CN104644693B - 注射用a群链球菌药物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用A群链球菌药物及其制备方法。药物的组分含量是：A群链球菌占3%~6%(W/W)，麦芽糖占13%~26%(W/W)，蛋氨酸占55%~75%(W/W)，氯化钠占0.3%~0.5%(W/W)，青霉素G钾6%~12%(W/W)。制备方法包括群链球菌冷冻管活化及血斜面培养、接种培养、灭活、配制、冷冻干燥等步骤。本发明的药物保持A群链球菌在青霉素G钾灭活过程中不被完全杀死，使其保留了使癌细胞裂解的抗癌活性，并且保持A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，能够在使用时恢复活性低副作用的情况下发挥其临床疗效，而该制备方法能够制备出稳定的产品。

Description

注射用A群链球菌药物的制备方法

技术领域：

本发明属医药生物技术领域，主要涉及一种注射液用A群链球菌药物及其制备方法，其目的旨在解决生产过程中A群链球菌经灭活，细胞壁受到损伤后，如何保持横一状态的问题。

背景技术：

A群链球菌是β-溶血性链球菌SIPI722#低毒菌株，它类似日本生产的OK-432（Picibanil），于1967年首次被日本学者Toyate等应用于临床。该产品通过活化巨噬细胞、NK细胞、诱生可溶性细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）发挥作用，同时它还能阻碍DNA、RNA合成蛋白产物的翻译而使肿瘤细胞变性、崩解，从而产生直接的杀瘤效应。目前在临床上主要用于治疗恶性胸腔积液，瘤内及全身用药对实体瘤有一定疗效，常用于配合手术、放疗或化疗，用于恶性肿瘤的辅助治疗。A群链球菌如果不经灭活是一种致病菌，在灭活后，如果没有合适的保护条件，细菌在药品的配制及冷冻干燥过程中很容易死亡，或者细菌重新恢复活性，造成药物失效或者增加临床使用的副作用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种注射用A群链球菌药物的制备方法，药物能够方便冻干状态下存储又能在使用时保证低副作用下的抗癌活性，而该制备方法能生产出符合要求的药物。

本发明的目的是以如下方式实现的：该注射用A群链球菌药物，组分含量按质量份是：A群链球菌占3~6份，麦芽糖占13~26份，蛋氨酸占55~75份，氯化钠占0.3~0.5份，青霉素G钾占6~12份。其中的麦芽糖可选用上海蓝季科技有限公司生产的产品，蛋氨酸可选用石家庄冀荣药业有限公司生产的产品，青霉素G钾可选用山东鲁抗医药股份有限公司生产的产品。

制备以上A群链球菌组合物的方法，按规格为1KE的药物1万支为例，不同批量按比例投料，制备步骤如下：

a. A群链球菌冷冻管活化及血琼脂斜面培养：取冻干管一支，直接加入无菌生理盐水溶解后，接入5％酵母粉培养基中于37±0.5℃活化培养18-24小时，然后涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，将菌株接入血琼脂斜面于37±0.5℃培养18-24小时；

b.接种培养：采用三级培养法，第一级培养系将菌种从血琼脂斜面接种入一级酵母浸膏粉培养基内于37±0.5℃培养20小时，培养液经涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，按5% v/v的接种量接入二级酵母浸膏粉培养基中，于37±0.5℃培养20小时，与接种二级同样的方法，将菌种接入三级酵母粉培养基内，于37±0.5℃培养20小时；

c.灭活：取3级培养的A群链球菌菌体，经0.45μm滤膜过滤，经无菌0.9%氯化钠溶液分三次洗去残余培养基，获得生产用A群链球菌菌体；加入12万µ/ml青霉素G钾的10%麦芽糖的无菌溶液400ml，pH值为7.5，37℃水浴加入30分钟后，继续升温至45℃加热20分钟；

d.配制：向上述菌液中加入继续加入12万µ/ml青霉素G钾的0.9%氯化钠无菌溶液100ml摇匀，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5；取样后，按2000版«中国生物制品规程»中规定的浓度测定方法测含量，补加按1- 2%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5，搅匀，灌装，每瓶装量1ml；

e.冷冻干燥：将灌装好的药液，半压塞放入冻干机内，制品通过搁板降温，在-40℃预冻2小时，然后抽真空至0.3-0.4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至0℃，抽真空至0.09-0.15mbar，在4小时内逐渐升温至30℃，维持30 ℃干燥3小时，冻干结束，压塞、压铝盖出箱，即制得成品。

