CN115074406B - 一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于灵芝发酵技术领域，具体涉及一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法和应用。本发明提供了一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法，通过控制液态深层发酵的培养基组分、发酵时间和接种量，解决灵芝液态发酵胞外液多糖易析出和难复溶的问题；同时，本发明所述发酵方法具有培养成本低、发酵周期短和发酵得率高的特点，发酵液中富含灵芝多糖和β‑葡聚糖，具有保湿、抗氧化和促进受损细胞修复的功效，在化妆品中的应用价值得到进一步提高。

Description

一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法和应用

技术领域

本发明属于灵芝发酵技术领域，具体涉及一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法和应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma spp.)是我国著名的药用真菌，因富含多糖、三萜、核苷、蛋白等多种活性物质，具有很高的医疗保健价值，在保健食品和药品领域应用广泛。近些年的研究表明，灵芝也具有良好的美容功效，随着人们对绿色、安全化妆品的追求，加之中药护肤理念的发展，灵芝因其独特的功效，在化妆品领域的开发应用也已逐步开展。灵芝拥有多种活性成分，可从多角度进行养肤护肤，绿色安全，开发前景可观。目前市场上的灵芝化妆品添加形式均为提取物，技术单一，且成本较高。因此寻找高效且成本较低的灵芝活性物质生产方法，才能促进灵芝在美容护肤及化妆品领域的大量应用。

然而，灵芝中的化学成分复杂，目前获得灵芝有效成分的方法主要有人工栽培和液体深层发酵法。传统的灵芝栽培方式生产效率低，生产周期长，容易受到环境的影响，而且不同批次灵芝中的活性成分含量也有较大差别；而液体深层发酵技术因具有原料来源广、生产周期短、产量大、产品质量稳定等特点而备受关注，现阶段已成为了获取灵芝活性物质最高效的手段之一。然而，目前灵芝液态深层发酵技术的发展并不完善，且具有较大的开发利用空间。

目前灵芝液态深层发酵技术的研究工作主要是在菌株的筛选、培养基成分和发酵条件的优化以及提取分离等方面，在灵芝发酵液的生产过程中，随着发酵时间的延长，胞外多糖得到大量积累，但是因胞外多糖分子量较大，含量较高时则会出现絮凝且难以复溶等问题，严重影响了其在化妆品无水配方生产中的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法和应用，采用本发明提供的发酵方法可以解决灵芝液态深层发酵胞外液中多糖易析出和难复溶的问题，进而提高其在化妆品中的应用价值。

本发明提供了一种提高灵芝液态深层发酵胞外液稳定性的发酵方法，包括如下步骤：将灵芝种子液于发酵培养基中液态深层发酵36～48h，得到灵芝液态深层发酵胞外液；

所述发酵培养基包括如下组分：无水葡萄糖4～5g/L、酵母粉0.5～1g/L和磷酸二氢钾0.3～0.4g/L；

所述灵芝种子液的接种量为发酵培养基体积的5～10％。

优选的，所述液态深层发酵为有氧发酵，在发酵过程中，通气量为0.8～1.0vvm，转速为80～120rpm。

优选的，将灵芝菌株经活化、一级种子液培养和二级种子液扩繁，得到所述灵芝种子液。

优选的，所述一级种子液培养和二级种子液扩繁的培养基均为种子液培养基，所述种子液培养基包括如下组分：无水葡萄糖20～30g/L、酵母粉2～4g/L、磷酸二氢钾1.5～2g/L和七水合硫酸镁1.5～2g/L。

优选的，所述一级种子液培养和二级种子液扩繁的培养温度均为25～28℃，转速均为80～120rpm，培养周期均为5～7天。

优选的，所述一级种子液培养过程中，接种量为每100mL种子液培养基中接种3～4块活化的灵芝菌株，每块活化的灵芝菌株的直径为3～5mm；

所述二级种子液扩繁过程中，一级种子液的接种量为种子液培养基体积的5～10％。

本发明还提供了上述发酵方法得到的灵芝液态深层发酵胞外液，所述灵芝液态深层发酵胞外液中灵芝多糖含量为0.3～0.5g/L，β-葡聚糖含量为0.1～0.12g/L。

本发明还提供了上述技术方案提供的灵芝液态深层发酵胞外液在化妆品中的应用。

优选的，所述化妆品包括具备保湿、美白和修复中的任意一种或多种功效的化妆品。

优选的，所述应用包括以所述灵芝液态深层发酵胞外液代替水做溶剂。

有益效果：

本发明提供了一种灵芝液态深层发酵胞外液及其发酵方法，通过控制液态深层发酵的发酵培养基的组分、发酵时间和接种量，解决灵芝液态发酵胞外液多糖易析出和难复溶的问题；

同时，本发明所述发酵方法具有培养成本低，发酵周期短和发酵得率高的特点，发酵液中富含灵芝多糖和β-葡聚糖，具有保湿、抗氧化和促进受损细胞修复的功效，在化妆品中的应用价值得到进一步提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液冷冻复溶前、后稳定性对比图；

