CN101886044A - 二十二碳六烯酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

二十二碳六烯酸的制备方法，涉及一种不饱和脂肪酸。提供一种适于裂殖壶菌高密度生长，提高DHA产量的全合成培养基的制备方法。包括碳源、氨基酸、无机盐、维生素和微量元素。碳源为葡萄糖；氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸；维生素包括VB₁、VB₁₂、生物素、硫辛酸、叶酸；无机盐包括NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、Na₂HPO₄和KH₂PO₄；微量元素包括AlCl₃、H₃BO₃、ZnSO₄、MnCl₂、CuSO₄、FeSO₄、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；余为水。利用该合成培养基于摇瓶培养裂殖壶菌，DHA产量为9.8g/L。

Description

二十二碳六烯酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种不饱和脂肪酸，尤其是涉及一种使用全合成培养基培养海洋微生物生产高度不饱和脂肪酸的方法。

背景技术

已充分证明，增加人体内长链omega-3不饱和脂肪酸的饮食摄入量的有益效果，所述的DHA是最重要的长链omega-3不饱和脂肪酸之一，所述有益效果包括：(1)健脑益智，保护视力：研究表明，DHA对婴幼儿大脑的正常发育和成人大脑功能的正常发挥有非常重要的作用，它不仅能促进婴幼儿大脑和眼睛的发育，并提高其认知能力，而且影响成年人的大脑功能和行为反应，可有效地用于治疗阿尔茨海默型痴呆症并减少其发病率；(2)预防和治疗心血管疾病：DHA有明显的降血脂，降血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和升高血清密度的功效，并保持心血管健康(Thomas A.B.Sanders，Kelly Gleason，Bruce Griffin，George J.Miller.Influence of an algal triacylglycerol containing docosahexaenoic acid(22：6n-3)and docosapentaenoic acid(22：5n-6)on cardiovascular risk factors in healthy men and women.JBritish Journal of Nutrition.，2006，95：525-531)；(3)抑制炎性疾病(inflammatory diseases)(如风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘等)；(4)抗癌、抗肿瘤作用：有研究表明，DHA可成为一种新型的抗癌药物或辅助用药(矢泽一良.DHA的生理活性[J].油化学，1991，40：974-978；陈晓光.抗肿瘤药物研究策略与方向[R].专家论坛，2004，5(22)：11-17)。

由于DHA上述重要的生理功能，已引起人们越来越多的关注。现已发现几种异养的海洋微生物能高水平地生产这类重要的多不饱和脂肪酸，其中包括破囊壶菌属的海洋微生物。DHA作为长链不饱和脂肪酸，在不同的微生物体内有着不同的合成途径。大部分微生物都是通过脂肪酸合成酶系统(FAS)途径合成不饱和脂肪酸DHA，如破囊壶菌(Thraustochytrium)。杜冰等(杜冰，刘长海，姚汝华.微生物发酵法生产DHA的研究[J].食品科学，2005，26(3)：128-130)通过摇瓶培养破囊壶菌ATCC34304六天，DHA含量为0.32g/L。而另外一些微生物采用聚酮合成酶(PKS)途径合成不饱和脂肪酸DHA，如裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)、隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)等(Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production.J Biochimie，2004，86：807-815；Ana Mendes，Alberto Reis，Rita Vasconcelos，Pedro Guerra，Teresa Lopes da Silva.Crypthecodinium cohnii with emphasis on DHA production：a review.J Appl Phycol，2009，21：199-214；Jianzhong Huang，Xianzhang Jiang et al.Expressed sequence tag analysis of marine fungus Schizochytrium producing docosahexaenoic acid.J Journal of Biotechnology，2008，138：9-16)。王菊芳等(王菊芳，梁世中，陈峰.几种无机盐对隐甲藻生长和DHA产量的影响[J].湛江海洋大学学报，2001，21(4)：18-22)采用胰蛋白胨、酵母浸提粉做培养基，摇瓶培养隐甲Crypthecodinium cohnii ATCC30556三天，其最大生物量和DHA产量分别为3.31g/L和0.49g/L。张娟梅等(张娟梅，江贤章，黄建忠.裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512细胞油脂的研究[J].福建师范大学学报.2007，23(2)：75-80)采用葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、海水晶的天然培养基培养裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512，DHA产量为2.1g/L。

