KR20240032914A - 국소 피부 관리를 위한 박테리아 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 파라카세이 종 (최근 J. Zheng et al., 2020에 의해 재분류됨)에 속하는 선택 박테리아 균주 및 이들의 혼합물, 이들의 조성물, 및 피부 질환 및 손상을 예방 및/또는 치료하는데 있어 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 락토바실러스 파라카세이 종 (최근 J. Zheng et al., 2020에 따라 재분류됨)에 속하는 선택 박테리아 균주 및 이들의 혼합물, 이들의 조성물, 및 피부 질환 및 손상을 예방 및/또는 치료하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
클렌저, 토너, 보습제, 항-노화 세럼 등과 같은 다수 유형의 국소 피부 관리 제품들이 이용 가능하다. 이들 조성물은 흔히 피부에 비교적 공격적인 화학 물질을 함유하고 있어, 장기간에 피부에 확연한 손상을 유발할 수 있다. 이들 제품은 단독으로 또는 다른 성분과 함께 피부에 유익하기보다는 피부에 유해할 수 있는 화학 성분들을 통상적으로 함유하고 있으며, 그래서 모든 타입의 피부에 적합한 것은 아니다. 아울러, 이러한 제형은 특정 피부 유형에 자극을 유발할 수 있다.
이에, 기존의 화학적 미용학적 조성물 및 치료제에 대한 대안으로서 피부 결함, 자극/발적, 건조증 및/또는 피부 염증을 저하할 수 있는 새로운 피부 관리 처리제를 발굴하고자 하는 강력한 요구가 존재한다.
본 출원인은, 집중적인 오랜 연구와 개발을 통해, 락토바실러스 파라카세이 종에 속하며 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01®으로 동정되고 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 2013년 1월 11일자로 기탁번호 DSM 26760로 기탁된 후 2017년 5월 15일자로 부다페스트 조약에 따른 기탁으로 전환된, 락토바실러스 속의 특정 박테리아 균주가 전술한 기술적인 문제를 해결할 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다.
본 출원인은, 집중적인 오랜 연구와 개발을 통해, 락토바실러스 카세이 DG®로 동정되고 1995년 5월 5일자로 기탁자 Sofar S.p.A.에 의해 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR (CNCM)에 기탁번호 CNCM I-1572로 기탁된, 락토바실러스 카세이 spp. 카세이 종에 속하는 락토바실러스 속의 특정 박테리아 균주가 전술한 기술적인 문제를 해결할 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다.
본 출원인은, 집중적인 오랜 연구와 개발을 통해, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (예, 락토바실러스 파라카세이 또는 락토바실러스 파라카세이)로 동정되고 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에 기탁번호 DSM 33788로 락토바실러스 파라카세이로서 기탁된 (이탈리아 LAC2BIOME S.r.l.,에 의해 2021년 1월 20일에 기탁됨; 이후 락티카세이바실러스 파라카세이 DSM로 개명됨) 다른 특정 박테리아 균주가 몇가지 피부 손상을 또한 해결할 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다.
상기한 박테리아 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 기탁되었으며; 본 출원에서 기술되고 청구되는 박테리아 균주의 기탁자 및 출원인은 특허 기간 동안 균주를 입수가능하게 하는데 동의를 표한다.
도 1: 각질 형성 세포를 여러가지 검사 프로바이오틱으로 접촉 사전-자극한 후 살아있는 생체 세포 (vital cell)의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 (P. acnes) (도면에서, (*) 통계적으로 유의한 데이터 (p<0.05)). LP125=LPC-S01; LC48=DG
도 2: 각질 형성 세포를 프로피오니박테리움 아크네스 및 여러가지 검사 프로바이오틱과 공-배양한 후 살아있는 생체 세포의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 (도면에서, (*) 통계적으로 유의한 데이터 (p<0.05)).
도 3: 진핵생물 세포를 병원체로 챌린지한 후, 각질 형성 세포를 여러가지 검사 프로바이오틱과 함께 인큐베이션한 이후의 살아있는 생체 세포의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 (도면에서, (*) 통계적으로 유의한 데이터 (p<0.05)).
도 4: 프로바이오틱 균주에 의한 IL1β, IL10 및 IL8 면역조절 효과.
도 5: COX-2 및 NF-κB에 대한 웨스턴 블롯팅.
도 6: 진피 두께 평균 측정값.
도 7: 인플라마솜 (Inflammasome) 모델 도표.
도 8: 4h 시점에 VS 42-18 NF-κB 전좌를 도시한 블록 도표. CN: 음성 대조군, CP: 양성 대조군, P1: LPC S01, P2: 히알루론산 마스크 + LPC S01, P3: 히알루론산 마스크.
도 9 및 10: 4시간 및 24시간 시점에 T-피부에 대한 염증-노화 모델.
도 11A 및 도 11B: 24h (좌측) 및 48h (우측) 후 유전자 발현 결과. NC 24h=1으로 계산한 RQ, NC 48h=1으로 계산한 RQ. RQ < 0.5 하향 조절, RQ > 2 상향 조절.
도 12: 피부 구조.
도 13-15: 실험 4b.2 프로토콜. 도 14: 전-처리 프로토콜. 도 15: 후-처리 프로토콜.
도 16A 및 도 16B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 프로바이오틱을 이용한 전-처리 모델 및 후속적인 병원체 감염에서 다양한 검사 조건에서의 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897 생존성 감소 %.
도 17: 패널 검사.
도 18A 및 도 18B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 경쟁 검사에서 다양한 검사 조건 하에 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 생존성 감소 %.
도 19A 및 도 19B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 도치 (displacement) 검사에서 다양한 검사 조건 하에 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 생존성 감소 %.
도 20은 지원자 29명에서 입수한 검사 부위에서의 피부 표면 보습 수치 (surface hydration value)를 도시한다.
도 21은 발병한 안면부 확산에 대한 임상 평가 및 지원자 29명에서 입수한 델타 값 (delta values)을 도시한다.
도 22는 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계적으로 유의한 홍반 감소를 도시한다.
도 23은 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계학적으로 유의한 구진 및/또는 농포 개수의 감소를 도시한다.
도 24는 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계학적으로 유의한 피부 건조의 감소를 도시한다.
도 25는 처리 14일 대 28일 후 샘플 당 사례 29건에 기반한 처리 결과를 도시한다.
도 26은 Ha 마스크 + 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 상피 세포 증식을 촉진함을 도시한다. 컴플리트 마스크 (complete mask)에 대한 여러가지 희석물을 이용하여 다양한 시점에 인큐베이션한 후 HaCaT 세포에서 창상 봉합에 대한 정량 결과.
도 27은 물에 1:20으로 희석한 부형제 마스크에 재현탁한 여러가지 박테리아 세포를 이용한 상피 형성 정량 결과를 도시한다.
도 28은 광 현미경에서 Giemsa 염색으로 관찰한 HaCaT 상피 세포에 대한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 균주의 부착을 도시한다.
도 29는 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 리포터 벡터로 형질감염된 HaCaT 세포 층에서 NF-κB 전사 조절자의 활성화 실험을 도시한 것이다.
도 30은 여러가지 프로바이오틱 제제의 스캐빈저 효과 (scavenging effect)를 비교하여 도시한 것이다.
도 31은 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 항산화제 효과에 의한 HaCaT 세포에서 세포내 ROS 조절을 도시한 것이다.
도 32는 여러가지 락토바실러스 현탁물들과 비교한, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 조제물의 항-병원성 효과를 도시한 것이다.
도 2: 각질 형성 세포를 프로피오니박테리움 아크네스 및 여러가지 검사 프로바이오틱과 공-배양한 후 살아있는 생체 세포의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 (도면에서, (*) 통계적으로 유의한 데이터 (p<0.05)).
도 3: 진핵생물 세포를 병원체로 챌린지한 후, 각질 형성 세포를 여러가지 검사 프로바이오틱과 함께 인큐베이션한 이후의 살아있는 생체 세포의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 (도면에서, (*) 통계적으로 유의한 데이터 (p<0.05)).
도 4: 프로바이오틱 균주에 의한 IL1β, IL10 및 IL8 면역조절 효과.
도 5: COX-2 및 NF-κB에 대한 웨스턴 블롯팅.
도 6: 진피 두께 평균 측정값.
도 7: 인플라마솜 (Inflammasome) 모델 도표.
도 8: 4h 시점에 VS 42-18 NF-κB 전좌를 도시한 블록 도표. CN: 음성 대조군, CP: 양성 대조군, P1: LPC S01, P2: 히알루론산 마스크 + LPC S01, P3: 히알루론산 마스크.
도 9 및 10: 4시간 및 24시간 시점에 T-피부에 대한 염증-노화 모델.
도 11A 및 도 11B: 24h (좌측) 및 48h (우측) 후 유전자 발현 결과. NC 24h=1으로 계산한 RQ, NC 48h=1으로 계산한 RQ. RQ < 0.5 하향 조절, RQ > 2 상향 조절.
도 12: 피부 구조.
도 13-15: 실험 4b.2 프로토콜. 도 14: 전-처리 프로토콜. 도 15: 후-처리 프로토콜.
도 16A 및 도 16B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 프로바이오틱을 이용한 전-처리 모델 및 후속적인 병원체 감염에서 다양한 검사 조건에서의 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897 생존성 감소 %.
도 17: 패널 검사.
도 18A 및 도 18B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 경쟁 검사에서 다양한 검사 조건 하에 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 생존성 감소 %.
도 19A 및 도 19B: Log10 CFU/인서트에서 발현된 코리네박테리움 아크네스 (종래에 프로피오니박테리움 아크네스) DSM 1897의 생존성 감소 (도 16의 좌측). 우측, 도치 (displacement) 검사에서 다양한 검사 조건 하에 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 생존성 감소 %.
도 20은 지원자 29명에서 입수한 검사 부위에서의 피부 표면 보습 수치 (surface hydration value)를 도시한다.
도 21은 발병한 안면부 확산에 대한 임상 평가 및 지원자 29명에서 입수한 델타 값 (delta values)을 도시한다.
도 22는 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계적으로 유의한 홍반 감소를 도시한다.
도 23은 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계학적으로 유의한 구진 및/또는 농포 개수의 감소를 도시한다.
도 24는 지원자 29명에서 입수한 델타 값 및 통계학적으로 유의한 피부 건조의 감소를 도시한다.
도 25는 처리 14일 대 28일 후 샘플 당 사례 29건에 기반한 처리 결과를 도시한다.
도 26은 Ha 마스크 + 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 상피 세포 증식을 촉진함을 도시한다. 컴플리트 마스크 (complete mask)에 대한 여러가지 희석물을 이용하여 다양한 시점에 인큐베이션한 후 HaCaT 세포에서 창상 봉합에 대한 정량 결과.
도 27은 물에 1:20으로 희석한 부형제 마스크에 재현탁한 여러가지 박테리아 세포를 이용한 상피 형성 정량 결과를 도시한다.
도 28은 광 현미경에서 Giemsa 염색으로 관찰한 HaCaT 상피 세포에 대한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 균주의 부착을 도시한다.
도 29는 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 리포터 벡터로 형질감염된 HaCaT 세포 층에서 NF-κB 전사 조절자의 활성화 실험을 도시한 것이다.
도 30은 여러가지 프로바이오틱 제제의 스캐빈저 효과 (scavenging effect)를 비교하여 도시한 것이다.
도 31은 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 항산화제 효과에 의한 HaCaT 세포에서 세포내 ROS 조절을 도시한 것이다.
도 32는 여러가지 락토바실러스 현탁물들과 비교한, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 조제물의 항-병원성 효과를 도시한 것이다.
특정 박테리아 균주 2종이 프로피오니박테리움 아크네스에 대해 특이적인 작용을 발휘함으로써 몇가지 피부 질환 및 손상에 매우 유효한 것으로 흥미롭게도 발견되었다.