图2为对比例1中灵芝液态深层发酵胞外液冷冻复溶前、后稳定性对比图；

图3为实施例2中灵芝液态深层发酵胞外液的外观图；

图4为应用例4中灵芝液态深层发酵胞外液多糖测定标准曲线图；

图5为应用例7中灵芝液态深层发酵胞外液保湿率变化图；

图6为应用例12灵芝液态深层发酵胞外液化妆水的稳定性实验图，其中从左到右依次为在40℃下耐热测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液化妆水，-8℃下耐寒测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液化妆水，离心处理测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液化妆水以及高温低温贮存下的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液化妆水；

图7为应用例13灵芝液态深层发酵胞外液乳液的稳定性实验图，其中从左到右依次为在40℃下耐热测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液乳液，-8℃下耐寒测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液乳液，离心处理测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液乳液以及高温低温贮存下的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液乳液；

图8为应用例14灵芝液态深层发酵胞外液膏霜的稳定性实验图，其中从左到右依次为在40℃下耐热测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液膏霜，-8℃下耐寒测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液膏霜，离心处理测定的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液膏霜以及高温低温贮存下的空白样品和灵芝液态深层发酵胞外液膏霜。

具体实施方式

本发明提供了一种提高灵芝液态深层发酵胞外液稳定性的发酵方法，包括如下步骤：将灵芝种子液于发酵培养基中液态深层发酵36～48h，得到灵芝液态深层发酵胞外液；所述发酵培养基包括如下组分：无水葡萄糖4～5g/L、酵母粉0.5～1g/L和磷酸二氢钾0.3～0.4g/L；所述灵芝种子液的接种量为发酵培养基体积的5～10％。

本发明在将所述灵芝种子液进行液态深层发酵前，优选还包括制备灵芝种子液。本发明所述灵芝种子液的制备方法优选包括将灵芝菌株经活化、一级种子液培养和二级种子液扩繁，得到所述灵芝种子液。

本发明优选对灵芝进行活化，得到活化的灵芝菌株。本发明所述活化方法优选包括将灵芝菌株于固体培养基上活化培养，得到活化的灵芝菌株。本发明所述灵芝菌株优选包括赤芝(Ganoderma lucidum)。本发明对所述赤芝的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可，如在实施例以G0160为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述赤芝由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供。本发明优选将所述灵芝菌株切成小块后进行活化，所述小块的直径优选为3～5mm。本发明所述活化培养的接种量优选为1块灵芝菌株。本发明所述固体培养基优选为PDA培养基，每25mL固体培养基接种1块灵芝菌株。本发明对所述PDA培养基的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售PDA培养基即可。本发明所述活化培养的温度优选为25～28℃，更优选为26℃；所述活化培养的时间优选为5～7d，更优选为7d。

得到所述活化的灵芝菌株后，本发明优选将所述活化的灵芝菌株进行一级种子液培养，得到一级种子液。本发明所述一级种子液培养的培养基优选为种子液培养基，所述种子液培养基的组分优选包括无水葡萄糖20～30g/L、酵母粉2～4g/L、磷酸二氢钾1.5～2g/L和七水合硫酸镁1.5～2g/L，更优选包括无水葡萄糖30g/L、酵母粉3g/L、磷酸二氢钾1.5g/L和七水合硫酸镁1.5g/L。本发明所述一级种子液培养的培养温度优选为25～28℃，更优选为26℃。本发明优选采用振荡培养；所述振荡培养的转速优选为150～180rpm，更优选为150rpm；所述培养时间优选为5～7天，更优选为7天。本发明在所述一级种子液培养过程中，接种量优选为每100mL种子液培养基中优选接种3～4块所述活化的灵芝菌株，更优选为4块；每块活化的灵芝菌株的直径优选为3～5mm，更优选如黄豆大小。

得到所述一级种子液后，本发明优选将所述一级种子液进行二级种子液扩繁，得到所述灵芝种子液。本发明所述二级种子液扩繁的培养基、培养温度、转速和培养周期均与所述一级种子液培养条件范围相同，在此不再进行赘述。本发明在所述二级种子液扩繁过程中，所述一级种子液的接种量优选为种子液培养基体积的5～10％，更优选为10％。

得到所述灵芝种子液后，本发明将所述灵芝种子液于发酵培养基中液态深层发酵36～48h，得到灵芝发酵产物。本发明所述发酵培养基的组分优选包括无水葡萄糖4～5g/L、酵母粉0.5～1g/L和磷酸二氢钾0.3～0.4g/L，更优选包括无水葡萄糖4g/L、酵母粉0.5g/L和磷酸二氢钾0.3g/L。本发明所述灵芝种子液的接种量为发酵培养基体积的5～10％，更优选为10％。本发明所述液态深层发酵优选为有氧发酵，在发酵过程中，通气量优选为0.8～1.0vvm，更优选为0.8vvm。本发明所述液态深层发酵优选为振荡培养，所述振荡培养的转速优选为80～120rpm，更优选为90～115rpm，进一步优选为110rpm。本发明所述液态深层发酵的时间优选为36～48h，更优选为36h。本发明所述液态深层发酵优选在发酵罐中进行，本发明对所述发酵罐的规格和型号没有特殊限定，采用本领域常规发酵罐即可。本发明所述液态深层发酵过程中，所述发酵培养基的装液量优选为发酵罐体积的65～80％。

