CN112402463B - 一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌及其制品和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌及其制品和用途，所述复合益生菌包括干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang)、鼠李糖乳杆菌Probio‑M9(Lactobacillus rhamnosus Probio‑M9)和植物乳杆菌P‑8(Lactobacillus plantarum P‑8)，所述复合益生菌及其制品能够预防、缓解、抑制和/或治疗炎症反应，并且具有抗阴道炎的功效，可用于治疗阴道炎或者制备用于治疗阴道炎的药物。

Description

一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌及其制品和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌及其制品和应用。

背景技术

健康女性阴道中微生物主要以乳杆菌属为主，用以维持正常酸性环境。通常情况下，健康女性阴道的pH低于4.50，在此环境下具有“阴道自净作用”。但是，阴道炎患者的阴道自净作用被破坏，病原细菌相对丰度提升，过量消耗糖原进而抑制乳酸杆菌的酵解，使阴道酸性环境转变为中性或碱性，从而导致如大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌等病原菌增殖，相关的炎症反应包括细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎和老年性阴道炎等。

临床上治疗阴道炎主要以阴道灌洗和抗菌药物应用结合治疗为主，多采用咪唑类、盐酸克林霉素和复方制剂等，但是，上述药物会出现诸多的不良反应，导致病原菌耐药性逐渐增强，具有复发率较高、内环境微生态失衡和治疗不彻底等缺点。

发明内容

本申请的目的之一在于提供一种用于抑制阴道炎症的复合益生菌，所述复合益生菌包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Probio-M9和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8，所述复合益生菌能够预防、缓解、抑制和/或治疗炎症反应，并且具有抗阴道炎的功效，可用于治疗阴道炎或者制备用于治疗阴道炎的药物。

在本申请中，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang于2002年分离自锡林郭勒大草原自然发酵酸马奶，是我国第1株完成全基因组测序的乳酸菌，已被证明，具有调节血脂代谢、保护肝脏、提高机体免疫及抗氧化能力、调节肠道菌群年轻化、促进肠道菌群稳态等多种保健作用，已于2011年11月18日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为CGMCCNo.5469，该菌株的检测结果为存活；所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Probio-M9是从中国内蒙古、新疆、湖北、北京等地区100份健康妇女母乳样中分离得到的乳酸菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，体外耐酸性试验和胆盐耐受性试验表明鼠李糖乳杆菌Probio-M9对胃肠消化液具有良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效，目前，已被广泛地用于治疗腹泻、缓解便秘和提高机体免疫力中，已于2019年10月08日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为CGMCCNo.18639，该菌株的检测结果为存活；所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8于2005年分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗自然发酵酸牛乳，相继完成基因组学、益生功能研究及开发，广泛应用于食品、畜牧及农业种植领域，具有改善脂质代谢、降低血脂、提高机体抗氧化能力、提高机体免疫力、促进肠道菌群成熟和维护肠道菌群稳态多种健康作用，已于2012年6月28日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为CGMCCNo.6312，该菌株的检测结果为存活。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌还可以包括发酵底物以及所述复合益生菌在发酵过程中所产生的代谢产物。

进一步地，所述发酵底物可以发酵益生菌的任何一种底物，包括脱脂乳粉、全脂大豆粉和水等。

更进一步地，发酵所述复合益生菌的方法包括：将所述复合益生菌按照特定比例接种于发酵底物中，于特定条件下发酵。

其中，所述特定比例为基于所述发酵底物的总体积，复合益生菌的接种量为1×10⁵CFU/mL～2×10⁷CFU/mL，例如，2×10⁶CFU/mL。

可选地，所述复合益生菌中各菌株的活菌数相等。

所述特定条件包括将接种后的复合体系于37℃恒温发酵至pH＝4.50。

进一步地，在发酵终点将发酵体系于85℃下杀菌15min。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌的剂型包括固体剂型和液体剂型。

进一步地，所述复合益生菌的剂型是外用剂型。

可选地，所述外用剂型包括乳膏、喷雾剂、凝胶、散剂或霜剂等固态剂型，所述外用剂型的复合益生菌承载于妇科用品，所述妇科用品包括卫生棉条和卫生巾等。

在本申请中，所述固态剂型包括粉体剂型。本申请人发现，固体剂型具有物理化学稳定性好、生产制造成本较低、携带方便等特点，液体剂型具有吸收快、起效迅速、生物利用度较高等特点。

