CN105420131A - 一种耐高糖酵母菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种耐高糖酵母菌及其应用。所述的耐高糖酵母菌为蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces？mellis)LGL-1，其保藏编号为CCTCC？No.M2015545。所述的耐高糖酵母菌延滞期相对较短，对数生长期和平衡期较长，运用于实际生产中可节约成本；特别是其具有很好的抗逆性，如可耐受浓度为70％(w/v)的总糖，耐受浓度为12％(v/v)的酒精，当pH为2.5时，所述的耐高糖酵母菌可正常快速的生长，耐酸能力较强。

Description

一种耐高糖酵母菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种耐高糖酵母菌及其应用。
背景技术
酵母是一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵转化成酒精和二氧化碳，是一种天然发酵剂，分布于整个自然界，它有自己的生命现象，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧气和没有氧气存在的条件下都能够存活。目前,已知的酵母菌已有500多种,共有56个属,分别属于半知菌亚门、子囊菌亚门及担子菌亚门。
随着经济的发展，酒精工业生产的新趋势是浓醪发酵，该发酵工艺最大的特点是生成的酒精浓度较高，同时醪液中的糖浓度也高。酒精生产过程中，酒精度的提高可以降低蒸馏时的能耗，发酵时应尽可能地提高成熟醪的酒精度。而酒精含量对酵母菌的正常生长影响很大，在乙醇浓度超过12％左右时，普通酵母发酵会受到不同程度的抑制。不能在含糖浓度高的条件下良好发酵的菌株，其产酒率必然大受影响。所以有必要筛选出、高糖耐受性较高的菌株，这样可以很好的为酒精工业的生产服务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中已知酵母菌的抗逆性不强的缺点，提供一种耐高糖酵母菌。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1，其保藏编号为CCTCCNo.M2015545。该菌株已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学)。
本发明所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1是发明人通过大量的实验筛选出来的新的具有优异抗逆性能的酵母菌株，所述菌株能在现有酵母菌不能发酵的条件下(如高糖、高酒精、高酸性条件)发酵生产酒精，具有了新的突破。因此，本发明新菌株的应用可大幅提高酿酒工业的产酒率。
所述蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1的主要形态特征如下：细胞形态特征为圆形，多端出芽明显，进行无性生殖；菌落特征为在固体培养基中菌落凸起偏小、生长较慢、乳白色、表面光滑、偏干、菌落边缘整齐、平板有酒香。
所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1通过如下方法筛选得到：
S1.将稀释10～1000倍的蜂蜜倒入装有麦芽汁琼脂培养基的培养皿中，在25～30℃的恒温条件下培养1.5～3d，观察菌株的生长情况，挑取单菌落，于显微镜下观察，根据酵母菌的形态特征，筛选出酵母菌；
S2.将经步骤S1.筛选出来的酵母菌，于装有含糖浓度为68～75％(w/v)麦芽汁琼脂培养基的培养皿中划线，在25～30℃的恒温条件下培养1.5～3d，并观察菌株的生长情况；将长出的菌株挑取单菌落划线分离1～3次，直至分离出单菌落；再将单菌落置于显微镜下观察，根据蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1的形态特征，筛选出纯的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1。
优选地，S1中所述的蜂蜜为百花蜜。
优选地，S1中的培养条件为在28℃的恒温条件下培养2d。
优选地，S2中所述麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：将葡萄糖、麦芽汁粉、去离子水，以及琼脂粉于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。
更优选地，S2中所述麦芽汁琼脂培养基的含糖浓度为70％(w/v)。
最优选地，S2中所述的含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：
称取葡萄糖138g，麦芽汁粉13g，去离子水100mL，琼脂粉2g，于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。
优选地，S2中的培养条件为在28℃的恒温条件下培养2d。
所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1在酿酒生产中的应用。
所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1在生产工业酒精中的应用。
有益效果：本发明提供了一株新颖的酵母菌菌株，其延滞期相对较短，对数生长期和平衡期较长，运用于实际生产中可节约成本，尤其是所述菌株具有很好的抗逆性。实施例数据显示所述菌株的延滞期为22h左右，对数生长期为20h左右，平衡期为15h左右；可耐受浓度为70％(w/v)的总糖，耐受浓度为12％(v/v)的酒精，当pH为2.5时，所述的耐高糖酵母菌可正常快速的生长，耐酸能力较强；实施例数据还显示所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1能在高浓度糖环境下发酵产生酒精，而现有技术常用的安琪葡萄酒活性干酵母BV818及安琪果酒专用酵母SY在同样的高糖环境下基本没有发酵能力。