제1 측면에서, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스 종에 속하는 병원성 박테리아에 의해 유발된 감염 및/또는 염증을 예방적 또는 근치적 치료 (curative treatment)하는데 이용하기 위한 박테리아 균주에 관한 것으로, 이러한 균주는 하기로 이루어지거나 또는 대안적으로 하기를 포함하는 군으로부터 선택되고:
- 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 (DSM 26760);
- 락토바실러스 카세이 DG® (CNCM I-1572), 및 이들의 혼합물.
예방적 또는 근치적 치료가 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 특이적인 작용을 통해 발휘되는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기한 균주 하나 이상과 선택적으로 적어도 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 특이적인 작용을 통해 염증을 저해하도록 고안된 것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 또는 대안적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주를 투여하는 것을 포함하고, 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 특이적인 작용을 통해 염증을 저해하도록 고안된 것을 특징으로 하는, 여드름을 치료하기 위한 미용학적 방법에 관한 것이다:
- 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 (DSM 26760);
- 락토바실러스 카세이 DG® (CNCM I-1572), 및 이들의 혼합물.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 또는 대안적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주를 필요한 개체에 1일당 1회로 투여하는, 전술한 미용학적 방법에 관한 것이다:
- 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 (DSM 26760);
- 락토바실러스 카세이 DG® (CNCM I-1572), 및 이들의 혼합물.
미용학적 또는 피부학적 조성물이 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 특이적인 작용을 통해 작용하는 것을 특징으로 하는, 여드름을 치료 또는 예방하기 위한 이러한 미용학적 또는 피부학적 조성물의 제조에서 적어도 상기에서 정의되는 박테리아 균주의 용도는, 본 발명의 다른 내용이다.
다른 측면에서, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 특이적인 작용을 통해 염증을 저해하도록 고안된 것을 특징으로 하는, 하기를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
- 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 (DSM 26760), 락토바실러스 카세이 DG® (CNCM I-1572) 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주;
- 히알루론산 또는 이의 염.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 피부 보습 (skin hydration)을 강화하기 위한 미용학적 방법으로서:
- 상기에서 정의되는 바와 같은 조성물을 피부에 적용하여 적어도 6시간 동안 적용을 유지하는 단계;
- 적용한 조성물을 물로 제거하는 단계,
상기한 적용이 적어도 14일간, 바람직하게는 14-28일로 구성되는 기간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 미용학적 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:
- 상기와 같이 정의되는 조성물; 및
- 박테리아 균주용 개별 구획을 구비한 디스펜서 (dispenser).
다른 측면에서, 본 발명은 인간 피부를 자외선 조사로부터 보호하고 피부 보습을 강화하는데 이용하기 위한, 하기를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
- 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 (DSM 26760), 락토바실러스 카세이 DG® (CNCM I-1572) 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주;
- 히알루론산 또는 이의 염.
다른 측면에서, 본 발명은 상피 형성 촉진 및 상처 치유에 이용하기 위한 하기를 포함하는 조성물에 관한 것이다:
- 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)
- 히알루론산 또는 이의 염.
다른 측면에서, 본 발명은 피부 노화를 예방하기 위한, 하기를 포함하는 피부학적 또는 미용학적 조성물의 용도에 관한 것이다:
- 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788); 및 선택적으로,
- 히알루론산 또는 이의 염.
다른 측면에서, 본 발명은 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptococcus aureus)에 의해 유발된 감염 및/또는 염증에 대한 예방적 또는 근치적 치료에 이용하기 위한 균주에 관한 것으로, 상기한 균주는 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 스트렙토코커스 아우레우스에 의해 유발된 감염 및/또는 염증에 대한 예방적 또는 근치적 치료에 이용하기 위한, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 및 선택적으로 적어도 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 박테리아 균주 및 조성물은 1일당 1회 이상, 바람직하게는 1일당 1회로 국소 사용하기 위한 것으로 의도된다.
바람직하게는, 본 발명의 균주는 동결건조된 형태이며, 통상적인 부형제의 존재 하에 국소 사용하기 위한 약학적, 피부학적 또는 미용학적 조성물로 투여된다. 이러한 조성물은 의약제 또는 미용학적 제품일 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 용량 단위 형태 또는 다중 투여 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 겔, 크림, 에멀젼, 연고, 폼, 분말, 수성 용액 또는 현탁물, 오일 용액 또는 현탁물 또는 또한 사용하기 전 교반하는 2상 용액 또는 현탁물 형태로, 제조할 수도 있다. 또한, 본 발명의 치료에 마스크도 적합하다.
본 조성물은 조성물 1 g 당 103 내지 1012, 예를 들어, 105 내지 1010 CFU (콜로니-형성 단위)를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 처치할 면적에 따라 적절한 양으로 투여할 수 있다. 처치는 바람직하게는 적어도 14일, 바람직하게는 요망하는 피부학적 또는 미용학적 결과가 달성될 때까지 연장된다.
본 발명의 조성물은, 통상적인 부형제 외에도, 질환 또는 미용학적 손상을 치료하는데 유익한, 추가의 활성 성분을 또한 함유할 수 있다. 대안으로서, 본 발명의 균주 또는 조성물의 투여는 또한 다른 편리한 처치와 함께 국소 또는 비경구로 이루어질 수 있다.
실험 부문
프로바이오틱 대 프로피오니박테리움 아크네스 (큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes), 종래에 프로피오니박테리움 아크네스)
다음에 대한 효능을 평가하기 위한, 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) 균주 2종, 즉 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 및 락토바실러스 카세이 (L. casei) DG:
ㆍ 프로피오니박테리움 아크네스의 증식 저해;
ㆍ 염증성 자극 (LPS)으로 챌린지한 후 각질 형성 세포에서 염증 반응의 조절.
이러한 실험을 수행하기 위해, 정상적인 인간 각질 형성 세포를 이용하였으며, 적절한 보충제를 첨가하여 배양 상태로 유지하였다.
배양한 인간 각질 형성 세포는 피부 자극을 완화하는 용도로 고안된 프로바이오틱의 효능을 평가하는데 필요한 예비 결정에서 적절한 물질인 것으로 밝혀진 바 있다. 각질 형성 세포는 실제 피부 외층 (표피)에 퍼져있는 외부 환경에 대한 1차 피부 방어선으로서, 사이토카인 및 케모토카인의 분비를 유도해 피부의 더 깊은 층으로 경고 메시지를 전달함으로써 염증 반응을 구현할 수 있다. 진행되면서 최심부 층에서 가장 바깥쪽 층으로 전파되고, 보호 작용을 담당하는 케라틴이 점진적으로 침착된다.
인간 일차 각질 형성 세포는 실험실에서 시험관내 배양할 수 있으며, 이로부터 유도된 면역 반응의 특성을 파악하기 위해 박테리아 균주를 이용한 배양 검사를 수행하게 될 것이다.
이용한 박테리아 균주를 아래에 열거한다:
ㆍ 락토바실러스 카세이 DG® (락토바실러스 파라카세이 CNCM I-1572)
ㆍ 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01® (DSM 26760)
ㆍ 락토바실러스 카세이 DG® + 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01, 1:1 혼합물
다음과 같은 검사를 수행하였다:
1.
세포주에 대한 병원체 부착 및 챌린지 검사;
2.
면역-조절 검사;
1.2.1 부착 및
챌린지
검사
이들 실험은 락토바실러스 파라카세이의 특정 균주가 단독으로 또는 1:1 혼합물로서 배양 중인 정상적인 인간 각질 형성 세포에 대한 프로피오니박테리움 아크네스의 부착을 간섭하는 능력을 검증하고자 하였다.
배제 검사에서 (진핵생물 세포를 프로바이오틱스로 전-처리하고 후속적으로 병원체와 인큐베이션함), 그 결과, 프로바이오틱 균주 2종은 프로피오니박테리움 아크네스의 부착을 비슷한 %로 방지하는 능력을 보인 것으로 확인되었다 (락토바실러스 카세이 DG®의 경우 42%, 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 경우 35%).
이들 결과는 도 1에 도시하며, 도 1은 각질 형성 세포를 여러가지 검사 프로바이오틱스로 사전 접촉 자극한 후 부착된 살아있는 생체 세포의 % 측면에서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착성을 나타낸다. 프로바이오틱을 이용한 자극 없이 프로피오니박테리움 아크네스를 부착시킨 후, 검사 균주의 저해 능력을 양성 대조군 대비 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 감소 %로 나타내었다.
경쟁 검사에서 (진핵생물 세포를 프로바이오틱스 및 병원체와 공동-인큐베이션함), 검사 결과, 락토바실러스 카세이 DG® 균주의 부착 감소 능력이 17%인 반면, 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주의 부착 감소 능력은 9%인 것으로 밝혀졌다. 이들 균주들의 혼합물은 프로피오니박테리움 아크네스 부착을 통계학적으로 유의하게 저해하였으며, 검사한 각 균주에서 관찰된 결과보다 명확하게 높은 42%에 달하였으며, 이는 상승적인 효과를 분명하게 보여준다. 그 결과는 도 2에 나타낸다.
도 2는 각질 형성 세포를 프로피오니박테리움 아크네스 및 다양한 검사 프로바이오틱스와 공동 인큐베이션한 이후에 부착된 살아있는 생체 세포의 %로서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착성을 도시한다. 앞서 언급한 바와 같이, 프로바이오틱으로 자극하지 않고 프로피오니박테리움 아크네스를 부착시켜, 검사 균주의 저해 능력을 양성 대조군 대비 프로피오니박테리움 아크네스의 부착 감소 %로 나타내었다.
도치 검사에서 (진핵생물 세포를 병원체로 전처리한 다음 프로바이오틱과 인큐베이션함), 그 결과, 프로바이오틱스 2종으로 된 혼합물이 프로피오니박테리움 아크네스의 부착을 42% 감소시킬 수 있는 것으로 입증된 바, 흥미로운 통계학적으로 유의한 상승적인 효과가 확인되었다. 개개 프로바이오틱스는 대신 락토바실러스 카세이 DG®의 경우 18%, 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 경우 11%에 해당하는 부착 감소 능력을 가진 것으로 확인되었다.
결과들은, 진핵생물 세포를 병원체로 챌린지한 후, 각질 형성 세포를 여러가지 검사 프로바이오틱스와 인큐베이션하였을 경우 부착된 살아있는 생체 세포의 %로서 프로피오니박테리움 아크네스의 부착성을 나타낸 도 3으로 기재하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 프로바이오틱으로 자극하지 않고 프로피오니박테리움 아크네스를 부착시켜, 검사 균주의 저해 능력을 양성 대조군 대비 프로피오니박테리움 아크네스에 의한 부착 감소 %로서 나타내었다.
1.2.2 면역-조절 검사
실험의 목적은 락토바실러스 파라카세이 특정 균주가 단독으로 또는 1:1 혼합물로서 배양 중인 정상적인 인간 각질 형성 세포에 대한 면역-조절 효과를 발휘하는 능력을 검증하는 것이었다.
검사는 마커 2종, 즉 COX-2 및 NF-κB의 활성화를 평가하고 사이토카인 (IL-8, IL-1β 및 IL-10)을 확인하는데 초점을 맞추었다.
COX-2 (사이클로옥시게나제-2)는 특이적인 염증 자극원에 대해 반응하여 소수의 세포 유형들에서 생산되는 유도 마커이다. 이는 피부 신생물 등의 수종의 신생물에서 과다 발현되는 것으로 보인다.
NF-κB (활성화된 B 세포의 핵 인자 k-경쇄-인핸서)는 염증 특성을 가진 것 등의 다양한 자극원에 대해 반응하여 모든 세포 유형들에서 생산되는 전사 인자 기능을 가진 단백질 복합체이다.
그 결과 다음과 같이 입증되었다:
ㆍ 프로바이오틱에 노출된 세포의 상층액에 대한 사이토카인 분석은 면역조절 효과를 부각하였으며, 개별 검사한 프로바이오틱 균주는 IL1β, IL10 및 IL8의 발현을 감소시켰으며, 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01을 구체적으로 참조한다. 그 결과는 도 4에 나타낸다.
