CN113564070B - 食用菌生防酵素发酵菌系、发酵方法及在水稻苗期抗病的应用 - Google Patents

食用菌生防酵素发酵菌系、发酵方法及在水稻苗期抗病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有抑制防治水稻苗期病害的食用菌生防酵素发酵菌剂(菌系)，使用该发酵菌系发酵生产食用菌生防酵素，可实现利用食用菌一次发酵生产生防农用酵素，可强化水稻苗期防病抑病功能，延长产品的保质期，降低发酵成本。本发明还提供一种酵素发酵菌系在食用菌生防酵素发酵中的应用。本发明还提供一种食用菌生防酵素的发酵方法，为使用该发酵菌系发酵生产生防酵素提供最优数据指导，以在短期内快速获得具有水稻苗期防病抑病功能的食用菌生防酵素。

Description

食用菌生防酵素发酵菌系、发酵方法及在水稻苗期抗病的 应用
技术领域
本发明涉及食用菌生防酵素发酵菌系的利用技术领域，尤其涉及食用菌生防酵素发酵菌系、发酵方法及在水稻苗期抗病的应用。
背景技术
农用酵素，一般是以植物为主要原料，添加或不添加辅料，经自然发酵制得的含有特定生物活性的用于种植业、养殖业、土壤改良的酵素产品。农用酵素的各种营养成分如益生菌、生物酶及各类营养素等具有重要的生物学功能：益生菌参与许多重要的生命活动，同时通过自身代谢产生一些益于生命活动的生物酶和益生因子等。因此近年来，农用酵素也被应用于作物生产的防病和抑病，但是由于功能活性物质浓度不高，作用机理不明确，导致农用酵素用于生防(生物防治)的商业化产品较少，效果不佳。
现有的农用酵素制作方法是以一种或者多种谷物、水果、蔬菜等为原料，经过加糖(糖蜜)、萃取、长期自然发酵而制得。现有的发酵方法有一次发酵、二次发酵或梯度发酵方法。无论是哪种方法，均为自然发酵；由自然发酵而来的酵素饮品可能会存在如下问题：(1)发酵周期长；(2)受原料、环境温度、环境湿度等因素影响，工艺不可控；(3)自然发酵，易污染。因此，产业亟需通过外源微生物加强发酵的技术，来强化产品功能，稳定产品质量。
水稻是中国的第二大粮食作物，全国的种植面积达到了4.5亿亩以上。我国水稻生产面临的重大挑战之一，就是水稻苗期的病害，每年都会造成很大的经济损失。目前，水稻的苗期抑病放病主要是以化学农药为主。同时，我国也是食用菌生产大国，随着食用菌栽培技术的发展，食用菌不仅作为一种“健康食品”被关注，其发酵液或者提取物也成为研究热点。除了人们认知的药用价值外，研究者发现其发酵液和提取物具有一定的抑菌作用。
本发明，采用生物发酵技术，以食用菌提取液为营养底物，外源添加生防发酵菌系，生产水稻苗期抑病放病的农用酵素生防制剂。
发明内容
本发明的目的在于：
本发明一个目的是提供一种具有抑制防治水稻苗期病害的食用菌生防酵素发酵菌剂(菌系)，使用该发酵菌系发酵生产食用菌生防酵素，可实现利用食用菌一次发酵生产生防农用酵素，可强化水稻苗期防病抑病功能，延长产品的保质期，降低发酵成本。
本发明还有一个目的是提供一种酵素发酵菌系在食用菌生防酵素发酵中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种食用菌生防酵素的发酵方法，为使用该发酵菌系发酵生产生防酵素提供最优数据指导，以在短期内快速获得具有水稻苗期防病抑病功能的食用菌生防酵素。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种酵素发酵菌系，包括：
毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌。
优选的是，毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的数量比例为3-5:2:2:2。
优选的是，毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的数量比例为2:1:1:1。
一种生防酵素发酵菌系在食用菌生防酵素发酵中的应用。
一种食用菌生防酵素的发酵方法，包括以下步骤：将酵素发酵菌系分批次添加入食用菌中进行发酵处理，获得食用菌生防酵素。
优选的是，还包括以下步骤：所述酵素发酵菌系经菌种活化和扩大培养后分别获得含有植物乳杆菌的发酵液、瑞士乳杆菌的发酵液、热纤梭菌的发酵液和毕赤酵母的发酵液，且所述植物乳杆菌的发酵液和/或所述瑞士乳杆菌的发酵液中有效活菌数量为1010个/mL及以上；热纤梭菌的发酵液和毕赤酵母的发酵液中有效活菌数量为109个/mL；
将毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的发酵液按照体积比为3-5:2:2:2，分批次添加到食用菌发酵体系中；对食用菌中进行发酵处理，获得食用菌生防酵素，且每1KG食用菌中添加入四种发酵液的量至少为27.3ml。
优选的是，毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的发酵液的体积比为2:1:1:1，分批次添加到食用菌发酵体系中。
优选的是，还包括以下步骤：
1)菌种活化：
