IT202100017855A1 - Bacteria strains for topical skin care - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell?invenzione dal titolo:
?Ceppi di batteri per la cura topica della pelle?
La presente invenzione si riferisce a ceppi batterici selezionati, appartenenti alla specie Lactobacillus paracasei (recentemente riclassificata da
, e loro relative miscele, loro composizioni e loro uso per ridurre imperfezioni della pelle, irritazioni/arrossamenti e secchezza.
STATO DELL?ARTE
Sono disponibili numerosi tipi di prodotti per la cura topica della pelle come detergenti, tonici, idratanti, sieri anti-et?, ecc. Queste composizioni molto spesso contengono sostanze chimiche che sono relativamente aggressive per la pelle e possono a lungo termine provocare danni pronunciati alla pelle. Questi prodotti di solito contengono ingredienti chimici che possono, indipendentemente o in combinazione con altri ingredienti danneggiare la pelle invece di giovarvi e quindi non sono adatti a tutti i tipi di pelle. Inoltre, queste formulazioni possono causare irritazione a certi tipi di pelle.
Pertanto, vi ? una forte domanda per l'identificazione di nuovi trattamenti per la cura della pelle in grado di ridurre imperfezioni della pelle, irritazioni/arrossamenti, secchezza e/o infiammazioni della pelle come alternative alle composizioni e ai trattamenti cosmetici chimici convenzionali.
La Richiedente, a seguito di un'intensa e prolungata attivit? di ricerca e sviluppo, ha sorprendentemente riscontrato che specifici ceppi batterici del genere Lactobacillus appartenenti alla specie Lactobacillus paracasei e identificati come Lactobacillus paracasei LPC-S01<? >e depositati presso il Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con numero di deposito DSM 26760 da l'11 gennaio 2013, e convertito in deposito secondo il trattato di Budapest il 15 maggio 2017, possono risolvere il problema tecnico di cui sopra.
La Richiedente, a seguito di un'intensa e prolungata attivit? di ricerca e sviluppo, ha sorprendentemente riscontrato che specifici ceppi batterici del genere Lactobacillus appartenenti alla specie Lactobacillus casei spp. casei identificati come L. casei DG<? >e depositati presso la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR (CNCM) con il numero di deposito CNCM I-1572 da il 5 maggio 1995, possono risolvere il problema tecnico di cui sopra.
Detti ceppi di batteri sono stati depositati conformemente alle disposizioni del trattato di Budapest; il depositante di detti ceppi di batteri descritti e rivendicati in questa domanda di brevetto e la richiedente esprimono il loro consenso a rendere disponibili i ceppi per la durata del brevetto.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito alla prestimolazione per contatto dei cheratinociti con i diversi probiotici testati (nella figura, (*) dati statisticamente significativi (p<0,05)). LP125=LPC-S01; LC48=DG.
Figura 2: adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito alla coincubazione di cheratinociti con P. acnes e con i diversi probiotici testati (nella figura, (*) dati statisticamente significativi (p<0,05)).
Figura 3: adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito all'incubazione di cheratinociti con i diversi probiotici testati, dopo sfida di cellule eucariotiche con l?agente patogeno. (nella figura, (*) dati statisticamente significativi (p<0,05)).
Figura 4: effetto immunomodulatore su IL1?, IL10 e IL8 da parte dei ceppi probiotici.
Figura 5: western blotting su COX-2 e NF-kB.
Figura 6: misurazioni medie di spessore dermico.
Figura 7: disegno del modello di Inflammasoma.
Figura 8: diagrammi a blocchi che riportano la Traslocazione di NF-kB VS 42-18 a 4 ore. CN: Controllo negativo, CP: Controllo positivo, P1: LPC S01, P2: Maschera di acido ialuronico LPC S01, P3: Maschera di acido ialuronico.
Figure 9 e 10: Modello di infiammazione-invecchiamento su pelle T a 4 ore e 24 ore.
Figura 11A e Figura 11B: risultati di espressione genica dopo 24 h (sinistra) e dopo 48 h (destra). RQ calcolato con NC 24 h=1, RQ calcolato con NC 48 h=1. RQ < 0,5 sottoregolazione, RQ> 2 sovraregolazione.
Figura 12: struttura della pelle.
Figure 13-15: protocolli dello studio 4b.2. La figura 14 rappresenta il protocollo pre-trattamento; la figura 15 rappresenta il protocollo post-trattamento.
Figura 16A e Figura 16B: riduzione della vitalit? di C. acnes (precedentemente P. acnes) DSM 1897 espressa in Log10 CFU/inserto (parte sinistra della figura 16). A destra, percentuale di riduzione della vitalit? di C. acnes DSM 1897 nelle varie condizioni testate nel modello di pre-trattamento con probiotico e successiva infezione con agente patogeno.
Figura 17: prova di gruppo.
Figura 18A e Figura 18B: riduzione della vitalit? di C. acnes (precedentemente P. acnes) DSM 1897 espressa in Log10 CFU/inserto (parte sinistra della figura 16). A destra, percentuale di riduzione della vitalit? di C. acnes DSM 1897 nelle varie condizioni testate nella prova di competizione.
Figura 19A e Figura 19B: riduzione della vitalit? di C. acnes (precedentemente P. acnes) DSM 1897 espressa in Log10 CFU/inserto (parte sinistra della figura 16). A destra, percentuale di riduzione della vitalit? di C. acnes DSM 1897 nelle varie condizioni testate nella prova di sostituzione.
Figura 20: mostra il valore di idratazione superficiale della pelle della zona trattata ottenuto sui 29 volontari.
Figura 21: rappresenta la valutazione clinica dell'estensione dell'area facciale coinvolta e mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari.
Figura 22: mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari e mostra una diminuzione statisticamente significativa dell'eritema.
Figura 23: mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari e mostra una diminuzione statisticamente significativa del numero di papule e/o pustole.
Figura 24: mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari e mostra una diminuzione statisticamente significativa della secchezza della pelle.
Figura 25: mostra i risultati del trattamento basato su 29 casi per campione dopo 14 giorni versus 28 giorni di trattamento.
Probiotici vs P. acnes (Cutibacterium acnes, precedentemente Propionibacterium acnes)
Due ceppi di Lactobacillus paracasei, vale a dire L. paracasei LPC-S01 e L. casei DG al fine di valutare la loro efficacia in:
? inibire la crescita di P. acnes;
? modulare la reazione infiammatoria dei cheratinociti in seguito alla sfida con stimolazione infiammatoria (LPS).
Per eseguire questi esperimenti sono stati usati cheratinociti umani normali, tenuti in coltura con gli integratori adeguati.
I cheratinociti umani coltivati sono stati identificati come un substrato adatto per le determinazioni preliminari necessarie per valutare l'efficacia di un probiotico destinato all'applicazione nell'attenuazione delle irritazioni cutanee. I cheratinociti rappresentano infatti la prima linea di difesa della pelle rispetto all'ambiente esterno, essendo disseminati nello strato cutaneo esterno (epidermide) e possono indurre la secrezione di citochine e chemochine per trasmettere il messaggio di allarme agli strati pi? profondi della pelle, generando la risposta infiammatoria. Durante la loro evoluzione subiscono una migrazione dagli strati pi? profondi a quelli pi? superficiali, con progressiva deposizione di cheratina, responsabile dell'azione protettiva.
I cheratinociti primari umani possono essere coltivati in vitro in laboratorio e destinati a prove di coltura con ceppi batterici per identificare la natura della risposta immunitaria da questi indotta.
