CN114164125A - 一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及以改变裂殖壶藻的培养基营养成分，以提高裂殖壶藻的油脂产量的生产工艺；包括以下步骤：1)种子液培养2)初始发酵：将种子培养液进行初始发酵培养；3)单因素分析：通过单因素分析对裂殖壶藻的不同浓度碳源、氮源、接种量进行培养分析，以确定优化的浓度确定量；4)正交实验：通过对优化的碳源、氮源、外源添加剂进行正交实验来确定最优的裂殖壶藻培养基成分；5)摇瓶发酵：根据步骤3)和4)获得的最优发酵参数进行摇瓶发酵：6)菌体收集：将步骤5)获得的菌液依次进行离心、干燥，即得裂殖壶藻菌粉。本发明成本较低，并且裂殖壶藻发酵的生物量和油脂含量较高。

Description

一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及以改变裂殖壶藻的培养基营养成分，以提高裂殖壶藻的油脂产量的生产工艺。

背景技术

裂殖壶菌(Scfizochytrium),又称裂壶藻，裂殖壶菌形态为单细胞椭圆球型,是一种缺乏叶绿素而不能进行光合作用的异养型微藻。裂殖壶菌生长速率快，一般3～7天即可产生大量菌体；其胞内油脂含量高,一般占菌体干重的40％～70％；油脂组分相对简单，DHA含量在20％～50％,且所产脂肪酸90％以上是以人体易吸收的甘油三脂形式存在。近年来研究也发现除DHA外,裂殖壶菌还可产EPA、角蟹烯、类胡萝卜素等其他对人体有益的产物。裂殖壶菌(Schizochytrium)是一种海洋真菌，具有生长快、不饱和脂肪酸组成简单、油脂含量高的生物资源。以及对人畜无毒害等特点，是一种极具工业化生产前景的DHA微生物资源。其中DHA占总脂肪酸的质量分数高达35％～45％。此外，该菌株细胞中还富含类胡萝素、虾青素、角鲨烯等对人类有益的活性物质。二十二碳六烯酸(DHA),是一种重要的w-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、增强视力、预防和治疗心脑血管疾病、抗动脉硬化、预防癌症等生理功效,被誉为新一代功能因子,广泛用于食品医药行业。

裂殖壶菌已被作为为数不多的商业化应用菌株之一,美国食品和药品局已经通过了裂殖壶菌藻粉和DHA油脂安全性的检测。2010年我国《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》将以裂殖壶菌等微生物生产的DHA列为新资源食品。2012年,卫生部颂布的《食品营养强化剂使用标准》批准裂殖壶菌生产的藻油DHA应用于婆幼儿配方食品中。裂殖壶菌已成为生产藻油DHA的工业化应用菌株，随着对其深入探索，针对其发酵生产6-3PUFAs进行代谢调控已有较多研究，并取得了一定的工艺进步，加深了对裂殖壶菌的认识。其中，培养基优化和培养条件控制是在工业微生物发酵过程中两大重要因素，目前对于裂殖壶菌的培养基优化和培养条件控制方面的研究还较少，急需加强。

发明内容

针对上述情况，本发明提供一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺。

本发明的技术方案如下：

一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)种子液培养：制备种子培养基，将菌种接种到制备菌悬液后，接种到一级种子培养基中培养，然后取一级种子培养液接入到二级种子培养基中培养，获得二级种子培养液；

2)初始发酵：将种子培养液进行初始发酵培养；

3)单因素分析：通过单因素分析对裂殖壶藻的不同浓度碳源、氮源、接种量进行培养分析，以确定优化的浓度确定量；

4)正交实验：通过对优化的碳源、氮源、外源添加剂进行正交实验来确定最优的裂殖壶藻培养基成分；

5)摇瓶发酵：根据步骤3)和4)获得的最优发酵参数进行摇瓶发酵：

6)菌体收集：将步骤5)获得的菌液依次进行离心、干燥，即得裂殖壶藻菌粉。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤1)具体包括以下步骤：

1)种子液培养：制备种子培养基，将菌种接种到制备菌悬液后，接种到一级种子培养基中，在25C，200rpm培养48h，然后取一级种子培养液接入到二级种子培养基中，接种量5％，在25C，200rpm培养48h，获得二级种子培养液。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述种子培养基包含以下成分：葡萄糖30g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，海盐20g/L。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤2)具体包括以下步骤：

