CN103215196B - 一株酿酒酵母及其在干白葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株酿酒酵母，保藏编号为CCTCC NO: M 2012501。该酿酒酵母抗逆性强，耐高糖，耐高温，耐高酒精，耐渗性好，产酒精度高，可广泛应用于中国产区特色白葡萄品种的优质白葡萄酒酿制。本发明的酿酒酵母发酵薏丝琳葡萄酿制成的新酒比商业酵母CY3079发酵的新酒澄清度更好，香气更加柔和协调，口感更加醇厚顺口、挂壁感更好。发酵霞多丽葡萄亦符合这个特点。本发明的酿酒酵母比对照CY3079能更好的挖掘中国产地薏丝琳葡萄、霞多丽葡萄的特色，发挥其酿造潜力，使其酿造特性得到了更好的展现。本发明的酿酒酵母也适合于中国产地白诗南、雷司令、龙眼等白葡萄品种的发酵，酿制特色优质干白葡萄酒，也可用于苹果酒、香梨酒等各种特色高端果露酒及普通果酒的酿制。

Description

一株酿酒酵母及其在干白葡萄酒酿造中的应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一株酿酒酵母菌株及其在发酵特色优质干白葡萄酒中的应用。

背景技术

白葡萄酒是以新鲜葡萄汁为原料经酵母发酵酿制而成的饮料酒。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中由酵母菌主导的酒精发酵是葡萄酒生产最重要的阶段之一。酵母菌的生物多样性及微生物群体组成对白葡萄酒的感观质量具有重要影响。

国内对葡萄酒酵母的研究和生产起步较晚，我国果酒用商业酵母的研究开发，以始于1986年的安琪酵母为代表，但由于产品种类少，专业化程度远远不能满足生产需求，因而在葡萄酒行业应用很少。目前国内葡萄酒行业大多使用进口葡萄酒活性干酵母进行生产，多来自欧美等国，价格昂贵。

长期使用进口葡萄酒活性干酵母进行葡萄酒生产，不仅让企业和国家损失大量外汇，更为重要的是会影响中国本土区域化特色葡萄酿酒酵母菌的生物多样性，对自然发酵菌种产生相当的抑制作用，使得由自然发酵产生的风味和香气物质消失，最终导致产品的同质化，缺乏地域特征。因此，加强我国本土葡萄酒酵母菌资源的开发与利用，进行中国原产地葡萄酒相关酵母及野生葡萄酒酵母的研究，选育适合中国各区域葡萄原料发酵的特色葡萄酒酵母，对于生产具有中国本土地区特色的优质葡萄酒，创造中国特色的地方名牌葡萄酒(形成葡萄酒中的“茅台、五粮液、西凤”)，促进中国葡萄酒产品差异特色化及中国葡萄酒特质文化的形成；打破国外葡萄酒辅料商垄断中国市场，降低葡萄酒生产成本，促进我国葡萄酒产业的健康发展具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株适用于中国地区白葡萄原料发酵的特色酿酒酵母。该菌株也可用于苹果酒、香梨酒等各种特色高端果露酒及普通果酒的酿造。

本发明一方面提供了一种酿酒酵母WW1211（Saccharomyces cerevisiaeWW1211），于2012年12月5日保藏在位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2012501。

本发明一方面提供了上述酿酒酵母在酿制干白葡萄酒中的应用。

本发明还提供了上述酿酒酵母在酿制苹果酒、梨酒等各种果露酒中的应用。

本发明的酿酒酵母抗逆性强，耐高糖，耐高温，耐高酒精，耐渗性好，产酒精度高，可广泛应用于中国产区各个特色白葡萄品种的优质白葡萄酒的酿制。本发明的酿酒酵母发酵薏丝琳葡萄原料酿制而成的新酒比商业酵母CY3079发酵的新酒澄清度更好，香气更加柔和协调，口感更加醇厚顺口、挂壁感更好。本发明的酿酒酵母比对照CY3079能更好的挖掘中国产地薏丝琳葡萄的特色，发挥其酿造潜力，使其酿造特性得到了更好的展现，对于酿造特色优质干白葡萄酒具有重要意义。本发明的酿酒酵母也适合于国产霞多丽葡萄及白诗南、雷司令、龙眼等白葡萄品种的特色发酵，酿制优质干白葡萄酒，也可用于苹果酒、香梨酒等各种特色高端果露酒及普通果酒的酿制。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明。

下述实施例中各培养基的配方如下：

YPD培养基：酵母粉10g/1000ml，蛋白胨20g/1000ml，葡萄糖20g/1000ml,自然pH值、115℃、20min高压灭菌。固体培养基加入20g/1000ml琼脂粉。

WL琼脂培养基：酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%,琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.0425%，氯化钙0.0125%，氯化铁0.00025%，硫酸镁0.0125%，硫酸锰0.00025%，溴甲酚绿0.0022%，pH值为6.5，121℃、20min高压灭菌。