附图说明
图1为本发明所菌株的生长曲线。
图2为菌株BV818的生长曲线。
图3为菌株SY的生长曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1的筛选
S1.在超净工作台中，将稀释100倍的百花蜜倒入麦芽汁琼脂培养基的培养皿中，在28℃的恒温培养箱中进行培养2d，观察菌株的生长情况，挑取单菌落，于显微镜下观察，根据酵母菌的形态特征，筛选出酵母菌；
S2.将经步骤S1.筛选出来的酵母菌，于装有含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基的培养皿中划线，在28℃的恒温培养箱中进行培养2d，并观察菌株的生长情况；将长出的菌株挑取单菌落划线分离3次，直至分离出单菌落；再将单菌落置于显微镜下观察，筛选出具有如下形态特征的菌落即为蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1，细胞形态特征为圆形，多端出芽明显，进行无性生殖；菌落特征为在固体培养基中菌落凸起偏小、生长较慢、乳白色、表面光滑、偏干、菌落边缘整齐、平板有酒香。所述的含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：
称取葡萄糖138g，麦芽汁粉13g，去离子水100mL，琼脂粉2g，于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。
实施例2蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1抗逆性实验
传代培养：将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1在装有含糖浓度为70％(w/v)麦芽汁琼脂培养基(制备方法同实施例1)的培养皿上划线，于28℃的恒温培养箱中进行培养2d，进行传代培养，并观察菌株的生长情况，重复上述实验步骤，直至筛选出纯蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1为止，并将传代得到的菌株于含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基的试管中进行保存。
扩大培养：上述传代培养得到的菌株挑取两环，于盛有糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁培养基的试管中，于28℃的恒温培养箱中培养2d；将培养的菌悬液倒入盛有糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁培养基的锥形瓶中，于28℃的恒温培养箱中继续培养2d，待用。进行下述抗逆性测试。
同时，将安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY活化后按照上述扩大培养的方法扩大培养两种酵母菌，用作对比实验。所述的活化方法为：称取所需酵母，按比例1:20(w/v)加入2％蔗糖溶液中，于38℃水浴锅中水浴30-35min，期间需搅拌均匀后静置。
(1)生长曲线的绘制
挑选上述传代培养得到的本发明所述的菌株以及活化的安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY，接2环到盛有糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁培养基的试管中，于28℃的恒温培养箱中培养2d；再接到盛有相同培养基的锥形瓶中，每隔4h，在波长为560nm处测定OD值，并以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标做生长曲线图。
如图1所示，当培养基中糖浓度为70％(w/v)时，本发明所述菌株的延滞期为22h左右，对数生长期为20h左右，平衡期为15h左右，延滞期相对较短，对数生长期和平衡期较长，该菌株运用于实际生产中可节约生产成本。
而当培养基中糖浓度为70％(w/v)时，菌株BV818的延滞期为56h左右，对数生长期为8h左右，平衡期为20h左右，延滞期相对较长，会增加实际生产中的生产成本，利润太低，该菌株无法给高糖度发酵提供发酵剂(如图2所示)。
同样，当培养基中糖浓度为70％(w/v)时，菌株SY的延滞期都为56h左右，对数生长期为8h左右，平衡期为20h左右，延滞期相对较长，会增加实际生产中的生产成本，利润太低，该菌株无法给高糖度发酵提供发酵剂(如图3所示)。
(2)菌株的耐高糖性能
采用杜氏管发酵法：将扩大培养得到的本发明菌株以及安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY，以10％(v/v)的接种量分别接种到盛有糖浓度为40％、50％、60％、65％、70％、77.5％(w/v)麦芽汁培养基，于28℃的恒温培养箱中培养，每隔12h观察一次，并记录产气情况，一直到菌株停止产气
为止。结果见表1～3所示：
表1本发明菌株对不同浓度高糖环境的耐受性能
注：+表示产气占总杜氏发酵小管的1/3，++表示产气占总杜氏发酵小管的2/3，+++表示产气充满总杜氏发酵小管，+-表示产气小于总杜氏发酵小管的2/3，-表示产气小于杜氏发酵小管的1/3，0表示无产气，糖浓度单位为％(w/v)
表2菌株BV818对不同浓度高糖环境的耐受性能
注：+表示产气占总杜氏发酵小管的1/3，++表示产气占总杜氏发酵小管的2/3，+++表示产气充满总杜氏发酵小管，-表示产气小于杜氏发酵小管的1/3，0表示无产气，糖浓度单位为％(w/v)
表3菌株SY对不同浓度高糖环境的耐受性能
注：+表示产气占总杜氏发酵小管的1/3，++表示产气占总杜氏发酵小管的2/3，+++表示产气充满总杜氏发酵小管，-表示产气小于杜氏发酵小管的1/3，0表示无产气，糖浓度单位为％(w/v)