I ceppi batterici usati sono elencati di seguito:
? L. casei DG<? >(L. paracasei CNCM I-1572)
? L. paracasei LPC-S01<? >(DSM 26760)
? L. casei DG<? >+ L. paracasei LPC-S01, miscela 1:1
Sono state condotte le seguenti prove:
1. Prove di adesione e di sfida della linea cellulare con l'agente patogeno;
2. Prova di immunomodulazione;
1.2.1 Prove di adesione e di sfida
Questi esperimenti servono a verificare la capacit? di ceppi specifici di Lactobacillus paracasei, da soli o in una miscela 1:1, per interferire con l'adesione di Propionibacterium acnes su cheratinociti umani normali in colture.
Nella prova di esclusione (pre-trattamento di cellule eucariotiche con probiotici e successiva incubazione con l'agente patogeno), i risultati hanno dimostrato che entrambi i ceppi probiotici hanno mostrato una capacit? di prevenire l'adesione di P. acnes, in % simile (il 42% per L. casei DG? e il 35% per L. paracasei LPC-S01).
I risultati sono riportati nella Figura 1 che rappresenta l'adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito alla prestimolazione per contatto dei cheratinociti con i diversi probiotici testati. Dopo l'adesione di P. acnes in assenza di stimolazione da parte dei probiotici, la capacit? di inibizione dei ceppi testati ? espressa come % di riduzione di adesione di P. acnes rispetto al controllo positivo.
Nella prova di competizione (coincubazione di cellule eucariotiche con probiotici e con l'agente patogeno), le prove risultanti hanno dimostrato che il ceppo L. casei DG? ha una capacit? di riduzione di adesione del 17% mentre il ceppo L. paracasei LPC-S01 ha una capacit? di riduzione di adesione del 9%. La miscelazione dei ceppi ha prodotto una riduzione statisticamente significativa dell'adesione di P. acnes, raggiungendo il 42%, una percentuale chiaramente superiore a quella osservata per i ceppi considerati singolarmente, mostrando chiaramente un effetto sinergico. I risultati sono riportati in figura 2.
La figura 2 rappresenta l?adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito alla coincubazione di cheratinociti con P. acnes e con i diversi probiotici testati. Come descritto in precedenza, con l'adesione di P. acnes in assenza di stimolazione da parte dei probiotici, la capacit? di inibizione dei ceppi testati ? stata espressa come % di riduzione di adesione di P. acnes rispetto al controllo positivo.
Nella prova di sostituzione (pre-trattamento di cellule eucariotiche con l'agente patogeno e successiva incubazione con il probiotico), i risultati hanno mostrato un interessante effetto sinergico statisticamente significativo, legato alla miscela di 2 probiotici che ha dimostrato di essere in grado di ridurre l'adesione di P. acnes del 42%. I singoli probiotici hanno invece rivelato una capacit? di riduzione di adesione pari al 18% per L. casei DG<? >e all'11% per L. paracasei LPC-S01.
I risultati sono riportati in figura 3 che rappresenta l?adesione di P. acnes in termini di percentuale di cellule vive e vitali aderenti in seguito all'incubazione di cheratinociti con i diversi probiotici testati, dopo sfida di cellule eucariotiche con l?agente patogeno. Come descritto in precedenza, con l'adesione di P. acnes in assenza di probiotici, la capacit? di inibizione dei ceppi testati ? stata espressa come % di riduzione di adesione di P. acnes rispetto al controllo positivo.
1.2.2 Prova di immunomodulazione
L'obiettivo di questi esperimenti era quello di verificare la capacit? di ceppi specifici di Lactobacillus paracasei, da soli o in una miscela 1:1, di esercitare un effetto immunomodulante sui cheratinociti umani normali in coltura.
Le prove si sono concentrate sulla determinazione di citochine (IL-8, IL-1beta e IL-10) e sulla valutazione dell'attivazione di 2 marcatori COX-2 e NF-kB.
COX-2 (cicloossigenasi-2) rappresenta un marcatore inducibile, prodotto da un piccolo numero di tipi di cellule in risposta a uno specifico stimolo infiammatorio. Sembra essere sovraespresso in diverse neoplasie, incluse quelle della pelle.
NF-kB (potenziatore di catena leggera di fattore nucleare kappa di cellule B attivate) ? un complesso proteico con funzione di fattore di trascrizione, prodotto da tutti i tipi di cellule in risposta a vari stimoli, inclusi quelli di natura infiammatoria.
I risultati hanno mostrato quanto segue:
? I saggi di citochine nel surnatante di cellule esposte ai probiotici hanno permesso di evidenziare un effetto immunomodulatore, riducendo l'espressione di IL1?, IL10 e IL8 da parte dei ceppi probiotici considerati singolarmente, con particolare riferimento a L. paracasei LPC-S01. I risultati sono riportati in figura 4.
? L'effetto immunomodulatore in seguito all'attivazione indotta da LPC-S01 ? altres? confermato dai risultati di western blotting su COX-2 e NF-kB. Un potenziale particolare ? associato al ceppo L. paracasei LPC-S01, sebbene anche il ceppo L. casei DG<? >sia stato interessante ma meno efficace nell'azione antinfiammatoria complessiva contro i cheratinociti. I risultati sono mostrati in Figura 5.
1.3 Sintesi dei risultati
Il potenziale sinergico dei ceppi misti ? significativo nella sostituzione dell?agente patogeno, se la miscela viene usata insieme alla presenza dell?agente patogeno a contatto con i cheratinociti o successivamente all'infezione, per il contenimento della sua proliferazione.
Da un punto di vista immunomodulatorio, in molti casi il ceppo L. paracasei LPC-S01 ? stato pi? efficace di L. casei DG<? >nel modulare la reazione infiammatoria dei cheratinociti in seguito a una sfida con stimoli infiammatori (LPC-S01).
2. Probiotici maschera - modello omeostatico
Lo scopo dello studio era di valutare una serie di campioni a base di acido ialuronico, o collagene, od olio di jojoba, con o senza i ceppi probiotici secondo l'invenzione. Gli studi sono stati eseguiti su un modello 3D completo ricostituito in vitro, incluso il derma e l'epidermide (modello di pelle a tutto spessore), al fine di esplorare la loro potenziale applicazione ed efficacia per la cura della pelle.
2.1. Stato dell?arte
I modelli di pelle umana ricostruita in vitro sono pi? vicini in termini di morfologia (epitelio multistratificato), propriet? biochimiche e fisiologiche ai tessuti umani in vivo e rappresentano oggi l'alternativa pi? promettente agli animali, agli espianti ex vivo e ai monostrati cellulari sommersi per la valutazione in vitro della sicurezza e dell'efficacia dei prodotti applicati topicamente (Gordon et al. 2015, Zuang V. 2016).
La rilevanza biologica e la predittivit? di questi modelli derivano dalla presenza di un tessuto organizzato con diversi strati di cellule viventi che permettono di valutare i prodotti topicamente a dosi cliniche realistiche e condizioni di esposizione.
Il trattamento della pelle umana con prodotti applicati topicamente, come i cosmetici, porta a una risposta genomica che ha un percorso dinamico e rappresenta il primo segnale cellulare a livello trascrizionale responsabile di una cascata di eventi. I tessuti umani viventi in 3D sono sistemi di prova rilevanti per indagare il meccanismo d'azione e per valutare l'efficacia del prodotto tenendo conto sia della risposta genomica diretta che dei risultati della comunicazione cellulare e dell?interferenza (crosstalk) attraverso mediatori solubili ed espressione di biomarcatori specifici.