ㆍ LPC-S01-유도된 활성화에 의한 면역조절 효과가 또한 COX-2 및 NF-κB에 대한 웨스턴 블롯팅 결과에서 검증되었다. 락토바실러스 카세이 DG® 균주가 또한 흥미롭지만 특정한 가능성은 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주와 관련 있으며, 각질 형성 세포에 대한 전반적인 항-염증 작용에는 덜 유효하였다. 그 결과는 도 5에 나타낸다.
1.3 결과 요약
혼합 균주의 상승적인 잠재성은, 혼합물을 각질 형성 세포와 접촉한 상태로 병원체의 존재 하에 함께 이용하거나 또는 이후에 이의 증식 오염을 위해 감염시키는 경우에, 병원체의 도치에서 현저하다.
면역조절 관점에서, 다수의 경우에 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주는 염증성 자극 (LPC-S01)으로 챌린지한 후 각질 형성 세포의 염증 반응을 조절하는데 락토바실러스 카세이 DG®보다 더 유효하였다.
2. 프로바이오틱 + 마스크 - 항상성 모델
본 실험의 목표는 본 발명에 따른 프로바이오틱 균주와 함께 또는 없이 히알루론산, 또는 콜라겐, 또는 호호바 오일에 기반한 일련의 샘플을 평가하는 것이다. 실험은 피부 관리에서 이의 잠재적인 용도 및 효능을 조사하기 위해, 진피 및 표피 (전층 피부 모델)를 포함한 시험관내 재구성된 완전한 3D 모델에서 수행하였다.
2.1 배경
시험관내 재구성한 인간 피부 모델은 형태 (다-층 상피), 생화학적 및 생리학적 특성 측면에서 생체내 인간 조직에 더 흡사하며, 오늘날 국소적으로 적용되는 제품의 시험관내 안전성 및 효능을 평가하기 위한 동물, 생체외 이식편 및 침지된 세포 단층 (submerged cell monolayer)에 대한 가장 기대되는 대안이다 (Gordon et al. 2015, Zuang V. 2016).
이 모델의 생물학적 관련성 및 예측성은 제품을 실제 임상 용량 및 노출 조건에서 국소적으로 평가할 수 있는, 여러가지 살아있는 세포 층으로 구성된 조직화된 조직의 존재로부터 비롯한다.
화장품과 같이 국소적으로 적용되는 제품으로 인간 피부를 처치하면, 동적 경로를 가지고 있으며 일련의 현상들을 담당하는 전사 수준에서 1차 세포 신호를 일으키는 게놈 반응이 이루어진다. 살아있는 3D 인간 조직은 직접적인 게놈 반응과 용해성 매개인자 및 특이적인 바이오마커 발현을 통한 세포 교류 및 혼선 결과를 모두 고려함으로써, 작용 기전을 조사하고 제품 효능을 평가하기 위한 적절한 검사 시스템이다.
진피 및 표피 구획을 재현하는 "전층 피부 모델" (T-피부)에서 항상성 모델을 검사하는 미용학적 제품을 위한 특수 모델을 개발하였다: 이 모델은 진피 세포외 매트릭스 변형 및 생존가능한 층 분화를 다중-매개변수 접근 방식으로 검사할 수 있는 특수성을 가진다.
2.2 실험
피부 관리에서 잠재적인 용도 및 효능을 조사하기 위해, 참조 제형 ("마스크") 자체에, 그리고 프로바이오틱 균주 LPC-S01의 존재 하에, 히알루론산, 콜라겐 또는 호호바 오일에 기반한 일련의 새로운 제품들을, 진피 및 표피를 포함하는 시험관내 재구축된 완전한 3D 모델 (전층 피부 모델)에서 평가하였다.
검사 제품은 다음과 같다:
| 명칭 | 표시 |
| 프로바이오틱 균주 LPC-S01 | P1 |
| 콜라겐 마스크 | P2 |
| 히알루론산 마스크 | P3 |
| 호호바 오일 마스크 | P4 |
| LPC-S01+콜라겐 마스크 | P5 |
| LPC-S01+히알루론산 마스크 | P6 |
| LPC-S01+호호바 오일 마스크 | P7 |
표 1
제품을 생리학적인 일일 노출 하에 8시간 동안 3D 모델 표면에 직접 적용한 다음 과도한 제품을 제거하기 위해 식염수로 부드럽게 세척하는 공정을 실시하였으며, 실제 마스크 노출을 모방하기 위해 16시간 동안 후속적인-인큐베이션을 수행하였다.
피부 용인성 및 효능을 하기 측면에서 규정하기 위해 다음과 같은 매개변수들을 진피 및 표피를 가진 시험관내 재구성된 완전한 3D 모델 (FT- 피부 모델)에서 검사하였다:
ㆍ 항-미생물 펩타이드의 유도에 의한 피부 자가-방어 강화;
ㆍ 각질 형성 세포의 선천적인 면역-반응, 표피 재생 및 분화 자극;
ㆍ 항-노화로서 작용하는, 표피 및 진피 구획의 긍정적인 재생 유도.
| 목표 | 바이오마커/매개변수 |
| 피부 용인성 | Toxilight 분석에 의한 세포독성 정량 |
| 항-미생물 펩타이드의 유도에 의한 피부 자가-방어 강화 | HBD2 및 CCL27 유전자 발현 |
| 각질 형성 세포의 선천적인 면역-반응, 표피 재생 및 분화 자극 | TLR-2, kRT14, 로리크린 (loricrin) 및 인보루크린 (involucrin) 유전자 발현 |
| 항-노화로서 작용하는, 표피 및 진피 구획의 긍정적인 재생 유도 | 유전자 발현에 의한 ㆍ HAS-2 (히알루로네이트 신테타제) 및 CD44 (히알루론산 수용체) ㆍ 콜라겐 III 및 IV (진피) 및 XIII (표피) ㆍ KGF 및 EGF (각질 형성 세포 성장인자) 표피 및 진피 두께 측정을 포함한 조직학적 분석에 의한 마손 삼색 (Trichrome Masson) |
표 2
수득한 주된 긍정적인 결과는, 주성분 3종 (호호바 오일, 히알루론산, 콜라겐)을 여러가지 마스크 제품에서 박테리아 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01와 함께 또는 단독으로 비교하여, 각 제품에 대해 하기 표에 열거한다.
| 제품 | 긍정적인 주요 결과 | |
| LPC-S01 (P1) | ㆍ HBD2 및 TLR-2의 상향 조절 → 면역조절 효과, 피부 방어 촉발 및 선천적인 반응의 부스팅 ㆍ 조직 형태 보존 → 양호한 생체적합성 |
|
| 콜라겐 | P2 | - |
| +LPC-S01(P5) | ㆍ HBD2 부스팅 → 선천적인 피부 방어 증가 | |
| 히알루론산 | P3 | ㆍ DEJ 구조가 현저하게 변형되지 않음 |
| +LPC-S01(P6) | ㆍ 피부 방어 증가를 의미하는 HBD2 부스팅 ㆍ 분화 강화 및 각질층 압축성 증가 ㆍ 콜라겐 네트워크 증가 |
|
| 호호바 오일 | P4 | - |
| +LPC-S01(P7) | ㆍ HBD2 부스팅 → 피부 방어 증가 ㆍ DEJ 및 콜라겐 네트워크의 일부 보존 |
|
표 3
최상의 결과는 히알루론산과 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 조합에서 수득되었다.
형태 분석에서, 대조군에 대한 정성 평가 점수를 평가하였다:
+
→ 유의한 변형 없음
+ +
→ 형태학적 기술 인자의 유의한 개선
-
→ 일부 형태 변형
- -
→ 형태 변형
| 제품 | 생물학적 증거 | 형태학적 증거 | |||
| LPC-S01 (P1) | ㆍ 콜라겐 III 및 HAS-2의 하향 조절 | + | + | - | |
| 콜라겐 | P2 | ㆍ 조사한 유전자는 조정되지 않음 | - | - | + |
| +LPC-S01 (P5) | ㆍ HAS-2 및 KGF의 하향 조절 ㆍ 콜라겐 III 발현 감소 |
+ | - | - | |
| 히알루론산 | P3 | ㆍ 조사한 유전자는 조정되지 않음 | - | ++ | + |
| +LPC-S01 (P6) | ㆍ 콜라겐 III, HAS-2 및 KGF 하향 조절 | ++ | ++ | + | |
| 호호바 오일 | P4 | ㆍ 처치 중 염증 반응을 활성화할 가능성이 있는 TLR-2 상향 조절 및 Ak 방출 증가 ㆍ 로리크린 하향 조절 및 기저층의 조직학적 변형 → 분화 공정의 변형 가능성 |
-- | -- | - |
| +LPC-S01 (P7) | ㆍ 콜라겐 III 하향 조절 | -- | + | - | |
표 4
2.3 결과 요약
전반적으로, 수득한 결과는, 프로바이오틱 LPC-S01이 단독 적용시 (TLR 2 및 HBD-2에 기반하여) 이의 선천적인 면역을 강화함으로써 피부에 긍정적인 효과를 발휘함을 보여준다.
프로바이오틱 균주 없이 히알루론산, 또는 콜라겐, 또는 호호바 오일에 기반한 제품들은 T-피부 모델에 긍정적인 효과를 발휘하지 못하였으며; 이와는 대조적으로, 박테리아 균주 LPC-S01을 또한 함유한 동일 제품은 피부의 자가-방어를 강화하여 피부를 강화하는데 긍정적인 효과를 나타내었다.
제품 히알루론산 마스크 + 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01이 가장 기대되는 조합으로서 하기 측면에서 긍정적인 효과를 나타내었다:
ㆍ 피부 분화 공정 및 피부 재생의 강화;
ㆍ 콜라겐 네트워크를 증가시킴으로써 진피 구획 구조에 대한 전반적인 부스팅 효과.
3a.
프로바이오틱
+ 마스크 -
인플라마솜
모델 - 살아있는 세포
목표
잠재적인 용도 및 염증 감소 효과를 조사하기 위해, 본 실험에서는 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01을 단독으로 또는 히알루론산 ("마스크")과 조합하여 인플라마솜 모델에 미치는 효과를 평가하였다. 본 실험은 UV 조사에 반응하여 인플라마솜의 활성화, 즉 염증에 대한 제품의 효과에 집중하였다.
| 목표 | 바이오마커/매개변수 |
| 인플라마솜의 활성화 방지 | ㆍ NF-κB 핵 전좌 평가 ㆍ 분비된 IL-1β 정량 |
| 표피 및 진피 수준에서 UV 손상의 감소 | ㆍ 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통한 진피 및 표피 형태 평가 |
표 5
3a.1
배경
시험관내 재구성된 인간 피부 모델은 형태 (다층화된 상피), 생화학적 및 생리학적 특성 측면에서 생체내 인간 조직과 비슷하고, 오늘날 국소 적용된 제품의 시험관내 안전성과 효능을 평가하는데 있어 동물, 생체외 이식편 및 침지된 세포 단일층에 대한 가장 기대되는 대안이다 (Gordon et al. 2015, Zuang V. 2016).
이들 모델의 생물학적 관련성 및 예측성은 실제 임상 용량 및 노출 조건에서 제품을 국소적으로 평가할 수 있는 여러가지 살아있는 세포 층을 가진 조직화된 조직의 존재로부터 비롯한다. 화장품과 같이 국소 적용되는 제품으로 인간 피부를 처치하면, 동적 경로를 가지고 있으며 일련의 현상들을 담당하는 전사 수준에서 1차 세포 신호를 발생시키는 게놈 반응이 이루어진다.
살아있는 3D 인간 조직은 직접적인 게놈 반응과 용해성 매개인자 및 특이적인 바이오마커 발현을 통한 세포 교류 및 혼선 결과를 모두 고려함으로써, 제품 효능을 평가하고 작용 기전을 조사하기에 적절한 검사 시스템이다.
본 실험에서, VitroScreen 사에서 화장품 제품 검사 목적으로 특수 개발한, 진피 및 표피 구획을 재생하는 "전층 피부 모델" (T-피부)을 이용하였다. 이 모델은 UV 조사에 의해 유발된 스트레스 조건에서 진피의 세포외 매트릭스 변형 및 표피 분화를 다중-매개변수 접근 방식을 이용하여 실험할 수 있다.