赖氨酸培养基(1-1):D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对-氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结晶硫酸镁500mg氯化钠100mg，结晶氯化钙100mg，赖氨酸盐酸盐2.5g，琼脂20g，pH值自然，121℃、20min高压灭菌。

糖发酵培养基、同化氮源基础培养基、同化碳源基础培养基、产酯培养基、产生类淀粉化合物培养基、高渗透压培养基均采用常规配方。

实施例1酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WW1211的分离纯化与筛选

1、出发菌株的选育

（1）果表酵母分离无菌称量10g成熟葡萄，放入盛有90ml无菌水三角瓶，震荡培养30mi n，制成菌悬液，准确吸取50ul放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24-28h；

（2）自然发酵酵母分离无菌称量约100g新鲜成熟度好的葡萄，放入无菌500ml三角瓶，以无菌研锤破碎，置于27℃培养，每隔24h取发酵液1ml，加入9ml无菌水中进行梯度稀释至10^-7，取50ul稀释后菌液放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24-28h；

（3）对（1）（2）中YPD培养48h的酵母菌株，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入YPD固体平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落后，转接至斜面试管作为出发菌株，得到283株菌。

2、酵母菌株初筛

（1）镜检初筛对斜面试管菌株在YPD液体培养基中培养48h，以16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株，得到108株菌；

（2）WL琼脂培养基筛选将镜检筛选出的菌株，接种YPD液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）-绿色，球形突起的表面光滑、不透明、奶油状的菌株，得到54株菌；

（3）菌株发酵力及产香特性筛选将WL培养基筛选出的菌株，接种到倒扣杜氏管的YPD液体试管培养基中，27℃培养，检测4h、6h、8h、10h的产气情况（以产气至杜氏管体积计发酵力）和产香特性（分为有异味、香气淡、香气稍好、香气浓郁四个级别），筛选出10h内产气满管、产香不错或产香浓郁的菌株，得到18株菌。

3、模拟酒精发酵复筛

将上述得到的18株菌株接种到含糖20%的100mlYPD液体摇瓶培养基中，27℃培养96h，检测模拟酒精发酵后的CO₂失重量（g）、酒精度（%vol）及产香情况，筛选出发酵后CO₂失重量在10g以上，酒精度在9%以上，产香较好或浓郁的菌株，得到14株菌。

4、复筛得到酵母菌株耐高糖、耐高温、耐酒精、耐渗性等抗逆性评价及最高产酒精度试验

（1）酵母菌株耐高糖评价将模拟酒精发酵得到的14株菌同时接到含有600g/L葡萄糖YPD液体试管培养基和固体平板培养基上，27℃培养，观察液体试管培养48h的产气情况及固体平板培养96h的菌株存活情况和菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株；

（2）酵母菌株耐高温评价将模拟酒精发酵得到的14株菌采用50℃和55℃两个温度点处理，水浴培养12h后，观察供试菌株产气情况（均为产气），然后点种到YPD平板上的28℃下培养48-72h，观察菌落生长情况，筛选出菌落生长良好且菌落较大的菌株；

（3）酵母菌株耐酒精评价将模拟酒精发酵得到的14株菌分别接到YPD含有12%、16%、20%乙醇的液体试管培养基和含有12%、16%、20%乙醇的固体平板培养基上，27℃培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株；

（4）酵母菌株耐渗性评价将模拟酒精发酵得到的14株菌分别接到YPD含有100g/L、120g/LNaCl的液体试管培养基和含有100g/L、120g/LNaCl的固体平板培养基上，27℃培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株

（5）菌株最高产酒精度试验将模拟酒精发酵得到的14株菌接到120ml含20g/L糖度的含30%蔗糖西瓜汁发酵液中，27℃培养，检测发酵96h后的CO₂失重量（g）、酒精度（%vol）及产香情况，筛选出发酵后产酒精度较高（12.5%以上），产香较好或浓郁的菌株；

综合（1）（2）（3）（4）（5）优筛，得到6株菌。

5、优筛菌株模拟葡萄汁培养基发酵筛选

把6株优筛菌株分别以1×10⁶CFU/mL接种量接种于400ml模拟红葡萄原料培养基（300mL玫瑰香葡萄破碎液，添加10%蔗糖）中，20℃模拟发酵静置培养45d左右，检测发酵酒样的CO₂失重量（g）、酒精度（%vol）、总酸（以酒石酸计，g/L）、挥发酸（以乙酸计，g/L）、总糖（g/L）、还原糖（g/L）等基本理化指标，并作产香香气分析和简单感官评价，筛选出整体表现优良的菌株，得到2株菌。