? stato sviluppato un modello specifico per i prodotti cosmetici che testa un modello di omeostasi su "Modello di pelle a tutto spessore" (pelle T) che riproduce i compartimenti dermico ed epidermico: questo modello ha la specificit? di permettere lo studio di modifica di matrice extracellulare dermica e di differenziazione di strato vitale con un approccio multiparametrico.
2.2 Lo studio
Una serie di nuovi prodotti a base di acido ialuronico, collagene od olio di jojoba in una formulazione di riferimento ("Maschera") come tale e in presenza del ceppo probiotico LPC-S01 sono stati valutati su un modello 3D completo ricostituito in vitro, includente il derma e l'epidermide (modello di pelle a tutto spessore), al fine di esplorare la loro potenziale applicazione ed efficacia per la cura della pelle.
I prodotti testati sono come segue:
Tabella 1
I prodotti sono stati applicati direttamente sulla superficie del modello 3D per 8 h in un'esposizione quotidiana fisiologica, seguita da una delicata procedura di lavaggio con soluzione salina per rimuovere l'eccesso di prodotto, e una postincubazione di 16 h per simulare un'esposizione realistica di una maschera.
I seguenti parametri sono stati considerati sul modello 3D completo ricostituito in vitro, inclusi il derma e l'epidermide (modello pelle FT), al fine di definire la loro tolleranza della pelle e la loro efficacia nel: ? migliorare l'autodifesa della pelle mediante induzione di peptidi antimicrobici;
? stimolare l'immunorisposta innata dei cheratinociti, il rinnovamento epidermico e la differenziazione;
? indurre un rinnovamento positivo dei compartimenti epidermico e dermico, agendo come antinvecchiamento.
Tabella 2
I principali risultati positivi ottenuti sono riportati nella seguente tabella per ciascun prodotto, mediante confronto per i 3 ingredienti principali (olio di jojoba, acido ialuronico, collagene) nei diversi prodotti a base di maschera, con o senza il ceppo batterico Lactobacillus paracasei LPC-S01.
Tabella 3
I migliori risultati sono stati ottenuti con la combinazione di acido ialuronico e del ceppo L. paracasei LPC-S01.
Per l'analisi morfologica, ? stato dato un punteggio di valutazione qualitativa rispetto al controllo:
? nessuna modifica significativa
? miglioramento significativo dei descrittori morfologici
- ? morfologia leggermente alterata
- - ? morfologia alterata
Tabella 4
2.3 Sintesi dei risultati
Globalmente, i risultati ottenuti indicano che il probiotico LPC-S01 esercita un effetto positivo sulla pelle migliorando la sua immunit? innata (basato su TLR 2 e HBD-2) quando applicato da solo.
I prodotti a base di acido ialuronico, o collagene, od olio di jojoba senza il ceppo probiotico non hanno esercitato un effetto positivo sul modello pelle T; al contrario, gli stessi prodotti comprendenti altres? il ceppo batterico LPC-S01 mostrano un effetto positivo nel migliorare l'autodifesa della pelle.
Il prodotto maschera di acido ialuronico Lactobacillus paracasei LPC-S01 ? risultato la combinazione pi? promettente mostrando un'efficacia positiva:
? nel migliorare il processo di differenziazione della pelle e il rinnovamento della pelle;
? nel potenziare globalmente la struttura di comparto dermico aumentando la rete di collagene.
3a. Probiotici maschera - modello di inflammasoma -cellule vive
Scopo
Con questo studio ? stato valutato l'effetto del ceppo Lactobacillus paracasei LPC-S01, da solo o in combinazione con l'acido ialuronico ("la maschera"), su un modello di inflammasoma al fine di esplorare la loro potenziale applicazione ed efficacia per la riduzione dell'infiammazione. Questo studio si ? concentrato sull'effetto del prodotto sull'attivazione di inflammasoma in risposta all'irradiazione UV e quindi all'infiammazione.
Tabella 5
3a.1 Stato dell?arte
I modelli di pelle umana ricostruita in vitro sono pi? vicini in termini di morfologia (epitelio multistratificato), propriet? biochimiche e fisiologiche ai tessuti umani in vivo e rappresentano oggi l'alternativa pi? promettente agli animali, agli espianti ex vivo e ai monostrati cellulari sommersi per la valutazione in vitro della sicurezza e dell'efficacia dei prodotti applicati topicamente (Gordon et al. 2015, Zuang V. 2016).
La rilevanza biologica e la predittivit? di questi modelli derivano dalla presenza di un tessuto organizzato con diversi strati di cellule viventi che permettono di valutare i prodotti topicamente a dosi cliniche realistiche e condizioni di esposizione. Il trattamento della pelle umana con prodotti applicati topicamente, come i cosmetici, porta a una risposta genomica che ha un percorso dinamico e rappresenta il primo segnale cellulare a livello trascrizionale responsabile di una cascata di eventi.
I tessuti umani viventi in 3D sono sistemi di prova rilevanti per indagare il meccanismo d'azione e per valutare l'efficacia del prodotto tenendo conto sia della risposta genomica diretta che dei risultati della comunicazione cellulare e dell?interferenza attraverso mediatori solubili ed espressione di biomarcatori specifici.
Nel presente studio ? stato usato il "modello di pelle a tutto spessore" (pelle T) che riproduce i compartimenti dermico ed epidermico, sviluppato appositamente per testare i prodotti cosmetici da VitroScreen. Questo modello ha permesso lo studio della modificazione di matrice extracellulare dermica e della differenziazione epidermica con un approccio multiparametrico in una condizione di stress indotta dalle radiazioni UV.
3a.2 Lo studio
Un nuovo prodotto a base di acido ialuronico in una formulazione di riferimento ("Maschera") come tale e in presenza di un ceppo batterico probiotico Lactobacillus paracasei LPC-S01 ? stato valutato su un modello di inflammasoma al fine di esplorare la loro potenziale applicazione ed efficacia per la riduzione di infiammazione. I prodotti testati sono come segue:
Tabella 6
I prodotti sono stati applicati direttamente sulla superficie del modello 3D e incubati per una notte, seguito da una delicata procedura di lavaggio con soluzione salina per rimuovere l?
eccesso di prodotto. I tessuti sono stati leggermente abrasi e poi esposti a 1 MED di UV per simulare la normale esposizione al sole. L'attivazione del percorso di inflammasoma ? stata valutata 4 h e 24 h dopo irradiazione di 1 MED.
I seguenti parametri sono stati analizzati rispetto al controllo non trattato:
- Immunocolorazione di NF-?B
- Colorazione con ematossilina ed eosina
- Quantificazione di IL-1? secreta mediante ELISA
Il controllo positivo (inflammasoma indotto da 1 MED) ha mostrato le seguenti caratteristiche:
Tabella 7
In termini di morfologia, tutti i tessuti irradiati hanno presentato cellule da scottatura a 4 h, seguite da danni epidermici e dermici significativi a 24 h, come previsto dopo abrasione epidermica.
I principali risultati degli elementi di prova ottenuti sono riportati nella seguente tabella, mediante confronto per la maschera (acido ialuronico), il ceppo probiotico LPC-S01 e la combinazione di entrambi rispetto al controllo positivo irradiato.
Tabella 8
I risultati ottenuti a 4 h sono mostrati in figura 8.
Un'efficacia significativa nel ridurre l'infiammazione ? stata osservata per tutti i prodotti a 4 h.
La maschera ha probabilmente agito come agente di formazione di pellicola che protegge dalla luce UV. Tuttavia, la morfologia di tessuto nel campione trattato con la P2 era significativamente diversa a 4 h e 24 h come mostrato nelle figure 9 e 10.
