CN101709311A - 一种花生四烯酸的快速高产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生四烯酸的快速高产方法，以高山被孢霉为发酵菌株，发酵培养基中，总磷含量控制在0.5～0.9g/L。本发明方法通过控制磷浓度可明显缩短发酵周期，增加多不饱和脂肪酸的产量。
Description
技术领域
本发明主要涉及花生四烯酸的生产方法，具体涉及利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的快速高产方法。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸，具有多种生理活性：是构成神经组织的重要结构脂类，它对婴幼儿的脑发育和视力功能至关重要。它能帮助神经系统的信息正常传递，增强记忆，对人体视力、大脑功能和协调能力起着极为重要的作用【Carlson S.E.Long-chainpolyunsaturated fatty acids and development of human infant[J].Acta Paediatric Supplement，1999，430：72-77.】；是二十碳族生物活性物质如前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷A2(TXA2)、白三烯B4(LTB4)和C4(LTC4)的直接前体，这些生物活性物质对脂蛋白代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用【Meydani M.Modulation of platelet thromboxane A2 and aortic prostacyclin synthesisby dietary selenium and vitamin E[J].Biol.Trace Elem.Res.1992(33)：79-86；Greeberg-LevyS.H.，Budowski P.，Grossman S.Lipoxygenase and other enzymes of arachidonic acidmetabolism in the brain of chicks affected by nutritional encephalomalacia[J].Int.J.Biochem.1993，3(25)：403-409】；具有调节体内多种离子通道作用，维持细胞膜功能，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理功能，是人体必需的脂肪酸之一【Van derZee L.，Nelemans A.，Den Hertog A.Arachidonic acid is functioning as a second messenger inactivating the Ca2+entry process on H1-histam inoceptor stimulation in DDT1 MF-2 cells[J].Biochem.J.，1995，305(3)：859-864】。
花生四烯酸的生产方法，主要以发酵生产为主。CN1323904A的发酵培养基配方中，磷元素的来源主要是玉米粉糖化液800～1200mL，酵母粉12～18g/1000mL，牛肉膏3～6g/1000mL，KH2PO4 0.5～1.0g/1000mL，其中磷的含量较高，培养时间长达10～20天。
高山被孢霉发酵法被认为是生产AA的最好方法而被广泛研究报道，并且已经进行工业化生产。但是，针对培养基优化这方面的工作，大部分都集中在碳源和氮源两种主要物质上，而对于磷源的研究十分罕见。但是磷源作为微生物生长所必须的元素，在微生物体内起着极其重要的作用：1、微生物在充足好氧条件下，贮存磷酸盐作为能量储备，贮存的聚合磷酸盐可以转化为ATP，ATP的利用又可以释放出磷【姜登岭，张晓健.饮用水中磷对微生物生长的限制作用[J].中国给水排水，2004，20：26-28】。ATP作为细胞内的储能物质在微生物体内参与大量的化学反应过程。对于脂肪酸合成，葡萄糖经过糖酵解途径(EMP途径)和三羧酸循环(TCA循环)生成脂肪酸合成前体物质乙酰辅酶A，三羧酸转运体系为脂肪酸合成提供大量的还原力NADPH，脂肪酸在前体乙酰辅酶A和还原力的驱动下合成。在脂肪酸合成的一系列过程中，ATP作为高能磷酸键的载体，起到了关键性的作用。2、构建细胞结构组织【Xiaoli Shi，Liuyan Yang，Lijuan Jiang，Fanxiang Kong，Boqiang Qin，Guang Gao.Intracellular phosphorus metabolism and growth ofMicrocystis aeruginosa in dark/light cycles under various redox potential differenceconditions[J].Hydrobiologia，2007，581：167-176】，微生物细胞膜主要由磷脂双分子层构成，中间镶嵌着蛋白质，磷脂双分子层主要由碳氢氧磷组成。
对于调节磷浓度在微生物发酵研究中已有些报到，Riscaldati等利用少根根霉(Rhizopus arrhizus)NRRL1526进行延胡索酸发酵时，在磷限制条件下，用碳酸铵调节pH，延胡索酸关于消耗葡萄糖的得率比氨限制时明显提高。在不同KH2PO4浓度下，随着磷浓度的提高，发酵时间缩短，说明微生物发酵周期与磷浓度有关。在利用微生物合成聚羟基烷羧酸(PHA)时，使用磷限制的培养基有利于这种高分子化合物的生产。例如Lee等用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2442合成MCL-PHA，随着培养基中磷浓度的降低，PHA生产速率提高【叶勤，发酵过程原理【M】，化学工业出版社，2005，97-98】。Sousa-Pinto等利用Gelidium robustum产琼脂时同样发现培养基中的磷浓度对发酵周期和琼脂产率都有影响，发酵周期随着磷浓度增大而缩短，降低磷浓度有利于琼脂产率的提高【Isabel Sousa-Pinto，Ray Lewis，Miriam Polne-Fuller.The effect of phosphateconcentration on growth and agar content of Gelidium obustum(Gelidiaceae，Rhodophyta)inculture.Hydrobiologia，1996，326/327：437-443】。
因此，磷源的研究对于微生物发酵周期及产物合成非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种花生四烯酸的快速高产方法，该方法的建立是基于磷源对高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程影响的研究。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种花生四烯酸的快速高产方法，以高山被孢霉为发酵菌株，发酵培养基中，总磷含量为0.5～0.9g/L。
优选的，发酵培养基中，总磷含量为0.7g/L。
其中，所述的发酵培养基，以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源和磷源，以磷酸二氢钾为磷源。
