好，无需采用较贵的麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源。
3.3.2氮源
将种子液中的麦麸分别换成无机氮(硫酸铵)、有机氮(酵母膏、黄豆粉)，其余成分不变。
结果：如图2所示，菌株NCPSLZ1液体发酵最适合的氮源为麦麸，对发酵中常见的廉价氮源硫酸铵、酵母膏、黄豆粉适应性也比较好，发酵中可以根据价格灵活使用。
3.4其他发酵条件
3.4.1灵芝菌丝体生长曲线
以培养基配方(15％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0)配制培养基，用500mL三角瓶做培养容器，装250mL培养基，共30瓶，按10％的接种量接种，27±2℃，150r/min恒温培养，每隔6h取样一次，每个取样点取3瓶，测量发酵液pH和菌丝干重，共82h。
结果：如图3所示，迟缓期在约0-36小时，对数期在约36-70小时，其后为稳定生长期，最适发酵时间为约70-80小时。
3.4.2pH实验
以培养基配方(15％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，)配制培养基，灭菌前用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl将培养基调成pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11共9个梯度，重复3次，观察不同pH对灵芝菌丝生长的影响。
结果：如图4所示，最适初始pH约7，与自然状态(约6)区别不大，两者均可使用。
3.4.3土豆汁浓度
以培养基配方(3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0)配制培养基，分别配制土豆汁浓度5％、10％、15％、20％的培养基，其余培养条件不变，重复3次。
结果：如图5所示，最适土豆汁浓度为20％。
3.4.4接种量
以培养基配方(15％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0)配制培养基，接种量分别为5％，10％，15％，20％，其余培养条件不变，重复3次。
结果：如图6所示，最适接种量为10％(V/V)(更高时培养基粘度过大)。
实施例4发酵罐发酵的初步试验
产灵芝多糖和三萜类化合物计量方法见实施例2部分，种子液制备见实施例3部分。
在实施例3基础上确定发酵培养基配方为：20％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH＝7。
16L不锈钢发酵罐中投料10L，接种量10％，27±2℃恒温培养80h，其中0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度90-110r/min，36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度110-130r/min，70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度90-110r/min。
结果：生物量：12.5g/L，胞内多糖：137mg/L，三萜类化合物：55mg/L，产量较未优化前的摇瓶发酵又有了很大的提高。

Claims (4)

1.一种鹿角灵芝菌液发酵培养方法，具体步骤如下：
(1)母种扩增
无菌条件下剖取小块鹿角灵芝菌的母种，移接到斜面培养基上，加塞，至恒温培养箱内，27℃中培养7天；
斜面培养基：马铃薯洗净，去皮，称取200g，切成小块，与30g麦麸，加水1000mL煮沸，保持30min，过滤，滤液中加入琼脂20g，加热使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，pH为7.0，分装入试管，放入高压灭菌锅灭菌，温度为121℃，时间为30min，制成试管斜面备用；
(2)种子液制备
在斜面培养基上取1cm2的菌丝体，接种于种子液培养基中，置于摇床中27℃、150r/min培养7天；
种子液培养基，按质量分数计：15％土豆汁，3％麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0，培养液分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，121℃灭菌30min，冷却后取出备用；
(3)发酵罐发酵
将种子液按10％(v/v)接种量接种到发酵罐中，25-29℃恒温培养80h，其中0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度90-110r/min，36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度110-130r/min，70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度90-110r/min；
发酵罐培养基，按质量分数计：20％土豆汁，3％的麦麸，3％葡萄糖，0.2％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，pH为7.0；
所述鹿角灵芝菌为菌株NCPSLZ1，保藏编号为CCTCC No.M2015796；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏日期为2015年12月29日；保藏地址为中国武汉大学；该菌株可用于发酵生产灵芝多糖和三萜类化合物，发酵80小时发酵液中胞内多糖和三萜类化合物产量可达137mg/L和55mg/L。
2.根据权利要求1所述鹿角灵芝菌液发酵培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中0-36小时菌丝体迟缓期内搅拌速度100r/min。
3.根据权利要求1所述鹿角灵芝菌液发酵培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中36-70小时菌丝体对数生长期内搅拌速度120r/min。
4.根据权利要求1所述鹿角灵芝菌液发酵培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中70-80小时菌丝体生长稳定期内搅拌速度100r/min。
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