将毕赤酵母接种于YPD培养基，在37℃条件下静止培养3d，获得种子液Ⅰ；
将热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅱ；
将植物乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅲ；
将瑞士乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅳ；
按重量份数计，所述的YPD培养基：酵母膏10份，蛋白胨20份，葡萄糖20份，蒸馏水1000份；
按重量份数计，所述的蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基的组成为：蛋白胨5份,酵母提取物1份，NaCl 5份，K2HPO4 1份，MgSO4.7H2O 0.35份，CaCO3 3份，蒸馏水1000份；
按重量份数计，所述MRS培养基的组成为：酪蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母粉5份，葡萄糖5份，乙酸钠5份，柠檬酸二铵2份，Tween 80 1份，K2HPO4 2份，MgSO4.7H2O 0.2份，MnSO4.H2O 0.05份，CaCO3 20.0g份，琼脂15份，蒸馏水1000份；
2)扩大培养：
将经菌种活化的毕赤酵母的种子液Ⅰ接种于所述YPD培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得毕赤酵母的发酵液；
将经菌种活化的热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得热纤梭菌的发酵液；
将经菌种活化的植物乳杆菌的种子液Ⅲ和瑞士乳杆菌的种子液Ⅳ分别接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，分别获得植物乳杆菌的发酵液和瑞士乳杆菌的发酵液。
一种所述的食用菌生防酵素的发酵方法获得的食用菌生防酵素。
一种所述食用菌生防酵素在水稻苗期抗病的应用。
作为优选，在育苗前，提前2个小时，将食用菌生防酵素和育苗基质土按照1：100的比例，喷施于基质土上。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明所述的食用菌生防酵素对水稻苗期病害的抑制作用，主要源于以下3个方面：1.食用菌本身还有大量的多酚类的抑菌物质，对水稻苗期病害有防治作用，因此要想保证生防酵素的作用，首先应该尽量减少食用菌本身自带的多酚类物质的降解；2.发酵菌系在食用菌的发酵过程中产生的大量乙醇和挥发性脂肪酸，明显降低生防酵素产品的pH值到4.0以下，低的pH值和高酸高醇环境对水稻苗期病害有明显的防治作用；3.发酵好的食用菌生防酵素，本身也是一个健康的微生物系统，可以降低水稻苗期外来的微生物的侵害。
本发明提供的食用菌生防酵素的发酵菌系，可在食用菌整个发酵过程中减少对多酚类抑菌物质降解的同时，形成稳定健康的微生态体系，且大量产生挥发性脂肪酸和乙醇，食用菌中本身携带的多种微生物可以降解多酚类物质，因此为了降低多酚类物质的降解，本发明所述的发酵菌系中的4种微生物，必须按照以下顺序依次添加，首先添加热纤梭菌，该菌种可以在食用菌发酵初期有效利用食用菌中的纤维素和半纤维素成分，快速生成可溶性糖类物质，之后添加毕赤酵母，利用热纤梭菌生成可溶性物质转化部分乙醇，发酵液体中乙醇含量的增加，可有效抑制其他病杂微生物的生长，最后接种物乳杆菌的和瑞士乳杆菌，利用可溶性物质大量生成挥发性脂肪酸，迅速降低食用菌生防酵素的pH值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种酵素发酵菌系，包括：毕赤酵母、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、植物乳杆菌和干酪乳杆菌。
其中，毕赤酵母(Bifidobacterium adolensentis)保藏号CICC No.1688、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)保藏号BIOMA No.1753、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)保藏号CICC No.11160、干酪乳杆菌(Lactobacillus helveticus)保藏号CICCNo.24071。
1)菌种活化：
将毕赤酵母接种于YPD培养基，在37℃条件下静止培养3d，获得种子液Ⅰ；
将热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅱ；
将植物乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅲ；
将干酪乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅳ；