3a.2
실험
참조 제형 ("마스크") 자체에서 그리고 프로바이오틱 박테리아 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 존재 하에 히알루론산에 기반한 새로운 제품을, 염증 감소 효과 및 잠재적인 용도를 조사하기 위해 인플라마솜 모델에서 평가하였다. 검사 제품은 다음과 같다:
| 명칭 | 국제 코드 |
| 프로바이오틱 균주 LPC-S01 | P1 |
| LPC-S01 + 히알루론산 마스크 | P2 |
| 히알루론산 마스크 | P3 |
표 6
제품을 3D 모델 표면에 적용하여 밤새 인큐베이션한 다음 과량의 제품을 제거하기 위해 식염수로 부드럽게 세척하는 공정을 실시하였다. 조직을 약간 마모시킨 후 UV 1 MED에 노출시켜 일반적인 햇빛 노출을 모방하였다. 1 MED 조사 후 4시간 및 24시간 시점에 인플라마솜 경로의 활성화를 평가하였다.
다음과 같은 매개변수를 비-처리 대조군과 비교해 분석하였다:
· NF-κB의 면역염색
· 헤마톡실린 및 에오신 염색
· ELISA에 의한 분비된 IL-1β 정량
양성 대조군 (1 MED에 의해 유도된 인플라마솜)은 다음과 같은 특징을 보인다:
| 초기 시점: 4h | 후기 시점: 24h |
| ㆍ NF-κB 핵 전좌 증가 ㆍ 복수의 일광화상 세포 존재 |
ㆍ조직에서 NF-κB 감소, 더 이상의 핵 전좌 없음 |
표 7
형태 측면에서, 조사 처리한 모든 조직들에는 4시간 시점에 일광화상 세포가 존재하였으며, 표피 찰과상/마모 후 예상한 바와 같이 24시간에 현저한 표피 및 진피 손상이 존재하였다.
검사 항목들에 대해 수득한 주요 결과를 마스크 (히알루론산), 프로바이오틱 균주 LPC-S01 및 이들의 조합을 조사 처리한 양성 대조군과 비교하여, 하기 표에 열거한다.
| 제품 | 주요 결과 |
| LPC-S01 (P1) | ㆍ 핵 전좌 (4h) 감소 ㆍ 세포질 NF-κB (24h) 감소 |
| 히알루론산 | ㆍ NF-κB 핵 전좌 (4h) 감소 ㆍ 세포질 NF-κB (24h) 감소 |
| 히알루론산 +LPC-S01 | ㆍ 핵 전좌 (4h) 감소 ㆍ 세포질 NF-κB (24h) 감소 |
표 8
4시간 시점에 수득한 결과를 도 8에 도시한다.
현저한 염증 저하 효과가 모든 제품들에서 4시간 시점에 관찰되었다.
마스크는 아마도 UV 광으로부터 보호하는 막 형성 물질로서 작용하는 것으로 보인다. 그러나, P2 처리 샘플의 경우 조직 형태에는 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이 4시간과 24시간 간에 현저한 차이가 존재하였다.
제품 히알루론산+LPC-S01은 본 발명에 따른 박테리아 균주가 첨가되지 않은 히알루론산 마스크와 비교해, 진피 상피의 정션 온전성, 그리고 전반적으로 피부 구성 및 피부 탄력을 UV 손상으로부터 더 잘 보존한 바, 명백한 상승적인 효과가 있는 것으로 확인되었다.
3a.3
결과 요약
프로바이오틱 LPC-S01 단독 (P1) 및 프로바이오틱 LPC-S01과 HA의 조합 (P2)은, 손상된 피부 장벽의 존재 하에 생물학적으로 관련있는 UV 선량 (1 MED)이 NF-κB 핵 전좌 및 후속적으로 각질 형성 세포의 세포질내 축적에 미치는 효과를 줄이는데 유의한 활성을 나타내었다: 이는 처음에는 핵 전좌 (4시간에 관찰가능한 초기 효과)를 감소시키고, 2차로 NF-κB의 세포질내 함유율을 감소시켰으며 (24시간에 관찰가능), 이는 인플라마솜을 감소시키는 긍정적인 지연 효과를 의미한다.
프로바이오틱 LPC-S01 (P1)은 4시간 시점에 세포질내 NF-κB 함량 감소를 추가로 유도하였다.
본 실험에서 채택한 특수 노출 조건에서 (밤새 처리, 가볍게 잔류물 세척, 장벽 기능을 감소시키고 UV에 대한 더 높은 민감성을 유발하기 위한 찰과상/마모, UV 노출), P1 및 P2는 스트레스 유발 후 4시간 시점에 가시적인 항-염증 기전 통해 작용하였으며, 24시간 이후에도 여전히 유효한 것으로 입증되었다.
비슷한 항-염증 효과에도 불구하고, 진피-표피 정션 구조를 UV 손상으로부터 보호하는데 있어 P2에서 상승적인 효과가 가시적으로 관찰되었다. 아울러, 프로바이오틱의 더 효과적이고 길게 지속되는 (24h) 효과가 HA 마스크와 함께 조합하여 이용하였을 경우에 달성되었다 (P2).
3b.
프로바이오틱
+ 마스크 -
인플라마솜
모델 - 살아있는 세포 및 불활화된 세포
인플라마솜 스트레스 유도 전 적용할 경우 프로바이오틱 균주 LPC-S01의 효과를 평가하기 위해, UVA + UVB (선량 :1 MED)에 의해 유발된 염증 경로에 기반하여 T-피부 (전층 피부) 실험 모델을 이용하였다.
본 실험은 2가지 목표로 계획하여 수행하였다: 생존가능한 LPC-S01 자체 또는 참조 제형 ("마스크") 중에 도입하였을 경우 단기간 (45분) 전-처리한 후 효과를 장기간 전-처리한 경우 (이전 실험에서와 마찬가지로 16시간 밤새)와 비교해 4시간 후 최종 판독으로, 효능 평가.
ㆍ 불활화된 LPC-S01의 단기 (45분) 및 장기 (16시간 밤새) 전-처리한 이후의 효능 평가.
3b.1
배경
본 실험에서는 진피 및 표피 구획을 재생하는 VitroScreen "전층 피부 모델" (T-피부)을 이용하였다: 이 모델은 UV 조사에 의해 유발된 스트레스 조건에서 복수의 매개변수 접근 방식으로 진피 세포외 매트릭스 변형 및 표피 분화 실험을 실시할 수 있다.
3b.2
실험
실험은 락토바실러스 파라카세이 프로바이오틱 균주 LPC-S01을 그 자체로 또는 국소 제형 ("마스크")에 도입한 경우에 효과를 제형 위약 (제품 3종)과 비교해 평가하기 위해 수행하였다: 프로토콜은 UVA + UVB (선량: 1 MED)에 의해 유발된 염증 경로를 기반으로 하였다.
본 실험에서, 제품들은 밤새 전-처리 기간 동안 적용한 다음 제거하고, T-피부를 자극하였다: 자극 후 4시간 및 24시간 시점에 판독 항목을 정량하였다 (NF-κB 전좌 및 형태).
검사 샘플과 실험 조건 (제품은 3D 모델의 표면에 직접 적용)을 아래 표에 열거한다.
| 표 I: 검사 항목 | 국제 코드 | 처리/판독 (NF-κB) |
| 프로바이오틱 균주 LPC-S01 | P1 | 45분 + 4시간 |
| 히알루론산 마스크 + LPC-S01 | P2 | |
| 히알루론산 마스크 - 위약 | P3 | |
| 히알루론산 마스크 + 불활화된 LPC-S01 | P4 | |
| 불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01 | P5 | |
| 히알루론산 마스크 - 위약 | P3-ON | 밤새 + 4시간 |
| 히알루론산 마스크 + 불활화된 LPC-S01 | P4-ON | |
| 불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01 | P5-ON |
표 9
장기간 16h 전-처리 프로토콜:
생존가능한
프로바이오틱과
불활화된
프로바이오틱의
비교
하기 표에, NF-κB 핵 전좌에 대한 반-정량적인 분석을, 16시간 (장기) 전-처리에 대해, 장기 처리 효과를 평가하기 위해 이전에 수득한 본 발명의 데이터 (이전 실험 참조)와 비교하여, 나타낸다.
| 표 III NF-κB 전좌 (평균±표준편차) | VS 75-18 | VS 42-18 | |
| 음성 대조군 | CN | 11,0 ± 2,1 | 25,7 ± 8,3 |
| 양성 대조군 (인플라마솜) | CP |
18,8 ± 4,8 (+70,7%, p=0,01) | 47,2 ± 6,2(+83,7 p=0,01) |
| 처리 | 16h 밤새 | 16h 밤새 | |
| 프로바이오틱 LPC-S01 |
P1 |
-- |
22,4 ± 6,6 (-52,2% p=0,00) |
| 프로바이오틱 LPC-S01 + 마스크 | P2 |
-- |
29,6 ± 6,3 (-37,3% p=0,00) |
| 마스크 위약 |
P3 |
13,4 ± 1,3 (-28,4%, p=0,00) | 23,0 ± 4,4 (-51,3% p=0,00) |
| 불활화된 LPC-S01 + 마스크 | P4 |
16,0 ± 3,2 (-14,8%) | -- |
| 불활화된 LPC-S01 | P5 | 18,9 ± 3,2 (+0,6%) | -- |
표 10
ㆍ 불활화된 LPC-S01 시리즈 (불활화된 LPC-S01 자체 또는 제형에 포함)는 16시간 전-처리 후 측정하였을 경우 현저한 NF-κB 감소는 발생하지 않은 반면, 생존가능한 시리즈 LPC-S01 (LPC-S01 자체 또는 제형에 포함)(참조 VS 42-18)은 모든 검사 항목들에서 음성 대조군에 비해 핵내 NF-κB 수준을 회복하는데 효과적이었으며, NF-κB 전좌가 현저하게 감소하였다.
ㆍ 위약 마스크를 감안하여, 이전 실험에서 보고된 바와 같이, 본 실험에서 16시간 전-처리 후 효과가 검출되었다 (-28,4% p=0,00).
하기 표에 조직-형태 분석 결과를 열거한다:
| 표. V 인플라마솜 경로의 저하 및 피부 유익성 측면에서 결과 분석 | |||
| 판독 매개변수 | NF-κB | SBC | |
| 인플라마솜에서 예측 모델 | 세포 핵내 NF-κB 전좌 증가가 예상됨 | 일광 화상 세포의 증가가 예상됨 | |
| 처리 | 45분 | ||
| 프로바이오틱 LPC-S01 | P1 | +++ | + |
| 프로바이오틱 LPC-S01 + 마스크 | P2 | +++ +++ |
+++ |
| 마스크 위약 | P3 | - | + |
| 불활화된 LPC-S01 + 마스크 | P4 | + | - |
| 불활화된 LPC-S01 | P5 | - | + |
| 처리 | 16h (밤새) | ||
| 마스크 | P3 ON | - | + |
| 불활화된 LPC-S01 + 마스크 | P4 ON | - | - |
| 불활화된 LPC-S01 | P5 ON | - | - |
표 11
처리제의 인플라마솜 (즉, NF-κB 양성 핵 및 SBC) 저하 효능 평가.
범례: (+) 약간 효과 있음; (+++) 현저한 효과; (-) 효과 없음.
3b.3
결과 요약
인플라마솜 모델 (UV 1 MED 노출, 최소 홍반 선량)의 생물학적 관련성 및 재현성이 음성 대조군과 비교해 조사 처리한 샘플에서 세포 핵내 NF-κB 전좌 증가에 의해 검증되었다.
ㆍ 상대적인 NF-κB 전좌 증가 (차이%)는 이전 실험에서 정량한 결과 (+83,7, p=0,01- VS 42-18)와 비슷하였다 (+70,7%, p=0,01- VS 75-18).
