CN110438180B - 灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备及其增强免疫用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备及其增强免疫用途，先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，再按10％接种量接种液体培养基上，分别接种到以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等为碳源，以酵母粉或酵母膏为氮源的液体发酵培养基中培养，加入乙醇使其终浓度为20‑30％，收集沉淀并经20‑30％乙醇洗涤2‑3次后进行干燥，用QUANTI‑Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin‑1途径激活NF‑κB的活性。结果显示经过此方法获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF‑κB的活性，所得多糖具有很好的增强免疫活性。

Description

灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备及其增强免疫用途
技术领域
本发明涉及到生物发酵工程领域，特别涉及灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备及其增强免疫用途。
背景技术
灵芝(Ganoderma spp)是我国著名的药用真菌，在汉代的医学专著《神农本草经》中被奉为上品，记载其能够益心气、安精魂、补肝益气、坚筋骨，具有很高的药用价值。近年来随着人们对生活品质要求的提升和对健康的重视，灵芝的保健作用逐渐被人们所关注。现代药理学研究已经证明灵芝的药用价值主要包括调节免疫、抗肿瘤、抗辐射以及辅助治疗心血管疾病等。目前灵芝已经逐渐成为保健类功能食品和中药产品研发领域的重要资源。
灵芝中所含化学成分非常复杂，现在已经分离出的有效成分达数十种之多，包括多糖、三萜、氨基酸、生物碱、蛋白等。其中多糖是灵芝最主要的活性成分之一，在抗肿瘤、调节机体免疫等方面效果显著。目前，灵芝多糖主要是从灵芝的子实体、孢子粉以及液体深层发酵的菌丝体和胞外液中获得。传统的灵芝栽培方式生产效率低，生产周期长，容易受到环境如土壤温度、湿度以及季节气候等的影响，而且不同批次灵芝中的活性成分含量也有较大差别。而液体深层发酵技术可以克服传统栽培方式的缺点和不足。液体深层发酵技术因具有原料来源广、生产周期短、产量大、产品质量稳定等特点而备受关注，且有研究表明，通过液体深层发酵生产的产品，苦味小，营养价值高，有效成分不低于子实体，甚至有些指标还高于子实体，现阶段已成为了获取灵芝活性物质最高效的手段之一。相较于灵芝子实体栽培技术而言，灵芝液态深层发酵技术还有很大的研究空间。由于自身的技术特点，如改变培养基成分或发酵条件参数，使得灵芝培养过程中的代谢产物发生一定程度的改变，目前灵芝液态深层发酵技术的研究工作主要是在菌株的筛选、培养基成分和发酵条件的优化以及提取分离等方面，这些研究使得灵芝发酵技术逐渐趋于系统化。
前期研究表明，在灵芝发酵过程中，培养基中不同的营养物质会在一定程度上影响到灵芝多糖的合成。而碳源与氮源作为两类菌体生长过程中必要的能源物质，对于发酵过程中灵芝多糖的影响不仅表现在产量上，更会影响到灵芝多糖的结构以及生物活性等方面。本发明在前期比较筛选的基础上，确定了灵芝发酵生产胞外活性多糖的培养基配方，并获得了活性多糖的制备方法，确定了多糖通过与Dectin-1受体结合激活NF-κB途径来增强机体免疫活性的用途，为发酵法生产灵芝活性多糖的应用和开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备及其增强免疫用途，获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF-κB的活性，所得多糖具有很好的增强免疫活性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备，包括以下步骤：
步骤一：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7天进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取约3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10天得一级种子液；
步骤二：按照10％的接种量接入二级培养基中，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入不同培养基配方的培养液中，在摇床上培养7-10d，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃后结束发酵；
步骤三：收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下高速离心，收集胞外液，向其中加入95％的乙醇使其终浓度为20-30％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心8000-10000r/min后弃去上清，沉淀部分以20-30％乙醇洗涤1-2次，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到灵芝胞外多糖；
步骤四：取2mg的发酵胞外液20％醇沉多糖20E组分，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h，采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成。
进一步地，针对步骤S1中，平板PDA培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
进一步地，针对步骤S2中，二级种子液培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
进一步地，针对步骤S3中，不同培养基包括分别接种到以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、鼠李糖为碳源，以酵母粉或酵母膏为氮源的液体发酵培养基。
本发明提供另一技术方案，灵芝液体发酵胞外活性多糖的增强免疫用途，包括以下步骤：