6、菌株以梅鹿辄、赤霞珠葡萄原料4L发酵小试和400L发酵中试筛选

2株菌以1×10⁶CFU/mL接种量分别接种于采自甘肃民勤县、武威市和青岛平度市、烟台蓬莱等地葡萄园的以蔗糖调糖度为20%的薏丝琳、霞多丽葡萄汁中，进行优筛菌种4L发酵小试实验和400L发酵中试实验，均以商业酵母法国拉曼公司的CY3079作为对照菌株，20℃模拟发酵，45d左右（中试样品定期检测，后熟半年后进行专家感官品评），检测发酵酒样的CO₂失重量（g）、酒精度（%vol）、总酸（以酒石酸计，g/L）、挥发酸（以乙酸计，g/L）、总糖（g/L）、还原糖（g/L）等基本理化指标，并作产香香气分析和专家感官品评，筛选出整体表现突出的菌株，得到酵母菌株WW1211，具体步骤如实施实例3所述。

实施例2酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WW1211菌株的鉴定

1、赖氨酸培养基鉴定（酿酒酵母不能采用赖氨酸作为氮源因而在该培养基上不能生长）

将酵母菌株WW1211接种YPD液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种到5mL无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸培养基，27℃培养5d后观察没有酵母生长，继续培养和观察，直到15d后仍无菌落生长，说明该菌株是酿酒酵母。

2、生理生化鉴定

将酵母菌株WW1211分别接种到各培养基上进行糖发酵（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、菊糖）、碳源同化（鼠李糖、L-阿拉伯糖、肌醇、纤维二塘、可溶性淀粉、菊糖、甲醇、D-木糖、山梨糖、柠檬酸）、氮源同化（硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、L-赖氨酸）、产生类淀粉及产酯、耐渗透压等生理生化鉴定，以商业酵母CY3079作为对照，结果如下：

表1酵母菌株糖发酵鉴定结果

表2酵母菌株碳源同化鉴定结果

表3酵母菌株氮源同化鉴定结果

表4酵母菌株耐高渗透压、产酯和抗放线菌酮鉴定结果

注：上述表格中，“+”表示菌体生长，鉴定结果阳性；“-”表示菌体不生长，鉴定结果阴性。

鉴定结果表明，酵母菌株WW1211能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖，不发酵乳糖、核糖、菊糖；碳源同化-发酵的糖全部同化，不同化乳糖、鼠李糖、肌醇、菊糖、纤维二塘、甲醇、L-阿拉伯糖、D-木糖、山梨糖、可溶性淀粉、柠檬酸；氮源同化硫酸铵、天门冬素，不同化硫酸钾、亚硝酸钠、赖氨酸；耐高渗压，产酯，不抗放线菌酮。对照《酵母菌特征与鉴定手册》，确定是酿酒酵母菌。

3、分子鉴定

采用26SrDNA酵母菌分子鉴定的常规方法鉴定酵母菌株WW1211，结果见下表

表5酵母菌株WW1211-26SrDNAD1/D2区序列同源比对分析结果

鉴定结果表明，酵母菌株WW1211为酿酒酵母。

综合上述三种鉴定方法，酵母菌株WW1211均被鉴定为酿酒酵母。将该菌株命名为酿酒酵母WW1211（Saccharomyces cerevisiae WW1211），于2012年12月5日送交“中国典型培养物保藏中心”保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2012501。

实施例3酿酒酵母WW1211在酿制特色优质干白葡萄酒中的应用

（以商业活性干酵母CY3079作为对照，4L小试）

1、干白葡萄酒酿制工艺

2、酿酒酵母WW1211种子液制备

将保存于YPD试管斜面的S.cerevisiae WW1211菌株转接于液体葡萄汁培养基，糖度自然（16%左右）、pH自然，20℃培养16-24h，得到酵母种子液（商业活性干酵母CY3079按使用说明书活化）。

3、原料发酵液制备与接种发酵

将采自胶东半岛和甘肃武威的成熟度好的新鲜薏丝琳、霞多丽葡萄分别破碎除梗、压榨取汁，同时按葡萄汁重量的50-60ppm加入SO₂，按终糖度200g/L添加蔗糖，分别取400mL葡萄汁装入500mL的三角瓶进行发酵，按葡萄汁比例50ml/L添加果胶酶，按1×10⁶CFU/mL接种量接入酵母种子液，开始主发酵（控制主发酵温度15-20℃），按1所述工艺完成整个过程。

4、原酒的理化指标检测

表6胶东半岛薏丝琳葡萄原料发酵原酒理化指标表

表7甘肃武威薏丝琳葡萄原料发酵原酒理化指标表

表8胶东半岛霞多丽葡萄原料发酵原酒理化指标表

表9甘肃武威霞多丽葡萄原料发酵原酒理化指标表

综合两个不同产地薏丝琳葡萄原料发酵原酒的理化指标分析，S.cerevisiae WW1211菌株发酵的原酒与商业酵母CY3079差别不大，但同样条件下发酵的酒度更高；总酸和挥发酸更低；总糖和还原糖更低，原酒质量更好；二个不同产地霞多丽葡萄原料发酵原酒的理化指标分析亦符合这个特点。

