CN118126907B - 一种抑制马拉色菌的干酪乳酪杆菌vb179及其培养装置和应用 - Google Patents
一种抑制马拉色菌的干酪乳酪杆菌vb179及其培养装置和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域,本发明公开了一种抑制马拉色菌的干酪乳酪杆菌VB179及其培养装置和应用。具体的,本发明公开了一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179,其特征在于,所述干酪乳酪杆菌VB179保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.28623,保藏日期为2023年10月12日。本发明的干酪乳酪杆菌VB179能够显著抑制马拉色菌的生长,进而能够用于治疗因马拉色菌的过度繁殖导致的花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,尤其是涉及一种能够显著抑制马拉色菌的干酪乳酪杆菌VB179及其培养装置和应用。
背景技术
马拉色菌是一种条件致病菌,具有嗜脂性,主要生长在人类皮肤角质层,与皮肤表面存在的三酰甘油脂和游离脂肪酸皮脂腺有关,随着年龄的增长,其密度会因脂质成分的减少而降低,在人群皮肤毛发样品中可以检出,大量研究表明它是一种条件致病菌,大多情况下无危害。但当某些内外条件改变,马拉色菌可以引起花斑癣、糠秕孢子菌毛囊炎、脂溢性皮炎及头皮屑,特应性皮炎和银屑病等。随着研究领域的不断扩大,也有研究证实它与甲真菌病及系统感染有关。
因此寻找一种能够抑制马拉色菌过度繁殖的药物刻不容缓。酮康唑、伊曲康唑等唑类抗真菌化学药物曾因效果明显而备受患者们的青睐,但常常会伴随着皮肤的红肿,部分毛囊肿胀等副作用,且随着时间的推移,人们发现此类药物存在副作用大、容易复发等问题,需要开发一些新型的马拉色菌抑制剂。
为此,本发明筛选了一种具有抑制马拉色菌生长的功效益生菌,其为开发治疗头皮屑的治疗性涂抹剂以及洗护产品提供新思路。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明首次提供了一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179,该干酪乳酪杆菌VB179来源于酸奶,其能够显著抑制马拉色菌的生长,进而能够用于治疗因马拉色菌的过度繁殖导致的花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病。因此,利用本发明的干酪乳酪杆菌VB179可以制备马拉色菌抑制剂并作为预防、缓解、治疗上述皮肤疾病的药物以及日化用品。此外,本发明的干酪乳酪杆菌VB179还展现出了广泛的抗菌活性,对其他多种致病菌也具有抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
因此,在本发明的第一方面,本发明提出一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179。根据本发明的实施例,所述干酪乳酪杆菌VB179保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.28623,保藏日期为2023年10月12日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的干酪乳酪杆菌VB179展现出了广泛的抗菌活性,不仅可以显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生了抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
在本发明的第二个方面,本发明提出了一种发酵液、菌悬液或菌渣。根据本发明的实施例,所述发酵液、菌悬液或菌渣包括第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179。因此,本发明的发酵液、菌悬液或菌渣也能够显著抑制马拉色菌的生长,进而用于治疗因马拉色菌的过度繁殖导致的花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病。
在本发明的第三个方面,本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例,所述微生物菌剂包括第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179或第二方面所述的发酵液、菌悬液或菌渣。因此,本发明的微生物菌剂不仅能够显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生了抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
在本发明的第四个方面,本发明提出了一种单剂量制剂。根据本发明的实施例,所述单剂量制剂包括不低于106CFU第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179作为活性成分。因此,本发明的单剂量制剂不仅能够显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生了抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