Il prodotto acido ialuronico LPC-S01 ha conservato meglio l'integrit? della giunzione dermoepidermica e globalmente l'architettura e la compattezza della pelle dai danni di UV rispetto alla maschera ialuronica senza il ceppo batterico secondo l'invenzione, mostrando un chiaro effetto sinergico.
3a.3 Sintesi dei risultati
Il probiotico LPC-S01 da solo (P1) e il probiotico LPC-S01 in combinazione con HA (P2) sono stati significativamente attivi nel ridurre l'effetto di una dose di UV biologicamente rilevante (1 MED) in presenza di una barriera della pelle compromessa sulla traslocazione nucleare di NF-?B e il successivo accumulo nel citoplasma dei cheratinociti: essi hanno diminuito prima la traslocazione nucleare (efficacia iniziale visibile a 4 h) e in un secondo tempo il contenuto citoplasmatico di NF-?B (visibile a 24 h), indicando la loro efficacia positiva ritardata sulla riduzione di inflammasoma.
Il probiotico LPC-S01 (P1) ha indotto un'ulteriore riduzione del contenuto citoplasmatico di NF-?B a 4 h.
Nelle condizioni di esposizione specifiche adottate in questo studio (trattamento per una notte, lavaggio delicato di residuo, abrasione per ridurre la funzione di barriera e indurre una maggiore sensibilit? agli UV, esposizione agli UV) P1 e P2 hanno dimostrato di agire attraverso un meccanismo antinfiammatorio visibile 4 h dopo induzione di stress e ancora attivo dopo 24 h.
Nonostante un'efficacia antinfiammatoria simile, un effetto sinergico era visibile per P2 nella protezione della struttura di giunzione dermoepidermica dai danni di UV. Inoltre, un'efficacia pi? efficiente e duratura (24 h) del probiotico ? ottenuta quando usato in combinazione con la maschera HA (P2).
3b. Probiotici maschera - modello di inflammasoma -cellule vive e inattivate
Un modello sperimentale su pelle T (pelle a tutto spessore) basato su percorsi infiammatori indotti da UVA UVB (dose di 1 MED) ? stato applicato per valutare l'efficacia del ceppo probiotico LPC-S01 (vitale e inattivato) quando applicato prima dell'induzione dello stress da inflammasoma.
Il presente studio ? stato pianificato e condotto con 2 scopi: valutare l'efficacia del LPC-S01 vitale da solo o quando introdotto in una formulazione di riferimento ("Maschera") dopo un breve tempo di pre-trattamento (45 min) con lettura finale dopo 4 h rispetto al tempo di pre-trattamento a lungo termine (16 h per una notte come nello studio precedente).
? per valutare l'efficacia di LPC-S01 inattivato sia per un tempo di pre-trattamento breve (45 min) che a lungo termine (16 h per una notte).
3b.1 Stato dell?arte
Nel presente studio ? stato usato un "modello di pelle a tutto spessore" VitroScreen (pelle T) che riproduce compartimenti dermici ed epidermici: questo modello ha permesso lo studio di modifica di matrice extracellulare dermica e la differenziazione epidermica con un approccio multiparametrico in una condizione di stress indotto da radiazioni UV.
3b.2 Lo studio
Uno studio ? stato condotto al fine di valutare l'efficacia di ceppo probiotico Lactobacillus paracasei LPC-S01 da solo o quando introdotto in una formulazione topica ("Maschera") rispetto alla formulazione placebo (3 prodotti): il protocollo era basato su percorsi infiammatori indotti da UVA UVB (dose di 1 MED).
In questo studio i prodotti sono stati applicati per un pre-trattamento per una notte, poi rimossi e la pelle T ? stata irradiata: la lettura (traslocazione di NF-kB e morfologia) ? stata quantificata dopo 4 h e 24 h dopo irradiazione.
I campioni testati e le condizioni sperimentali (i prodotti sono stati applicati direttamente sulla superficie del modello 3D) sono riportati nella seguente tabella.
Tabella 9
Protocollo di tempo di pre-trattamento a lungo termine di 16 h: confronto tra probiotico vitale e inattivato
Nella tabella seguente, l'analisi semiquantitativa di traslocazione nucleare di NF-?B ? presentata per il tempo di pre-trattamento di 16 h (a lungo termine), confrontando i dati attuali con quelli ottenuti in precedenza (si veda studio precedente) per valutare l'effetto del trattamento a lungo termine.
Tabella 11
? Le serie LPC-S01 inattivato (LPC-S01 inattivato da solo o nella formulazione) non hanno indotto una riduzione significativa di NF-kB, che ? stata misurata dopo 16 h di pre-trattamento, mentre le serie vitali LPC-S01 (LPC-S01 da solo o nella formulazione) (rif. VS 42-18) sono state efficaci nel ripristinare il livello di NF-kB nucleare al controllo negativo per tutti gli elementi di prova con una diminuzione significativa di traslocazione di NF-kB.
? Considerando la maschera placebo, nel presente studio ? stata rilevata un'efficacia anche dopo 16 h di pretrattamento (-28,4% p = 0,00) come riportato nello studio precedente.
Nella seguente tabella sono riportati i risultati dell'analisi istomorfologica:
Tabella 12
Punteggio dell'efficacia di trattamenti nella riduzione di inflammasoma (vale a dire nuclei positivi a NF-kB e SBC).
Legenda: (+) leggera efficacia; (+++) marcata efficacia; (-) nessun effetto.
3b.3 Sintesi dei risultati
La rilevanza biologica e la riproducibilit? del modello di inflammasoma (esposizione UV a 1 MED, dose minima eritemica) ? stata confermata da un aumento di traslocazione di NF-kB nel nucleo delle cellule nei campioni irradiati rispetto al controllo negativo.
? L'aumento relativo di traslocazione di NF-kB (differenza percentuale) ? comparabile (+70,7%, p = 0,01 - VS 75-18) a quello quantificato nello studio precedente (+83,7, p = 0,01 - VS 42-18).
? I prodotti contenenti il probiotico vitale LPC-S01 dopo un breve pre-trattamento (45 min) hanno mostrato una minore efficacia nel ridurre la traslocazione di NF-kB rispetto al pre-trattamento a lungo termine (16 h). ? Il probiotico inattivato LPC-S01 da solo o quando introdotto nella formulazione ("Maschera") mostra una bassa efficacia nel ridurre il danno indotto da UV (traslocazione di NF-kB) sia nei pre-trattamenti a breve che a lungo termine.
? La maschera ialuronica da sola (maschera placebo) ha confermato la sua azione come scudo fisico sia a breve termine (-27,2%, p = 0,001) che a lungo termine (-28,4% p = 0,00).
4. Probiotico inattivato crema Yaluage?
Lo studio ? diviso in tre diverse fasi:
1. Valutazione dell'efficacia del ceppo probiotico inattivato LPC-S01, da solo o incluso in una formulazione di crema (Yaluage) su un modello 3D completo ricostituito in vitro, incluso il derma e l'epidermide (modello di pelle a tutto spessore), in termini di benefici per l'omeostasi della pelle per esplorare la sua potenziale applicazione ed efficacia nella cura della pelle. (modello omeostatico)
2. La dose precedentemente studiata sar? testata per la sua efficacia sul modello di inflammasoma con pretrattamento (rispetto all'irradiazione) di 45 minuti e 4 ore in 3 forme: a) come tale b) nella formulazione di Yaluage e c) Yaluage come tale (controllo). (modello inflammasoma).
