CN103146584A - 一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产dha的方法 - Google Patents

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Abstract

一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，涉及发酵生产DHA的方法。采用的菌种为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12。菌种活化与菌悬液制备；一级种子制备；二级固料种子的制备；二级固料种子发酵罐扩大培养；发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。改进种子制备方式，简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，可减少投资，节约成本；同时固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小。

Description

一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法
技术领域
本发明涉及发酵生产DHA的方法，特别涉及一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，22:6△4,7,10,13,16,19，简称DHA)俗称“脑黄金”，属于ω-3型多不饱和脂肪酸，具有补脑健脑，预防老年性痴呆症；提高视力，防治近视；预防高血压、动脉硬化、关节炎及治疗癌症等生理功能。因此，DHA作为新一代功能性保健因子具有广阔的市场前景。随着市场需求量的扩大，对DHA品质的要求也越来越高，DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展，传统鱼油来源的DHA已逐渐被藻油DHA所取代。藻油DHA是指通过微生物发酵获得的含有DHA等长链多不饱和脂肪酸的油脂，其中DHA生产菌主要有裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等。
裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形。细胞累积大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素（类胡萝卜素、叶黄素、虾青素）、角鲨烯等，其中总脂肪酸中DHA含量高达35%～45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂——甘油三酯形式存在，是DHA的理想生产菌株。
中国专利CN101575584公开一种裂殖弧菌及利用其生产DHA油脂的方法，该方法提供一种从渗透压和元素供应角度优化菌株发酵培养基，并结合流加策略，实现裂殖壶菌高密度发酵，采用传统的发酵方法，从甘油保存种接入摇瓶活化→一级种子液→摇瓶二级种子液→一级种子罐→二级种子罐→发酵，最终细胞干重达到70g/L，油脂含量达31.5g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35%。
中国专利CN101519676公开一种采用含微量元素的发酵培养基进行发酵生产DHA的发酵生产工艺，采用传统方法培养菌种裂殖壶菌，即斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到发酵用种子液；或菌种经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到发酵用种子液，10T罐发酵95h生物量为53g/L，油脂含量72%，DHA含量50%。而传统的种子培养和发酵方法涉及的发酵级数较多，工艺较繁琐，培养周期长，投资成本高。因此，改进种子制备方式，简化扩种工艺，降低生产成本，有利于DHA的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供可简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，减少投资，节约成本，固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好，培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。
本发明采用的菌种为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.6843，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编为100101。
本发明包括如下步骤：
1）菌种活化与菌悬液制备：将裂殖壶菌菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；
在步骤1）中，所述斜面培养基的配方可为：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；所述培养活化的温度可为25～28℃，培养活化的时间可为2～3天；所述菌悬液的菌体浓度可为1.0～2.5×106个/mL。
2）一级种子制备：将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或
将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子；
在步骤2）中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250～400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米等中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦等中的至少一种；
所述液体营养液组分包括组分1和组分2，所述组分1的组成为：葡萄糖2～5g/L，七水硫酸镁0.2～0.6g/L，磷酸氢二钾1.0～5.0g/L，海盐0.1～0.8g/L，甘氨酸0.2～0.6g/L，苏氨酸1.5～1.8g/L，蛋氨酸2～3.5g/L，苹果酸3～6g/L，加水定容，调节pH值为6～7；所述组分2的组成为：La3+10～15mg/L，Ce3+1～4mg/L，Sm3+2～6mg/L，Nd3+8～12mg/L，Mn2+0.6～1.2mg/L，Co2+0.05～0.1mg/L，生物素0.2～0.6mg/L，浅蓝菌素0.1～0.3mg/L，赤霉素GA2～5mg/L，VB120.5～1.0mg/L，叶酸0.01～0.05mg/L，余量为水；
所述固料培养基的制备方法可为：固态组分与液体营养液组分1混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50%～65%，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2～1.0cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基；
所述固态组分与液体营养液组分1按质量/体积的配比可为（5～10）g∶（2～5）mL，其中固态组分按质量计算，液体营养液组分1按体积计算；
所述固料培养基原料与液体营养液组分2按质量/体积的配比可为（10～15）g∶（3～6）mL，其中固料培养基原料按质量计算，液体营养液组分2按体积计算；
所述液体种子培养基的组成可为：葡萄糖20～25g/L，氯化钠20～25g/L，磷酸二氢钾0.2～0.5g/L，酵母粉3～5g/L，七水硫酸镁8～12g/L，海盐0.1～0.8g/L，谷氨酸0.2～0.6g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；
所述培养的温度可为25～28℃，培养的时间可为1天；所述摇瓶的转速可为180～220rpm；摇瓶培养的温度可为25～28℃，摇瓶培养的时间可为1天。
3）二级固料种子的制备：一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液；
在无菌条件下：
按质量分数为10%～20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或
按质量分数为8%～15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，25～28℃，培养2～3天；
制得二级固料种子；
4）二级固料种子发酵罐扩大培养：二级固料种子加入1:3～5（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%～20%的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在25～28℃，利用搅拌转速保持30%～50%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18～22℃，发酵3～5天，通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0～6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4～8g/L；