得到所述灵芝发酵产物后，本发明优选将所述灵芝发酵产物进行离心，过滤，收集滤液，即得到灵芝液态深层发酵胞外液。本发明所述离心的转速优选为6000～8000rpm，更优选为8000rpm；所述离心的时间优选为15～20min，更优选为20min。本发明优选采用滤布进行所述过滤，以分离菌丝，收集滤液。本发明所述滤布的粒径优选为100～200目，更优选为200目。本发明优选还包括对得到的灵芝液态深层发酵胞外液进行杀菌，所述杀菌的温度优选为100～121℃，更优选为121℃，所述杀菌的时间为20～30min，更优选为30min。

本发明还提供了上述发酵方法得到灵芝液态深层发酵胞外液，所述灵芝液态深层发酵胞外液中灵芝多糖含量为0.3～0.5g/L，β-葡聚糖含量为0.1～0.12g/L。采用本发明发酵方法得到的灵芝液态深层发酵胞外液中多糖含量适中，胞外液稳定性较高，解决了现有的灵芝胞外液因胞外多糖含量较高而出现絮凝难复溶的问题，提高了其在无水配方化妆品生产中的稳定性。

本发明还提供了上述技术方案提供的灵芝液态深层发酵胞外液在化妆品中的应用。本发明所述化妆品优选包括具备保湿、美白和修复中的任意一种或多种功效的化妆品。本发明所述应用优选包括以所述灵芝液态深层发酵胞外液代替水做溶剂。本发明所述灵芝液态深层发酵胞外液保湿效果明显，且具有显著的抗氧化效果，其过氧化氢清除率为90～91％，超氧阴离子清除率为82％～84％；同时其具有一定的美白效果，对酪氨酸酶的抑制率为87.67～90.34％；细胞损伤修复效果较好，24h的细胞修复率为67.10～70.60％；另外，所述灵芝液态深层发酵胞外液对细菌具有一定的抑制效果且安全性好。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

灵芝液态深层发酵胞外液的发酵方法，步骤如下：

菌种活化：取灵芝菌株G0160于超净工作台上，使用无菌接种铲将菌斜面切成小块，取1块接种于平板培养皿上中进行活化培养，培养皿中装有25mL PDA固体培养基，培养温度为26℃，培养时间为7d。

灵芝种子液培养：将活化后的灵芝菌株切割成3～5块，然后接种于100mL液体培养基(无水葡萄糖20～30g/L、酵母粉2～4g/L、磷酸二氢钾1.5～2g/L和七水合硫酸镁1.5～2g/L)中，在培养温度为26℃、搅拌转速为150rpm的条件下培养7d，得到灵芝种子液。灵芝种子液以10％接种量接种，按照一级种子液的培养条件进行二级种子液扩繁，得到灵芝种子液进行深层发酵培养。

灵芝深层发酵培养：将灵芝种子液接种到发酵培养基(无水葡萄糖为4g/L、酵母粉为0.5g/L、磷酸二氢钾为0.3g/L)中，接种量为发酵培养基体积10％，温度25～28℃，通气量为0.8vvm，搅拌转速为110rpm的条件下深层发酵36h，得到灵芝深层发酵产物。

灵芝液态深层发酵胞外液的获得：将上述灵芝深层发酵产物，在转速为8000rpm的条件下离心20min，再经200目滤布过滤得到上清液即为灵芝液态深层发酵胞外液。

实施例2

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为48h。

实施例3

采用实施例2中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的接种量为发酵培养基体积5％。

对比例1

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为72h。

对比例2

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为78h。

对比例3

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为96h。

对比例4

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为120h。

对比例5

采用实施例1中的发酵方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，在灵芝深层发酵培养中的发酵时间为144h。

对比例6

采用实施例1中的制备方法制备灵芝液态深层发酵胞外液，区别在于，采用文献报道的灵芝发酵高产胞外多糖培养基配方制备得到灵芝发酵液，具体方法为：灵芝种子液培养方法同实施例1，发酵培养基配方为：无水葡萄糖30g/L、酵母粉3g/L、磷酸二氢钾2g/L和七水合硫酸镁2g/L。

应用例1

将实施例1中得到的灵芝液态深层发酵液与对比例6中制备得到的灵芝发酵液的稳定性进行比较，具体方法为将发酵液放入-18℃冷冻24小时后拿出置于室温，待冰全部融化后混匀拍照对比，结果分别如图1(左侧为实施例1冷冻前的灵芝液态深层发酵胞外液，右侧为冷冻复溶后的灵芝液态深层发酵胞外液)和图2(左侧为对比例6冷冻前的灵芝发酵液，右侧为冷冻复溶后的灵芝发酵液)所示。

由图1和图2可知，本发明实施例1中制备得到的灵芝液态深层发酵液经过冷冻和复溶后依然澄清透明，并未出现明显的絮状沉淀物；而对比例6中的灵芝发酵液在冷冻复溶后出现明显絮状沉淀物。由此说明，采用本发明提供的制备方法得到的灵芝液态深层发酵胞外液的性质更加稳定。

应用例2

测定实施例1～2及对比例1～5中得到的灵芝液态深层发酵胞外液的含量和回收率(回收率即灵芝液态深层发酵胞外液体积占发酵液(发酵培养基和接种的种子液的总体积)体积的比例)进行测定，结果如表1所示：