3. La dose precedentemente studiata sar? testata per la sua efficacia sul modello inflammasoma con applicazione dopo 45 min e 4 ore dopo irradiazione (post-trattamento) in 3 forme: a) come tale (ceppo probiotico batterico LPC-S01) b) nella formulazione Yaluage e c) Yaluage (modello inflammasoma).
La crema Yaluage ? una crema antinvecchiamento per il viso, comprendente acido ialuronico, collagene, vitamina E, cellule staminali di Gardenia jasmoides (gardenia), filtri chimici liberi e legati e burro di karit?.
4a. Modello omeostatico
Lo scopo dello studio ? stato quello di indagare il profilo di tolleranza della pelle del ceppo di batterio inattivato (LPC-S01) dopo esposizione ad alte concentrazioni e di valutare la sua efficacia (da solo o nella crema) nel:
? migliorare l'autodifesa della pelle mediante induzione di peptidi antimicrobici.
? stimolare l'immunorisposta innata dei cheratinociti, il rinnovamento epidermico e la differenziazione.
4a.1 Stato dell?arte
Nel presente studio ? stato usato un "modello di pelle a tutto spessore" sviluppato da VitroScreen. VitroScreen ha sviluppato in particolare per testare i prodotti cosmetici un modello di omeostasi su "Modello di pelle a tutto spessore" (pelle T) che riproduce i compartimenti dermico ed epidermico: questo modello ha la specificit? di permettere lo studio di modifica di matrice extracellulare dermica e di differenziazione di strato vitale con un approccio multiparametrico.
4a.2 Lo studio
L'efficacia del ceppo probiotico inattivato LPC-S01 da solo o incluso in una formulazione di crema (Yaluage) in termini di benefici per l'omeostasi della pelle ? stata valutata sul modello pelle T.
Lo studio ? stato condotto usando un'alta concentrazione di batterio inattivato (109 cellule/tessuto) al fine di esplorare la sua potenziale applicazione ed efficacia per la cura della pelle.
In particolare, i prodotti:
- LPC-S01 inattivato risospeso in soluzione salina (10<9 >cellule/tessuto) (codice univoco = P1),
- la crema Yaluage (codice univoco = P2),
- LPC-S01 inattivato risospeso in crema Yaluage (10<9 >cellule/tessuto), corrispondente al 30% della formulazione finale (codice univoco = P3),
sono stati applicati direttamente sulla superficie del modello 3D per 24 h e 48 h.
I seguenti parametri sono stati analizzati rispetto al controllo non trattato:
? Rilascio di IL-1? nel terreno;
? Espressione genica di biomarcatori chiave di difesa della pelle (DEFB4), risposta immunitaria innata (TLR2, TNF ?), differenziazione e rinnovamento epidermico (TGMS-1, CCND1, TGF-?1);
?Analisi istologica mediante H&E
Si prega di trovare di seguito il significato biologico dei marcatori di cui sopra.
Tabella 13
I risultati sono descritti di seguito.
Lo studio ? stato condotto usando una concentrazione molto alta di batterio inattivato (10<9 >cellule/tessuto). In particolare, i prodotti testati:
? LPC-S01 inattivato risospeso in soluzione salina (10<9 >cellule/tessuto) (etichettato come = P1),
? la crema Yaluage (etichettata come = P2),
? LPC-S01 inattivato risospeso in crema Yaluage (10<9 >cellule/tessuto), corrispondente al 30% della formulazione finale (etichettato come = P3),
sono stati applicati direttamente sulla superficie del modello di pelle T per 24 h e 48 h.
La crema Yaluage ? una crema antinvecchiamento per il viso, a base di acido ialuronico, collagene, vitamina E, cellule staminali di Gardenia jasmoides (gardenia), filtri chimici liberi e legati e burro di karit?, che presenta le seguenti propriet?: Antinvecchiamento, previene le rughe e le linee sottili, protezione UVA e UVB, leviga lo strato epidermico, idratante, emolliente, antiossidante.
I parametri specifici e il loro significato biologico sono descritti nella tabella seguente:
Tabella 13b
I principali risultati ottenuti sono riportati di seguito:
Tabella 14
I risultati sulla defensina umana ? sono riportati nella figura 11. Mentre l'effetto della combinazione sul processo di differenziazione della pelle ? riportato nella figura 12.
4a.3 Sintesi dei risultati
In questo modello omeostatico, gli effetti che sono stati osservati con la combinazione di LPC-S01 inattivato e crema Yaluage possono essere riassunti come segue:
? Sovraregolazione delle defensine beta-2 umane in tutti i tempi considerati (24 e 48 ore), che suggerisce un aumento dell'efficacia della combinazione summenzionata nell'aumentare le difese dell'ospite.
? Attivazione metabolica che induce un processo accelerato di differenziazione con uno schema dinamico da 24 h a 48 h, con tessuto altamente differenziato e cambiamenti allo strato corneo (figura di seguito).
Pertanto, la combinazione ? stata ben tollerata nel modello di pelle 3D ed era in grado di stimolare le difese del corpo e i processi di differenziazione cellulare.
4b. Modello Inflammasoma
Lo scopo dello studio ? stato quello di indagare l'efficacia del batterio inattivato LPC-S01 a due diverse dosi (da solo o nella crema) nel modulare l'attivazione di NF-kB e la traslocazione al nucleo, quando applicato prima o dopo l'induzione dello stress inflammasoma.
Nel presente studio ? stato usato un "modello di pelle a tutto spessore" sviluppato da VitroScreen. VitroScreen ha sviluppato specificamente per testare i prodotti cosmetici un modello di inflammasoma su "modello di pelle a tutto spessore" (pelle T) che riproduce i compartimenti dermico ed epidermico: questo modello permette lo studio di modifica di matrice extracellulare dermica e di differenziazione epidermica con un approccio multiparametrico in una condizione di stress indotto da radiazioni UV.
4b.2 Lo studio
Il ceppo probiotico inattivato LPC-S01, da solo o incluso in una formulazione di crema (Yaluage), ? stato valutato usando due diverse concentrazioni di batterio inattivato (10<7 >o 10<9 >cellule/tessuto) al fine di esplorare la sua potenziale applicazione ed efficacia sul modello inflammasoma pelle T secondo 2 protocolli, pre-trattamento e post-trattamento, come riportato nelle figure 13-15.
In particolare, i prodotti sono stati testati sulla pelle T secondo 2 protocolli:
? LPC-S01 inattivato risospeso in soluzione salina (10<9 >cellule/tessuto) (etichettato come = P1);
? la crema Yaluage (etichettata come = P2);
? LPC-S01 inattivato risospeso in crema Yaluage a 2 concentrazioni (10<9 >e 10<7 >cellule/tessuto), corrispondenti rispettivamente al 30% e allo 0,03% della formulazione finale (etichettato come = P3-10<9 >e P3-10<7>);
? Protocollo di pre-trattamento: Pelle T abrasa attraverso uno stress meccanico sulla superficie epidermica e pre-trattata per 45 min e 4 h con gli elementi di prova, quindi sottoposta a irradiazione UVA e UVB (1 MED). Dopo una postincubazione di 4 h i tessuti sono stati raccolti per l'analisi (figura 14);
? Protocollo post-trattamento: Pelle T abrasa attraverso uno stress meccanico sulla superficie epidermica e sottoposta a irradiazione UVA e UVB (1 MED), poi trattata per 45 min e 4 h con gli elementi di prova e immediatamente raccolta per l'analisi (figura 15).
I risultati sono riportati di seguito.