ㆍ 생존가능한 프로바이오틱 LPC-S01을 함유한 제품은 단기 전-처리 (45분)가 장기 전-처리 (16시간)와 비교해 NF-κB 전좌를 감소시키는데 효과가 더 낮았다.
ㆍ 불활화된 프로바이오틱 LPC-S01 자체 또는 제형 ("마스크")에 도입하였을 경우, 단기 전-처리 및 장기 전-처리시 UV 유도된 손상 (NF-κB 전좌)을 완화하는데 낮은 효능을 보였다.
ㆍ 히알루론산 마스크 단독 (위약 마스크)은 단기 (-27,2%, p=0,001) 및 장기 (-28,4% p=0,00) 전-처리시 물리적 차폐로서의 이의 작용이 검증되었다.
4. 불활화된
프로바이오틱
+
Yaluage
® 크림
실험은 3 단계로 나뉜다:
1. 진피 및 표피를 포함한 시험관내에서 재구성된 완전한 3D 모델 (전층 피부 모델)에서 피부 관리 효과 및 이의 잠재적인 용도를 조사하기 위해 피부 항상성에 대한 유익성 측면에서, 불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01 자체 또는 크림 제형 (Yaluage)에 함유된 경우의 효능 평가 (항상성 모델).
2. 이전에 조사한 용량을 45분 및 4시간 전-처리하여 인플라마솜 모델에 대한 이의 효능을 3가지 형태에서 검사한다: a) 단독, b) Yaluage의 제형에 포함 및 c) Yaluage 단독 (대조군). (인플라마솜 모델).
3. 이전에 조사한 용량을 조사 후 45분 및 4시간 경과시 적용 (후-처리)하여 인플라마솜 모델에 대한 이의 효능을 3가지 형태에서 검사한다: a) 단독 (프로바이오틱 박테리아 균주 LPC-S01), b) Yaluage 제형에 포함 및 c) Yaluage 단독 (인플라마솜 모델).
Yaluage 크림은 히알루론산, 콜라겐, 비타민 E, 가데니아 자스모데스 (Gardenia jasmoides)(가데니아) 줄기 세포, 프리 (free) 및 결합 화학 필터 (bond chemical filter) 및 시어버터를 포함하는 항-노화성 얼굴 크림이다.
4a. 항상성 모델
본 실험의 목표는 고 농도에 노출된 후 불활화된 박테리아 균주 (LPC-S01)의 피부 용인성 프로파일을 조사하고 (단독으로 또는 크림 형태로) 다음에 대해 그 효능을 평가하고자 하는 것이다:
ㆍ 항-미생물성 펩타이드의 유도에 의한 피부 자가방어 강화.
ㆍ 각질 형성 세포의 선천적인 면역-반응, 표피 재생 및 분화 자극.
4a.1
배경
본 실험에서는 VitroScreen에서 개발한 "전층 피부 모델"을 이용하였다. VitroScreen 사는 진피 및 표피 구획을 재현하는 "전층 피부 모델" (T-피부)에서 항상성 모델을 검사하는 미용학적 제품용으로 특별히 개발하였다: 이 모델은 진피 세포외 매트릭스 변형 및 생존가능한 층 분화를 다중-매개변수 접근 방식에 의해 연구할 수 있는 특수성을 가진다.
4a.2
실험
불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01 단독 또는 크림 제형 (Yaluage)에 함유된 형태에서 피부 항상성에 대한 유익성 측면에서 그 효능을 T-피부 모델에서 평가하였다.
실험은 잠재적인 용도 및 피부 관리 효능을 조사하기 위해 불활화된 박테리아를 고 농도 (109 세포/조직)로 이용해 수행하였다.
구체적으로, 제품:
- 식염수에 재현탁한 불활화된 LPC-S01(109 세포/조직)(단일 코드=P1),
- Yaluage 크림 (단일 코드=P2),
- 최종 제형의 30%에 해당하는, Yaluage 크림에 재현탁된 불활화된 LPC-S01 (109 세포/조직)(단일 코드=P3)을 3D 모델의 표면에 직접 24시간 및 48시간 동안 적용하였다.
다음과 같은 매개변수를 비-처리 대조군과 비교해 분석하였다:
ㆍ 배지내 IL-1α 방출;
ㆍ 피부 방어 (DEFB4), 선천적인 면역 반응 (TLR2, TNFα), 표피 분화 및 재생 (TGMS-1, CCND1, TGF-β1)에 대한 핵심 바이오마커의 유전자 발현;
ㆍ H&E에 의한 조직학적 분석.
상기 마커들의 생물학적 의미는 아래에서 확인할 수 있다.
| 기전 | 바이오마커/매개변수 |
| 피부 용인성 및 피부 항상성에 대한 효과 | 조직형태학적 분석 (H&E) 배지내 IL-1α 방출 (ELISA) |
| 각질 형성 세포 방어 및 선천적인 반응 및 박테리아 관련 염증 반응의 부스팅 | HBD2, TLR2, TNFα 유전자 발현 |
| 피부 재생 및 분화 부스팅 | TGM1, CCND1, TGF-β1 유전자 발현 |
표 12
결과를 아래에 기술한다.
실험은 불활화된 박테리아를 매우 고 농도 (109 세포/조직)로 이용해 수행하였다.
구체적으로, 검사 제품:
ㆍ 식염수에 재현탁한 불활화된 LPC-S01 (109 세포/조직)(P1으로 표시),
ㆍ Yaluage 크림 (P2로 표시),
ㆍ 최종 제형의 30%에 해당하는, Yaluage 크림에 재현탁한 불활화된 LPC-S01 (109 세포/조직)(P3으로 표시)을 T-피부 모델 표면에 24시간 및 48시간 동안 직접 적용하였다.
Yaluage 크림은 히알루론산, 콜라겐, 비타민 E, 가데니아 자스모데스 (Gardenia jasmoides)(가데니아) 줄기 세포, 프리 (free) 및 결합 화학 필터 (bond chemical filter) 및 시어버터를 포함하는 항-노화성 얼굴 크림으로서, 다음과 같은 특성을 제공한다: 항-노화, 주름 및 잔주름 방지, UVA & UVB 보호, 표피층 평탄화, 보습, 진정, 항산화.
구체적인 매개변수 및 이의 생물학적 의미를 하기 표에 기술한다:
| 기전 | 바이오마커 / 매개변수 |
| 피부 용인성 및 피부 항상성 효과 | 조직형태학적 분석 (H&E) 배지내 IL-1α 방출 (ELISA) |
| 각질 형성 세포의 방어 및 선천적인 반응 및 박테리아 관련 염증 반응의 부스팅 | HBD2, TLR2, TNFα 유전자 발현 |
| 피부 재생 및 분화 부스팅 | TGM1, CCND1, TGF-β1 유전자 발현 |
표 12b
수득한 주요 결과를 아래에 기술한다:
| 제품 | 결과 |
| 불활화된 LPC-S01 (P1) | ㆍ 숙주 방어를 촉발하는 효능을 의미하는, 2가지 시점에 인간 디펜신 β2의 현저한 상향 조절 ㆍ 조직에 고 용량으로 적용시 아마도 상호적인 박테리아-피부 상호작용으로 인한 염증 반응의 유도를 의미하는, 48시간 후 TNFα 유전자의 현저한 발현 ㆍ 24시간부터 48시간까지 동적 패턴을 보이는 가속화된 분화 공정을 유발하는 대사 활성화, 고도로 분화된 조직의 존재. 더 조밀하고 압축된 세포 매트릭스 유도 → 이 결과는 특이적인 염색으로 검증할 수 있다 |
| YALUAGE (P2) | ㆍ 장기 적용 기간 동안 숙주 방어를 부스팅하는데 있어 크림 자체의 효능을 의미하는, 48시간 후 인간 디펜신 β2의 조절. ㆍ 24시간 후 조직 형태 유지, 48시간 후 완전성의 부분적인 상실 및 DE 정션의 탈착. |
| YALUAGE + 불활화된 LPC-S01 (P3) | ㆍ 모든 시점에 인간 디센틴 β2 상향 조절, 이는 숙주 방어를 부스팅하는데 있어 혼합 제형의 효능 달성을 의미함 ㆍ 48시간 후 TNFα 상향 조절, 이는 24시간부터 48시간까지 동적 패턴을 보이는 가속화된 분화 공정을 의미하며, 고도로 분화된 조직 및 각질층으로의 변형 존재 . 더 조밀하고 압축된 세포외 매트릭스 유도 → 이 결과는 특이적인 염색으로 검증할 수 있다 ㆍ 가속화된 분화된 조직 및 각질층으로의 변형을 유도하는 대사 활성화 . 더 조밀하고 압축된 세포외 매트릭스 유도 → 이 결과는 특이적인 염색으로 검증할 수 있다 |
표 13
인간 디펜신 β에 대한 결과는 도 11에 기술한다. 피부 분화 공정에 대한 조합물의 효과는 도 12에 기술한다.
4a.3
결과 요약
이러한 항상성 모델에서, 그 효과는 불활화된 LPC-S01 및 Yaluage 크림 조합에서 관찰되었으며, 다음과 같이 요약할 수 있다:
ㆍ 검사한 모든 시점 (24시간 및 48시간)에 인간 beta-2 디펜신 상향 조절. 이는 전술한 조합에 의한 숙주의 방어를 강화하는 효능 증가를 시사한다.
ㆍ 24시간부터 48시간까지 동적 패턴을 보이는 가속화된 분화 공정을 유도하는 대사 활성화, 고도로 분화된 조직 및 각질층으로의 변형 존재 (하기 도 참조).
따라서, 조합물은 3D 피부 모델에서 충분히 용인되며, 신체의 방어 및 세포 분화 공정을 자극할 수 있다.
4b. 인플라마솜 모델
실험의 목표는, 인플라마솜 스트레스 유도 전 또는 유도 후 적용할 경우, NF-κB 활성화 및 핵으로의 전좌를 조절하는데 있어 불활화된 박테리아 LPC-S01 효능을 2가지 용량 (단독으로 또는 크림내)에서 조사하고자 하는 것이다.
본 실험에서 VitroScreen에 의해 개발한 "전층 피부 모델"을 이용하였다. VitroScreen 사는 진피 및 표피 구획을 재생하는 "전층 피부 모델" (T-피부)에서 인플라마솜 모델을 검사하는 화장품 제품을 위해 특별히 개발되었다: 이 모델은 UV 조사에 의해 유도된 스트레스 조건에서 진피 세포외 매트릭스 변형 및 표피 분화를 다중-매개변수 접근 방식으로 조사할 수 있다.
4b.2
실험
불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01은, 2가지 프로토콜, 즉 도 13-15에 나타낸 바와 같이, 전-처리 및 후-처리 프로토콜에 따라 T-피부 인플라마솜 모델에서 효능 및 잠재적인 용도를 조사하기 위해, 단독으로 또는 크림 제형 (Yaluage)에 함유된 형태로, 불활화된 박테리아를 서로 다른 2가지 농도 (107 또는 109 세포/조직)로 이용해 평가하였다.
구체적으로, 2가지 프로토콜에 따라 T-피부에서 제품을 검사하였다:
ㆍ 식염수에 재현탁한 불활화된 LPC-S01 (109 세포/조직)(P1으로 표시);
ㆍ Yaluage 크림 (P2로 표시);
ㆍ 최종 제형의 각각 30% 및 0.03%에 해당하는, 2가지 농도 (109 및 107 세포/조직)로 Yaluage 크림에 재현탁한 불활화된 LPC-S01 (표시: P3-109 및 P3-107);
ㆍ 전-처리 프로토콜: 표피 표면에 기계적 스트레스에 의해 T-피부 마모 및 45분 및 4시간 동안 검사 항목으로 전-처리, 이후 UVA 및 UVB (1 MED) 조사에 노출. 4시간 인큐베이션한 후, 분석하기 위해 조직 수집 (도 14);
ㆍ 후-처리 프로토콜: 표피 표면에 기계적 스트레스에 의해 T-피부 마모 및 UVA 및 UVB (1 MED) 조사에 노출, 이후 45분 및 4시간 동안 검사 항목으로 처리한 다음 즉시 분석하기 위해 수집 (도 15).