表1实施例1～2及对比例1～5中灵芝液态深层发酵胞外液的得率

由表1可知看出，实施例1～3中发酵方法的灵芝液态深层发酵胞外液的回收率显著高于对比例1～6中的回收率。

应用例3

1)对实施例1～2中得到的灵芝液态深层发酵胞外液和蒸馏水的粘度进行检测，检测方法为：采用RVA-TM快速粘度计，取25mL样品，25℃，600r/min条件下持续3min。

结果实施例1和实施例2中灵芝液态深层发酵胞外液的粘度分别为34cP和38cP，蒸馏水的粘度为30cP，由此可见实施例1～2中得到的灵芝液态深层发酵胞外液的粘度较蒸馏水中的粘度更高，而此粘度条件下，结合应用例1中的技术效果可知，本申请实施例1～2中的灵芝液态深层发酵胞外液发酵胞外液的稳定性较好，肤感较好。

2)观察实施例2中制备得到的灵芝液态深层发酵胞外液的外观状态，结果如图3所示。

由图3可以看出，实施例2中得到的灵芝液态深层发酵胞外液为无色至淡黄色透明液体，结合步骤1)中的结果可知，此发酵胞外液具有一定的粘度，状态较好。

应用例4

对实施例1～3中的灵芝胞外多糖的含量和β-葡聚糖的含量进行测定，测定方法如下：

1)灵芝液态深层发酵胞外液中多糖含量参考苯酚硫酸法对灵芝胞外液样品进行测定。

标准曲线的建立：配置5％的苯酚溶液、浓硫酸、0.1mg/mL葡萄糖标准溶液。分别取标准品溶液(标准品浓度为0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg/mL)1mL于长试管中，分别加5％的苯酚溶液、2.5mL浓硫酸，混匀，置于100℃水浴15min，取出，冷却至室温，取200μL于酶标板中，490nm下测定吸光度(OD值)，做出标准曲线，标准曲线如图4所示。

取样品测定液1mL于长试管中，分别5％的苯酚溶液、2.5mL浓硫酸，混匀，置于100℃水浴15min，取出，冷却至室温，取200μL于酶标板中，490nm下测定吸光度。

计算样品灵芝胞外液多糖的含量，测得实施例1、实施例2和实施例3中灵芝发酵胞外液的灵芝多糖含量分别0.3g/L、0.5g/L和0.3g/L。

2)β-葡聚糖的含量参考酵母和蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒(K-YBGL/100次)测得。

A.测定葡聚糖总量(α-葡聚糖+β-葡聚糖+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖)

a.总葡聚糖(α-葡聚糖+β-葡聚糖)+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖的溶解和部分水解

1.量取0.7mL原液到50mL离心管中。

2.向每个管中加入1.3mL冰的浓硫酸，盖上盖子，用涡旋仪混合器强力混匀。放置在冰水浴中2h，在这期间，每隔10-15分钟混匀一次。

3.向每个管中加入4mL水，盖上盖子，涡旋10s。然后加入6mL的水，盖上盖子，涡旋10s。

4.将盖子拧松，置于100℃沸水浴中5min之后，拧紧盖子，继续孵育2h。

5.将反应管冷却至室温，小心松开盖子。

6.转移每管中的内容物至100mL容量瓶，用200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)漂洗试管。

7.加入6mL的8M NaOH溶液到容量瓶中，用200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容，混匀。

8.取1.5mL于2mL离心管中离心，13000rpm，5min，上清液即为测定液。

b.总葡聚糖+寡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖和游离D-葡萄糖的测定

1.取测定液0.1mL加至玻璃试管(16×100mm)底部，每个样品(样品、质控物)/标准品/空白对照做3-4个平行样。

2.取0.1mL溶于200mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中的1,3-β-葡聚糖外切酶(20U/mL)和β-葡糖苷酶(4U/mL)，至每一个试管底部，涡旋混匀，40℃孵育1h。

3.每管加GOPOD试剂3.0mL，40℃孵育20min。

4.510nm下测定吸光度值。

B.α-葡聚糖(植物糖原和淀粉)和蔗糖中的D-葡萄糖及游离D-葡萄糖的测定

α-葡聚糖和蔗糖中的D-葡萄糖及游离D-葡萄糖的溶解，水解和测定

1.量取原液2mL，在冰浴或水浴中加入到称有0.136gNaOH的50mL离心管中。

2.再向每个试管中加入磁力转子，在冰浴或水浴状态下搅拌20min，置重悬浮絮状物。

3.向每个试管中加入8mL1.2M的醋酸钠缓冲液(pH3.8)，混匀。立即加入0.2mL淀粉葡糖苷酶(1630U/mL)加转化酶(500U/mL)，混匀，并放入40℃水浴孵育。

4.40℃孵育30min，期间用涡旋器间歇混匀。

5.对于α-葡聚糖含量>10％的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶，并定容至100mL，混匀。以单位体积离心溶液，13000rpm，10min或用Whatman NO.1滤纸过滤(9cm)。

6.对于α-葡聚糖含量<10％的样品，直接离心13000rpm，10min(无需稀释)。对于这些的样品，试管里的最终体积大约为10.3mL(体积可能会变化，样品类型不同，体积可能会稍稍变化)，在计算公式内，要注意及时变化。