在步骤4）中，所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成可为：葡萄糖30～60g/L，NaCl15～20g/L，MgSO4.7H2O4～8g/L，酵母粉3～8g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，(NH4)2SO40.2～0.5g/L，NaHCO30.8～1.2g/L，CoCl21.0～2.0μg/L，MnSO40.5～1.0μg/L，VB10.05～0.1mg/L，VB120.001～0.01mg/L，初始pH6.0～7.0；所述发酵最好溶氧维持在8%～12%。
5）发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。
经测定，发酵液中细胞干重达105～160g/L，DHA含量达20～35g/L。
本发明还适用于除裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12以外的其它裂殖壶菌种属的生产，包括可以从美国典型培养物收集中心、日本大阪发酵工程研究所等保藏机构获得的裂殖壶菌菌种。
本发明摒弃传统的种子培养工艺流程，直接由固料发酵获得的种子液进行液体发酵培养：斜面活化→一级固料种子/摇瓶液体种子→二级固料种子液→液体发酵。本发明改进种子制备方式，简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，可减少投资，节约成本；同时固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小。
本发明的有益效果是：克服传统发酵方法种子扩培级数较多的缺陷，改进DHA发酵用种子液的制备，可简化DHA生产工艺过程；固料培养基营养丰富，种子饱满活力强，可缩短种子上罐后延迟期，提高DHA产量，降低生产成本，保持稳定的生产能力；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小；发酵得到的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例中用到的菌种为：
裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12（CGMCCNo.6843）；
裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）S31(ATCC No.20888)
裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）S8(ATCC No.20889)
裂殖壶菌Schizochytrium aggregatum(ATCC No.28209)
实施例1：
将裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为25℃，培养2天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5×106个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至灭菌的固料培养基上，25℃培养1天，制得一级固料种子。
在无菌条件下，按质量分数为10%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子（用于接种的一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液），摇动K瓶混合均匀，25℃，培养2.5天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:4（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为15%的接种量接种至50L发酵罐扩大培养，接后体积32L。发酵前48h温度控制在25℃，利用搅拌转速保持40%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在22℃，溶氧维持在10%左右，发酵4天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为375g/L，小米与液体营养液组分1按8：3（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，获得固料培养基原料。固料培养基原料与液体营养液组分2按10：3（W/V）比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.3cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖3，七水硫酸镁0.2，磷酸氢二钾3.0，海盐0.6，甘氨酸0.6，苏氨酸1.5，蛋氨酸2，苹果酸4，加水定容至所需体积，调节pH值6.5。组分2（mg/L）：La3+15，Ce3+2，Sm3+3，Nd3+8，Mn2+1.0，Co2+0.08，生物素0.2，浅蓝菌素0.1，赤霉素GA5，VB121.0，叶酸0.03，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖30g/L，NaCl20g/L，MgSO4.7H2O5g/L，酵母粉3g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2SO40.4g/L，NaHCO31.2g/L，CoCl22.0μg/L，MnSO40.7μg/L，VB10.06mg/L，VB120.005mg/L，初始pH6.5。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达125g/L，DHA含量达25g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例2：
将裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28℃，培养2天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶16，琼脂粉20，pH值6.0，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为1.0×106个/mL。
获得的菌悬液直接接种至摇瓶液体培养基上，接种量1%，摇瓶转速220rpm，28℃培养1天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖25，氯化钠20，磷酸二氢钾0.2，酵母粉5，七水硫酸镁10，海盐0.4，谷氨酸0.4，pH值6.0，121℃灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为10%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26℃，培养3天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:3（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为20%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在28℃，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18℃，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在7g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为300g/L，小米与液体营养液组分1按8：3（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为60%，培养基原料与液体营养液组分2按10：4（W/V）比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.5cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖5，七水硫酸镁0.4，磷酸氢二钾2.0，海盐0.5，甘氨酸0.3，苏氨酸1.5，蛋氨酸3.5，苹果酸6，加水定容至所需体积，调节pH值6.0。组分2（mg/L）：La3+10，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+9，Mn2+0.8，Co2+0.06，生物素0.2，浅蓝菌素0.1，赤霉素GA2，VB120.8，叶酸0.03，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖40g/L，NaCl15g/L，MgSO4.7H2O4g/L，酵母粉5g/L，KH2PO40.5g/L，(NH4)2SO40.2g/L，NaHCO30.8g/L，CoCl21.5μg/L，MnSO41.0μg/L，VB10.1mg/L，VB120.01mg/L，初始pH6.0。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达159g/L，DHA含量达34.5g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例3：
将裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28℃，培养3天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.0×106个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速220rpm，28℃培养1天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖20，氯化钠22，磷酸二氢钾0.2，酵母粉3，七水硫酸镁10，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121℃灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为8%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26℃，培养3天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:3（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在25℃，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20℃，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小麦，含量为350g/L，小麦与液体营养液组分1按10：4（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按15：4（W/V）比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.7cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖3.5，七水硫酸镁0.3，磷酸氢二钾3.0，海盐0.4，甘氨酸0.5，苏氨酸1.6，蛋氨酸3.5，苹果酸5，加水定容至所需体积，调节pH值6.0。组分2（mg/L）：La3+12，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+8，Mn2+0.9，Co2+0.08，生物素0.4，浅蓝菌素0.1，赤霉素GA3，VB120.8，叶酸0.02，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖40g/L，NaCl16g/L，MgSO4.7H2O6g/L，酵母粉4g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaHCO31.2g/L，CoCl22.0μg/L，MnSO41.0μg/L，VB10.05mg/L，VB120.005mg/L，初始pH6.0。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达132g/L，DHA含量达30.5g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例4：
将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.S31)（ATCC No.20888)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28℃，培养2天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为1.5×106个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速200rpm，28℃培养1天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖20，氯化钠22，磷酸二氢钾0.2，酵母粉5，七水硫酸镁12，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121℃灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26℃，培养2天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:3（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在25℃，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20℃，溶氧维持在10%左右。发酵4.5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在6g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为350g/L，小米与液体营养液组分1按10：4（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按10：4（W/V）比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.3cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖3，七水硫酸镁0.5，磷酸氢二钾5.0，海盐0.8，甘氨酸0.2，苏氨酸1.6，蛋氨酸3.5，苹果酸3，加水定容至所需体积，调节pH值6.0。组分2（mg/L）：La3+15，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+10，Mn2+0.9，Co2+0.1，生物素0.4，浅蓝菌素0.2，赤霉素GA2，VB121.0，叶酸0.02，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖40g/L，NaCl20g/L，MgSO4.7H2O6g/L，酵母粉4g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaHCO30.8g/L，CoCl22.0μg/L，MnSO40.5μg/L，VB10.05mg/L，VB120.005mg/L，初始pH6.0。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达115g/L，DHA含量达22.7g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例5：
将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.S8)（ATCC20889)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28℃，培养2天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶20，琼脂粉20，pH值6.5，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5×106个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速220rpm，28℃培养1天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成（g/L）：葡萄糖25，氯化钠22，磷酸二氢钾0.5，酵母粉5，七水硫酸镁12，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121℃灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为12%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，28℃，培养3天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:4（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为18%的接种量接种至1000L发酵罐扩大培养，接后体积600L。发酵前48h温度控制在28℃，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20℃，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为大米，含量为300g/L，大米与液体营养液组分1按8：5（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为50%，培养基原料与液体营养液组分2按15：3（W/V）比例混合均匀，厚度0.5cm。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖3，七水硫酸镁0.5，磷酸氢二钾5.0，海盐0.8，甘氨酸0.2，苏氨酸1.6，蛋氨酸3.5，苹果酸3，加水定容至所需体积，调节pH值6.0。组分2（mg/L）：La3+15，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+10，Mn2+1.2，Co2+0.1，生物素0.4，浅蓝菌素0.2，赤霉素GA2，VB121.0，叶酸0.02，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖40g/L，NaCl20g/L，MgSO4.7H2O6g/L，酵母粉4g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaHCO30.8g/L，CoCl22.0μg/L，MnSO40.5μg/L，VB10.05mg/L，VB120.005mg/L，初始pH6.5。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达138g/L，DHA含量达31.6g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例6：
将裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)（ATCC28209)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为25℃，培养2天。斜面培养基配方为（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121℃灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5×106个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至灭菌的固料培养基上28℃培养1天，制得一级固料种子。
在无菌条件下，按质量分数为20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子（用于接种的一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液），摇动K瓶混合均匀，25℃，培养3天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:4（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为12%的接种量接种至1000L发酵罐扩大培养，接后体积600L。发酵前48h温度控制在28℃，保持40%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18℃，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为：由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为大麦，含量为375g/L，大麦与液体营养液组分1按8：3（W/V）比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按10：3（W/V）比例混合均匀，厚度0.5cm。
液体营养液组分1(g/L)：葡萄糖5，七水硫酸镁0.2，磷酸氢二钾3.0，海盐0.6，甘氨酸0.6，苏氨酸1.5，蛋氨酸2，苹果酸4，加水定容至所需体积，调节pH值6.5。组分2（mg/L）：La3+15，Ce3+2，Sm3+3，Nd3+8，Mn2+1.2，Co2+0.08，生物素0.2，浅蓝菌素0.1，赤霉素GA5，VB121.0，叶酸0.03，余量为水。
液体发酵培养基组成：葡萄糖30g/L，NaCl20g/L，MgSO4.7H2O5g/L，酵母粉3g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2SO40.4g/L，NaHCO31.2g/L，CoCl22.0μg/L，MnSO40.7μg/L，VB10.06mg/L，VB120.005mg/L，初始pH6.5。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达142g/L，DHA含量达32.3g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。

Claims (10)

1.一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）菌种活化与菌悬液制备：将裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；所述裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.6843；
2）一级种子制备：将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或
将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子；
3）二级固料种子的制备：一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液；
在无菌条件下：
按质量分数为10%～20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或
按质量分数为8%～15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，25～28℃，培养2～3天；
制得二级固料种子；
4）二级固料种子发酵罐扩大培养：二级固料种子加入1:3～5（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%～20%的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在25～28℃，利用搅拌转速保持30%～50%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18～22℃，发酵3～5天，通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0～6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4～8g/L；
5）发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。
2.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤1）中，所述斜面培养基的配方为：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；所述培养活化的温度可为25～28℃，培养活化的时间可为2～3天；所述菌悬液的菌体浓度可为1.0～2.5×106个/mL。
3.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250～400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦中的至少一种。
4.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述液体营养液组分包括组分1和组分2，所述组分1的组成为：葡萄糖2～5g/L，七水硫酸镁0.2～0.6g/L，磷酸氢二钾1.0～5.0g/L，海盐0.1～0.8g/L，甘氨酸0.2～0.6g/L，苏氨酸1.5～1.8g/L，蛋氨酸2～3.5g/L，苹果酸3～6g/L，加水定容，调节pH值为6～7；所述组分2的组成为：La3+10～15mg/L，Ce3+1～4mg/L，Sm3+2～6mg/L，Nd3+8～12mg/L，Mn2+0.6～1.2mg/L，Co2+0.05～0.1mg/L，生物素0.2～0.6mg/L，浅蓝菌素0.1～0.3mg/L，赤霉素GA2～5mg/L，VB120.5～1.0mg/L，叶酸0.01～0.05mg/L，余量为水。
5.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述固料培养基的制备方法为：固态组分与液体营养液组分1混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50%～65%，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2～1.0cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。
6.如权利要求5所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于所述固态组分与液体营养液组分1按质量/体积的配比为（5～10）g∶（2～5）mL，其中固态组分按质量计算，液体营养液组分1按体积计算；
所述固料培养基原料与液体营养液组分2按质量/体积的配比为（10～15）g∶（3～6）mL，其中固料培养基原料按质量计算，液体营养液组分2按体积计算。
7.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述液体种子培养基的组成为：葡萄糖20～25g/L，氯化钠20～25g/L，磷酸二氢钾0.2～0.5g/L，酵母粉3～5g/L，七水硫酸镁8～12g/L，海盐0.1～0.8g/L，谷氨酸0.2～0.6g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min。
8.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述培养的温度为25～28℃，培养的时间为1天。
9.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述摇瓶的转速为180～220rpm；摇瓶培养的温度为25～28℃，摇瓶培养的时间为1天。
10.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤4）中，所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成为：葡萄糖30～60g/L，NaCl15～20g/L，MgSO4.7H2O4～8g/L，酵母粉3～8g/L，KH2PO40.5～1.0g/L，(NH4)2SO40.2～0.5g/L，NaHCO30.8～1.2g/L，CoCl21.0～2.0μg/L，MnSO40.5～1.0μg/L，VB10.05～0.1mg/L，VB120.001～0.01mg/L，初始pH6.0～7.0；所述发酵最好溶氧维持在8%～12%。
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