A群链球菌经灭活后，使其不产生溶血素S（SLS），但保留了使癌细胞裂解的抗癌活性，本发明中采用霉素G钾在特定的条件下使A群链球菌细胞壁缺损，细胞并非真正死亡，但A群链球菌细胞壁缺损后，由于失去了细胞壁的渗透屏障，失去了保护膜，细菌变得脆弱，如果没有合适的保护条件，细菌在冷冻干燥过程中很容易死亡，本发明使A群链球菌保持稳定的衡一状态，在合适的条件下仍可恢复其生理活性。

本发明的有益效果是：药物保持A群链球菌在青霉素G钾灭活过程中不被完全杀死，并且保持A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，能够在使用时恢复生理活性，而该制备方法能够制备出稳定的产品。

具体实施方式：

正常A群链球菌是兼性厌氧菌，其生长代谢需要以下条件：（1）充足的营养物质：主要为合适的N源和C源。（2）适宜的温度：最适宜的温度为37℃。（3）合适的酸碱度：pH范围在7.2～7.6之间。（4）合适的溶氧浓度：溶氧浓度过高或者过低都会影响细菌的代谢，保持一定的氧浓度，满足生产菌对氧的需求同时，还可以减低有害废物的产生。

本发明中提到的A群链球菌制剂是经青霉素G钾灭活后细胞壁缺损的细菌，经细菌培养发现，在5%的酵母粉培养基中不再复活，在由牛肉汤、胰蛋白胨、蔗糖、无菌绵羊血清和氯化钠等组成的高渗培养基中能够复活。由此可知A群链球菌经青霉素灭活后，细胞壁受到损伤，在冷冻过程中，如果没有合适的保护剂，则其可能彻底死亡；在生产和储存过程中，如果养分条件充足，菌体则有可能复活，只要不能够保持灭活后稳定的衡一状态，则不利于临床治疗。

本发明中旨在保持A群链球菌在青霉素G钾灭活过程中不被完全杀死，以及保持A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，解决的方法主要有两方面，第一：通过选择合适的养分，主要为合适的N源和C源。第二：控制合适的氧浓度。另外温度和酸碱度控制如下：储存温度采用2～8℃冷藏保存，以控制细菌的生长；pH范围控制在7.2～7.6之间，使其接近人体血液的pH。研究结果如下：

一、A群链球菌青霉素G钾灭活过程中保护剂的选择，以配制量按1万支消耗计：

方案一：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万µ/ml青霉素G 钾的无菌溶液400ml，（pH：7.5），37℃恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45℃恒温加热20分钟，冷却放置1小时后待检。

方案二：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万µ/ml青霉素G钾的5%葡萄糖无菌溶液400ml，（pH：7.5），37℃水浴恒温加热30分钟后，继续升温至45℃恒温加热20分钟，冷却放置1小时后待检。

方案三：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万µ/ml青霉素G钾的10%麦芽糖无菌溶液400ml，（pH：7.5），37℃恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45℃恒温加热20分钟，冷却放置1小时后待检。

方案四：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万µ/ml青霉素G钾的20%甘露醇无菌溶液400ml，（pH：7.5），37℃恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45℃恒温加热20分钟，冷却放置1小时后待检。