在本发明的第五个方面,本发明提出了第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179、第二方面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、第三方面所述的微生物菌剂或第四方面所述的单剂量制剂在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或缓解和/或治疗致病菌感染引起的相关疾病或症状。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种产品。根据本发明的实施例,所述产品包括第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179、第二方面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、第三方面所述的微生物菌剂和第四方面所述的单剂量制剂中的至少之一。由此,本发明所述的产品能够用于抑制马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌的生长,进而用于预防和/或缓解和/或治疗与这些致病菌相关的疾病或症状。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种体外抑制致病菌生长的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179、第二方面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、第三方面所述的微生物菌剂和第四方面所述的单剂量制剂中的至少之一与含有致病菌的样本共培养。采用本发明的方法,能够高效地阻止致病菌的生长,从而有效地控制它们引起的感染和疾病,为疾病的治疗和预防提供了一种高效可靠的途径。
在本发明的第八方面,本发明提出了第一方面所述的干酪乳酪杆菌VB179、第二方面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、第三方面所述的微生物菌剂或第四方面所述的单剂量制剂的培养装置或生产装置。
有益效果:
本发明首次发现了具有抑制马拉色菌生长作用的干酪乳酪杆菌VB179,因此,可以利用本发明的干酪乳酪杆菌VB179制备马拉色菌抑制剂并作为预防、缓解、治疗花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病的药物以及日化用品。此外,本发明的干酪乳酪杆菌VB179还具有多种致病菌的抑制活性,能抑制沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌等致病菌的生长,因此,可单独或与其他益生菌组合预防、缓解、治疗由上述致病菌引起的相关疾病。最后,本发明的干酪乳酪杆菌VB179作为一种常见的益生菌,具备较高的安全性,且易于生长繁殖,生产成本较低,工艺简单。这些优势为其在多个应用领域展现出乐观的前景,为相关产业的发展和创新提供了有力支持。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是根据本发明实施例的干酪乳酪杆菌VB179对马拉色菌的抑制作用(阴性对照:无菌水;阳性对照:酮康唑0.1mg/L);
图2是根据本发明实施例的不同干酪乳酪杆菌VB178,VB179,VB180,VB217对马拉色菌的抑菌圈区别;
图3是根据本发明实施例的不同干酪乳酪杆菌VB178,VB179,VB180,VB217对粪肠球菌的抑菌圈区别。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中,术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法,包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”,可将干酪乳酪杆菌或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者,或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者,即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中,术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种干酪乳酪杆菌VB179、发酵液、菌悬液或菌渣、微生物菌剂、单剂量制剂、产品及其它们的用途和培养装置或生产装置,下面将分别对其进行详细描述。
菌种
在本发明的一个方面,本发明提出一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179。根据本发明的实施例,所述干酪乳酪杆菌VB179保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.28623保藏日期为2023年10月12日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的干酪乳酪杆菌VB179展现出了广泛的抗菌活性,不仅可以显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