결과를 아래에 기술한다.
| A. 전-처리: 45분 및 4시간 전-처리 + UV 조사 후 4시간 인큐베이션 . | |||
| 음성 대조군 (NC) 양성 대조군 (인플라마솜) 109 불활화된 LPC-S01 (P1) Yaluage 크림 (P2) 109 불활화된 LPC-S01+ Yaluage 크림 (P3-109) 107 불활화된 LPC-S01+ Yaluage 크림 (P3-107) |
NF-κB 양성 핵 | ||
| 45min+4h | 4h+4h | ||
| 0 | 0 | ||
| 7 | 5 | ||
| 3 | 1 | ||
| 0 | 0 | ||
| 1 | 1 | ||
| 5 | 2 | ||
| 불활화된 LPC -S01 (P1) | ㆍ LPC-S01 단독은 NF-κB 활성화를 상쇄하였으며, 이는 피부를 UV 유발성 염증 스트레스로부터 보호하는 예방 효과가 있음을 의미한다. ㆍ HBD2의 유의한 상향 조절이 관찰된 항상성 모델에서 수득한 결과와 종합하면 (VS 43-19), 이 결과는 숙주 선천 반응을 강화하는 기저 기전으로서 LPC-S01의 현저한 보호 및 예방 효과를 의미한다. |
||
| YALUAGE (P2) | ㆍ Yaluage는 NF-κB 전좌를 완전히 저해한다: 이 기전은 UV 선에 대한 물리적 보호 "차폐"와 관련 있다. ㆍ 이러한 물리적 기전 (단기 처리 후 염증에 의해 유발되는 손상의 방지)은 장기간 항상성 조건으로 적용하였을 경우 (VS 43-19) Yaluage 결과에 의해 검증되었다: 이 조건에서, HBD2의 활성화가 확인되며, 또한 48시간 후 독성이 확인된다. |
||
| YALUAGE + 불활화된 LPC -S01 (P3-10 9 및 P3-10 7 ) | ㆍ LPC-S01 P3-10 9 및 Yaluage의 조합은 단일 구성성분들과 비교해 상승적인 항-염증 보호 효과를 나타내었다. ㆍ 2가지 농도로 전-처리한 경우, 용량-반응 양성 기전이 시사된다: 박테리아 최고 용량이 NF-κB를 낮추는데 더 효과적이다. ㆍ 이들 결과는 (VS 43-19에서 관찰된 바와 같이) 생리학적 수준 그리고 UV-유발된 염증 스트레스에 대한 예방 치료로서 프로바이오틱 균주의 면역조절 특성을 검증해준다. 동시에, 이러한 상승작용은 피부 국소 용인성과 추가적인 입증이 필요한 숙주 방어 기전의 유도를 보장한다. |
||
표 14
| B. 후-처리: UV 조사 후 45분 및 4시간. | |||
| 음성 대조군 (NC) 양성 대조군 (인플라마솜) 109 불활화된 LPC-S01 (P1) Yaluage 크림 (P2) 109 불활화된 LPC-S01+ Yaluage 크림 (P3-109) 107 불활화된 LPC-S01+ Yaluage 크림 (P3-107) |
NF-κB 양성 핵 | ||
| 45min | 4h | ||
| 0 | 0 | ||
| 9 | 4 | ||
| 13 | 1 | ||
| 1 | 0 | ||
| 3 | 1 | ||
| 0 | 9 | ||
| 불활화된 LPC -S01 (P1) | ㆍUV 스트레스 적용 후 LPC-S01 항-염증 효능은 조직을 항상성 수준으로 회복시키기 위해서는 장시간 (4h)을 필요로 한다; 이 기전은 흔히 항-염증 효능을 가진 프로바이오틱에서 관찰된다. ㆍVS 43-19에서 관찰된 바와 같이 장기 노출시, 대사 활성화는 48시간 후 관찰되었으며, 이는 최적 반응에 더 긴 노출이 필요함을 검증해준다. |
||
| YALUAGE (P2) | ㆍ전-처리 시리즈에서 관찰된 바와 같이, Yaluage 크림은 염증 발생 피부에서 NF-κB 전좌를 물리적 기전에 의해 상쇄할 수 있다. 이러한 결과는 Yaluage이 항상성 조건의 피부보다는 염증 발생한 조직에 적용하였을 경우 더 효과적임을 추가로 시사해준다. | ||
| YALUAGE + 불활화된 LPC-S01 (P3-10 9 및 P3-10 7 ) | ㆍYaluage 제형에 포함시켰을 경우, LPC-S01은 특히 단기간 처리 후 (염증 반응이 최고 수준인 경우) NF-κB 기저 수준으로 더 효율적이고 신속하게 회복되었으며, 이는 이러한 상승작용이 조직 항상성 회복에 유효함을 시사한다. 이들 결과는, Yaluage 및 불활화된 LPC-S01의 조합이 항상성 조건 및 UV-유발된 인플라마솜 피부 둘다에 대해 효과가 있음을 검증한다. | ||
표 15
상기 표에서, 인플라마솜 경로 저하에 대한 불활화된 LPC-S01의 효능에 해당하는 결과는 진한 글씨로 기술한다. 불활화된 LPC-S01 및 Yaluage 간에 관찰된 최상의 상승작용은 밀줄 및 진한 글씨 로 기술한다.
4b.3
결과 요약
UVA + UVB에 의해 유발된 염증 경로에 기반한 T-피부 실험 모델에서, 불활화된 프로바이오틱 균주 LPC-S01은 단독으로 또는 크림에 함유된 형태에서 인플라마솜 스트레스 유도 전 또는 유도 후 적용하였을 경우, 다음과 같이 입증되었다:
ㆍ전-처리: 109 세포/조직 농도의 LPC-S01 및 크림과의 조합은 단일 성분과 비교해 상승적인 항-염증 예방 효능을 나타내었다. 2가지 농도에서 전-처리는 용량-반응 양성 기전을 나타내었다: 최대 용량의 박테리아는 NF-κB를 감소시키는데, 즉 염증 저하에 더 효과적이었다.
이들 결과는 UV-유발된 염증 스트레스에 대한 예방 처리로서, 그리고 생리학적 수준에서 프로바이오틱 균주의 면역조절 특성을 검증해준다. 동시에, 상승작용은 숙주 방어 기전의 유도 및 국소 피부 용인성을 보장한다.
ㆍ후-처리: 크림 제형에 함유된 경우, LPC-S01은 특히 단기 처리 후 (염증 반응이 최고 수준일 경우) NF-κB을 기저 수준으로 더 효과적이고 신속하게 회복시키는 것으로 확인된 바, 이러한 상승작용은 조직 항상성 회복에 효과적임을 시사해준다.
이러한 결과는, 크림과 불활화된 LPC-S01의 조합이 항상성 조건 및 UV-유발성 인플라마솜 피부 둘다에서 유효함을, 검증해준다.
5.
프로바이오틱
+ 마스크 vs
프로피오니박테리움
아크네스
본 실험의 목표는 프로바이오틱 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주가 단독으로 및/또는 히알루론산과 조합하여 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes)(종래에 프로피오니박테리움 아크네스)가 전층 시험관내 피부 모델에 부착하는 것을 상쇄하는 능력을 평가하고자 하는 것이다. 평가를 모든 가능한 감염 상황으로 확대하기 위해, 경쟁 모델, 배제 모델 및 도치 모델을 Coman et al. in 2015에 기술된 방법이 적용된 프로젝트 토대 하에 평가하였다.
5.1 실험
전층 피부 인서트를 코리네박테리움 아크네스로 감염시킨 시험관내 모델을 이용해, 고 분자량 히알루론산 및/또는 프로바이오틱 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01이 병원체의 감염 능력에 미치는 잠재적인 영향을 조사하였다.
병원체에 대한 프로바이오틱 균주 및/또는 히알루론산의 잠재적인 효과를 3가지 시험관내 모델을 통해 평가하였다:
ㆍ 전층 피부를 프로바이오틱 및/또는 히알루론산으로 전-처리 (배제 모델),
ㆍ 전층 피부를 프로바이오틱 및/또는 히알루론산 및 병원체로 동시 처리 (경쟁 모델),
ㆍ 1차로 병원체로 감염된 전층 피부를 프로바이오틱 및/또는 히알루론산으로 후-처리 (도치 모델).
구체적으로, 아래 열거한 다양한 처리 조건들을 고려해 검사를 수행하였다:
1)
배제, 경쟁 및 도치 모델 3종에서 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 유효한 비-방해 부착 능력을 평가하기 위한, 비-처리;
2)
락토바실러스 파라카세이 LPC-S01를 24h 동안 예방적 처리, 병용 처리 또는 전-처리;
3)
0.5% 히알루론산으로 24h 동안 예방적 처리, 병용 처리 또는 후-처리;
4)
히알루론산 및 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01로 구성된 균질한 혼합물로 24h 동안 예방적 처리, 병용 처리 또는 후-처리;
5)
벤조일 퍼옥사이드로 24h 동안 예방적 처리, 병용 처리 또는 후-처리 (Benzac 10%, 양성 대조군).
도 16에 실험 결과를 기술한다.
a)
배제 분석
도 16에 기술된 결과를 토대로, Benzac 10%, LPC-S01 및 0.5% 히알루론산 + LPC-S01 조합을 이용해 수행한 처리가, 코리네박테리움 아크네스의 생존 부하 (vital charge)를 병원체 생존성의 20% 감소에 해당하는 약 1.0-1.4 Log10로 감소시키는 것으로 볼 수 있다. 그러나, 0.5% 히알루론산 단독 처리는 어떠한 측정에서도 병원체의 생존성을 감소시킬 수 있는 것으로 보이진 않는다.
락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주는 3D 피부 전층 모델에서 친화적인 것으로 부각되었다. 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주는 실제 3D 피부 전층 모델과 인큐베이션하는 동안 활발하게 증식할 수 있어, 이의 생존 부하를 전-처리된 인서트에서 로그의 절반 이상으로 높일 수 있다.
따라서, 프로바이오틱 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01로 전-처리한 후 병원체 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 감소는 활발한 프로바이오틱 증식으로 인한 배양 배지의 산성화에 기인한 것일 수 있다.
배양 기간 종료 시점에 대상 인서트에서 관찰된 약간의 변질 (인서트의 배양 배지의 노란색 변화) 역시 프로바이오틱의 대사 활성에 기인한 것일 수 있다 (도 17).
b)
경쟁 분석
도 18에 기술된 바와 같이, Benzac 10%, LPC-S01 및 0.5% 히알루론산 + LPC-S01 조합을 이용해 수행한 처리가 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 생존 부하를 1.0-1.3 Log10 CFU까지 감소시키는 것으로 검증되었다. 0.5% 히알루론산 단독 처리는 병원체의 생존성을 감소시키는 것으로 보이진 않는다.
락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주가 3D 피부 전층 모델에서 인큐베이션하는 동안 친화성이 매우 낮았음에 유념하여야 한다. 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주의 수치는 인서트와 23시간 인큐베이션한 후 8.0 Log10 CFU에서 8.2 Log10 CFU로 매우 약간 증가한 것으로 관찰되었다. 즉, 경쟁 모델에서, 프로바이오틱 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 동시 존재시 병원체 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 감소는 명백하게도 프로바이오틱의 증식으로 인한 것이 아니며, 따라서 다른 작용 기전을 추정할 수 있다.
c)
도치 분석
도 19에 나타낸 바와 같이, Benzac 10%을 이용해 수행한 처리만 병원체의 증식을 약 2 로그 (약 23%) 감소시킬 수 있었다.
그외 모든 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897 감염-후 처리는 병원체의 생존성을 감소시키지 못하는 것으로 보인다.