按重量份数计，所述的YPD培养基：酵母膏10份，蛋白胨20份，葡萄糖20份，蒸馏水1000份；
按重量份数计，所述的蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基的组成为：蛋白胨5份,酵母提取物1份，NaCl 5份，K2HPO4 1份，MgSO4.7H2O 0.35份，CaCO3 3份，蒸馏水1000份；
按重量份数计，所述MRS培养基的组成为：酪蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母粉5份，葡萄糖5份，乙酸钠5份，柠檬酸二铵2份，Tween 80 1份，K2HPO4 2份，MgSO4.7H2O 0.2份，MnSO4.H2O 0.05份，CaCO3 20.0g份，琼脂15份，蒸馏水1000份；
2)(菌剂生产)扩大培养：
将经菌种活化的毕赤酵母的种子液Ⅰ接种于所述YPD培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得毕赤酵母的发酵菌剂；
将经菌种活化的热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得热纤梭菌的发酵菌剂；
将经菌种活化的植物乳杆菌的种子液Ⅲ和干酪乳杆菌的种子液Ⅳ分别接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5％-10％的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，分别获得植物乳杆菌的发酵菌剂和干酪乳杆菌的发酵菌剂。
实施例1：发酵菌剂应用于3种食用菌生防酵素的生产
实验材料：食用菌6种：分别为金针菇、青头菌、多汁乳菇；上述3种食用菌的比例为3:3:2，共计8kg；糖蜜2kg；毕赤酵母发酵菌剂100ml，热纤梭菌100ml，植物乳杆菌的发酵菌剂和干酪乳杆菌的发酵菌剂各50ml。
发酵过程：将金针菇、青头菌、多汁乳菇按照比例为3:3:2混合好后，取8kg，然后和2kg的糖蜜均匀混合后，首先添加热纤梭菌100ml，该菌种可以在食用菌发酵初期有效利用食用菌中的纤维素和半纤维素成分，快速生成可溶性糖类物质。当发酵液中的可溶性糖含量达到15g/kg时，可以加入毕赤酵母发酵液100ml，利用热纤梭菌生成可溶性物质转化部分乙醇，发酵液体中乙醇含量的增加，可有效抑制其他病杂微生物的生长。当乙醇含量达到5g/kg时，最后接种植物乳杆菌和干酪乳杆菌各50ml，利用可溶性物质大量生成挥发性脂肪酸，迅速降低食用菌生防酵素的pH值,当发酵液的pH低于4时，食用菌生防酵素制备完成。
实施例2：发酵菌剂应用于6种食用菌生防酵素的生产
实验材料：食用菌6种：分别为平菇、青头菌、白灵菇；杏鲍菇、枝瑚菌、多汁乳菇上述6种食用菌的比例为4:3:2:1:1:1，共计11kg；糖蜜3.0kg；毕赤酵母发酵菌剂150ml，热纤梭菌150ml，植物乳杆菌的发酵菌剂和干酪乳杆菌的发酵菌剂各50ml。
发酵方法：将平菇、青头菌、白灵菇；杏鲍菇、枝瑚菌、多汁乳菇上述6种食用菌的比例为4:3:2:1:1:1混合好后，取11kg，然后和3.0kg的糖蜜均匀混合后，首先添加热纤梭菌150ml，该菌种可以在食用菌发酵初期有效利用食用菌中的纤维素和半纤维素成分，3天左右可以分解利用4％的半纤维素和2％的纤维素。当发酵液中的可溶性糖含量达到15g/kg时，可以加入毕赤酵母发酵液150ml，利用热纤梭菌生成可溶性物质转化部分乙醇，发酵液体中乙醇含量的增加，可有效抑制其他病杂微生物的生长。当乙醇含量达到5-15g/kg时，最后接种植物乳杆菌和干酪乳杆菌各50ml，利用可溶性物质大量生成挥发性脂肪酸，迅速降低食用菌生防酵素的pH值,当发酵液的pH低于4时，或者乳酸的浓度达到20g/kg时，食用菌生防酵素制备完成。。
发酵前，还包括以下步骤：
将食用菌总量的1/5进行切碎处理，切碎的食用菌碎块的粒径为1cm；
将食用菌碎块与1/3的糖蜜充分混合，静置处理120min；
之后，将所述的热纤梭菌的发酵液均匀喷洒在所述食用菌碎块上；当可溶性糖的农大达到上述标准后，才可以将所述的毕赤酵母的发酵液加入到发酵物中，并混合均匀；当乙醇的浓度达到上述标准后，才可以将所述的植物乳杆菌和干酪乳杆菌加入到发酵物中，并混合均匀。
实施例3：食用菌生防酵素在水稻育苗防病的应用-基质土的消毒防病
育苗前的基质土，粉碎筛分后，备用。在育苗前，提前2个小时，将食用菌生防酵素和育苗基质土按照1：100的比例，喷施于基质土上。之后按照常规育苗步骤，进行育苗。同时将不喷施食用菌生防酵素的基质土做对照。
育苗结束后，喷施食用菌生防酵素的秧苗，得病率降低。对喷施和不喷施的样品中微生物进行高通量分析后，发现菌群种类相差不大，但优势菌群相差很大。得病样品与正常样品相比，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)的细菌有增多趋势。致病菌镰刀病菌的数量增多，可达到107CFU/g,而喷施食用菌生防酵素的样品，没有检测到镰刀菌。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种酵素发酵菌系的食用菌生防酵素的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将酵素发酵菌系分批次添加入食用菌中进行发酵处理，获得食用菌生防酵素；