2)初始发酵：将种子培养液接种到初始发酵培养基中培养，调节培养基PH6-7，在25C，200rpm培养96h。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述始发酵培养基包含以下成分：葡萄糖80g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，海盐20g/L。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤3)单因素分析中的碳源为浓度分别为40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L的葡萄糖；所述步骤3)单因素分析中的氮源包括浓度为4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的胰蛋白胨以及浓度4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的酵母提取物；所述步骤3)单因素分析中的接种量包括4％，6％，8％，10％，12％。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤3)单因素分析或所述步骤4)正交实验中包括以下通用分析步骤：

S1种子液培养：在装有100mL种子培养基的250mL挡板瓶中接入少量活化后的菌种，25℃、200r/min培养48小时后再次转接，将经过第二次转接的菌液作为种子液使用；摇瓶发酵培养：将种子液接入装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶，25℃、200r/min培养4天；

S2生物量的测定：干重法：菌株发酵4天后，取100mL发酵液至已称重的50mL离心管中，8000r/min离心10min后，弃去上清液，去离子水震荡洗涤离心2次后弃去上清，然后将菌体置于-0.09～0.1Mpa、60℃～70℃的真空干燥箱中真空干燥，恒重后称量。

S3油脂含量测定：取一定量的干燥的裂殖壶藻粉通过索氏提取12h，计算油脂含量。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤4)正交实验中的外源添加剂包括海水晶、柠檬酸、硝酸铵、K₂HPO₄、MgSO4。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述步骤5)摇瓶培养的最优发酵参数为：

培养基组成：葡萄糖110g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5.5g/L，海水晶13g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵5g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄4g/L；

培养条件：PH:6-7，接种量：4％，培养时间：96h，温度：25℃。

进一步的，上述一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，所述发酵工艺获得的菌体含量≥30g/L,油脂率≥30％。

进一步的，上述裂殖壶藻的菌株编号为ATCC20888。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明在反应过程中，反应过程稳定，成本较低；并且裂殖壶藻发酵的生物量较多。

2、本发明的提取工艺简单、无需复杂的设备即可提高裂殖壶藻的生物量和油脂含量，为实现大规模工业化生产提供基础，应用前景广泛。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。实施例所用菌株为商业化菌株，ATCC编号为ATCC20888。

实施例

1.本实验为了确定适合裂殖壶菌种子生长、生物质生长和油脂积累的最优条件，通过单因素实验对碳源、氮源、接种量进行了探究。

(1)培养基成分：

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉4，蛋白胨4，海盐20PH值自然，120℃高温条件下灭菌20min。。

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母粉4，蛋白胨4，海盐20PH值自然，120℃高温条件下灭菌20min。。

(2)培养条件:接种量：5％转速：200r/min温度：25℃种子培养基：2天发酵周期：4天

(3)菌株保藏实验室多采用液体培养基保藏于-80℃冰箱中，使用甘油管保藏，甘油的比率为20％～40％，-20℃冰箱可保藏2个月左右，-80℃冰箱可保藏1年。

(4)种子液培养：在装有100mL种子培养基的250mL挡板瓶中接入少量活化后的菌种，25℃、200r/min培养48小时后再次转接，将经过第二次转接的菌液作为种子液使用。

摇瓶发酵培养：按5％(v/v)的接种量将种子液接入装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶，25℃、200r/min培养4天。

(5)生物量的测定干重法：菌株发酵4天后，取100mL发酵液至已称重的50mL离心管中，8000r/min离心10min后，弃去上清液，去离子水震荡洗涤离心2次后弃去上清，然后将菌体置于-0.09～0.1Mpa、60℃～70℃的真空干燥箱中真空干燥，恒重后称量。

(6)油脂含量测定取一定量的干燥的裂殖壶藻粉通过索氏提取12h，计算油脂含量。

1.1在摇瓶发酵的条件下，进行单因素试验，对不同浓度碳源葡萄糖浓度进行优化。

(1)碳源来源:葡萄糖变量浓度为：40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L发酵培养基其他成分不变。按照步骤(4)，(5)，(6)进行操作得到表1结果：