7.取0.1mL稀释的或非稀释的上清液(样品、质控物)、0.1mL标准品、0.1mL醋酸钠缓冲溶液至玻璃试管(16×100mm)，每个样品做3-4个平行。

8.取0.1mL醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)+3.0mLGOPOD试剂，至每一个试管底部，涡旋混匀，40℃孵育20分钟。

9.510nm下测定所有管中的吸光度值。

计算公式如下：

总葡聚糖含量(％)＝ΔE×F×90/W

α-葡聚糖含量(％)＝ΔE×F×9.27/W

β-葡聚糖含量(％)＝总葡聚糖含量-α-葡聚糖含量

其中：

ΔE：反应吸光光度值减去空白试剂的吸光光度值

F：吸光光度值转换为葡萄糖(μg)的因子＝100/100μg D-葡萄糖在510nm下的吸光光度值

W：样品重量mg

计算得到实施例1、实施例2和实施例3中灵芝深层液态发酵胞外液中β-葡聚糖含量分别为0.1g/L、0.12g/L和0.1g/L。

应用例5

对实施例1～3及对比例1～6中的灵芝深层液态发酵胞外液对细胞的毒性进行检测，具体方法如下：

取对数生长期的B16-F10细胞，消化并收集细胞，用完全培养基制备成浓度为2×10⁴个/mL的细胞悬浮液。接种至96孔板，每孔200μL，贴壁后弃去原培养基，将200μL含不同稀释比例灵芝胞外液的完全培养基加入96孔板中，具体体积分数如表1所示。空白组用DMSO代替，72h后培养结束，每孔加入30μL的浓度为1％的AlamarBlue溶液反应4h，在570nm和600nm下分别检测其吸光度，并计算细胞增殖率。

细胞增殖率计算公式如下：

增殖率(％)＝[1-(OD₅₇₀(样品)×117216-OD₆₀₀(样品)×80586)/]OD₅₇₀(对照)×117216-OD₆₀₀(对照)×80586)]×100％。

结果如表2所示：

表2实施例1～3灵芝深层液态发酵胞外液的细胞毒性结果

根据表1可以看出，本发明提供的灵芝深层液态发酵胞外液对细胞的生长没有明显影响，与空白对照组没有明显差异，说明本发明提供的灵芝深层液态发酵胞外液对细胞没有明显的毒性，较为安全。同时，基于应用例2中的结果数据可知，对比例1～5中灵芝深层液态发酵胞外液的回收率较低，发酵时间延长，成本大幅增加，不适宜进行后续应用和制备试验；采用对比例6中发酵培养基制备得到的灵芝深层液态发酵胞外液不稳定，出现沉淀问题，其成本和品质均无法满足后续化妆品的应用和制备试验。

应用例6

利用斑贴试验对灵芝深层液态发酵液的安全性进行评价，具体方法如下：

受试物：实施例2的灵芝液态深层发酵胞外液(原液)，阴性对照：斑试器+滤纸片；

受试者：共30人，男15人，女15人；18～25岁符合受试者志愿入选标准。

斑试方法：斑试器(北京百亿怡达科技发开有限公司)，以封闭型斑贴试验方法，将受试物约0.020mL涂于斑试器小室中，外用专用胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24h后除去斑试器，如有剩余产品用纸巾轻轻擦去，分别于去除斑试器后0.5h，24h观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015)中皮肤反应分级标准记录其结果。

皮肤反应分级标准(参考《化妆品安全技术规范》(2015))，如表3，记录结果如表4所示。

表3皮肤反应分级标准

表4实施例2中灵芝液态深层发酵胞外液人体皮肤斑贴试验结果

由表4可以看出，实施例2中灵芝液态深层发酵胞外液在斑贴试验中，30例受试者均未产生不良反应。

应用例7

灵芝液态深层发酵胞外液保湿活性评价

根据QB/T 4256-2011，对实施例1中的灵芝液态深层发酵胞外液进行保湿评价。招募25名年龄为18～60岁的健康人群，在20℃～22℃温度下的40％～60％相对湿度下进行保湿性能的评价。测试前，对志愿者前臂内侧进行统一的清洗，并在测量区做好标记，每个区域面积为2cm×2cm，区域间间隔最少为1cm，在该环境下放松静坐30min，不能喝水和饮料。称取样品8.0mg，用乳胶指套均匀的涂抹在标记区域，使用CM825皮肤水分测试仪分别在涂抹前、涂抹后20min、50min、110min、170min、230min、290min和350min对皮肤含水量进行测定，本次测试由同一个人使用同一仪器完成，每次测量之前均进行探头的清洗，如志愿者皮肤出现不良反应，立刻停止测试进行医治，且对此进行记录，结果如表5和图5所示：