裂殖壶菌是用于生产DHA的最理想的微生物之一，其生长繁殖较快，耐机械搅拌，培养条件要求相对较低，产生的脂质成分简单且易于分离，已成为一株可商业化生产DHA的理想来源(周茂洪，周林.1株裂殖壶菌(Schizochytrium.sp1)的分离鉴定[J].微生物学通报，2006，33(4)：48-51；Richard B.B，Don D.M，Hansen M，et al.Enhanced production of Lipid containing polyenoic fatty acid by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermenters[P].美国专利US 6,607,900)。此外，Schizochytrium产生的脂质中长链不饱和脂肪酸(LC-PUFA)含量高，且成分比例与母乳中的脂质组成相近，已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用(K.Boswell，E.K.Koskelo，L.Carl，S.Glaza，D.J.Hensen，K.D.Williams and D.J.Kyle.Preclinical Evaluation of Single-cell Oils that are Highly Enriched with Arachidonic Acid and Docosahexaenoic Acid.Food and Chemical Toxicology，1996，34：585-593；Statement of the Scientific Panel on Dietetic Products，Nutrition and Allergies on a request from the Commission related to the addition of DHA-rich oil from micro algae to an extended range of foods.Request N°EFSA-Q-2005-286.European Food Safety Authority，expressed on 6 July 2006 at its 14th plenary meeting corresponding to item 8.2 of the agenda)。

用于培养裂殖壶菌的培养基可分为三类，即天然培养基、半合成培养基和合成培养基。天然培养基由化学成分不清楚或不衡定的天然有机物配制而成，包含动植物提取物如酵母粉、酪蛋白胨、大豆蛋白胨等；半合成培养基由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成；合成培养基由各种成分已知的化学物质组成，成分精确，重复性强，并且可避免产品被动植物提取物污染。而目前尚没有一种全合成培养基是针对性地根据裂殖壶菌的营养要求及代谢途径设计的，以高水平生产DHA的培养基。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可提高二十二碳六烯酸(DHA)产量的裂殖壶菌全合成培养基及其制备方法。

本发明的第二目的是提供一种采用所述裂殖壶菌全合成培养基培养裂殖壶菌的方法本发明的第三目的在于提供一种采用所述裂殖壶菌全合成培养基制备二十二碳六烯酸(DHA)的方法。

本发明所述裂殖壶菌全合成培养基的组成是：

碳源：葡萄糖100～130g/L；

氨基酸：丙氨酸1.8～2.2g/L、甲硫氨酸1.0～1.5g/L、半胱氨酸0.15～0.3g/L、赖氨酸0.2～0.5g/L、组氨酸1.2～1.4g/L、谷氨酸1.3～1.6g/L、谷氨酰胺1.3～1.6g/L、异亮氨酸1.2～1.5g/L、苏氨酸0.9～1.2g/L、色氨酸1.5～1.8g/L；

维生素：VB₁ 2～8mg/L，VB₁₂ 8～14mg/L，生物素3～9mg/L，硫辛酸15～30mg/L，叶酸38～42mg/L；

无机盐(人工海水)：NaCl 14～18g/L，KCl 0.3～0.5g/L，MgCl₂ 2.3～2.5g/L，CaCl₂ 0.6～0.75g/L，Na₂HPO₄ 0.35g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L；

微量元素：AlCl₃ 1～1.3mg/L，H₃BO₃ 20～25mg/L，ZnSO₄.7H₂O 2.6～3.0mg/L，MnCl₂.4H₂O 1.5～2mg/L，CuSO₄.5H₂O 2～3mg/L，FeSO₄.7H₂O 20～25mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 0.1～0.12mg/L；