表1不同葡萄糖浓度裂殖壶藻生物量和油脂含量

葡萄糖浓度g/L	生物量g/L	总油脂率％	总油脂量g/L
				40	14.49	14.81％	2.147
60	20.216	14.20％	2.871
				80	25.99	13.89％	3.6034
100	30.96	19.26％	5.971
				120	36.56	28.00％	10.46

从表1可知，葡萄糖浓度为120g/L时,此时裂殖壶藻发酵的生物量和总油脂含量最高,所以后续试验选择120g/L葡萄糖作为碳源添加量。

(2)碳源来源:酵母提取物、胰蛋白胨

胰蛋白胨变量浓度为：4g/L,6g/L,8g/L,10g/L,12g/L发酵培养基其他成分不变，按照步骤(4)，(5)，(6)进行操作得到表2结果。

表2不同胰蛋白胨浓度裂殖壶藻生物量和油脂含量

胰蛋白胨浓度g/L	生物量g/L	总油脂率％	总油脂量g/L
				4	4.6970	2.46％	0.1153
6	4.9733	5.62％	0.2793
				8	5.6953	1.46％	0.0832
10	5.6433	2.46％	0.1388
				12	6.1600	3.88％	0.2393

从表2可知胰蛋白胨浓度为6g/L时,总油脂量最高,本试验的目的为提高裂殖壶藻的油脂量,故后续试验选用6g/L的胰蛋白胨。

酵母提取物变量浓度为：4g/L,6g/L,8g/L,10g/L,12g/L酵培养基其他成分不变，按照步骤(4)，(5)，(6)进行操作得到表3结果。

表3不同酵母提取物浓度裂殖壶藻生物量和油脂含量

酵母提取物浓度g/L	生物量g/L	总油脂率％	总油脂量g/L
				4	24.50	15.50％	3.7975
6	25.11	12.40％	3.266
				8	26.34	8.63％	1.910
10	29.59	6.99％	2.068
				12	26.92	8.49％	2.286

从表3可知酵酵母提取物浓度为4g/L时,总油脂量最高,本试验的目的为提高裂殖壶藻的油脂量,故后续试验选用4g/L的胰蛋白胨。

(3)接种量变量浓度为：4％，6％，8％，10％，12％发酵培养基其他成分不变，按照步骤(4)，(5)，(6)进行操作得到表4结果。

表4不同接种量裂殖壶藻生物量和油脂含量

接种量	生物量g/L	总油脂率％	总油脂量g/L
				4％	25.67	3.63％	0.9311
6％	25.31	4.03％	1.0200
				8％	24.37	5.80％	1.4148
10％	25.48	5.38％	1.3702
				12％	27.45	5.12％	1.4050

从表4可知为接种量为4％时，生物量量最高，故后续试验选用4％的接种量为后续实验接种量。

1.2以单因素变量确定范围，后续以正交实验来确定其精确的浓度范围，同时加入外源添加剂，柠檬酸，硝酸铵，K₂HPO₄，MgSO₄，其中添加入外源添加物能够提高生物量、油脂产量以及油脂中DHA的比例。因此在基础培养基中添加一定量的外源添加物，探究对其裂殖壶藻的菌体生长以及油脂积累。

(1)根据正交实验设计原则，结合单因素试验结果，选择葡萄糖浓度、酵母提取物浓度、胰蛋白胨浓度、海水晶、柠檬酸、硝酸铵、K₂HPO₄、MgSO₄8个因素，采用8因素3水平的正交分析方法。正交实验分析因素与水平设计见表5。

表5裂殖壶藻正交实验计划表L₂₇(3⁸)

(2)试验方案及总结果见表6：

表6实验方案及总结果

(3)最终结果见表7

表7最终结果

	生物量	脂肪率
			最优工艺	A3B3C3D3E3F1G3H3	A1B1C1D2E2F2G3H1
主次顺序	E>G>F>B>D>H>A>C	B>A>E>C>F>D>G>H

(4)综合水平分析：

培养基成分：葡萄糖(g/L)110，酵母提取物(g/L)4，胰蛋白胨(g/L)5.5，海水晶(g/L)13，柠檬酸(g/L)2，硝酸铵(g/L)5，K₂HPO₄(g/L)2，MgSO₄(g/L)4。培养条件：PH:6-7接种量：4％培养时间：96h温度：25℃。结果：生物量(g/L)：31.88油脂率：33.23％