具体的，所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖70～150g/L，酵母膏6～12g/L，KH2PO4 0.3～1.85g/L，MgSO·7H2O 0.5～1g/L，NaNO3 2～6g/L，泛酸钙0.1～2g/L，维生素C 0.2～1g/L，pH值7.0～8.0。优选的，所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO·7H2O 0.5g/L，NaNO3 3g/L，泛酸钙0.5g/L，维生素C 0.2g/L，pH值7.0。
上述的高山被孢霉使用的是高山被孢霉(Mortierella alpina)菌种ME-AA01，保藏编号CCTCC NO：M207067。
本发明的方法是在发明人对高山被孢霉的培养基中最小化磷元素用量试验中偶然发现的，即可以通过在培养基中控制磷浓度来缩短发酵周期，提高生物量和AA产量，加强AA合成中的关键酶——苹果酸酶的活性。
有益效果：本发明方法解决了由于磷浓度高而引起的高山被孢霉发酵时间长，花生四烯酸产量不够高等问题。通过本发明方法，发酵周期可缩短到6天，菌体合成油脂总量及花生四烯酸含量均较高，分别可达到14.8g/L和6.19g/L。
附图说明
图1是高山被孢霉在不同KH2PO4中的生长消耗葡萄糖曲线；
其中，KH2PO4(0.5)表示培养基中KH2PO4浓度为0.5g/L；
KH2PO4(1)表示培养基中KH2PO4浓度为1g/L；
KH2PO4(1.85)表示培养基中KH2PO4浓度为1.85g/L；
KH2PO4(4)表示培养基中KH2PO4浓度为4g/L；
KH2PO4(7)表示培养基中KH2PO4浓度为7g/L；
KH2PO4(10)表示培养基中KH2PO4浓度为10g/L。
图2是高山被孢霉在不同KH2PO4中生长时，发酵液中P浓度随发酵时间变化情况；
其中，KH2PO4(0.5)表示培养基中KH2PO4浓度为0.5g/L；
KH2PO4(1)表示培养基中KH2PO4浓度为1g/L；
KH2PO4(2.5)表示培养基中KH2PO4浓度为2.5g/L；
KH2PO4(4)表示培养基中KH2PO4浓度为4g/L；
KH2PO4(7)表示培养基中KH2PO4浓度为7g/L；
KH2PO4(10)表示培养基中KH2PO4浓度为10g/L。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例的总磷含量检测方法参照GB 11893-89水质总磷的测定，钼酸铵分光光度法。
实施例1：发酵培养基中总磷0.5g/L。
菌种活化：将保藏编号为CCTCC NO：M207067的高山被孢霉菌种ME-AA01接种于PDA斜面28℃培养7天。PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
种子活化：培养7天的PDA斜面用无菌水洗下菌丝，接入摇瓶活化。摇瓶活化培养基包含质量体积比的下列物质(％表示g/100mL，以下实施例相同)：葡萄糖3％，酵母膏0.6％，KH2PO4 0.3％，NaNO3 0.3％，MgSO4·7H20 0.05％，其余为水，pH值7.0，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，120rpm，25℃，活化3天。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵5天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到油脂，干重40.8g/L；油脂20.2g/L；AA12.7g/L。
表1：实施例1发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 0.19 |
| 棕榈酸(16∶0) | 6.55 |
| 硬脂酸(18∶0) | 9.66 |
| 油酸(18∶1) | 7.77 |
| 亚油酸(18∶2) | 4.60 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 2.74 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.67 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.93 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 63.00 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.93 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.59 |
| 其他脂肪酸 | 0.37 |
实施例2：发酵培养基中总磷0.7g/L。
菌种活化与种子活化同实例1。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵5天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏出去即得到油脂，干重42.6g/L；油脂21.6g/L；AA13.9g/L。
表2：实施例2发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 0.56 |
| 棕榈酸(16∶0) | 6.91 |
| 硬脂酸(18∶0) | 9.68 |
| 十四烷酸(14∶0) | 0.56 |
| 油酸(18∶1) | 7.83 |
| 亚油酸(18∶2) | 4.28 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 1.97 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.69 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.46 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 64.00 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.82 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.52 |
| 其他脂肪酸 | 0.27 |
实施例3：发酵培养基中总磷0.9g/L。
菌种活化与种子活化同实例1。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 0.185％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵5.5天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏出去即得到油脂，干重41g/L；油脂21.2g/L；AA12.7g/L。
表3：实施例3发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 0.75 |
| 棕榈酸(16∶0) | 8.47 |
| 硬脂酸(18∶0) | 9.36 |
| 油酸(18∶1) | 9.89 |
| 亚油酸(18∶2) | 4.30 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 1.89 |