保湿率计算公式如下：

公式中：W₀为涂抹灵芝胞外液前皮肤的含水量；W_t为涂抹灵芝胞外液后t时间的皮肤含水量。

表5实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液的保湿率变化表

备注：表5中胞外液保湿率和基底保持率均为25名志愿者测定数据的平均值。

由表5和图5可以看出：

以未涂抹胞外液的皮肤为基底值，刚涂抹胞外液时保湿率大幅上升，随着时间的延长，涂抹胞外液的保湿率逐渐降低，而基底值的保湿率随着时间的增加逐渐增加，这可能是因为稳定时间较短，测试空间比外环境相对湿度大引起的，当涂抹150min左右，皮肤水分变化率逐渐趋于稳定，此时涂抹胞外液的保湿率在8.96左右，而未涂抹胞外液的基底值在6.00左右。实验结果表明，实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液具有较强的短期保湿能力。

应用例8

灵芝液态深层发酵胞外液体外抗氧化试验

过氧化氢(H₂O₂)清除能力检测：参考过氧化氢-鲁米诺体系测定灵芝胞外液对过氧化氢(H₂O₂)的清除能力，配置0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(pH＝9.5)与1mmol/L的鲁米诺溶液，并以17:1的体积比例配制成鲁米诺-碳酸盐发光液。测量时向发光池中先注入10μL的样品溶液(如表6所示，不同体积分数的灵芝液态深层发酵胞外液以水进行稀释得到)，后注入10μL 6％的过氧化氢溶液以及150μL的上述鲁米诺-碳酸盐发光液，反应1.5s，设置化学发光仪连续记录实验数据5s，得到发光峰值A₁，将超纯水代替样品得到发光峰值A₀。其中，化学发光体系的测定条件为：高压800V；光谱扫描范围180～800nm；测试温度25℃。

过氧化氢(H₂O₂)清除率计算公式如下：

式中：A₁为样品检测数据，A₀为空白对照检测数据。

结果如表6所示：

表6实施例1-2中灵芝液态深层发酵胞外液体外过氧化氢清除率的清除效果

超氧阴离子(O^2-)清除能力检测：参考邻苯三酚-鲁米诺体系测定灵芝胞外液对超氧阴离子(O^2-)清除活性。具体为配制0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(pH＝10)与1mmol/L的鲁米诺溶液，以2：1的比例配制成鲁米诺—碳酸盐发光液。测量时向发光池中注入10μL样品溶液，再注入10μL 6.25×10^-4mol/L的邻苯三酚和150μL的鲁米诺～碳酸盐缓冲液，反应2s，设置化学发光仪连续记录实验数据30s，得到发光峰值A1，将超纯水代替样品得到峰值A0。

清除率计算公式如下：

式中：A₁为样品检测数据，A₀为空白对照检测数据。

结果如表7所示：

表7实施例1-2中灵芝液态深层发酵胞外液体外超氧阴离子清除率的清除效果

由表6～7可以看出，实施例1和实施例2中灵芝液态深层发酵胞外液原液对超氧阴离子清除率分别为83.27％和88.66％，过氧化氢清除率分别为90.69％和97.57％，稀释至10％含量时，实施例1对超氧阴离子和过氧化氢的清除率分别达到40.81％和62.43％，实施例2对超氧阴离子和过氧化氢的清除率分别达到39.76％和70.91％。结果表明：灵芝液态深层发酵胞外液具有很好的清除自由基的抗氧化效果。

应用例9

灵芝液态深层发酵胞外液体外抑制酪氨酸酶活性

酪氨酸酶活性抑制实验

100U/mL酪氨酸酶配制：酪氨酸酶50000U/瓶，5mL的PBS溶解，在稀释100倍即为100U/mL的酪氨酸酶溶液。

5×10^-4g/mL多巴配制：称取50mg多巴于100mL容量瓶中，加100mL的PBS，超声溶解，避光。(该试剂现配现用)。

PBS配制：NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、KH₂PO₄0.24g/L、Na₂HPO₄1.44g/L。

实验过程：

样品管1mL样品(实施例1～3及对比例1～6)中的灵芝液态深层发酵胞外液，不同体积分数的样本以水稀释得到)加0.5mL酪氨酸酶、样品对照管1mL样品加0.5mLPBS、阴性对照1mlPBS加0.5mL酪氨酸酶、空白对照1mLPBS加0.5mLPBS，30℃水浴锅中反应10min，取出，继续向样品管、对照管、阴性对照、空白对照中加入1mL多巴试剂，置于30℃水浴锅中反应5min，取200μL到酶标板中，475nm测定。

抑制率计算公式如下：

抑制率(％)＝[1-(样品管-样品对照)/(阴性对照-空白对照)]×100

结果如表8所示：

表8实施例1-3中不同体积分数灵芝液态深层发酵胞外液对酪氨酸酶活性的抑制效果

由表8可以看出，实施例1中灵芝深层液态发酵胞外液及其稀释液对酪氨酸酶活性的抑制率均明显高于空白对照组(培养基)，且实施例1-3中灵芝深层液态发酵胞外液原液对酪氨酸酶抑制率分别为87.67％、90.43％和85.13％。证明灵芝深层液态发酵胞外液具有较好的美白效果。