目前对裂殖壶藻的发酵研究主要集中在高产菌株的诱变和筛选，培养基和发酵条件的优化，如C源、N源、无机盐、pH、温度、溶氧以及前体促进物质等。本发明主要是对培养基成分的优化来改变裂殖壶藻的生物量及油脂含量。裂殖壶菌发酵产油脂的培养过程可分为两步，即细胞生长/分裂期和脂质积累期。在微生物油脂生产过程中，关键因素就是碳源充足、其他营养条件充分。在氮源缺乏的情况下，才能进行油脂的积累过程。在这种情况下，细胞不再繁殖,而是积累油脂，并将碳源转化成油脂。在此条件下，培养基中的碳源不再用于微生物胞内碳骨架的合成，而是转向油脂的积累。而微量元素是大多数生物酶在行使生物学功能时的激活因子，提高裂殖壶菌培养基中微量元素的含量有望提高裂殖壶菌在生长过程及DHA合成过程中某些酶的活性，从而使裂殖壶菌生物量及DHA产量有所提高。本发明通过优化其培养基成分，进行正交试验分析表明其最优的试验的方案。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)种子液培养：制备种子培养基，将菌种接种到制备菌悬液后，接种到一级种子培养基中培养，然后取一级种子培养液接入到二级种子培养基中培养，获得二级种子培养液；

2)初始发酵：将种子培养液进行初始发酵培养；

3)单因素分析：通过单因素分析对裂殖壶藻的不同浓度碳源、氮源、接种量进行培养分析，以确定优化的浓度确定量；

4)正交实验：通过对优化的碳源、氮源、外源添加剂进行正交实验来确定最优的裂殖壶藻培养基成分；

5)摇瓶发酵：根据步骤3)和4)获得的最优发酵参数进行摇瓶发酵：

6)菌体收集：将步骤5)获得的菌液依次进行离心、干燥，即得裂殖壶藻菌粉。

2.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下步骤：

1)种子液培养：制备种子培养基，将菌种接种到制备菌悬液后，接种到一级种子培养基中，在25C，200rpm培养48h，然后取一级种子培养液接入到二级种子培养基中，接种量5％，在25C，200rpm培养48h，获得二级种子培养液。

3.根据权利要求2所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述种子培养基包含以下成分：葡萄糖30g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，海盐20g/L。

4.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤2)具体包括以下步骤：

2)初始发酵：将种子培养液接种到初始发酵培养基中培养，调节培养基PH6-7，在25C，200rpm培养96h。

5.根据权利要求4所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述始发酵培养基包含以下成分：葡萄糖80g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨4g/L，海盐20g/L。

6.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤3)单因素分析中的碳源为浓度分别为40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120g/L的葡萄糖；所述步骤3)单因素分析中的氮源包括浓度为4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的胰蛋白胨以及浓度4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的酵母提取物；所述步骤3)单因素分析中的接种量包括4％，6％，8％，10％，12％。

7.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤3)单因素分析或所述步骤4)正交实验中包括以下通用分析步骤：

S1种子液培养：在装有100mL种子培养基的250mL挡板瓶中接入少量活化后的菌种，25℃、200r/min培养48小时后再次转接，将经过第二次转接的菌液作为种子液使用；摇瓶发酵培养：将种子液接入装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶，25℃、200r/min培养4天；

S2生物量的测定：干重法：菌株发酵4天后，取100mL发酵液至已称重的50mL离心管中，8000r/min离心10min后，弃去上清液，去离子水震荡洗涤离心2次后弃去上清，然后将菌体置于-0.09～0.1Mpa、60℃～70℃的真空干燥箱中真空干燥，恒重后称量。

S3油脂含量测定：取一定量的干燥的裂殖壶藻粉通过索氏提取12h，计算油脂含量。

8.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤4)正交实验中的外源添加剂包括海水晶、柠檬酸、硝酸铵、K₂HPO₄、MgSO4。

9.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述步骤5)摇瓶培养的最优发酵参数为：

培养基组成：葡萄糖110g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5.5g/L，海水晶13g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵5g/L，K₂HPO₄2 g/L，MgSO₄4 g/L；

培养条件：PH:6-7，接种量：4％，培养时间：96h，温度：25℃。

10.根据权利要求1所述的一种培养高油脂含量裂殖壶藻的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺获得的菌体含量≥30g/L,油脂率≥30％。