S1：胞外液20E多糖组分样品制备：将得到的20E组分配制成2mg/mL的悬浮液，进行均质粉碎处理，所得样品液在121℃条件下灭菌30min。
S2：试剂配制：
S21：生长培养基：DMEM(4.5g/L葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺)，10％(v/v)胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100μg/mL的Normocin(细菌、真菌、支原体多效抗生素)。
S22：选择培养基：取50mL完全培养基，加入200μL HEK-Blue CLR Selection(HEK蓝细胞和小细胞维持用抗生素)，4℃条件下保存。
S23：检测培养基：将HEK-Blue Detection溶于50mL无菌水，4℃避光条件下保存。
S3：细胞培养：用DMEM完全培养基培养HEK-Blue hDectin-1b细胞株，两代后在选择培养基中进行培养，培养箱条件均为5％CO2、37℃和饱和湿度。
S4：测定方法：取对数生长期的HEK-Blue hDectin-1b细胞，用检测培养基调节其细胞密度为3×105个/mL，在96孔板中每孔加入180μL的细胞悬液和20μL不同样品液，以无菌水为阴性对照，终浓度为100μg/mL的葡聚糖标准品(SG)为阳性对照，样品终浓度为200μg/mL，每个样品设置三个重复。置于培养箱中培养24h，用酶标仪在630nm波长处测定其吸光度值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备方法及其增强免疫用途，先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，再按10％接种量接种液体培养基上，分别接种到以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等为碳源，以酵母粉或酵母膏为氮源的液体发酵培养基中培养，加入乙醇使其终浓度为20-30％，收集沉淀并经20-30％乙醇洗涤2-3次后进行干燥，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。结果显示经过此方法获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF-κB的活性，所得多糖具有很好的增强免疫活性。
附图说明
图1为本发明的优化前后单糖组成分离效果对比图；
图2为本发明的以酵母粉为氮源时不同碳源培养所得20E多糖组分激活NF-κB活性比较与阴性对照组相比较；
图3为本发明的以酵母膏为氮源时不同碳源培养所得20E多糖组分激活NF-κB活性测定与阴性对照组相比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚；完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备，其中斜面培养基：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得。
种子培养基的配方：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
发酵培养基的配方：
配方1：葡萄糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
配方2：半乳糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
配方3：果糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
配方4：甘露糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
配方5：木糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
配方6：鼠李糖20-30g/L，酵母粉或酵母膏2-4g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
实施例一：
步骤一：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，平板PDA培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然，在25-30℃培养箱中培养5-7天进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取约3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10天得一级种子液；
步骤二：按照10％的接种量接入二级培养基中，二级种子液培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入不同培养基配方的培养液中，在摇床上培养7-10d，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃后结束发酵；
步骤三：收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下高速离心，收集胞外液，向其中加入95％的乙醇使其终浓度为20-30％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心8000-10000r/min后弃去上清，沉淀部分以20-30％乙醇洗涤1-2次，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到灵芝胞外多糖；
步骤四：取2mg的发酵胞外液20％醇沉多糖20E组分，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h，采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成。
灵芝胞外多糖的特征检测：灵芝胞外多糖的得率为1.1-2.5g/L，经苯酚-硫酸法检测其多糖含量为50-80％之间，高效阴离子交换色谱分析其单糖组成主要包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖等，比例随培养基的不同会有所变化。