락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주는 24시간 도치 검사 중에 활발하게 증식하지 못하였음에 유념하여야 한다. 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01 균주의 수치는 실제 인서트와 함께 24시간 인큐베이션한 후 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 도치 모델에서 프로바이오틱 균주 락토바실러스 파라카세이 LPC-S01의 동시 존재에 따른 병원체 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 일부 감소는 명백하게도 프로바이오틱의 증식으로 인한 것이 아니었다.
5.2 검사 요약
모든 시험관내 검사에서 코리네박테리움 아크네스에 의한 감염 오염에 대한 10% Benzac 양성 대조군의 효능이 입증되었으며, 병원체 집단의 생존성이 15%에서 23%로 감소하였다. 도치 검사에서 입증된 바와 같이, 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897 감염이 인서트에서 일단 시작되면, 오직 의료 기구만 이의 복제를 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 입증되었다.
배제 검사 및 경쟁 검사에서는, LPC-S01 및 LPC-S01 + 0.5% 히알루론산 조합을 이용해 실시한 처리가 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897의 감염을 약 18%-19% 감소시키는 것으로, 입증되었다. 프로바이오틱 효능은 합리적으로는 시험관내 배제 모델에서 균주가 인서트의 배양 배지에서 증식하여 배지를 약간 산성화하는 능력에 기인한 것일 수 있는 반면, 경쟁 모델에서는 더 짧은 인큐베이션 시간으로 인해 이러한 효과는 관찰되지 않았으며, 따라서 프로바이오틱에 의한 현저한 병원체 저해는 다른 기전에 의해 기인한 것일 수 있다.
도치 모델의 결과는 프로바이오틱의 매우 약간의 긍정적인 효과를 보여주었지만 (병원체 집단의 생존성 3% 감소), 앞서 검사한 모델 2종에서 관찰된 것보다는 훨씬 낮았다.
수득한 데이터는, 0.5% 히알루론산이 프로바이오틱 균주 LPC-S01에 대해 어떠한 길항성 효과를 발휘하지 않으며, 심지어 히알루론산과 조합할 경우 코리네박테리움 아크네스 DSM 1897에 대항하는 능력을 실질적으로 변화없이 유지함을, 시사해준다.
실험 부분
실험 목표
본 실험의 목표는 제품 "인피니트 피부 마이크로바이옴 세럼"을 14일 및 28일간 처리한 후 임상 평가, 피부 보습에 대한 장치 측정 및 자가-인지 설문지를 통해 효능을 평가하고자 하는 것이다.
제품 및 사용법
본 발명의 일 구현예는 "인피니트 피부 마이크로바이옴 세럼"으로서, 이는 아쿠아 프로판다이올, 소듐 히알루로네이트, 페녹시에탄올, 락토바실러스 발효물, 말토덱스트린, 1,2-헥사다이올, 카프릴릴 글리콜, 소듐 아니세이트, 하이드롤라이즈드 히알루로닉을 포함한다. 화장품 제품을 다음과 같이 적용하도록 지원자들에게 요청하였다:
제품 활성화:
* 트임이 있는 탭을 제거하고,
* 손바닥으로 플런저를 누르고 (딱딱하고 평평한 표면에서 수행하면 더 용이함),
* 바틀을 5-10초간 흔들어 분말을 액체에 완전히 분산시킨다.
보관:
* 제품을 활성화한 후 각각의 적용 후 냉장고에 넣어 보관한다.
사용법:
* 제품은 (매일밤 루틴의 마지막 단계로서) 저녁에 적용하여 밤에 작용하도록 두어야 한다.
* 바틀을 매번 적용하기 전 2-3초간 흔든다.
* 세럼을 파이펫으로 2번 취해 손바닥에 놓은 다음 이를 얼굴과 목에 도포하고; 건조되게 둔다 (제품은 수분내에 건조될 것이다).
* 아침에 세수한다.
목적:
14주 및 28주간 사용한 후 처리 효과를 다음과 같은 측면에서 평가한다:
* MoistureMeter SC (Delfin)를 사용해 수행하는 장치 평가를 통한 피부 보습 변화.
* 피부과 전문의에 의한 임상 평가를 통해 수행되는 각 지원자의 피부의 여드름 발생한 안면적 확대, 존재하는 여드름 개수 변화, 적색 영역 (홍반) 및 피부 건조 측면에서의 변화 확인.
* 14주 및 28주 사용한 후 처리에 대한 자체 평가 및 부작용의 존재 또는 부재를 통한, 지원자가 인지한 효능 평가.
* 처리 전 및 처리 후 피부 상태를 디지털 카메라로 기록.
표적:
지원자 30명; 여성 및 남성. 연령: 18세에서 40세. 피부 질환이 없는 건강한 개체, 화장품 또는 약물에 대한 알레르기 및/또는 불내증이 없음. 특징: 여드름이 발생하기 쉬운 피부를 가지고 있으며 여드름이 약간 내지 중등도로 존재하는, 개체.
검사 대상:
실험에 참여하는 지원자는 모데나 지역에서 다음과 같은 포함/비-포함 기준에 따라 건강한 개체 패널로부터 선정하였다.
포함 기준:
18세에서 40세. 여드름이 발생하기 쉬운 피부를 가지고 있으며 여드름이 약간 내지 중등도로 존재하는 개체. 피부 질환 또는 화장품 또는 약물에 대한 알레르기/불내증이 없는 건강한 개체. 실험 절차를 이행하고 관리 단계를 준수하는데 동의한 개체.
제외 기준:
효능 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있는 임의 약물로 국소 또는 전신 처리 중인 개체. 피부 질환을 앓고 있는 개체. 임산부 또는 수유 중인 여성. 약물 및/또는 화장품에 불내증을 가진 개체.
제한:
실험 전 기간 동안 지원자는 분석하는 피부 영역에 실험 중인 제품 이외의 다른 화장품 제품은 적용하지 않도록 요청한다.
탈락:
탈락 사례 1건이 있었다.
평가자는, 검사 개시하기 전, 지원자에게 검사 제품과 정보 양식을 전달한다. 각 개체는 검사 개시 시점에 서면 동의서를 읽고 실험에 참여하는데 부서 (countersign)한다. 0, 14일 처리, 28일 처리 후, 다음과 같이 평가를 수행한다:
- 지정된 얼굴 영역에서 피부 표면 보습을 평가하기 위해, MoistureMeter SC (Delfin)를 이용한 장치 측정.
- 여드름이 집중된 얼굴 영역, 여드름 개수, 피부 발적 (홍반) 및 피부 건조에 대해 피부과 의사에 의해 수행되는 임상 평가.
- 피부 상태를 디지털 카메라로 기록.
14일 처리 후, 28일 처리 후, 그리고 실험 종료한 후 30일 경과 시점에, 지원자에게 설문지에 답변하여 인지된 효과 및 부작용 측면에서 처리에 대한 평가를 요청하였다.
표면 보습 평가
검사 제품으로 처리된 지정된 얼굴 영역에서 장치 측정을 수행하였다. 각 지원자에 대해 하기 탐침을 사용해 각 단계별 3번 반복 실시한다:
MoistureMeter SC (Delfin). 탐침으로 각질층 수준에서 피부 표면의 보습 정도를 측정한다.
임상 평가: 임상 평가는 피부과 의사가 아래 표에 나타낸 임상 점수에 따라 수행한다.
발병한 얼굴 영역의 확대에 대한 임상적인 분류:
발병 영역 없음 0 *
얼굴의 <25% 1
얼굴의 25% 내지 50% 2
얼굴의 > 50% 3
임상적인 홍반 분류:
홍반 없음 0 *
홍반이 거의 인지되지 않음 0,5
약간의 홍반 1
중간 수준의 발적 2
강하고 균일한 발적 3
맹렬한 발적 4
* T0 시점에, 값 0은 제외 기준으로 간주한다.
피부 건조에 대한 임상 분류:
건조하지 않음 0
매우 약간 건조함 0,5
약간 건조함 1
다소 건조함 2
극심하게 건조함 3
가시적인 박리를 수반한 극심한 건조증 4
1. 장치 결과:
피부 표면 보습 (MoistureMeter SC - Delfin).
도 20에 나타낸 그래프는 T0 시점 및 화장품 제품을 14일 및 28일간 처리한 이후에 각 지원자에서 기록한 장치 평가 데이터의 델타 값을 도시한다. 수득한 데이터에 대해 쌍별 데이터에 대한 윌콕슨 검사를 수행하였다. 이 검사로, 비-모수 데이터에 대해, 처리에 대해 통계학적으로 유의한 (P = 95%) 효능이 존재하는지를 확립할 수 있다.
도 20의 그래프는 지원자 29명에서 수득한 처리 영역의 피부 표면 보습 수준을 나타낸다.
도 20에는 각 지원자에서의 T0 대비 T 14일 및 T 28일차의 평균 값 차이를 도시한다. 14일 및 28일간 처리한 후, 피부 표면 보습에 통계학적으로 유의한 개선이 관찰되었다.
2. 임상 결과:
발병한 얼굴 영역의 확대에 대한 임상 평가.
도 21의 그래프는 각 지원자에 대해 피부과 의사가 기록한, T0 시점 및 화장품 제품으로 T 14일 및 T 28일 처리한 경우에 대한 임상 평가 데이터의 델타 값을 도시한다. 쌍별 데이터에 대한 윌콕슨 검사를 수득한 데이터에 대해 수행하였다. 이 검사로, 비-모수 데이터에 대해, 처리에 대해 통계학적으로 유의한 (P = 95%) 효능이 존재하는지를 확립할 수 있다.
도 21의 그래프 (발병한 얼굴 영역의 확대에 대안 임상 평가)는 지원자 29명에서 수득한 델타 값을 도시한다.
3. 임상 결과:
홍반.
도 22의 그래프는 지원자 29명에서 수득한 델타 값을 도시한다.
임상적으로 14일 및 28일간 처리한 후, 홍반에 대해 통계학적으로 유의한 감소가 기록되었다.
4. 임상 결과:
구진 및/또는 농포의 개수.
도 23의 그래프는 지원자 29명에서 수득한 델타 값을 도시한다.
임상적으로 14일 및 28일간 처리한 후, 구진 및/또는 농포 개수에 대해 통계학적으로 유의한 감소가 기록되었다.
5. 임상 결과:
피부 건조.
도 24의 그래프는 지원자 29명에서 수득한 델타 값을 도시한다.
임상적으로 14일 및 28일간 처리한 후, 피부 건조에 대해 통계학적으로 유의한 감소가 기록되었다.
6. 자가-인지 결과:
각 샘플에 대해 사례 29건을 기반으로 14일 처리 대 28일 처리를 비교하여 도 25에 도시한다.
지원자 평가에 대해 분산 분석 (P=95%) 및 최소 유의차 검정 (LSD P=95%)을 수행하였다. 그래프 관점에서 LSD-검정 결과는 평균 값 근처에 한문자 이상을 사용해 그래프에 표시하였다: 각 항목에 대해 2 단계는, 동일한 문자로 표시되지 않은 경우, 확률 P≥95%로, 통계학적으로 구분가능한 것으로 간주할 수 있다.
결론
(i) 장치 및 임상 결론
14일 처리 후 및 28일 처리 후 둘다에서, 참여한 지원자 패널에 대해 MoistureMeter SC (Delfin)로 실시한 장치 측정에서 통계학적으로 유의한 피부 보습의 증가가 관찰되었다. 피부과 의사에 의해 이루어진 임상 평가에서는 여드름이 발생한 얼굴 영역의 확대에 대해 통계학적으로 유의한 감소, 피부 발적에 대해 통계학적으로 유의한 감소, 구진 및/또는 농포의 개수 및 피부 건조에 대해 통계학적으로 유의한 감소가 확인되었다.
(ii) 자가-인지 결론
전반적으로, 지원자들은 14일 처리 및 28일 처리 후 치유를 감지하였다. 지원자들은 여드름 부위에서 발적/염증이 개선되었다는 점에 상당히 동의하였다. "나는 나의 피부 상태가 개선된 것으로 인지한다" 및 "나는 여드름 및 이의 외양상 완화된 것으로 보인다"는 진술에 대한 동의 수준이 양호하였다. 처리는 또한 본 실험에 참여한 모든 개체들에서 충분히 용인되었다 (유해한 피부 반응은 전체 검사 기간 28일 동안 관찰되지 않았음).