其余为水。

本发明所述裂殖壶菌全合成培养基的制备方法包括以下步骤：

1)在全部无机盐溶液中加入碳源葡萄糖及氮源氨基酸后，用NaOH或柠檬酸调节pH至6.0～6.5，并灭菌，得到未添加维生素和微量元素的培养基；

在步骤1)中，所述灭菌，最好在115℃高压灭菌20min。

2)将所有的维生素和微量元素配成溶液后用膜过滤除菌，然后再加到步骤1)所得的培养基中，即制成裂殖壶菌全合成培养基。

在步骤2)中，所述膜的孔≤0.2μm。

采用本发明所述裂殖壶菌全合成培养基培养裂殖壶菌的方法包括以下步骤：

1)菌种：裂殖壶菌；

2)菌种活化：将保藏于-80℃的菌种转接于斜面，25℃、200r/min培养1～2天；一级种子：用接种环挑取活化的菌种，接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶，25℃、200r/min培养1天；二级种子：取4mL的一级种子，接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，25℃、200r/min培养1天；种子培养基为：30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水；

3)扩大培养：将二级种子以4％的接种量接种于全合成培养基，培养条件同上。

所述二十二碳六烯酸的制备方法如下：

采用所述裂殖壶菌全合成培养基于摇瓶培养裂殖壶菌，于25℃、200r/min培养4天，生物量达到58g/L，总油脂占细胞干重的51％，DHA产量为9.8g/L。

本发明是以天然培养基及半合成培养基为优化起点，对特定培养基组分如碳源、氮源、维生素的种类及其浓度进行优化，并向其中添加了无机盐溶液为海洋微生物裂殖壶菌提供一个适宜的生长环境，即采用人工海水(无机盐溶液)代替自然海水，使用方便，并避免了因地域不同而无机盐成分差异的缺陷。

本发明给出了采用海洋微生物裂殖壶菌Schizochytrium sp.利用PKS途径高水平生产DHA的全合成培养基及培养方法，此培养基是按照海洋真菌类微生物——裂殖壶菌(Schizochytrium Sp.)的营养要求精确设计的，各成分(包括微量元素、无机盐离子)的量都确切已知的，以此来提高微生物的生物量和DHA产量。该培养基的优点是成分精确，不含动植物提取物，实验重现性高。

附图说明

图1为实施例1中不同碳源对Schizochytrium sp.生物量、总油脂及DHA积累的影响结果。在图1中，横坐标为培养时间(h)，左纵坐标为细胞干重(■，g/L)和总油脂(●，g/L)，右纵坐标为DHA含量(▲，g/L)；图a为甘油，图b为果糖，图c为乳糖，图d为蔗糖，图e为葡萄糖。

图2为实施例2中氨基酸单一缺失图谱。在图2中，横坐标为每次实验中缺少的氨基酸组分，纵坐标为细胞干重与对照组相比的相对影响值，可为正、零、负值。其中横坐标的1～20分别代表20种氨基酸，其分别为1：半胱氨酸，2：亮氨酸，3：组氨酸，4：丙氨酸，5：色氨酸，6：甘氨酸，7：甲硫氨酸，8：天冬酰胺，9：谷氨酸，10：异亮氨酸，11：精氨酸，12：脯氨酸，13：缬氨酸，14：天冬氨酸，15：赖氨酸，16：谷氨酰胺，17：丝氨酸，18：苯丙氨酸，19：苏氨酸，20：酪氨酸。

图3为实施例5中单因子实验维生素对Schizochytrium sp.生长和DHA积累中的作用。在图3中，横坐标为维生素的浓度(mg/L)，纵坐标为细胞干重(g/L)和DHA含量(g/L)；图A为VB₁，图B为VB₂、图C为VB₁₂、图D为生物素、图E为硫辛酸，图F为叶酸；a为细胞干重，b为DHA。

具体实施方式

以下实施例更为详细地解释了本发明中的某些关键点，为更好地理解本发明提供了依据。

实施例1：不同碳源对Schizochytrium sp.发酵产DHA的影响

选取5种碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油)，分别以120g/L的浓度添加到培养基中，氮源为酵母膏，添加量为10g/L，以及人工海水无机盐溶液；装液量100ml/500ml，于25℃、200r/min培养4天，结果见图1。如图所示选取的五种碳源Schizochytrium sp.都能够利用，其中对甘油、乳糖利用较难，对葡萄糖、蔗糖、果糖的利用率较高。以葡萄糖为碳源，Schizochytrium sp.摇瓶生物量为36.1g/L，是果糖的1.2倍，甘油的2倍；其中DHA含量6.14g/L。因此，葡萄糖是Schizochytrium sp.生长繁殖的最佳碳源。