高效阴离子交换色谱分析条件优化：以半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸为混标，混标中各种标准品的浓度均为5、10、15、20、25μmol/L，根据各单糖在相应浓度下检测所得峰面积与对应浓度做标准曲线，用于计算样品中单糖的摩尔百分比。
采用ICS5000高效阴离子交换色谱，上样量：25μL；流速为0.40mL/min；色谱柱：预处理柱CarboPacTM PA20 Guard(3mm×30mm)，分析柱CarboPacTM PA20 Analytical(3mm×150mm)；温度：30℃；检测器：脉冲安培检测器；流动相：A相：去离子水；B相：50mmol/L NaOH；C相：1mol/L NaAc。
请参阅图1，通过优化流动相A(超纯水)及B相(50mmol/L NaOH)的比例，确定了梯度洗脱程序使得8种单糖在PA20分析柱上得到较好分离，后期加入C相(1mol/L NaAc)使得2种糖醛酸能够达到较好分离，从而对多糖中的单糖和糖醛酸组成进行测定。优化后的分析条件如表1梯度洗脱设定。
表1流动相梯度洗脱比例
Figure GDA0003911162900000071
灵芝胞外多糖活性检测：HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。结果显示经过此方法获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF-κB的活性。
本发明提供另一技术方案，灵芝液体发酵胞外活性多糖的增强免疫用途，包括以下步骤：
步骤一：胞外液20E多糖组分样品制备：将得到的20E组分配制成2mg/mL的悬浮液，进行均质粉碎处理，所得样品液在121℃条件下灭菌30min。
步骤二：试剂配制：
第一节：生长培养基：DMEM(4.5g/L葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺)，10％(v/v)胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100μg/mL的Normocin。
第二节：选择培养基：取50mL完全培养基，加入200μL HEK-Blue CLR Selection，4℃条件下保存。
第三节：检测培养基：将HEK-Blue Detection溶于50mL无菌水，4℃避光条件下保存。
步骤三：细胞培养：用DMEM完全培养基培养HEK-Blue hDectin-1b细胞株，两代后在选择培养基中进行培养，培养箱条件均为5％CO2、37℃和饱和湿度。
步骤四：测定方法：取对数生长期的HEK-Blue hDectin-1b细胞，用检测培养基调节其细胞密度为3×105个/mL，在96孔板中每孔加入180μL的细胞悬液和20μL不同样品液，以无菌水为阴性对照，终浓度为100μg/mL的葡聚糖标准品(SG)为阳性对照，样品终浓度为200μg/mL，每个样品设置三个重复，置于培养箱中培养24h，用酶标仪在630nm波长处测定其吸光度值。
多糖组分的得率及多糖含量和单糖组成分析：
以葡萄糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为2.43g/L，该组分的多糖含量为75.63％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(87.54％)、木糖(3.22％)、甘露糖(9.25％)；
以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为2.12g/L，该组分多糖含量为81.37％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(85.76％)、木糖(6.19％)、甘露糖(6.69％)。
实施例2：
将种子液接种到发酵培养基配方2中培养，按实施例1中的方法收集胞外液进行醇沉处理得到大分子量多糖组分20E。
以半乳糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为1.52g/L，该组分的多糖含量为70.53％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(56.16％)、木糖(2.78％)、甘露糖(7.54％)、半乳糖(33.53％)；
以半乳糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为1.88g/L，该组分多糖含量为66.84％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(13.12％)、木糖(2.93％)、甘露糖(2.98％)、半乳糖(80.97％)。
实施例3：
将种子液接种到发酵培养基配方3中培养，按实施例1中的方法收集胞外液进行醇沉处理得到大分子量多糖组分20E。
以果糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为1.82g/L，该组分的多糖含量为73.85％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(81.45％)、木糖(3.19％)、甘露糖(9.65％)；
以果糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为1.97g/L，该组分多糖含量为71.24％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(13.59％)、木糖(0.98％)、甘露糖(2.31％)、果糖(79.55％)、半乳糖(3.57％)。
实施例4：
将种子液接种到发酵培养基配方4中培养，按实施例1中的方法收集胞外液进行醇沉处理得到大分子量多糖组分20E。
以甘露糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为1.14g/L，该组分的多糖含量为67.10％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(49.78％)、木糖(2.82％)、甘露糖(47.40％)；
以甘露糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为1.89g/L，该组分多糖含量为55.36％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(17.96％)、木糖(5.44％)、甘露糖(73.80％)、半乳糖(2.80％)。