表1结果表明本发明所述的菌株在含糖浓度为70％(w/v)的高浓度糖环境中能够大量生长，具有很强的耐高糖性。其耐糖能力远远大于安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY的含糖浓度为50％(w/v)(表2和表3所示)。
(3)菌株的耐酒精性能
采用杜氏管发酵法：将扩大培养得到的本发明菌株以10％(v/v)的接种量分别接种到含6％、8％、10％、12％(v/v)酒精的麦芽汁培养基中，，于28℃的恒温培养箱中培养，每隔12h观察一次，并记录产气情况，一直到菌株停止产气为止。结果如表4所示：当酒精含量为12％时本发明所述的菌株的产气充满了杜氏发酵小管，说明其有较强的酒精耐受能力。
表4本发明菌株对不同酒精浓度的耐受性能
注：+表示产气占总杜氏发酵小管的1/3，++表示产气占总杜氏发酵小管的2/3，+++表示产气充满总杜氏发酵小管，-表示产气小于杜氏发酵小管的1/3，0表示无产气，糖浓度单位为％(w/v)
(4)菌株的耐酸性能
采用杜氏管发酵法。将扩大培养得到的菌株以10％(v/v)的接种量分别接种于pH值分别为2.5、3、3.5、4、4.5的麦芽汁培养基中，于28℃的恒温培养箱中培养，每隔12h观察一次，并记录产气情况，一直到菌株停止产气为止。结果如表5所示：
表5本发明菌株对酸性环境的耐受性能
注：+表示产气占总杜氏发酵小管的1/3，++表示产气占总杜氏发酵小管的2/3，+++表示产气充满总杜氏发酵小管，-表示产气小于杜氏发酵小管的1/3，0表示无产气，糖浓度单位为％(w/v)
酿酒酵母在高酸环境下发酵，不仅能抑制有害微生物的干扰，加速发酵进程；还能改善酒的风味。因此，优良的酿酒酵母都有较好的耐酸能力。由表5可知，本发明菌株在pH2.5的酸性环境中产气都能够快速充满杜氏发酵小管，说明其酸度耐受性较强。
实施例3蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1发酵性能测定
将蜂蜜按一定比列稀释，于70℃～75℃中水浴20min进行巴氏灭菌；调整pH值至4；然后分别将实施例2扩大培养得到的本发明菌株以及安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY以5％(v/v)的接种量，接入到含不同糖浓度的发酵液中，于28℃恒温培养箱中培养10d；再进行巴氏灭菌(70℃，20min)，最后测定酒精含量。实验结果见表6～8所示。
酒精含量的测定采用酒精计法，参照GB/T15038-2006。
总糖含量的测定采用直接滴定法，参照GB/T15038-2006。
表6本发明菌株对不同浓度高糖的利用能力
表7菌株BV818对不同浓度高糖的利用能力
注：“-”无酒精产生，该菌无法在55％以上的高糖环境中生长
表8菌株SY对不同浓度高糖的利用能力
注：“-”无酒精产生，该菌无法在55％以上的高糖环境中生长
由表6、表7、表8的数据可以看出，本发明所述菌株在起始糖度为55％～70％(v/v)时，都能发酵产生酒精，而在此糖度的条件下安琪葡萄酒活性干酵母BV818和安琪果酒专用酵母SY均不能发酵产生酒精。说明本发明所述的菌株在高糖环境中的发酵能力远远优于安琪酵母BV8181和SY。

Claims (10)

1.一种蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1，其保藏编号为CCTCCNo.M2015545。
2.权利要求1所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1的筛选方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.将稀释10～1000倍的蜂蜜倒入装有麦芽汁琼脂培养基的培养皿中，在25～30℃的恒温条件下培养1.5～3d，观察菌株的生长情况，挑取单菌落，于显微镜下观察，根据酵母菌的形态特征，筛选出酵母菌；
S2.将经步骤S1.筛选出来的酵母菌，于装有含糖浓度为68～75％(w/v)麦芽汁琼脂培养基的培养皿中划线，在25～30℃的恒温条件下培养1.5～3d，并观察菌株的生长情况；将长出的菌株挑取单菌落划线分离1～3次，直至分离出单菌落；再将单菌落置于显微镜下观察，根据蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1的形态特征，筛选出纯的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1中所述的蜂蜜为百花蜜。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1中的培养条件为在28℃的恒温条件下培养2d。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中所述麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：将葡萄糖、麦芽汁粉、去离子水，以及琼脂粉于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中所述麦芽汁琼脂培养基所含糖浓度为70％(w/v)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S2中所述的含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：称取葡萄糖138g，麦芽汁粉13g，去离子水100mL，琼脂粉2g，于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中的培养条件为在28℃的恒温条件下培养2d。
9.权利要求1所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1在酿酒生产中的应用。
10.权利要求1所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-1在生产工业酒精中的应用。
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