进一步地，所述复合益生菌还包括药学上可接受的其它辅料，包括赋形剂或稀释剂。本申请是以可直接接触于患处的形式存在。

更进一步地，所述赋形剂和所述稀释剂的状态包括固体、液体，其中，所述固体可以为粉末状态。

可选地，所述复合益生菌还可以包括热灭活处理后的菌体及代谢产物。本申请人发现，所述复合益生菌及其代谢产物经灭活处理后亦可产生益生作用，且更易于应用和保藏，未来或有更大应用潜力。

本申请的目的还在于提供所述复合益生菌及其制品在制备用于预防、缓解、抑制和/或治疗发炎反应药物中的应用。

本申请的目的还在于提供所述复合益生菌及其制品在制备抗因微生物菌群失衡引起的阴道炎药物中的应用。

与现有技术相比，本申请提供复合益生菌及其制品以可直接接触于患处的益生菌赋形剂或稀释剂的形式存在，并且能够抑制发炎反应，能够抗阴道炎。

附图说明

图1示出复合益生菌发酵液中目标物质含量检测结果；

图2示出受试者使用PFB凝胶前后阴道健康评分结果；

图3A示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的香农多样性指数结果；

图3B示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的辛普森指数结果；

图3C示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的超1指数结果；

图4示出使用PFB凝胶前后优势细菌门构成；

图5A示出使用PFB凝胶前后各细菌属平均相对含量；

图5B示出使用PFB凝胶前后各链球菌属平均相对含量。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的用于抑制阴道炎症复合益生菌及其应用进行详细阐述。

益生菌是一种能够对宿主健康产生有益作用的微生物，通常，益生菌通过口服调节体内菌群的方式来调节改善人体的健康状态。然而，目前尚未有益生菌用于制备外用药物的先例。

本申请人尝试使用复合益生菌制备外用药物，以期获得能够缓解或者消除皮肤或者黏膜等体表炎症的非激素类或者抗生素类药物。

本申请人在经过大量试验后，将干酪乳杆菌Zhang、鼠李糖乳杆菌Probio-M9和植物乳杆菌P-8组成组合物，进一步地，将上述复合益生菌投放至发酵基底上，在特定条件下进行发酵，将发酵所得的体系，包括发酵底物、复合益生菌菌体以及各益生菌生长过程中产生的代谢物制备成制剂，再进一步地，将所述制剂进行高温灭活，使得前一步所制得的制剂中的益生菌失活，检测复合益生菌、复合益生菌制品以及复合益生菌灭活制品对阴道炎的治疗作用。在本申请中，所述复合益生菌制品中还可以包括赋形剂或稀释剂。

实验例

实验例1复合益生菌发酵基料及发酵完成后抑菌物质(有机酸和短链脂肪酸)

将各原料按照表1与55℃蒸馏水均匀混合，经均质、杀菌、冷却后于37℃恒温发酵至pH＝4.50，再于85℃下杀菌15min备用，即PFB凝胶。

表1基料发酵配比及益生菌接种量明细

其中，脱脂乳粉、全脂大豆粉以及蒸馏水的含量百分比，基于三者的重量之和进行计算；干酪乳杆菌Zhang、鼠李糖乳杆菌Probio-M9和植物乳杆菌P-8的接种浓度基于脱脂乳粉、全脂大豆粉以及蒸馏水三者组合物的总体积进行计算。

将本实施例所得发酵液进行靶向定量检测，结果如图1所示，如图1所示，所述发酵液中，基于所述发酵液的总重量，乳酸的含量为566.13μg/g、苯乳酸的含量为31.91μg/g、4-羟基苯乳酸的含量为24.21μg/g、乙酸的含量为65.46μg/g、丙酸的含量为8.19μg/g，丁酸的含量为11.27μg/g。

由本实施例中检出的产物均属于有机酸和短链脂肪酸，由于有机酸和短链脂肪酸具有抑制病原菌能力，因此，本申请人认为本实例所得发酵液具有较好抑制病原菌效果。

基于此，本申请人进行以下实验例2。

实验例2添加益生菌发酵液凝胶治疗阴道炎临床效果及阴道菌群变化

1.制备益生菌发酵液凝胶

使用柠檬酸将去离子水(79.45％)调至pH＝4.50，加入(0.5％)卡波940后搅拌至溶解均匀，继续加入三乙醇胺(1.5％)搅拌均匀，逐次加入丙二醇(2.5％)、PEG-90M(0.05％)、保湿凝胶(5.0％)、苯氧乙醇(1.0％)和实验例1所制备的益生菌发酵液(10.0％)，搅拌均匀，以3g/支进行备样，其中，各组分的配比为基于益生菌发酵液凝胶总重量的重量百分比。