在本文中,“干酪乳酪杆菌VB179”和“干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179”同义。
发酵液、菌悬液或菌渣
在本发明的另一方面,本发明提出了一种发酵液、菌悬液或菌渣。根据本发明的实施例,所述发酵液、菌悬液或菌渣包括前面所述的干酪乳酪杆菌VB179。因此,本发明的发酵液、菌悬液或菌渣也能够显著抑制马拉色菌的生长,进而用于治疗因马拉色菌的过度繁殖导致的花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特征性皮炎等皮肤疾病。
需要说明的是,本发明所述的“发酵液”指的是将干酪乳酪杆菌VB179培养一段时间后得到的溶液。本发明所述的“菌渣”是指将所述发酵液进行离心处理后,去掉上清液所得到的菌体沉淀。本发明所述的“菌悬液”是指在所述菌渣中加入一定体积的生理盐水吹打混匀后所得到的混悬液。
微生物菌剂
在本发明的又一方面,本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例,所述微生物菌剂包括前面所述的干酪乳酪杆菌VB179或前面所述的发酵液、菌悬液或菌渣。因此,本发明的微生物菌剂不仅能够显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
需要说明的是,本发明的微生物菌剂可为微生物液体菌剂,包括但不限于发酵液等;也可为微生物固体菌剂,包括但不限于冻干粉等。
根据本发明的实施例,所述微生物菌剂还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一:
根据本发明的实施例,所述干酪乳酪杆菌VB179以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
在本文中,“活细胞”是指干酪乳酪杆菌VB179具有新陈代谢、繁殖或复制能力。
示例性地,所述活细胞可为固定化的细胞。本文中,“固定化的细胞”是指干酪乳酪杆菌VB179固定在载体上,可在一定的空间范围进行生长、发育、繁殖、遗传和新陈代谢等生命活动。
在本文中,“非活细胞”是指不具有新陈代谢、繁殖和复制能力的细胞,包括但不限于干菌体。示例性地,所述微生物菌剂为冻干粉。
示例性地,所述干酪乳酪杆菌VB179是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的。
示例性地,所述干菌体是所述干酪乳酪杆菌VB179经冷冻干燥处理获得的。
根据本发明的实施例,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
在本文中,“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地,本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中,术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂,药物稳定剂,或其组合物,这些载体都是所属技术领域技术人员已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外,涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本文中,术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂,适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与发明本公开的干酪乳酪杆菌VB179不相容的范围,例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用,它们的用途也是本发明所考虑的范围。
单剂量制剂
在本发明的又一方面,本发明提出了一种单剂量制剂。根据本发明的实施例,所述单剂量制剂包括不低于106CFU前面所述的干酪乳酪杆菌VB179作为活性成分。例如可以为106~1012CFU、106~1010CFU、106~109CFU,更具体的可以但不限于为106CFU、107CFU、108CFU、109CFU、1010CFU、1011CFU、1012CFU。因此,本发明的单剂量制剂不仅能够显著抑制马拉色菌的生长,还对其他多种致病菌产生了抑制作用,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌,这为进一步治疗与这些致病菌相关的疾病提供了潜在的治疗选择和可能性。
需要说明的是,本发明所述的“单剂量制剂”指在一次给药中所含有的药物剂量完整、准确,并且适合单次使用的制剂形式。简单来说,它是一种包含单一药物剂量的制剂,可以直接给患者使用,而无需进一步分割或计量。
产品
在本发明的又一方面,本发明提出了一种产品。根据本发明的实施例,所述产品包括前面所述的干酪乳酪杆菌VB179、前面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、前面所述的微生物菌剂和前面所述的单剂量制剂中的至少之一。由此,本发明所述的产品能够用于抑制马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌的生长,进而用于预防和/或缓解和/或治疗与这些致病菌相关的疾病。