实施例2：氮源——氨基酸组分的单一缺失实验

本实施例设计了氨基酸单一缺失实验以筛选出对Schizochytrium sp.生长有显著作用的氨基酸组分。在实施例1的基础上，选用葡萄糖做碳源，20种基本氨基酸代替酵母膏，各氨基酸初始浓度均为0.5g/L，每次一种氨基酸缺失，其他氨基酸浓度保持不变，结果见图2。

如图2所示，20种基本蛋白质组分氨基酸，它们在Schizochytrium sp.生长和积累DHA的过程中所起到的作用大小各异。半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸等10种氨基酸缺失后，对Schizochytrium sp.生长和积累DHA影响相对比较大，同对照组(氨基酸未缺失)相比Schizochytrium sp.生物量积累明显减少，说明这些氨基酸在Schizochytrium sp.生长和积累DHA过程中扮演着比较重要的角色；丝氨酸、精氨酸、脯氨酸等7种氨基酸缺失后，Schizochytrium sp.生物量同对照组相比反而有所增加，说明这些氨基酸的存在会抑制Schizochytrium sp.生长，且不利于DHA的积累；亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺缺失后，Schizochytrium sp.生物量同对照组相当，表明该3种氨基酸对Schizochytrium sp.生长和积累DHA没有太大的影响。

实施例3：Schizochytrium sp.生长过程中氨基酸的利用情况

通过液相色谱对Schizochytrium sp.生长过程前后培养基中氨基酸组分进行分析，得到了Schizochytrium sp.生长过程中各种必须氨基酸的利用情况，如表1所示。

表1 Schizochytrium sp.生长过程中氨基酸的利用情况

实施例4：均匀设计法优化培养基中氨基酸组分

在实施例2和3的基础上运用均匀设计来优化必需氨基酸的组成，确定10种必需氨基酸为考察对象。固定培养基中的其他成分，采用10因素5水平20组实验的方式[U₂₀(5¹⁰)]考察了10种氨基酸对Schizochytrium sp.生长和积累DHA的影响(见表2)。

表2各考察氨基酸水平表

结合统计分析软件分析实验结果(见表3)，得到最优化的配比如下：

丙氨酸2.0(1.8～2.2)g/L；

甲硫氨酸1.2(1.0～1.5)g/L；

半胱氨酸0.2(0.15～0.3)g/L；

赖氨酸0.3(0.2～0.5)g/L；

组氨酸1.3(1.2～1.4)g/L；

谷氨酸1.4(1.3～1.6)g/L；

谷氨酰胺1.4(1.3～1.6)g/L；

异亮氨酸1.3(1.2～1.5)g/L；

苏氨酸1.0(0.9～1.2)g/L；

色氨酸1.6(1.5～1.8)g/L。

其中对DHA的积累影响显著因素依次是：丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸。将氨基酸组分代替传统氮源——酵母膏，微生物的生物量最大可提高32％。

表3均匀设计方案及实验结果

实施例5：维生素对Schizochytrium sp.生长和油脂积累中的作用

通过单因子实验，添加不同维生素考察Schizochytrium sp.生长和DHA积累情况，结果见图3。如图3所示，VB₁、VB₁₂、生物素、硫辛酸和叶酸对Schizochytrium sp.生长和积累DHA有一定的促进作用，而VB₂对Schizochytrium sp.生长和积累DHA没有促进作用，添加VB₂在某种程度上会抑制Schizochytrium sp.的生长。则各种维生素最适的添加量如下：VB₁ 5mg/L(2-8)、VB₁₂ 10mg/L(5-15)、生物素6mg/L(3-9)、硫辛酸20mg/L(15-30)、叶酸40mg/L(38-42)。