2.实验对象及使用方法

以在昆明同仁医院妇产科门诊于2020年1月至2020年3月就诊的50位阴道炎女性(年龄在18～55岁之间)为对象，经独立伦理委员会(IEC)审核批准。受试者在避开月经期每晚在使用前用温水清洁双手及外阴部，取产品一支，仰卧姿势臀部微抬，将载有凝胶液的凝胶导管缓缓插入阴道深部，用推杆推入阴部，保持姿势15分钟左右即可，连续使用7天，每晚一支。

3.样本采集及观察指标

在用药开始前以及用药结束后的第一天用无菌棉采集新鲜的阴道分泌物，采样后将无菌棉置于含生理盐水的试管中，用于后续测序。同时记录受试者外阴瘙痒情况、白带数量、颜色和气味的情况，并在取样30分钟内在化验室测定白带的生化情况。所有评定由专业医生或者人员操作，数据录入时，均由2人以上复核，以保证数据的一致性和准确性。

4.疗效评定方法

(1)疗效指标：有效，使用后阴道清洁度级别正常或过氧化氢结果为阴性，症状体征有所好转；无效，未达到上述标准。

(2)阴道健康评分：

对使用前和使用后两个组的阴道健康进行评分，评分标准为《中药新药临床研究指导原则(试行)》。具体地，评价白带量的方面：将量少的记为2分，将中等的记为1分，将量多的记为0分；评价白带的性状：将稀的记为1分，稠的记为0分；评价白带气味：将无味的记为1分，将有异味的记为0分；评价白带颜色方面：将颜色为清的记为3分，淡黄记为2分，黄色记为1分，绿色记为0分。

结果如图2所示，使用添加益生菌发酵液凝胶后，阴道分泌物的健康状况出现明显好转，其阴道健康评分与使用添加益生菌发酵液凝胶前相比均显著提高。与使用添加益生菌发酵液凝胶前相比，使用后的患者白带的量从多逐渐正常，部分患者的白带气味从有异味变成了没有气味，白带的质地从浓稠变成了正常的，白带的颜色也出现明显的改善。由此可见，添加益生菌发酵液凝胶能够有效的改善白带异常，促进阴道健康。

5.Illumina高通量测序

应用Illumina高通量测序技术测定阴道分泌物中的细菌相对含量，通过CTAB法提取阴道分泌物中宏基因组DNA，并使用515F和806R引物对16S rRNAV4区进行扩增，将扩增成功的样品进行DNA文库构建，最后使用Illuminanovaseq PE250平台进行测序。

6.临床疗效

通过对临床的疗效进行评估，结果如表2所示。

表2临床疗效结果

由表2可知，使用实验例1制备的PFB凝胶后，在50位阴道炎患者中，有45人的症状体征出现明显好转，另有5人的症状与之前相比症状体征未出现变化或有变重的趋势。

外阴瘙痒是一种主管参考指标，正常的阴道环境pH为弱酸性。50位患者中，有3例样本在使用PFB凝胶后没有出现瘙痒症状，有2例样本的pH值从6.5降到5.5，并且，PFB凝胶对于阴道炎患者的总有效率达到90％，表明PFB凝胶对阴道炎有改善作用。

7.α多样性分析

为了研究使用PFB凝胶前后所形成两组样品的差异，本研究将样品进行筛选，剔除脱组的样品，共得到42对样品(同一患者使用PFB凝胶前后分别采集的样品形成一对样品)。将所获得42对样品对其组间α多样性进行研究，分别是香农多样性指数、辛普森指数和超1指数，结果如图3A至图3C所示。通过分析使用PFB凝胶前后白带中细菌的香农多样性指数、辛普森指数和超1指数进行综合的评价其对微生态环境的影响。结果如图3A至图3C的示，其中，

图3A示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的香农多样性指数结果；

图3B示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的辛普森指数结果；

图3C示出使用PFB凝胶前后白带中细菌的超1指数结果。

由图3A至图3C可知，PFB凝胶使用前和使用后，受试者阴道分泌物中细菌的物种多样性和物种丰度存在一定的区别。具体体，使用PFB凝胶后，受试者阴道分泌物中细菌的物种多样性和物种丰度方面均呈现指出下降的趋势，但是并没有表现出显著性差异。