根据本发明的实施例,所述产品还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一:
根据本发明的实施例,所述产品选自日化用品或药物。
根据本发明的实施例,所述产品选自药物时,还可以进一步包括赋形剂和/或载体。
根据本发明的实施例,所述赋形剂包括选自粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、缓释剂中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述载体包括选自糖类、纤维素及其衍生物、磷酸钙类、硬脂酸碱土金属盐、植物油类、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、负离子表面活性剂、脂肪醇类、谷物水解固形物中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述药物的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、外用溶液剂、洗剂、挫剂、软膏剂、贴剂、涂抹剂等。
根据本发明的实施例,所述日化用品包括但不限于洗发水、沐浴露、护发素、香皂、面霜、护肤霜、乳液、身体乳、化妆水等。
用途
在本发明的又一方面,本发明提出了前面所述的干酪乳酪杆菌VB179、前面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、前面所述的微生物菌剂或前面所述的单剂量制剂在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或缓解和/或治疗致病菌感染引起的相关疾病或症状。
根据本发明的实施例,所述用途还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一:
根据本发明的实施例,所述致病菌选自马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述相关疾病选自皮肤病。
根据本发明的实施例,所述皮肤病包括但不限于花斑癣、糠秕孢子菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎和银屑病。
根据本发明的实施例,所述症状包括但不限于头皮屑。
方法
在本发明的又一方面,本发明提出了一种体外抑制致病菌生长的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将前面所述的干酪乳酪杆菌VB179、前面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、前面所述的微生物菌剂和前面所述的单剂量制剂中的至少之一与含有致病菌的样本进行共培养。如前所述,本发明的干酪乳酪杆菌VB179具有广谱的抗菌活性,能够有效抑制多种致病菌,因此,采用本发明所述的方法,能够高效地阻止致病菌的生长,从而有效地控制它们引起的感染和疾病,为疾病的治疗和预防提供了一种高效可靠的途径。
根据本发明的实施例,所述致病菌选自马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
装置
在本发明的又一方面,本发明提出了前面所述的干酪乳酪杆菌VB179、前面所述的发酵液、菌悬液或菌渣、前面所述的微生物菌剂或前面所述的单剂量制剂的培养装置或生产装置。本发明的培养装置可以用于批量生产干酪乳酪杆菌VB179或其发酵产物,利于开发微生物菌剂或单剂量制剂的生产装置,批量生产商业化产品,经济价值高。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所使用的培养基中,物料配比所用的百分数(%)计量单位,除特殊说明外均为质量百分比。
实施例1:干酪乳酪杆菌菌种鉴定
(1)菌种来源
干酪乳酪杆菌是从酸奶中分离获得的。取足量酸奶在无菌容器中加入灭菌PBS缓冲液,充分震荡后稀释涂布在MRS固体培养基平板上,培养48h后挑取大小形态不一的单菌落在新鲜的平板上划线,然后挑取单菌落到斜面,斜面培养好后镜检菌落形态,镜检无杂菌后进行鉴定。
(2)菌株鉴定
参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。纯化后的单菌种在MRS液体培养基中培养1天后取1 mL菌液10000 rpm离心1 min,弃上清,收集菌体,按照MAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(购自上海迈跟生物科技有限公司)操作步骤提取DNA。以提取的DNA为模板,采用通用引物337F (5’-GACTCCTACGGGAGGCWGCAG-3’)和1492R (5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)通过PCR(聚合酶链式反应) 进行16S rRNA扩增。PCR的反应体系为50μL,按照Phusion高保真DNA聚合酶(购自Thermo Scientific)说明书配置反应体系和设置程序,退火温度55℃。PCR产物送上海生工生物有限公司测序。