应用例10

灵芝液态深层发酵胞外液对细胞损伤修复效果试验

运用划痕实验对实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液促进HSF细胞划痕愈合能力进行测定。用记号笔在24孔板背面画直线备用。取对数生长期的HSF细胞，消化并收集后用完全培养基稀释成1×10⁵个/mL的细胞悬液，每孔0.5mL接种至24孔板，培养至单层细胞状态，用20μL的枪头沿记号笔所画线的方向进行划痕，弃原培养基，并用PBS清洗3次，以便去除细胞残渣，加入含不同浓度的灵芝发酵液的饥饿培养基0.5mL，空白组用DMSO代替，每孔设置3个复孔，用酶标仪拍照并记录初始距离，记为H₀，于培养箱中培养24h后，分别于培养10、12、16、20和24h时拍照记录距离，记为H_n(n为对应拍照时的培养时间)，根据下面公式计算划痕愈合率。

划痕愈合率计算公式如下：

划痕愈合率(％)＝(H₀-H_n)/(H₀)×100％，结果如表9所示。

表9实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液对HSF细胞划痕修复愈合效果比较

由表9可以看出，在添加实施例1的灵芝液态深层发酵胞外液及其稀释液的细胞组中，不同时间点观察所得划痕愈合率均明显高于空白对照组，证明灵芝液态深层发酵胞外液对细胞具有明显的修复效果。

应用例11

灵芝液态深层发酵胞外液抑菌活性实验

菌种活化：分别用3mL灭菌的0.85％生理盐水洗刷己培养好的斜面表面上的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。然后把得到的菌悬液分别收集到己灭菌的试管中。添加适量无菌生理盐水将菌悬液浓度调至1.0×10⁸～1.0×10⁹cfu/mL

将配置好的培养基和包扎好的平板除96孔板外于灭菌锅中，121℃，灭菌20min。

1.在96孔板的第1和2列中加入50μL不添加苯氧乙醇的样品溶液，在第3和4列中加入50μL含有0.5％苯氧乙醇的样品溶液，在第5和6列加入50μL含有0.8％苯氧乙醇的样品溶液，在第7和8列加入50μL含有1.0％苯氧乙醇的样品溶液，每个样品溶液做三个平行。

2.在96孔板的第2，4，6，8列中加入50μL无菌水，2，4，6，8列作为样品对照以排除样品本身颜色对结果的影响。在第9列加入50μL无菌水，第9列作为阳性对照。在第10列加入100μL无菌水。第10列作为阴性对照。

3.在96孔板的单数列(第1，3，5，7，9列)中加50μL菌液(大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液或铜绿假单胞菌菌悬液中的任意一种)。每种菌各使用一整块酶标板。

4.在各孔中加入100μL培养基。

5.将加完液体的96孔板于摇床中培养，细菌在160RPM，37℃条件下培养24h。

用酶标仪在600nm下测出各孔的OD值后通过公式计算各浓度的样品的抑菌率。

抑菌率计算公式为：

抑制率＝((OD阳性-OD阴性)-(OD样品-OD样品对照))/(OD阳性-OD阴性)×100％

结果如表10所示。

表10实施例1中灵芝液态深层发酵胞外液复配苯氧乙醇对细菌的抑制效果

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由表10可以看出，本发明中实施例1中的灵芝液态深层发酵胞外液对大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌和铜绿假单胞菌均具有较好的抑制作用。

应用例12

灵芝液态深层发酵胞外液化妆水的制备及稳定性实验

化妆水的配方如表11所示。按各配方比例称量A相成分，边搅拌边分散均匀后，依次加入B相中的原料，等到B相中各组分分散均一后，此时再搅拌20-30mim至体系均一即可。

表11灵芝液态深层发酵胞外液化妆水配方

稳定性测试方法

1、耐热测试

将试样分别倒人2支ф20mm×120mm的试管内，使液面高度约80mm，塞上干净的塞子。把一支待验的试管置于预先调节至40℃的恒温培养箱内，经24h后取出，恢复至室温后与空白试管的试样进行目测比较。

2、耐寒测试

将试样分别倒入2支ф20mm×120mm的试管内，使液面高度约80mm，塞上干净的塞子。把一支待验的试管置于预先调节至-8℃的冰箱内，经24h后取出，恢复至室温后与空白试管的试样进行目测比较。

3、离心稳定性测试

在离心管中注入试样约2/3高度并装实，用塞子塞好。然后放入预先调节到38℃的电热恒温培养箱内，保持1h后，立即移人离心机中，并将离心机调整到2000r/min的离心速度，旋转30min取出观察。

4、高温低温贮存稳定性试验

将试样分别倒入2支ф20mm×120mm的试管内，使液面高度约80mm，塞上干净的塞子。把一支待验的试管置于预先调节至-8℃的冰箱内，经24h后取出，转移到40℃恒温箱中24h，取出稳定后与空白试管进行对比。

结果如图6所示：由图6可以看出，与空白样本对比，采用本发明灵芝液态深层发酵胞外液制备得到的化妆水在40℃、-8℃和离心条件下均未发生分层和破乳等体系改变的现象，采用灵芝液态深层发酵胞外液化妆水较为稳定。

应用例13

灵芝液态深层发酵胞外液乳液的制备及稳定性实验

乳液的配方如表12所示。按各配方比例称量A相中成分的并加入烧杯A中并置于90℃水浴中融化，留作备用，称取适量去离子水加入烧杯B中，将B相中的各组分按顺序分散于烧杯B的水相中，在90℃水浴中边搅拌边加热，当A、B两相达到90℃时，不停止B相的搅抖，将A中融化好的料液匀速加入B烧杯中，并维持搅拌分散5min，之后均质2min均质条件为10000rpm，均质结束后保持漫速搅拌，待体系温度降至55℃左右时将C相添入，此时继续搅拌20-30min，体系均匀罐装保存。