实施例5：
将种子液接种到发酵培养基配方5中培养，按实施例1中的方法收集胞外液进行醇沉处理得到大分子量多糖组分20E。
以木糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为1.54g/L，该组分的多糖含量为78.74％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(56.08％)、木糖(39.91％)、甘露糖(4.01％)；
以木糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为1.46g/L，该组分多糖含量为69.53％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(34.59％)、木糖(64.58％)、半乳糖(0.83％)。
实施例6：
将种子液接种到发酵培养基配方6中培养，按实施例1中的方法收集胞外液进行醇沉处理得到大分子量多糖组分20E。
以鼠李糖为碳源，以酵母粉为氮源所得20E组分的得率为1.32g/L，该组分的多糖含量为55.89％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(37.67％)、木糖(21.62％)、甘露糖(18.82％)、鼠李糖(11.01％)、半乳糖(8.17％)、阿拉伯糖(2.71％)；
以鼠李糖为碳源，以酵母膏为氮源所得20E组分的得率为1.24g/L，该组分多糖含量为61.48％，其单糖组成及摩尔百分比为葡萄糖(48.88％)、木糖(8.52％)、甘露糖(12.87％)、鼠李糖(25.81％)、半乳糖(3.92％)。
实施例7：
不同培养基配方所得胞外多糖20E组分激活NF-κB活性比较：
请参阅图2，HEK-Blue hDectin-1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性，以酵母粉为氮源时不同碳源培养所得20E多糖组分激活NF-κB活性结果显示：以木糖和鼠李糖为碳源进行发酵培养后，胞外液中的20E多糖组分没有检测出活性，而其他组分均有不同程度的激活NF-κB的活性，其中，以果糖和葡萄糖为碳源时，其活性最强。
请参阅图3，以酵母膏为氮源时不同碳源培养所得20E多糖组分激活NF-κB活性结果显示，以木糖和鼠李糖为碳源进行发酵培养后，胞外液中的20E多糖组分没有检测出活性，而其他组分均有不同程度的激活NF-κB的活性的能力其中，以半乳糖和葡萄糖为碳源时，其活性最强。
综上所述，本灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备方法及其增强免疫用途，先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7天进行活化；然后进行摇瓶液体发酵培养7-10天得一级种子液，温度25-30℃，转速100-200rpm；再按10％接种量接种液体培养基上，以相同条件培养获得二级种子液，分别接种到以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等为碳源，以酵母粉或酵母膏为氮源的液体发酵培养基中培养7-10天，离心收集胞外液，加入乙醇使其终浓度为20-30％，收集沉淀并经20-30％乙醇洗涤2-3次后进行干燥，用QUANTI-Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin-1途径激活NF-κB的活性。结果显示经过此方法获得的灵芝发酵胞外多糖均具有激活NF-κB的活性，所得多糖具有很好的增强免疫活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备，其特征在于，包括以下步骤：
S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25-30℃培养箱中培养5-7天进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取约3-6mm2大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7-10天得一级种子液；
S2：按照10％的接种量接入二级培养基中，培养7-10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入不同培养基配方的培养液中，在摇床上培养7-10d，转速控制在100-200rpm/min，温度为25-30℃后结束发酵，其中，不同培养基配方包括：以酵母粉为氮源，以果糖为碳源；或者以酵母膏为氮源，以半乳糖为碳源；
S3：收集发酵液在6000-8000r/min转速条件下高速离心，收集胞外液，向其中加入95％的乙醇使其终浓度为20-30％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6-12h，再经高速离心8000-10000r/min后弃去上清，沉淀部分以20-30％乙醇洗涤1-2次，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到灵芝胞外多糖；
S4：取2mg的发酵胞外液20％醇沉多糖20E组分，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)，在110℃下油浴4h，采用氮吹仪吹干TFA，然后加入3mL甲醇继续吹干，重复以上操作4-5次，直到完全除去TFA，用去离子水溶解定容至50mL容量瓶，高效阴离子交换色谱法测定水解产物中的单糖组成。
2.根据权利要求1所述的灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备，其特征在于，针对步骤S1中，平板PDA培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
3.根据权利要求1所述的灵芝液体发酵胞外活性多糖的制备，其特征在于，针对步骤S2中，二级种子液培养基是：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，pH自然。
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