菌株所测的16S rRNA的序列经校对后,与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较,以确定该菌株的分类地位。
经过比对发现,其与Lactobacillus casei strain NWAFU1563的同源性高达99.93%,与Lacticaseibacillus casei strain D2同源性高达99.93%,故将该菌株鉴定为干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株。该菌种内部编号为VB179,已于2023年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No. 28263。
干酪乳酪杆菌VB179的16S rRNA测序结果如SEQ ID NO:1所示:
TGAGGGGGGGGGTGCCTAATACATGCAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGTAT(SEQ ID NO:1)
实施例2:干酪乳酪杆菌菌种生理生化实验
干酪乳酪杆菌制备(1)培养基:将胰蛋白胨10 g,牛肉膏10g,酵母膏10 g,柠檬酸氢二钠2.0 g,葡萄糖20g,吐温80 1mL,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g添加到1L蒸馏水中,灭菌锅115℃灭菌20min得到发酵液体培养基;将胰蛋白胨10 g,牛肉膏10g,酵母膏10 g,柠檬酸氢二钠2.0 g,葡萄糖20g ,吐温80 1mL,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,琼脂20g添加到1L蒸馏水中,灭菌锅115℃灭菌20min得到MRS固体培养基。
(2)活化:将冻存于-80℃冰箱中的干酪乳酪杆菌取出,轻沾一下于MRS固体培养基上划线培养,置于37℃培养箱中24h后获得单菌落。
2. 生理生化实验
(1)生理生化试剂:采购于青岛海博生物技术有限公司的HBI乳酸菌生化鉴定条。用于乳酸菌的生化鉴定,每条组成:七叶苷,纤维二糖,麦芽糖,甘露醇,水杨苷,山梨醇,蔗糖,棉子糖,菊糖,乳糖,马尿酸,共11种生化反应。
(2)实验准备:从包装盒中取出一条生化鉴定条,打开盖子,用打孔器开孔或直接把膜撕掉。如果染菌或变色,则不能使用,重新拿一条。注:打孔器用75%酒精擦拭后使用。
(3)接种:
挑取步骤1中的干酪乳杆菌,制成菌悬液,分别接种到以下培养基:七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠。
菌悬液法:取一内盛2mL无菌生理盐水试管,用接种针从纯化培养的平板上挑取单个菌落于无菌生理盐水中仔细研磨制成均一细菌悬液,每孔加入100μl菌悬液。
(4)培养:接种完后做好标记,盖上盖子,放入底托中,放置36±1℃培养。
(5)观察:24小时后培养结束,放在记录卡上观察。
实验结果如下表1所示,可见该株干酪乳酪杆菌VB179可利用纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠;不可利用七叶苷以及棉子糖。
表1:VB179生理生化试剂盒结果
实施例3:干酪乳酪杆菌对马拉色菌的抑制作用
干酪乳酪杆菌(1)培养基:将胰蛋白胨10 g,牛肉膏10g,酵母膏10 g,柠檬酸氢二钠2.0 g,葡萄糖20g,吐温80 1mL,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g添加到1L蒸馏水中,灭菌锅115℃灭菌20min得到发酵液体培养基;将胰蛋白胨10 g,牛肉膏10g,酵母膏10 g,柠檬酸氢二钠2.0 g,葡萄糖20g ,吐温80 1mL,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,琼脂20g添加到1L蒸馏水中,灭菌锅115℃灭菌20min得到MRS固体培养基。
(2)活化:将冻存于-80℃冰箱中的干酪乳酪杆菌取出,轻沾一下于MRS固体培养基上划线培养,置于37℃培养箱中24h。划取MRS固体培养基上的单菌落,于发酵液体培养基中,37℃、180rpm摇床培养24h后即可活化完成。
2. 马拉色菌
(1)马拉色菌购自上海保藏生物技术中心。
(2)活化:培养基使用商品化的YM液体培养基,YM固体培养基则需要在YM液体培养基的基础上额外添加2%的琼脂。沾取少量冻存在-80℃冰箱的马拉色菌于YM固体培养基上划线,30℃培养48h即可完成活化。其中,YM培养基成分:酵母粉0.3%;麦芽粉0.3%;蛋白胨0.5%。
3. 体外抑制实验:
(1)干酪乳酪杆菌处理:取活化好的干酪乳酪杆菌,按照1%的接种比例接种到发酵液体培养基中,30℃、180rpm摇床培养48h后取出。所得发酵液于冷冻离心机中4℃、4000rpm离心10min,离心后的上清液,即为发酵上清,菌体即为菌渣,将菌渣加入相同体积的生理盐水吹打破胞混匀后,即为破胞的菌悬液。
将原发酵液稀释到合适的倍数,得到稀释液,取100μL该稀释液于MRS固体培养基上涂布计数。
(2)马拉色菌处理:沾取少量活化的马拉色菌单菌落,置于适量无菌生理盐水中,振荡混匀。利用血细胞计数板测量马拉色菌的浓度,然后将其浓度调整到其菌浓度大致为1.0×106CFU/mL。