表12灵芝液态深层发酵胞外液乳液配方

稳定性测试方法

测试方法参照化妆水的稳定性测试方法。测试结果见图7与空白样本对比，采用本发明灵芝液态深层发酵胞外液制备得到的化妆水在40℃、-8℃和离心条件下均未发生分层和破乳等体系改变的现象，采用灵芝液态深层发酵胞外液乳液较为稳定。

应用例14

灵芝液态深层发酵胞外液膏霜的制备及稳定性实验

膏霜的配方如表13。按各配方比例称量A相中的成分并加入烧杯A中并置于90℃水浴中融化，留作备用，称取适量去离子水加入烧杯B中，将B相中的各组分按顺序分散于烧杯B的水相中，在90℃水浴中边搅拌边加热，当A、B两相达到90℃时，不停止B相的搅拌，将A中融化好的料液匀速加入B烧杯中，并维持搅拌分散5min，之后均质2min，均质条件为10000rpm，均质结束后保持慢速搅拌，待体系温度降至55℃左右时将C相添入，此时继续搅拌20-30min，体系均匀后罐装保存。

表13灵芝液态深层发酵胞外液膏霜配方

稳定性测试方法

测试方法参照化妆水的稳定性测试方法。测试结果见图8，由图8可以看出，与空白样本对比，采用本发明灵芝液态深层发酵胞外液制备得到的膏霜在40℃、-8℃和离心条件下均未发生分层和破乳等体系改变的现象，采用灵芝液态深层发酵胞外液膏霜较为稳定。

应用例14

安全性测试(人体皮肤斑贴试验)

采用封闭式斑贴试验，选取15名年龄为20-50岁之间的无皮肤病过敏史的健康受试者。取约15uL应用例11-13的样品滴于斑试器内，每个样品贴2个斑试器，将上述斑试器贴敷于受试者前臂曲侧，受试者在测试期间保持斑贴部位干燥，避免激烈运动、挠抓斑试部位、长时间日光照射等。分别测试0.5h、6h、12h、24h、48h的皮肤反应。皮肤不良反应分级标准如表14所示，各产品的安全性能测试结果如表15所示。

表14皮肤不良反应分级标准

表15化妆品人体皮肤斑贴试验结果

从表15人体斑贴试验结果可知，所有受试者通过斑贴试验。在0.5、6、12、48小时观察皮肤反应，所有受试者的皮肤反应均为阴性，说明本发明制备的化妆水，乳液和膏霜使用安全。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的发酵方法得到的灵芝液态深层发酵胞外液可以解决灵芝液态发酵胞外液多糖易析出和难复溶的问题；同时，本发明所述发酵方法具有培养成本低，发酵周期短和发酵得率高的特点，发酵液中富含灵芝多糖和β-葡聚糖，具有保湿、抗氧化和促进受损细胞修复的功效，在化妆品中的应用价值得到进一步提高。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种提高灵芝液态深层发酵胞外液稳定性和得率的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

将灵芝种子液于发酵培养基中液态深层发酵36~48h，得到灵芝液态深层发酵胞外液；

所述发酵培养基由如下组分：无水葡萄糖4~5g/L、酵母粉0.5~1g/L和磷酸二氢钾0.3~0.4g/L组成；

所述灵芝种子液的接种量为发酵培养基体积的5~10％；

所述液态深层发酵为有氧发酵，在发酵过程中，温度为25~28℃，通气量为0.8~1.0vvm，转速为80~120rpm；

所述灵芝种子液的制备包括：将灵芝菌株G0160经活化、一级种子液培养和二级种子液扩繁，得到所述灵芝种子液；

所述一级种子液培养和二级种子液扩繁的培养温度分别为25~28℃，转速分别为80~120rpm，培养周期分别为5~7天；

所述灵芝液态深层发酵胞外液中灵芝多糖含量为0.3~0.5g/L，β-葡聚糖含量为0.1~0.12g/L；

所述灵芝液态深层发酵胞外液的过氧化氢清除率为90~91％，超氧阴离子清除率为82％~84％；对酪氨酸酶的抑制率为87 .67%~90.34％；24h的细胞修复率为67.10%~70.60％。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述一级种子液培养和二级种子液扩繁的培养基均为种子液培养基，所述种子液培养基包括如下组分：无水葡萄糖20~30g/L、酵母粉2~4g/L、磷酸二氢钾1.5~2g/L和七水合硫酸镁1.5~2g/L。

3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述一级种子液培养过程中，接种量为每100mL种子液培养基中接种3~4块活化的灵芝菌株，每块活化的灵芝菌株的直径为3~5mm；

所述二级种子液扩繁过程中，一级种子液的接种量为种子液培养基体积的5~10％。

4.权利要求1~3任一项所述的发酵方法得到的灵芝液态深层发酵胞外液在制备化妆品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括具备保湿、美白和修复中的任意一种或多种功效的化妆品。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以所述灵芝液态深层发酵胞外液代替水做溶剂。