本申请人认为，物种多样性和物种丰度下降的原因可能是实验使用的添加益生菌发酵液凝胶抑制了部分微生物的生存，从而降低物种的丰富度和多样性。

8.细菌门属水平差异分析

检测方法为：通过分析使用PFB凝胶前后细菌的门水平和属水平差异，进而解释对其阴道微环境的影响。

本实验例将平均相对含量大于1.0％的门属分别定义为优势细菌门和优势细菌属，经过实验获得，使用PFB凝胶前后，阴道分泌物中的优势细菌门均有5个。

对优势细菌门进行对比分析，其优势细菌门在各样品中的相对含量如图4所示。由图4可知，使用添加益生菌发酵液凝胶前后患者的阴道分泌物的微生物群组成比例发生改变，与使用前相比，使用后的微生物群中Actinobacteria(放线菌门)和Fusobacteria(梭杆菌门)的相对含量有所增加，而Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)的相对含量则有所下降，但这些差异并无统计学意义(P>0.05)。

为分析微生物群的变化，本申请进一步对优势细菌属进行对比分析，结果如图5A和图5B所示，其中，图5A示出使用PFB凝胶前后各细菌属平均相对含量，图5B示出使用PFB凝胶前后各链球菌属平均相对含量。

由图5A可知，使用PFB凝胶前后，平均相对含量大于1％的细菌属分别为Lactobacillus(乳杆菌属，71.56％)、Gardnerella(加德纳菌属，6.02％)、Prevotella(普氏菌属，3.30％)、Streptococcus(链球菌属，1.62％)和Atopobium(奇异菌属，2.89％)。其中Lactobacillus在两组间的相对含量均达到70％以上。

与使用前相比，使用PFB凝胶后，Gardnerella中Streptococcus和Prevotella的相对含量有所下降，而Atopobium的相对含量有所增加。

进一步对使用前后菌属的变化差异进行分析发现，在使用PFB凝胶后，Streptococcus显著降低(P<0.001)，而Atopobium在使用前后的差异并不显著(P＝0.076)。

值得一提的是，在显微镜观察下，有10例样本中乳杆菌从无到有(显微镜部分数据未展示)，而这10例中仅有5例进行Illumina测序，通过对5例的乳杆菌属相对含量分析发现，有4例样本的乳杆菌相对含量均有不同程度的增加，而在42名患者中，有24名患者的阴道分泌物中乳杆菌属的含量有所增加，占患者总人数的57％。由此可见，PFB凝胶表现出增加阴道乳杆菌数量的作用。

使用Pearson相关系数将优势细菌属和白带的量、颜色、气味以及性状等指标进行分析，结果如表3所示。

表3优势细菌属与白带情况的相关性

说明：数值“正负”代表相关性，“-”为负相关，“+”为正相关，值为相关性大小。数字肩“*”表示显著性，其中“*”表示显著性水平为0.05，“**”表示显著性水平为0.01，“***”表示显著性水平为0.001。

由表3可知，阴道菌群中的优势菌属之间存在明显的相关性，但是与白带情况之间的相关性并不显著，其中，Lactobacillus与Gardnerella和Prevotella之间呈现极显著负相关(P<0.001)，其与Atopobium之间的负相关非常显著(P<0.01)。

使用PFB凝胶后，阴道炎患者阴道菌群中加德纳菌属有下降趋势，表明PFB凝胶能够有效抑制厌氧菌的生长，从而改善阴道菌群。

本申请人认为，阴道菌群健康的标准为阴道菌群主要以乳杆菌(Lactobacillus)为主导，上述实验例表明，本申请提供的复合益生菌能够对因阴道炎病理产生的微生物菌群结构异常进行调控，补充阴道菌群中的优势菌—乳杆菌，促进阴道菌群平衡，进而维持其稳态，从而抑制病原菌等菌群的繁殖，抑制发炎反应及阴道黏膜细胞发炎的症状，从而对阴道炎的症状有改善作用。

本申请提供的复合益生菌安全可靠，在临床上具有较高的应用价值，从根本上保护阴道微生态环境和致病菌的侵扰，弥补抗生素治疗阴道微生物感染疗效的不足。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种复合益生菌用于制备预防、缓解、抑制和/或治疗阴道炎的外用制剂的用途，其特征在于，

所述益生菌菌体包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Probio-M9和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8；其中，

所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Probio-M9的微生物保藏编号为CGMCCNo.18639和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8的微生物保藏编号为CGMCCNo.6312。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述复合益生菌的剂型为外用剂型，包括固体剂型或者液体剂型。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述复合益生菌承载于妇科用品，所述妇科用品包括卫生棉条和卫生巾。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述复合益生菌还包括药学上可接受的其它辅料。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述辅料包括赋形剂或稀释剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述赋形剂和所述稀释剂的状态包括固体、液体。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述阴道炎包括因微生物菌群失衡引起的阴道炎。