| 十四烷酸(14∶0) | 0.75 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.63 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.43 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 60.00 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.83 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.56 |
| 其他脂肪酸 | 0.89 |
实施例4：发酵培养基中总磷1.5g/L。
菌种活化与种子活化同实例1。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 0.4％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵7天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏出去即得到油脂，干重37.1g/L；油脂19.4g/L；AA10.9g/L。
表4：实施例4发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 1.07 |
| 棕榈酸(16∶0) | 9.73 |
| 硬脂酸(18∶0) | 10.55 |
| 油酸(18∶1) | 11.37 |
| 亚油酸(18∶2) | 4.30 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 1.69 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.66 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.50 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 56.00 |
| 十四烷酸(14∶0) | 1.07 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.84 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.60 |
| 其他脂肪酸 | 0.69 |
实施例5：发酵培养基中总磷2g/L。
菌种活化与种子活化同实例1。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 0.7％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵8天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏出去即得到油脂，干重33.9g/L；油脂17.4g/L；AA9.1g/L。
表5：实施例5发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 1.27 |
| 棕榈酸(16∶0) | 10.87 |
| 硬脂酸(18∶0) | 11.22 |
| 油酸(18∶1) | 12.76 |
| 亚油酸(18∶2) | 4.44 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 1.93 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.66 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.67 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 52.00 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.88 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.75 |
| 其他脂肪酸 | 0.54 |
实施例6：发酵培养基中总磷3g/L。
菌种活化与种子活化同实例1。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％(v/v)，装液量：250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm。发酵培养基包含质量体积比下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.8％，KH2PO4 1％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaNO3 0.3％，泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水，pH值7.0。
发酵8天后用双层滤纸收集湿菌体，60℃烘干，磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏出去即得到油脂，干重34.8g/L；油脂18.1g/L；AA10.0g/L。
表6：实施例6发酵后油脂组成(w/w％)
| 十四烷酸(14∶0) | 1.15 |
| 棕榈酸(16∶0) | 11.16 |
| 硬脂酸(18∶0) | 10.07 |
| 油酸(18∶1) | 12.26 |
| 亚油酸(18∶2) | 3.73 |
| γ-亚麻酸(18∶3) | 1.75 |
| 二十烷酸(20∶0) | 0.54 |
| 二十碳三烯酸(20∶3n6) | 2.52 |
| 花生四烯酸(20∶4) | 55.00 |
| 二十二烷酸(22∶0) | 0.86 |
| 二十四烷酸(24∶0) | 0.65 |
| 其他脂肪酸 | 0.31 |
上述实施例中，高山被孢霉在不同KH2PO4中的生长消耗葡萄糖曲线见图1，高山被孢霉在不同KH2PO4中生长时，发酵液中P浓度随发酵时间变化情况见图2。
Claims (6)
1.一种花生四烯酸的快速高产方法，以高山被孢霉为发酵菌株，其特征在于发酵培养基中，总磷含量为0.5～0.9g/L。
2.根据权利要求1所述的花生四烯酸的快速高产方法，其特征在于发酵培养基中，总磷含量为0.7g/L。
3.根据权利要求1所述的花生四烯酸的快速高产方法，其特征在于所述的发酵培养基，以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，以磷酸二氢钾为磷源。
4.根据权利要求3所述的花生四烯酸的快速高产方法，其特征在于所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖70～150g/L，酵母膏6～12g/L，KH2PO40.3～1.85g/L，MgSO·7H2O 0.5～1g/L，NaNO32～6g/L，泛酸钙0.1～2g/L，维生素C 0.2～1g/L，pH值7.0～8.0。
5.根据权利要求4所述的花生四烯酸的快速高产方法，其特征在于所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaNO33g/L，泛酸钙0.5g/L，维生素C 0.2g/L，pH值7.0。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的花生四烯酸的快速高产方法，其特征在于所述的高山被孢霉为CCTCC NO：M207067。
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