体外抑菌实验:采用双层板培养法,优化评估后具体方法如下:采用双层板培养法,方法如下:
①下层的制备:倒入MRS固体培养基。将活化后的干酪乳酪杆菌的发酵液,菌渣,破胞菌悬液点种在下层培养基上,接种量:2μl/点(108CFU的菌量);厌氧37摄氏度,培养1天后,倒入上层致病菌层。
②上层致病菌层的制备:经过121℃,30分钟高温灭菌的上层培养基(YM固体培养基)冷却至40-50℃,将马拉色菌按需求加入(培养基中致病菌最终浓度约106CFU/ml)混匀,之后将含马拉色菌的培养基按7ml/皿加入上述YM固体培养基(该培养基为空白平板)中,待凝固后,将阳性对照(0.1mg/L酮康唑)2μl/点,和水2μl/点,37℃有氧条件下培养1天,观察益生菌周围是否有抑菌圈,判断是否有抑菌能力。
外平板抑制实验结果如图1所示,可以明显看出,干酪乳酪杆菌发酵液对马拉色菌的抑制圈明显大于0.1mg/L浓度下的化学试剂酮康唑对马拉色菌的抑制圈,而干酪乳酪杆菌的菌渣和菌悬液对马拉色菌的抑制圈与0.1mg/L的酮康唑相差不大。可见干酪乳酪杆菌的菌渣,发酵液,菌悬液均对马拉色菌具有较好的抑制作用,且发酵液的抑制作用大于该浓度(0.1mg/L)的酮康唑。
实施例4:不同干酪乳酪杆菌菌悬液对马拉色菌的抑制作用
发明人同时研究了与VB179同属不同株的VB178、VB180和VB217(VB178、VB180和VB217的16S rRNA测序结果如SEQ ID NO:1所示)对马拉色菌的抑制作用,发明人按照实施例3所述的方法同时对VB178、VB179、VB180和VB217进行体外抑菌实验。不同的菌株的菌悬液接种量:2μl/点(106CFU的菌量),37℃有氧条件下培养1天,观察不同干酪乳酪杆菌周围抑菌圈的大小,判断是否有抑菌能力。
实验结果如图2所示,可以明显看出,虽然VB178、VB180和VB217对马拉色菌也有一定的抑制作用,但它们的抑制作用明显弱于VB179的抑制强度,因此,干酪乳酪杆菌VB179的抑菌能力明显高于其他株干酪乳酪杆菌。
实施例5:不同干酪乳酪杆菌对其他致病菌的抑制作用
为了研究不同干酪乳酪杆菌除了对马拉色菌有抑制作用外,是否还对其他致病菌有抑制作用,发明人采用双层板培养法研究了VB178、VB179、VB180和VB217对白念球菌、产气荚膜梭菌、加德纳杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、志贺氏杆菌、李斯特杆菌等9种致病菌的抑制作用,具体方法如下:
①下层干酪乳酪杆菌的制备:将不同的干酪乳酪杆菌VB178,VB179,VB180,VB217如实施例3-1活化后,按照1%的接种比例接种到发酵液体培养基中,30℃、180rpm摇床培养48h后取出。所得发酵液于冷冻离心机中4℃、4000rpm离心10min,离心后的上清液,即为发酵上清,菌体即为菌渣,将菌渣加入相同体积的生理盐水吹打混匀后,即为破胞菌悬液。
将上述不同的菌株的菌悬液以接种量:2μl/点(106CFU的菌量)点种至倒好的MRS固体平皿,厌氧37℃,培养1天后,倒入上层致病菌层。
② 上层致病菌层的制备:121℃,30分钟灭菌后的上层培养基(上层培养基为不同致病菌所需的培养基,具体如表2所示)冷却至40-50℃,将不同的致病菌按需求加入(培养基中致病菌最终浓度约106CFU/ml)混匀,将含致病菌的培养基按7ml/皿加入上述已长培养了1天的干酪乳酪杆菌VB178,VB179,VB180,VB217的单菌平板中,待凝固后,根据不同致病菌生长条件分别培养(培养方式详见表2),待上层板长好后观察益生菌周围是否有抑菌圈,判断是否有抑菌能力。
表2:不同致病菌的培养条件
不同干酪乳酪杆菌的抑菌圈大小如表3所示,可以看出干酪乳酪杆菌VB179对常见的菌即沙门氏杆菌,粪肠球菌(不同干酪乳酪杆菌对粪肠球菌的抑制圈如图3所示),李斯特杆菌,志贺氏杆菌,加德纳杆菌的抑制能力大于其他干酪乳酪杆菌,另外,干酪乳酪杆菌VB179对大肠杆菌,产气荚膜梭菌,金黄色葡萄球菌和白念球菌的能力也不弱于其他干酪乳酪杆菌。因此,本发明的干酪乳酪杆菌VB179不仅对马拉色菌具有较强的抑制作用,还能同时抑制大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌、白念球菌和加德纳杆菌的生长。
表3:不同干酪乳酪杆菌对不同致病菌的抑菌圈大小
直径(cm) | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄糖球菌 | 沙门氏杆菌 | 粪肠球菌 | 李斯特杆菌 | 志贺氏杆菌 | 产气荚膜梭菌 | 白念球菌 | 加德纳杆菌 |
干酪乳酪杆菌VB178 | 21 | 23 | 29 | 24 | 29 | 30 | 21 | 9 | 9 |
干酪乳酪杆菌VB179 | 24 | 24 | 30 | 28 | 34 | 36 | 21 | 10 | 11 |
干酪乳酪杆菌VB180 | 28 | 24 | 30 | 22 | 28 | 36 | 19 | 10 | 10 |
干酪乳酪杆菌VB217 | 25 | 23 | 26 | 24 | 28 | 28 | 23 | 9 | 9 |
实施例6:动物实验
1.实验动物:白色清洁级雄性豚鼠20只,体重300-320g,由本公司动物房饲养,所有豚鼠均单独喂养于不锈钢笼内,室温25±2℃。
2.实验菌株:马拉色菌以及培养基:见实施例3部分。