将按上述方案处理的样品，分别加入5%的酵母粉培养基中培养和在由牛肉汤、胰蛋白胨、蔗糖、无菌绵羊血清和氯化钠等组成的高渗培养基中，37℃恒温培养。结果见下表：

样品	5%酵母粉培养基	高渗培养基
			方案一	14天内未见任何菌生长	14天内未见任何菌生长
方案二	14天内有少量菌生长，经镜检为A群链球菌	14天内菌生长正常，经镜检为A群链球菌
			方案三	14天内未见任何菌生长	14天内菌生长正常，经镜检为A群链球菌
方案四	14天内未见任何菌生长	14天内菌生长正常，经镜检为A群链球菌

结论：按方案一、方案二生产的产品，不能保证A群链球菌经灭活后横一、稳定状态的问题。故放弃方案一、方案二，选择方案三、方案四继续研究。

二、冷冻过程保护剂的选择：

分别按方案三、四配制的溶液（配方均按1万支计），各配制四份，分别编号为3-0，3-1，3-2，3-3，4-0，4-1，4-2，4-3；向各菌液中分别加入12万µ/ml青霉素G钾的0.9%氯化钠无菌溶液100ml（pH:7.5）摇匀，继续分别加入0%、1%、2%、3%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，各溶液均用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH预调至7.5，6个样品均通过搁板降温，在-40℃以下预冻2小时，然后抽真空至0.3-0.4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至0℃，抽真空至0.09-0.15mbar，在4小时内逐渐升温至30℃，最后维持在30 ℃干燥3小时。

经冷冻后样品外观及水分检测情况如下表：

将上述样品分别至5%的酵母粉培养基和由牛肉汤、胰蛋白胨、蔗糖、无菌绵羊血清和氯化钠、磷酸二氢钾和硫酸镁组成的高渗培养基中分别培养，培养温度控制在37℃，菌体生长情况如下：

样品号	5%酵母菌培养基	高渗培养基
			3-0	14天内未见菌体生长	14天内未见菌体生长
3-1	14天内未见菌体生长	菌体生长良好，镜检为A群链球菌
			3-2	14天内未见菌体生长	菌体生长良好，镜检为A群链球菌
3-3	14天内未见菌体生长	菌体生长较2-1和2-2样品略差，镜检为A群链球菌
			4-0	14天内未见菌体生长	14天内未见菌体生长
4-1	14天内未见菌体生长	有少量菌体生长，镜检为A群链球菌
			4-2	14天内未见菌体生长	有少量菌体生长，镜检为A群链球菌
4-3	14天内未见菌体生长	有少量菌体生长，镜检为A群链球菌

结论：从细菌培养结果来看，3-0、3-3、4-0、4-1、4-2、4-3，四个产品均不能够保持A群链球菌灭活后保持横一、稳定，故放弃用3-0、3-3、4-0、4-1、4-2、4-3配方生产的产品，保留3-1、3-2配方产品继续试验。

将上述样品分别做抑瘤试验和NK细胞活性检测，结果如下表：

备注：抑瘤试验标准要求生命延长率应不小于50%；

NK细胞活性检测标准：实验组细胞毒指数(T)与对照组细胞毒指数（C）之差应不低于10%（T-C≥10%），两组检验应有显著性差异。

结论：从试验结果数据来看，只有按照3-1和3-2方案生产的产品，能够保持A群链球菌在灭活及灭活后在配制和冷冻干燥过程中稳定衡一的状态，经检验，产品能够符合2000版«中国生物制品规程»中规定的本品质量标准，并经动物试验，确实证明本品的临床疗效。

生产出的A群链球菌药物，组分含量按质量份是：A群链球菌占3~6份，麦芽糖占13~26份，蛋氨酸占55~75份，氯化钠占0.3~0.5份，青霉素G钾占6~12份。

制备方法：

实施例一：

以下配制以1万支为例，每支规格1KE：

a. A群链球菌冷冻管活化及血琼脂斜面培养：取冻干管一支，直接加入无菌生理盐水溶解后，接入5％酵母粉培养基中于37±0.5℃活化培养18-24小时，然后涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，将菌株接入血琼脂斜面于37±0.5℃培养18-24小时；