Tabella 15
Tabella 16
Nelle Tabelle di cui sopra, i risultati corrispondenti all'efficacia di LPC-S01 inattivato nel ridurre il percorso di inflammasoma sono riportati in grassetto. Le migliori sinergie osservate tra LPC-S01 inattivato e la Yaluage sono sottolineate e in grassetto.
4b.3 Sintesi dei risultati
In questo modello sperimentale su pelle T basato su percorsi infiammatori indotti da UVA UVB il ceppo probiotico inattivato LPC-S01, da solo o nella crema, quando applicato prima o dopo l'induzione dello stress da inflammasoma, ha mostrato quanto segue:
? Pre-trattamento: la combinazione di LPC-S01 alla concentrazione di 10<9 >cellule/tessuto e la crema ha confermato l'efficacia preventiva antinfiammatoria come sinergia rispetto ai singoli componenti. Il pretrattamento a 2 diverse concentrazioni suggerisce un meccanismo positivo dose-risposta: la dose pi? alta di batterio ? pi? efficiente nel diminuire NF-kB e, quindi, l'infiammazione.
Questi risultati confermano le propriet? immunomodulatorie del ceppo probiotico sia a livello fisiologico che come trattamento preventivo contro lo stress infiammatorio indotto da UV. Allo stesso tempo, la sinergia garantisce la tolleranza locale della pelle e l'induzione di meccanismi di difesa dell'ospite.
?Post-trattamento: quando incluso nella formulazione in crema, LPC-S01 ha determinato un recupero pi? efficiente e rapido ai livelli basali di NF-kB, in particolare dopo il trattamento breve (quando la risposta infiammatoria ? al suo livello massimo) suggerendo che questa sinergia ? efficace nel ripristinare l'omeostasi dei tessuti.
Questi risultati confermano che la combinazione della crema e LPC-S01 inattivato ha efficacia sia in condizioni omeostatiche che sulla pelle con inflammasoma indotto da UV.
5. Probiotico maschera vs P. acnes
Lo scopo dello studio era di valutare la capacit? del ceppo probiotico Lactobacillus paracasei LPC-S01, da solo e/o in combinazione con l'acido ialuronico, di contrastare l'adesione del Cutibacterium acnes (precedentemente Propionibacterium acnes) a un modello di pelle in vitro a tutto spessore. Al fine di estendere la valutazione a tutte le possibili situazioni di infezione, nel quadro di questo progetto sono stati valutati un modello di competizione, un modello di esclusione e un modello di sostituzione, basati sull'adattamento del metodo descritto da Coman et al. nel 2015.
5.1 Lo studio
Un modello in vitro di infezione di inserti di pelle a tutto spessore con C. acnes ? stato usato per valutare il possibile impatto dell'acido ialuronico ad alto peso molecolare e/o del ceppo probiotico L. paracasei LPC-S01 sulla capacit? di infezione dell?agente patogeno.
L'effetto potenziale del ceppo probiotico e/o dell'acido ialuronico sull?agente patogeno ? stato valutato da 3 diversi modelli in vitro:
? pre-trattamento della pelle a tutto spessore con probiotico e/o acido ialuronico (modello di esclusione), ? trattamento simultaneo della pelle a tutto spessore con probiotico e/o acido ialuronico e agente patogeno (modello di competizione),
? post-trattamento della pelle a tutto spessore, principalmente infettata dall?agente patogeno, con probiotico e/o acido ialuronico (modello di sostituzione).
In particolare, le prove sono state eseguite considerando diverse condizioni di trattamento, elencate di seguito:
1) nessun trattamento, per valutare la capacit? adesiva effettiva e indisturbata di C. acnes DSM 1897 nei tre modelli di esclusione, competizione e sostituzione;
2) preventivo, concomitante o post-trattamento con L. paracasei LPC-S01 per 24 h;
3) preventivo, concomitante o post-trattamento con acido ialuronico allo 0,5% per 24 h;
4) preventivo, concomitante o post-trattamento con una miscela omogenea di acido ialuronico e LPC-S01 L. paracasei per 24 h;
5) preventivo, concomitante o post-trattamento con perossido di benzoile per 24 h (Benzac al 10%, controllo positivo).
Nella figura 16 sono riportati i risultati dello studio.
a) Saggio di esclusione
Sulla base dei risultati riportati in figura 16, ? possibile affermare che i trattamenti effettuati con Benzac al 10%, LPC-S01 e la combinazione di LPC-S01 in presenza dello 0,5% di acido ialuronico riducono la carica vitale di C. acnes di circa 1,0-1,4 Log10, corrispondente a circa il 20% di riduzione della vitalit? di agente patogeno. Tuttavia, il trattamento con il solo acido ialuronico allo 0,5% non sembra in grado di ridurre la vitalit? dell?agente patogeno in nessuna misura.
Va sottolineato che il ceppo L. paracasei LPC-S01 mostra affinit? per il modello di pelle a tutto spessore 3D. Il ceppo L. paracasei LPC-S01 ? infatti in grado di moltiplicarsi attivamente durante l'incubazione con il modello di pelle a tutto spessore 3D, aumentando la sua carica vitale di poco pi? di mezzo logaritmo negli inserti pre-trattati.
La riduzione dell?agente patogeno C. acnes DSM 1897 in seguito al pre-trattamento con il ceppo probiotico L. paracasei LPC-S01 pu? quindi essere attribuibile all'acidificazione del terreno di coltura dovuta alla proliferazione attiva del probiotico.
Il leggero deterioramento osservato negli inserti in questione alla fine del periodo di incubazione (un cambiamento giallo del terreno di coltura degli inserti) pu? altres? essere attribuito all'attivit? metabolica del probiotico (figura 17).
b) Saggio di competizione
Come riportato nella figura 18, ? stato confermato che i trattamenti effettuati con Benzac al 10%, LPC-S01 e la combinazione di LPC-S01 in presenza dello 0,5% di acido ialuronico riducono la carica vitale di C. acnes DSM 1897 di 1,0-1,3 Log10 CFU. Il trattamento con il solo acido ialuronico allo 0,5% non sembra in grado di ridurre la vitalit? dell?agente patogeno.
Va notato che il ceppo L. paracasei LPC-S01 ha mostrato un'affinit? molto bassa per il modello di pelle a tutto spessore 3D durante il tempo di incubazione. La conta del ceppo L. paracasei LPC-S01 ha mostrato un aumento molto leggero, da 8,0 Log10 CFU a 8,2 Log10 CFU dopo 24 h di incubazione con gli inserti. Di conseguenza, per il modello di competizione, la riduzione dell?agente patogeno C. acnes DSM 1897, in seguito alla presenza simultanea del ceppo probiotico L. paracasei LPC-S01, non ? chiaramente attribuibile alla proliferazione del probiotico, e quindi un diverso meccanismo di azione pu? essere postulato.
c) Saggio di sostituzione
Come mostrato nella figura 19, solo il trattamento effettuato con Benzac al 10% ? stato in grado di ridurre la crescita dell?agente patogeno di circa due logaritmi (circa il 23%).
Tutti gli altri trattamenti postinfezione di C. acnes DSM 1897 non sembrano ridurre la vitalit? dell?agente patogeno.
Va notato che il ceppo L. paracasei LPC-S01 non ? stato in grado di moltiplicarsi attivamente durante la prova di sostituzione di 24 h. La conta del ceppo L. paracasei LPC-S01 mostrava infatti una diminuzione in seguito alle 24 h di incubazione con gli inserti. Di conseguenza, per il modello di sostituzione, la leggera riduzione dell?agente patogeno C. acnes DSM 1897 in seguito alla presenza simultanea del ceppo probiotico L. paracasei LPC-S01 non ? chiaramente attribuibile alla proliferazione del probiotico.