5、完成后发酵新酒感官品评

对完成后发酵的新酒进行感官品评，评酒专家组由2个来自高校的国家级品酒师（教授）和1个来自企业的省葡萄酒评委（丰富经验）组成，品评方式均为盲评。总结3位专家的品评结果，他们一致认为：

S.cerevisiae WW1211菌株发酵二个不同产地薏丝琳葡萄原料酿制而成的新酒风格差别不大，均符合优质干白葡萄酒的典型风格，却比商业酵母CY3079发酵的新酒澄清度更好，香气更加柔和协调，口感更加醇厚顺口、挂壁感更好；S.cerevisiae WW1211菌株发酵两个不同产地霞多丽葡萄原料酿制成的新酒亦符合这个特点。

实施例4酿酒酵母WW1211在酿制特色优质干白葡萄酒中的应用

（以商业活性干酵母CY3079作为对照，400L中试）

1、干白葡萄酒酿制工艺

2、酿酒酵母WW1211种子液制备

将保存于YPD试管斜面的S.cerevisiae WW1211菌株转接于液体葡萄汁培养基，糖度自然（16%左右）、pH自然，20℃培养16-24h，得到酵母种子液（商业活性干酵母CY3079按使用说明书活化）。

3、原料发酵液制备与接种发酵

将采自胶东半岛的成熟度好的新鲜薏丝琳葡萄除梗、破碎、压榨、分离皮渣取汁，按葡萄汁重量的50-60ppm加入SO₂，按终糖度200g/L添加蔗糖，泵入500L的发酵罐，倒一次罐，倒罐时按发酵液50ml/L添加果胶酶，按1×10⁶CFU/mL接种量接入酵母种子液，开始主发酵（控制主发酵温度15-20℃），按1所述工艺完成整个过程。

4、不同菌株发酵葡萄酒的理化指标检测

表10S.cerevisiae WW1211菌株和对照CY3079发酵葡萄酒理化指标对比表

由表10可知，S.cerevisiae WW1211菌株发酵特性比商业酵母CY3079更好，发酵酒度更高，总糖、还原糖和挥发酸更低。

5、不同菌株发酵葡萄酒的香气分析

表11S.cerevisiae WW1211菌株和对照CY3079发酵葡萄酒香气分析和含量对比表

表11是利用GC-MS技术检测的优选S.cerevisiae WW1211菌株与对照CY3079发酵后陈酿半年新酒的香气成分，可以看出，主要是酯、醇、酸三类物质，酮、醚、醛及其它类物质含量较少；S.cerevisiae WW1211菌株与对照CY3079发酵酒样分别检出总香气成分为45种和37种，其中酯类物质分别为24种和17种，醇类物质分别为10种和7种，酸类物质分别是3种和5种，醛类物质分别是1种和4种，酮类物质分别为5种和3种，S.cerevisiae WW1211菌株发酵酒样中检出一种醚类和一种酚类成分；在发酵香气的复杂性方面，对比CY3079，S.cerevisiae WW1211菌株无论是香气物质总种类，还是酯类、醇类物质种类均多于CY3079，复杂的香气成分必将赋予葡萄酒复杂的口感和味感，从而赋予葡萄酒更多的个性和特质。

6、不同菌株发酵新酒专家感官品评

评酒专家组由三名高校多年从事葡萄酒研究的教授（国家葡萄酒评委），四名来自企业的酿酒工程师（二名国家级葡萄酒评委，二名省级果露酒评委）和三名葡萄酒专业的研究生组成，兼顾企业及研究人员，具有较高的权威性和合理性。

表12中试葡萄酒专家感官品评（盲评）

由专家品评结果可知，专家组中绝大多数专家对本发明的S.cerevisiaeWW1211菌株发酵酒样评价比较高，认为比对照CY3079发酵酒样更优（6位）或相当（2位）。

综合香气成分分析结果，本发明的S.cerevisiae WW1211菌株比对照CY3079能更好的挖掘中国产地薏丝琳葡萄的特色，发挥其酿造潜力，使其酿造特性得到了更好的展现，对于酿造特色优质干白葡萄酒具有重要意义。

S.cerevisiae WW1211菌株亦适合于国产霞多丽及白诗南、雷司令、龙眼等白葡萄品种的发酵，酿制特色优质干白葡萄酒，也可用于苹果酒、香梨酒等特色高端果露酒的发酵及普通果酒的酿制。

Claims (3)

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其保藏编号为CCTCC NO:M2012501。

2.权利要求1所述的酿酒酵母在葡萄酒酿制中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的葡萄酒为白葡萄酒。