b.接种培养：采用三级培养法，第一级培养系将菌种从血琼脂斜面接种入一级酵母浸膏粉培养基内于37±0.5℃培养20小时，培养液经涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，按5% v/v的接种量接入二级酵母浸膏粉培养基中，于37±0.5℃培养20小时，与接种二级同样的方法，将菌种接入三级酵母粉培养基内，于37±0.5℃培养20小时；

c.灭活：取3级培养的A群链球菌菌体，经0.45μm滤膜过滤，经无菌0.9%氯化钠溶液分三次洗去残余培养基，获得生产用A群链球菌菌体；加入12万µ/ml青霉素G钾的10%麦芽糖的无菌溶液400ml，pH值为7.5，37℃水浴加入30分钟后，继续升温至45℃加热20分钟；

d.配制：向上述菌液中加入继续加入12万µ/ml青霉素G钾的0.9%氯化钠无菌溶液100ml摇匀，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5；取样后，按2000版«中国生物制品规程»中规定的浓度测定方法测含量，补加按1- 2%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5，搅匀，灌装，每瓶装量1ml；

e.冷冻干燥：将灌装好的药液，半压塞放入冻干机内，制品通过搁板降温，在-40℃预冻2小时，然后抽真空至0.3-0.4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至0℃，抽真空至0.09-0.15mbar，在4小时内逐渐升温至30℃，维持30 ℃干燥3小时，冻干结束，压塞、压铝盖出箱，即制得成品。制得三批成品检验结果如下表：

批号：20140514 规格：1KE

批号：20140515 规格：1KE

批号：20140516 规格：1KE

实施例二：

也以配制1万支为例，每支规格1KE：只在步骤d中补加无菌蛋氨酸溶液至1万ml时，所加的无菌蛋氨酸溶液浓度为2% ，其余步骤与实施例一相同。制得三批成品检验结果如下表：

批号：20140517 规格：1KE

批号：20140518 规格：1KE

批号：20140519 规格：1KE

Claims (1)

1.一种注射用A群链球菌药物的制备方法，其特征在于组分含量按质量份是：A群链球菌（Streptococcus A Group）占3~6份，麦芽糖占13~26份，蛋氨酸占55~75份，氯化钠占0.3~0.5份，青霉素G钾占6~12份；配制规格为1KE的药物1万支按顺序包括以下步骤：

a. A群链球菌冷冻管活化及血琼脂斜面培养：取冻干管一支，直接加入无菌生理盐水溶解后，接入5％酵母粉培养基中于37±0.5℃±活化培养18-24小时，然后涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，将菌株接入血琼脂斜面于37±0.5℃培养18-24小时；

b.接种培养：采用三级培养法，第一级培养系将菌种从血琼脂斜面接种入一级酵母浸膏粉培养基内于37±0.5℃培养20小时，培养液经涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，按5% v/v的接种量接入二级酵母浸膏粉培养基中，于37±0.5℃培养20小时，与接种二级同样的方法，将菌种接入三级酵母粉培养基内，于37±0.5℃培养20小时；

c.灭活：取3级培养的A群链球菌菌体，经0.45μm滤膜过滤，经无菌0.9%氯化钠溶液分三次洗去残余培养基，获得生产用A群链球菌菌体；加入12万µ/ml青霉素G钾的10%麦芽糖的无菌溶液400ml，pH值为7.5，37℃水浴加入30分钟后，继续升温至45℃加热20分钟；

d.配制：向上述菌液中加入继续加入12万µ/ml青霉素G钾的0.9%氯化钠无菌溶液100ml摇匀，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5；取样后，按2000版«中国生物制品规程»中规定的浓度测定方法测含量，补加按1- 2%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7.5，搅匀，灌装，每瓶装量1ml；

e.冷冻干燥：将灌装好的药液，半压塞放入冻干机内，制品通过搁板降温，在-40℃预冻2小时，然后抽真空至0.3-0.4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至0℃，抽真空至0.09-0.15mbar，在4小时内逐渐升温至30℃，维持30 ℃干燥3小时，冻干结束，压塞、压铝盖出箱，即制得成品。