实施例6：正交设计法优化维生素组合

通过正交实验得出硫辛酸和VB₁₂对DHA积累有着较大的影响，其次是生物素、叶酸和VB₁。最佳维生素组合为：VB₁ 5mg/L(2-8)，VB₁₂ 14mg/L(8-14)，生物素6mg/L(3-9)，硫辛酸30mg/L(15-30)，叶酸40mg/L(38-42)。在发酵培养基中控制这些维生素处于亚适量水平，有可能使Schizochytrium sp.中负责降解油脂的酶活性降低，从而实现DHA的过量合成。因此维持这些维生素浓度之间的平衡对于DHA过量合成显得非常重要。

实施例7：优化合成培养基摇瓶培养裂殖壶菌

利用权力要求书所示的优化合成培养基于摇瓶培养裂殖壶菌，培养条件为：装液量100ml/500ml，于25℃、200r/min培养4天。生物量(细胞干重)达到58g/L，发酵液中葡萄糖浓度从120g/L下降至≤15g.L^-1，总油脂占生物量的51％，DHA产量为9.8g/L。

使用的裂殖壶菌也可从浙江温州乐清海湾红树林分离、筛选得到。

Claims (6)

1.裂殖壶菌全合成培养基，其特征在于其组成是：

碳源：葡萄糖100～130g/L；

氨基酸：丙氨酸1.8～2.2g/L、甲硫氨酸1.0～1.5g/L、半胱氨酸0.15～0.3g/L、赖氨酸0.2～0.5g/L、组氨酸1.2～1.4g/L、谷氨酸1.3～1.6g/L、谷氨酰胺1.3～1.6g/L、异亮氨酸1.2～1.5g/L、苏氨酸0.9～1.2g/L、色氨酸1.5～1.8g/L；

维生素：VB₁ 2～8mg/L，VB₁₂ 8～14mg/L，生物素3～9mg/L，硫辛酸15～30mg/L，叶酸38～42mg/L；

无机盐(人工海水)：NaCl 14～18g/L，KCl 0.3～0.5g/L，MgCl₂ 2.3～2.5g/L，CaCl₂ 0.6～0.75g/L，Na₂HPO₄ 0.35g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L；

微量元素：AlCl₃ 1～1.3mg/L，H₃BO₃ 20～25mg/L，ZnSO₄.7H₂O 2.6～3.0mg/L，MnCl₂.4H₂O 1.5～2mg/L，CuSO₄.5H₂O 2～3mg/L，FeSO₄.7H₂O 20～25mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 0.1～0.12mg/L；

余为水。

2.如权利要求1所述的裂殖壶菌全合成培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在全部无机盐溶液中加入碳源葡萄糖及氮源氨基酸后，用NaOH或柠檬酸调节pH至6.0～6.5，并灭菌，得到未添加维生素和微量元素的培养基；

2)将所有的维生素和微量元素配成溶液后用膜过滤除菌，然后再加到步骤1)所得的培养基中，即制成裂殖壶菌全合成培养基。

3.如权利要求2所述的裂殖壶菌全合成培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述灭菌，是在115℃高压灭菌20min。

4.如权利要求2所述的裂殖壶菌全合成培养基的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述膜的孔≤0.2μm。

5.采用如权利要求1所述裂殖壶菌全合成培养基培养裂殖壶菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)菌种：裂殖壶菌；

2)菌种活化：将保藏于-80℃的菌种转接于斜面，25℃、200r/min培养1～2天；一级种子：用接种环挑取活化的菌种，接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶，25℃、200r/min培养1天；二级种子：取4mL的一级种子，接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，25℃、200r/min培养1天；种子培养基为：30g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，0.5倍浓度自然海水；

3)扩大培养：将二级种子以4％的接种量接种于全合成培养基，培养条件同上。

6.采用如权利要求1所述裂殖壶菌全合成培养基制备二十二碳六烯酸的方法，其特征在于其步骤为：

采用所述裂殖壶菌全合成培养基于摇瓶培养裂殖壶菌，于25℃、200r/min培养4天，即得二十二碳六烯酸。

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