5.2 Sintesi delle prove
Tutte le prove in vitro hanno dimostrato l'efficacia del controllo positivo di Benzac al 10% nel contenimento dell'infezione da C. acnes, con una riduzione % della vitalit? della popolazione patogena dal 15% al 23%. Come mostrato dalla prova di sostituzione, una volta che l'infezione da C. acnes DSM 1897 ? iniziata negli inserti, solo il dispositivo medico ha dimostrato di essere in grado di contenere efficacemente la sua replicazione.
Le prove di esclusione e di competizione hanno mostrato che i trattamenti effettuati con LPC-S01 e la combinazione di LPC-S01 0,5% di acido ialuronico riducono l'infezione di C. acnes DSM 1897 di circa il 18%-19%. L'efficacia del probiotico pu? essere ragionevolmente attribuita, nel modello di esclusione in vitro, alla capacit? del ceppo di proliferare nel terreno di coltura dell'inserto, causando una leggera acidificazione del terreno, mentre nel modello competitivo, con un tempo di incubazione pi? breve, questo effetto non ? stato osservato e di conseguenza la significativa inibizione dell?agente patogeno da parte del probiotico deve essere attribuita a un altro meccanismo.
I risultati del modello di sostituzione hanno mostrato un effetto positivo molto leggero del probiotico (il 3% di riduzione della vitalit? della popolazione dell'agente patogeno), anche se molto inferiore a quello osservato per i 2 modelli precedentemente considerati. I dati ottenuti suggeriscono che l'acido ialuronico allo 0,5% non produce alcun effetto antagonista nei confronti del ceppo probiotico LPC-S01 che, anche in combinazione con l'acido ialuronico, mantiene sostanzialmente invariata la sua capacit? di contrastare C. acnes DSM 1897.
PARTE SPERIMENTALE
Scopo dello studio
Lo scopo dello studio era di valutare l'efficacia del prodotto "Infinite Skin Microbiome Serum" dopo un trattamento di 14 e 28 giorni attraverso una valutazione clinica, una misurazione strumentale dell'idratazione della pelle e un questionario di autopercezione.
Prodotto e modalit? d'uso
Una forma di realizzazione della presente invenzione si chiama "Infinite Skin Microbiome Serum" e comprende: ACQUA PROPANEDIOLO, IALORONATO DI SODIO, FENOSSIETANOLO, FERMENTO DI LACTOBACILLUS, MALTODESTRINA, 1,2 ESANEDIOLO, GLICOLE CAPRILICO, ANISATO DI SODIO, IALURONICO IDROLIZZATO. Ai volontari ? stato chiesto di applicare il prodotto cosmetico come segue:
Attivazione del prodotto:
? Rimuovere la linguetta con uno strappo,
? Comprimere lo stantuffo con il palmo della mano (pi? facile se fatto su una superficie dura e piatta),
? Agitare la bottiglia per 5-10 secondi per disperdere completamente la polvere nel liquido.
Conservazione:
? Prodotto da conservare in frigorifero dopo la riattivazione e dopo ciascuna applicazione.
Modalit? d?uso:
? Il prodotto deve essere applicato la sera e lasciato agire la notte (come ultima fase della routine notturna),
? Agitare il flacone per 2-3 secondi prima di ciascuna applicazione,
? Prendere 2 pipette di siero, mettere il siero nel palmo della mano e applicarlo su viso e collo; lasciare asciugare (il prodotto si asciuga in pochi minuti), ? Lavare il viso al mattino.
Obbiettivi:
Valutare l'efficacia del trattamento dopo 14 e 28 settimane di uso in termini di:
? Cambiamenti nell'idratazione della pelle attraverso una valutazione strumentale realizzata con MoistureMeter SC (Delfin).
? Verificare le variazioni in termini di estensione dell'area del viso interessata dall'acne, le variazioni nel numero di brufoli presenti, le aree rosse (eritema) e la secchezza cutanea della pelle di ciascun volontario realizzato attraverso la valutazione clinica del dermatologo.
? Valutare l'efficacia percepita dai volontari, attraverso la loro valutazione del trattamento dopo 14 e 28 giorni di uso e la presenza o assenza di effetti collaterali.
? Documentare con una macchina fotografica digitale un'immagine della condizione della pelle prima e dopo il trattamento.
Target:
30 volontari; uomini e donne. Et?: tra i 18 e i 40 anni. Soggetti sani, senza malattie della pelle, non hanno allergie e/o intolleranze a cosmetici o farmaci. Caratteristiche: soggetti con pelle a tendenza acneica e con presenza di acne da lieve a moderata entit?.
Soggetti della prova:
I volontari che hanno partecipato allo studio sono stati selezionati nella zona di Modena da un gruppo di soggetti sani secondo i seguenti criteri di inclusione/non inclusione.
Criteri di inclusione:
Et? tra i 18 e i 40 anni. Soggetti con pelle a tendenza acneica e con presenza di acne da lieve a moderata entit?. Soggetti sani, senza malattie della pelle o allergie/intolleranze a cosmetici o farmaci. Soggetti che accettano di seguire le procedure di studio e di rispettare le fasi di controllo.
Criteri di esclusione:
Soggetti in trattamento topico o sistemico con qualsiasi farmaco che possa influenzare il risultato dello studio di efficacia. Soggetti affetti da malattie della pelle. Donne incinte o in allattamento. Soggetti con intolleranza a farmaci e/o cosmetici.
Limitazioni:
Per tutta la durata dello studio, ai volontari ? stato chiesto di non applicare sulla zona di pelle analizzata prodotti cosmetici diversi da quello in studio.
Abbandono:
C'? stato 1 caso di abbandono.
Prima dell'inizio della prova il ricercatore consegna ai volontari il prodotto testato e il modulo informativo. Ciascun soggetto all'inizio della prova, ha letto e controfirmato il consenso informato per partecipare allo studio. Al tempo 0 e dopo 14 giorni, 28 giorni di trattamento, sono state effettuate le seguenti valutazioni:
- Misurazioni strumentali con il MoistureMeter SC (Delfin) per valutare l'idratazione superficiale della pelle in una zona definita del viso.
- Valutazione clinica realizzata dal dermatologo relativa alla zona facciale interessata dall'acne, il numero di brufoli, l?arrossamento della pelle (eritema) e la secchezza della pelle.
- Documentazione con macchina fotografica digitale di un'immagine della condizione della pelle.
Dopo 14 giorni, 28 giorni di trattamento e dopo 30 giorni dalla fine dello studio, ai volontari ? stato chiesto di valutare il trattamento, in termini di efficacia percepita e di effetti collaterali, rispondendo a un questionario.
VALUTAZIONE DELL'IDRATAZIONE SUPERFICIALE
Le misurazioni strumentali sono state effettuate in una zona definita del viso trattato con il prodotto in prova. Per ciascun volontario, sono state effettuate 3 ripetizioni a ciascuna fase con la seguente sonda: MoistureMeter SC (Delfin). La sonda misura i livelli di idratazione della superficie della pelle a livello dello strato corneo.
VALUTAZIONE CLINICA: Le valutazioni cliniche sono state realizzate dal dermatologo secondo i punteggi clinici mostrati nelle tabelle seguenti.
Classificazione clinica dell'estensione dell'area facciale coinvolta:
Nessuna area coinvolta 0 *
<25% del viso 1
Tra il 25% e il 50% del viso 2
>50% del viso 3
Classificazione clinica dell'eritema:
Nessun segno di eritema 0 *
Eritema appena percettibile 0,5
Leggero eritema 1
Arrossamento moderato 2
Forte arrossamento uniforme 3
Arrossamento acceso 4
* A T0 il valore 0 ? considerato come un criterio di esclusione.