所述酵素发酵菌系包括：毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏号CICC No.1688；热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，保藏号BIOMA No.1753；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏号CICC No.11160；瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus），保藏号CICC No.24071；
首先添加热纤梭菌，之后添加毕赤酵母，最后接种植物乳杆菌和瑞士乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，还包括以下步骤：所述酵素发酵菌系经菌种活化和扩大培养后分别获得含有植物乳杆菌的发酵液、瑞士乳杆菌的发酵液、热纤梭菌的发酵液和毕赤酵母的发酵液，且所述植物乳杆菌的发酵液和/或所述瑞士乳杆菌的发酵液中有效活菌数量为1010个/mL及以上；热纤梭菌的发酵液和毕赤酵母的发酵液中有效活菌数量为109个/mL；
将毕赤酵母、热纤梭菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的发酵液按照体积比为3-5:2:2:2，分批次添加到食用菌发酵体系中；对食用菌中进行发酵处理，获得食用菌生防酵素，且每1KG食用菌中添加入四种发酵液的量至少为27.3 ml。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，毕赤酵母、热纤梭菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的发酵液的体积比为2:1:1:1，分批次添加到食用菌发酵体系中。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，
还包括以下步骤：
1）菌种活化：
将毕赤酵母接种于YPD培养基，在37℃条件下静止培养3d，获得种子液Ⅰ；
将热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅱ；
将植物乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅲ；
将瑞士乳杆菌接种于MRS培养基，在37℃条件下静止培养2d，收集所有的种子液Ⅳ；
按重量份数计，所述的YPD培养基：酵母膏10份，蛋白胨20份，葡萄糖20份，蒸馏水 1000份；
按重量份数计，所述的蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基的组成为：蛋白胨5份,酵母提取物1份，NaCl 5份，K2HPO4 1份，MgSO4.7H2O 0.35份，CaCO3 3份，蒸馏水 1000份；
按重量份数计，所述MRS培养基的组成为：酪蛋白胨 10 份，牛肉膏 10 份，酵母粉 5份，葡萄糖 5份，乙酸钠 5份，柠檬酸二铵 2份，Tween 80 1份，K2HPO4 2份，MgSO4.7H2O 0.2份，MnSO4.H2O 0.05份，CaCO3 20.0g份，琼脂 15份，蒸馏水 1000份；
2）扩大培养：
将经菌种活化的毕赤酵母的种子液Ⅰ接种于所述YPD培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%-10%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得毕赤酵母的发酵液；
将经菌种活化的热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%-10%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，获得热纤梭菌的发酵液；
将经菌种活化的植物乳杆菌的种子液Ⅲ和瑞士乳杆菌的种子液Ⅳ分别接种于MRS培养基中，在培养温度为37℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%-10%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数为109个/mL及以上时终止培养，分别获得植物乳杆菌的发酵液和瑞士乳杆菌的发酵液。
5.一种利用权利要求1-4中任一项所述的食用菌生防酵素的发酵方法获得的食用菌生防酵素。
6.一种权利要求5所述食用菌生防酵素在水稻苗期抗病的应用。
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