3.方法:
(1)菌悬液制备
将球形马拉色菌在YM固体培养基上连续传代培养2次,以保证其活力。第2次在3l℃培养3-4天后,挑其菌落于0.9%生理盐水中,无菌吸管反复吹打,制成马拉色菌菌悬液,在血细胞计数板上计数,调整其终密度为1×l06CFU/mL。
(2)菌以及药物的准备
将菌液制成2%凡士林霜剂,阴性对照物为单纯凡士林霜。
(3)豚鼠皮肤马拉色菌感染动物模型的建立:豚鼠背部剃毛后进行脱毛(给予蜜蜡:松香=1:1),形成一4.5cm×7.5cm的无毛区对豚鼠背部无毛区进行真菌直接镜检及培养7天,结果均为阴性。用砂皮纸在豚鼠背上轻轻均匀地摩擦,并将上述马拉色菌菌悬液200μL均匀涂于背部无毛区,每天涂1次。连续7天,马拉色菌菌悬液每天新鲜配制,菌落取自同一培养皿。末次接种后1天,取被接种处及未被接种处皮肤,置于10%甲醛溶液固定石蜡包埋,切片后,经PAS染色观察。
(4)在马拉色菌感染的豚鼠实验中,采取了自身对照的设计,豚鼠背部被均匀划分为两行,每行各有三个1.5cm直径的圆圈,每个圆圈之间保持约1.5cm的距离,以防止不同处理药物的相互干扰。每一个圆圈象征一个独立的实验组,总计有两个实验组:
治疗组:皮损处外用干酪乳酪杆菌VB179;
阴性对照组 :皮损处外用单纯凡士林霜。
4.药物疗效评价
每组分别在用药结束后1d,豚鼠将被处死以便进行真菌的显微检验,在检查前,实验豚鼠的背部区域会用75%的酒精棉球彻底消毒,之后,会切割并收集每个实验用的圆形样本。接下来,样本将被精细切碎,置入装有2毫升0.9%的无菌生理盐水的玻璃混合器中,并添加0.5%的山梨醇,混合形成均匀的混悬液。取300 μl上述混悬液于装有固体培养基的圆形培养皿中,立即摇匀,使其均匀分布于培养基表面,置32℃培养3天,观察培养皿中的菌落数,如培养皿中的菌落数>1,则视其为培养阳性,计算各组真菌转阴率。
真菌学治愈:真菌直接镜检及培养均为阴性。
真菌转阴率:每组真菌学治愈数除以每组豚鼠总数。
药物治疗后各组真菌转阴率见表4,可见治疗组(皮损处外用干酪乳酪杆菌VB179)的真菌转阴率明显大于阴性对照组。可见干酪乳酪杆菌VB179在动物实验上有明显抑制马拉色菌的作用。
表4:药物治疗后各组豚鼠的真菌转阴率(n=10)
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)VB179,其特征在于,所述干酪乳酪杆菌VB179保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.28623,保藏日期为2023年10月12日。
2.一种发酵液、菌悬液或菌渣,其特征在于,包括权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179。
3.一种微生物菌剂,其特征在于,包括权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179或权利要求2所述的发酵液、菌悬液或菌渣。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂,其特征在于,进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
5.一种单剂量制剂,其特征在于,包括不低于106 CFU权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179作为活性成分。
6.权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179或权利要求2所述的发酵液或权利要求2所述的菌悬液或权利要求2所述的菌渣或权利要求3~4任一项所述的微生物菌剂或权利要求5所述的单剂量制剂在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或缓解和/或治疗致病菌感染引起的相关疾病;
所述致病菌选自马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌中的至少之一;
所述相关疾病选自花斑癣、糠秕孢子菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎和银屑病的至少之一。
7.一种产品,其特征在于,包括权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179和权利要求2所述的发酵液和权利要求2所述的菌悬液和权利要求2所述的菌渣和权利要求3~4任一项所述的微生物菌剂和权利要求5所述的单剂量制剂中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的产品,其特征在于,所述产品选自日化用品或药物。
9.一种体外抑制致病菌生长的方法,其特征在于,包括:
将权利要求1所述的干酪乳酪杆菌VB179和权利要求2所述的发酵液和权利要求2所述的菌悬液和权利要求2所述的菌渣和权利要求3~4任一项所述的微生物菌剂和权利要求5所述的单剂量制剂中的至少之一与含有致病菌的样本进行共培养处理;
所述致病菌选自马拉色菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
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