Classificazione clinica della secchezza della pelle:
Secchezza assente 0
Leggerissima secchezza 0,5
Leggera secchezza 1
Secchezza moderata 2
Grave secchezza 3
Grave secchezza con desquamazione visibile 4
1. Risultati strumentali:
Idratazione superficiale della pelle (MoistureMeter SC -Delfin).
I grafici riportati in figura 20 mostrano il delta dei dati di valutazione strumentale registrati per ciascun volontario tra T0 e 14 giorni e 28 giorni di trattamento con il prodotto cosmetico. La prova di Wilcoxon per dati appaiati ? stata effettuata sui dati ottenuti. Questa prova, per dati non parametrici, permette di stabilire se esiste un'efficacia statisticamente significativa del trattamento (P = 95%).
Il grafico in figura 20 mostra il valore di idratazione superficiale della pelle della zona trattata ottenuto sui 29 volontari.
Nella figura 20 sono mostrate, per ciascun volontario, le differenze tra il valore medio a T 14 giorni e T 28 giorni rispetto a T0. Dopo 14 e 28 giorni del trattamento ? stato osservato un miglioramento statisticamente significativo dell'idratazione superficiale della pelle.
2. Risultati clinici:
Valutazione clinica dell'estensione dell'area facciale coinvolta.
I grafici in figura 21 mostrano il delta dei dati di valutazione clinica registrati dal dermatologo per ciascun volontario tra T0 e 14 giorni e 28 giorni di trattamento con il prodotto cosmetico. La prova di Wilcoxon per dati appaiati ? stata effettuata sui dati ottenuti. Questa prova, per dati non parametrici, permette di stabilire se esiste un'efficacia statisticamente significativa del trattamento (P = 95%).
Il grafico in figura 21 (valutazione clinica dell'estensione dell'area facciale coinvolta) mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari.
3. Risultati clinici:
Eritema.
Il grafico in figura 22 mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari.
Clinicamente, dopo 14 giorni e 28 giorni di trattamento, viene registrata una diminuzione statisticamente significativa dell'eritema.
4. Risultati clinici:
Numero di papule e/o pustole.
Il grafico in figura 23 mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari.
Clinicamente, dopo 14 giorni e 28 giorni di trattamento, viene registrata una diminuzione statisticamente significativa del numero di papule e/o pustole.
5. Risultati clinici:
Secchezza della pelle.
Il grafico in figura 24 mostra i valori delta ottenuti sui 29 volontari.
Clinicamente, dopo 14 giorni e 28 giorni di trattamento, viene registrata una diminuzione statisticamente significativa della secchezza della pelle.
6. Risultati dell'autopercezione:
basato su 29 casi per campione dopo 14 giorni rispetto a 28 giorni di trattamento ? mostrato nella figura 25.
Le valutazioni dei volontari sono state sottoposte all'analisi di varianza (P = 95%) e alla prova della differenza meno significativa (LSD, Least Significant Difference P = 95%). Da un punto di vista grafico, i risultati della prova LSD sono contrassegnati nel grafico dall'applicazione di una o pi? lettere vicino ai valori medi: per ciascun elemento, due fasi possono essere considerate statisticamente distinguibili, con una probabilit? P?95%, se non sono contrassegnati dalla stessa lettera.
Conclusioni
(i) Conclusioni strumentali e cliniche
Sia dopo 14 che dopo 28 giorni di trattamento, sul gruppo di volontari coinvolti, le misurazioni strumentali effettuate con il MoistureMeter SC (Delfin) hanno mostrato un aumento statisticamente significativo dell'idratazione della pelle. La valutazione clinica effettuata dal dermatologo ha mostrato una riduzione statisticamente significativa dell'estensione dell'area facciale coinvolta dall'acne, una diminuzione statisticamente significativa dell?arrossamento della pelle, del numero di papule e/o pustole e della secchezza della pelle.
(ii) Conclusioni dell?autopercezione
Nel complesso, il trattamento ? stato apprezzato dai volontari sia dopo 14 che 28 giorni di trattamento. I volontari sono abbastanza d'accordo nel percepire un miglioramento della pelle per quanto riguarda l?arrossamento/l?infiammazione della zona con i brufoli. Il grado di accordo per le affermazioni "percepisco la condizione della mia pelle migliorata" e "vedo una riduzione dei brufoli e del loro aspetto" ? buono. Il trattamento ? stato anche ben tollerato da tutti i soggetti che hanno partecipato allo studio (nessuna reazione cutanea avversa ? stata monitorata durante l'intero periodo di prova di 28 giorni).
Claims (13)
1. Un ceppo di batteri per uso nel trattamento preventivo o curativo di infezioni e/o infiammazioni causate da batteri patogeni appartenenti alla specie Propionibacterium acnes; in cui detto ceppo ? selezionato dal gruppo consistente di o, in alternativa, comprendente:
- Lactobacillus paracasei LPC-S01 (DSM 26760)
- Lactobacillus casei DG<? >(CNCM I-1572), e loro relative miscele.
2. Una composizione comprendente il ceppo secondo la rivendicazione 1, e facoltativamente almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
3. Un metodo cosmetico per il trattamento dell'acne, comprendente somministrare un ceppo batterico selezionato dal gruppo comprendente o, in alternativa, consistente di:
- Lactobacillus paracasei LPC-S01 (DSM 26760)
- Lactobacillus casei DG<? >(CNCM I-1572), e loro relative miscele.
4. Il metodo cosmetico secondo la rivendicazione 3, in cui un ceppo batterico selezionato dal gruppo comprendente o, in alternativa, consistente di:
- Lactobacillus paracasei LPC-S01 (DSM 26760)
- Lactobacillus casei DG? (CNCM I-1572), e le loro relative miscele, viene somministrato alla persona che ne necessita una volta al giorno.
5. Un uso di un ceppo batterico secondo la rivendicazione 1, per la preparazione di una composizione cosmetica, o dermatologica per trattare o prevenire l'acne.
6. Un uso secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che la composizione ? destinata a inibire l'infiammazione attraverso un'azione specifica su P. acnes.
7. Una composizione comprendente:
- un ceppo batterico selezionato dal gruppo comprendente o, in alternativa, consistente di: Lactobacillus paracasei LPC-S01 (DSM 26760), Lactobacillus casei DG<? >(CNCM I-1572), e loro relative miscele;
- acido ialuronico o suoi relativi sali.
8. La composizione secondo la rivendicazione 7 per uso nel trattamento preventivo o curativo di infezioni e/o infiammazioni causate da batteri patogeni appartenenti alla specie Propionibacterium acnes.
9. Un uso della composizione secondo la rivendicazione 7 per migliorare l'idratazione della pelle.
10. Un metodo cosmetico per migliorare l'idratazione della pelle, comprendente:
- applicare la composizione secondo la rivendicazione 7 sulla pelle e mantenere l'applicazione per almeno 6 ore; - rimuovere la composizione applicata con acqua.
11. Il metodo secondo la rivendicazione 11, in cui l'applicazione ? effettuata per almeno 14 giorni, preferibilmente per un periodo compreso da 14 a 28 giorni.
12. Un kit comprendente:
- la composizione secondo la rivendicazione 7;
- un erogatore avente un compartimento separato per il ceppo batterico.
13. La composizione secondo la rivendicazione 7 per uso nel proteggere la pelle umana dalle radiazioni ultraviolette.
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