상처 치유, NF-κB 발현 및 피부 노화에 대한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) + 히알루론산 (HA) 드라이 캡 마스크의 효과
실험 목표
본 프로젝트의 목표는 피부 관리 제품으로서 프로바이오틱 균주 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 존재 하에 히알루론산 마스크 (HA)의 효능을 조사하는 것이다. 구체적으로, 이들 성분 2종의 상승적인 효과를 다음과 같은 측면에서 평가하여 분석하고자 한다:
-
상처 치유
-
부착/군집화 특성
-
NF-κB 활성화
-
항산화 특성
-
항-병원성 특성
재료 및 방법
HaCaT
부착 분석
HaCaT 세포층에 Liveskin88의 부착을 (Guglielmetti, 2008)에 기술된 바와 같이 광을 교체하여 평가하였다. 간략하게는, HaCaT 세포를 10% (v/v) 열-불활화된 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 2 mM L-글루타민이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (MEM)에서, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 분위기 하에 37℃에서 배양하여 증식시켰다. 부착 실험에서는 세포 2 x 105개를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 컴플리트 마스크를 다양하게 희석해 (1:2 및 1:10), HaCaT 세포 단일층과 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 단층을 포스페이트-완충화된 염수 pH 7.3 (PBS)로 3번 헹궈 미-부착 박테리아를 제거하고, 메탄올 3 ml과 8분간 실온에서 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 그 후, 세포를 Giemsa 염색 용액 (1:20; Carlo Erba, Milano, Italy) 3 ml로 염색하고, 실온에서 암 조건 하에 30분간 두었다. 마지막으로, 단층을 PBS로 3번 헹구고 인큐베이터에 넣어 1시간 건조한 다음 오일 침지 하에 현미경으로 검경하였다 (배율, 400x).
시험관내
HaCaT
상처 치유
HA 마스크 자극에 대한 반응으로서 상처 치유를 HaCaT 세포 단일층에 대한 스크래치 분석으로 평가하였다. 간략하게는, HaCaT 세포 5 x 105개를 배양 인서트의 각 웰에 접종하고, 5% CO2의 가습 분위기 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배양 인서트를 멸균 집게를 사용해 조심스럽게 제거하고, 단일층에 스크래치를 만들었다. 상처 발생한 부분을 자극하기 직전에 (시간대 0) 사진 촬영하고, 이후 지정된 인큐베이션 시점에 사진 촬영하여, 상처 난 부위의 봉합을 모니터링하였다. 상처 봉합 %를 (초기 면적 - 최종 면적)/초기 면적 x 100으로 계산하였다.
NF
-
κB
활성화 분석
핵 인자 kB (NF-κB) 활성화를 벡터 pNiFty2-Seap (InvivoGen, Labogen, Rho, Italy)로 형질감염된 재조합 HaCaT 세포주를 이용해 조사하였다. 간략하게는, 50 ㎍/ml 제옥신의 존재 하에 배양한 재조합 Caco-2 단일층 (대략 5 x 105 세포/웰)을 0.1 M Tris-HCl 완충제 (pH 8.0)로 헹군 다음 100 mM HEPES (pH 7.4)가 함유된 신선한 DMEM에 현탁한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 5 x 107개와 함께, 즉, MOI 약 100으로 인큐베이션하였다. 각 제품 성분의 면역조절 특성을 조사하기 위해, HA 및 컴플리트 마스크 (HA + 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788))를 PBS에 1:20으로 희석한 다음 HaCaT 세포 단일층에 첨가하였다.
20 ng/ml TNF-α를 첨가해 자극을 수행하였다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 상층액내 SEAP를 Quanti-Blue 시약 (Invivogen)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 검출하고, 655 nm OD에서 정량하였다. 모든 측정은 마이크로플레이트 리더 (Multiskan SkyHigh, Thermo Fisher Scientific)를 사용해 수행하였다. 독립적인 2번의 실험을 각 조건에 대해 3세트로 수행하였다.
(2,2-
다이페닐
-1-
피크릴하이드라질
) 유리 라디칼 소거 활성 (Scavenging Activity)
락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 유리 라디칼 소거 활성을 일부 변형하여 DPPH 분석으로 조사하였다. 간략하게는, 1 x 109 세포/mL 농도의 프로바이오틱 현탁물을 96웰 플레이트에서 1 mM DPPH 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 인큐베이션하고, 광 차단하였다. DPPH가 항산화제 샘플로부터 수소 원자를 받게 되면, 보라색에서 연노란색으로 색이 바뀐다. 마이크로플레이트 리더를 사용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도 1 ㎍/mL의 아스코르브산을 양성 대조군으로 사용하였다.
HaCaT
세포에서
ROS
생산
세포내 ROS 농도를 다이클로로-다이하이드로-우로레세인 다이아세테이트 (DCFH-DA) 분석으로 평가하였다. HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 3.0 x 104 세포/웰로 접종해 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하였다. 세포를 과량의 PBS로 헹군 다음 무혈청성 배지 중의 10 μmol/L DCFH-DA로 37℃에서 45분간 전처리하였다. 그 후, 세포를 과량의 PBS로 헹군 다음 무혈청성 배지 중의 1500 μmol/L 농도로 H2O2 및 프로바이오틱 현탁물을 37℃에서 처리하였다. 마지막으로, 3시간 후 ROS 수준을 마이크로플레이트 리더를 사용해 여기 및 방출 파장 485 및 530 nm에서 측정하였다.
항미생물
분석
항미생물 활성을 아가-스팟 검사 방법에 의해 결정하였다. 간략하게는, 각 LAB 분리주를 MRS 아가에 스팟팅하여, 37℃에서 72시간 동안 혐기 조건 하에 인큐베이션하였다. 그 후, 스타필로코커스 아우레우스 균주의 밤새 배양물 1 ml이 접종된 소프트 MRS 아가 (0.9% 아가) 6 ml을 플레이트에 적층하였다. 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 활성을 다음과 같은 균주의 활성화 비교해 조사하였다: 락토바실러스 람노수스 (L. rhamnosus) GG, 락토바실러스 액시도필러스 (L. acidophilus) LA5 및 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei) SHIROTA. 클로르헥시딘을 대조군으로 사용하였다.
결과 및 고찰
락티카세이바실러스
파라카세이
m.biome
LIVESKIN88
(
DSM
33788) 마스크의 상처 치유 효과
외상 (절단, 찰과상/마모, 화학적 화상, 열 화상, 냉기, 열, 방사선, 수술 등) 또는 당뇨병과 같은 기저 질환의 결과와 같은 다양한 여러가지 이유로 피부 손상이 발생할 수 있다. 가장 효과적인 상처 관리 전략은 감염을 방지하고, 치유를 촉진하고, 과도한 흉터 발생을 방지하는 것이다.
통례적인 단층 배양법은 결과를 확인하기에 쉽고, 저렴하고 비교적 빠르다. 세포 단층, 예를 들어 인간 표피 각질 형성 세포는 일반적으로 멸균 손상 장치 (스크래치 분석)를 이용해 파괴하는데, 이는 상처 치유를 지배하는 기전을 파악하는데 일반적인 문제를 제기한다. 상처 치유 실험에서 가장 많이 사용되는 세포주 모델 한가지는 불멸화된 성체 피부로부터 유래한 자발적으로 돌연변이된 각질 형성 세포주인 HaCaT이다.
몇몇 증거는 HA가 증식 및 이동과 같은 여러가지 생물학적 과정에 참여하는 세포외 매트릭스의 핵심 성분임을 뒷받침한다. 피부의 재생 과정에서 화장품 제품의 HA와 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 간의 상승적인 효과 가설을 다루기 위해, HaCaT 세포를 이용하여 시험관내 증식에서의 그 효과를 검사하였다. 또한, 상처 치유를 모방하기 위한 모델 사용에 대해서도 일부 발표된 문헌들이 있지만, 프로바이오틱을 이와 이용한 경우에서 다룬 발표된 문헌은 아직 없다.
먼저, 컴플리트 마스크 (락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 냉동 건조 분말 (8 x 109 CFU/g)의 상처 치유 촉진 능력을 확인하였다. 이를 위해, 컴플리트 제품의 여러 희석물을 부형제의 독성 평가 및 기계적 스트레스 적용 하 조직 재생 촉진력을 평가하는데 모두 이용하였다 (도 26).
그 결과, 컴플리트 마스크 (HA+락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788))의 적용이 HaCaT 세포의 컨플루언트 단층에서 스크래치 상처 유발에 의한 상처 치유를 촉진하는 것으로, 나타났다. 1:10 희석이 더 빠른 단층 재생을 촉진하는 것으로 확인되었지만, 24시간 후 봉합 % 감소는 세포 증식/이동에 대해 유해하다는 것을 의미하였다. HaCaT 단층의 봉합 % 측면에서 최상의 결과는 1:20 희석에서 수득되었는데, 더 느렸지만 조직 재생 수준은 더 높았다. 아울러, 이 희석 수준은 얼굴에 안면 마스크의 실제 노출을 모방한 것으로, 즉 각 바틀의 제품을 7번 적용하는 것을 감안하였다.
재생 효과가 박테리아 세포 또는 HA 효과로 인한 것인지를 조사하기 위해, 1:20 HA 마스크 단독으로 그리고 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)을 여러가지 농도로 함께 이용해, 몇가지 실험을 수행하였다.
HA 마스크에서 프로바이오틱 첨가 (probiotic addiction) 효과를 조사하기 위해, 1:20으로 희석한 마스크에 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)을 여러가지 농도로 재현탁하여 이용함으로써 4시간 후 상처 치유 촉진을 모니터링하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 1:20 마스크에 재현탁하는 세포를 고 농도 (9 및 8 logCFU/mL)로 사용하였을 경우 조직 상처 봉합은 달성되지 않거나 또는 매우 낮았다. 아마도 이는 마스크 부형제에 용해된 냉동-건조한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 높은 함량으로 인한 검사 물질의 낮은 pH가 원인일 수 있다.
양호한 결과는 더 낮은 농도 (7 및 6 logCFU/mL)에서 수득되었다. 특히, 이들 데이터는 HA 마스크와 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 조합에 의해 발생한 상승적인 효과를 입증하였다. 특히, 7 logCFU/mL은 컴플리트 마스크를 1:20으로 희석한 박테리아 세포 농도에 해당한다. 마지막 2종의 희석 간에는 유의한 차이가 검출되지 않았다.
락티카세이바실러스
파라카세이
m.biome
LIVESKIN88
(
DSM
33788)의
HaCaT
세포 부착 능력
숙주의 부착 능력은 면역조절 효과를 촉진하고 피부 장벽 및 대사 기능을 자극하는데 도움이 되는 일시적인 집락화를 초래할 수 있는 잠재적인 프로바이오틱 박테리아에 대한 고전적인 선별 기준이다. 프로바이오틱 박테리아는 항미생물 화합물의 생산, 병원성 박테리아의 부착 감소 및 숙주 세포 결합 부위에 대한 경쟁 등의 여러가지 기전을 통해 병원체에 대해 잠재적인 보호 역할을 가진 것으로 잘 알려져 있다.
경쟁 배제, 영양분과 결합 부위에 대한 미생물 및 항미생물 물질의 생산, 즉 병원체 불활화 달성 간의 경쟁은 정상적인 건강한 피부 미생물총의 중요한 기능이다. 프로바이오틱은 유사한 효과를 가진 것으로 입증되어 있으며, 피부에의 부착이 일부 병원성 유기체의 결합을 방지할 수 있다.
락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 부착 특성에 HA의 "부스팅 효과"를 평가하기 위해, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 HaCaT 세포에 부착하는 특성을 HA 마스크의 존재 하에 그리고 부재 하에 평가하였다 (도 28).
그 결과, HA 마스크에 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)을 재현탁한 경우, 박테리아 세포의 부착 특성이 개선된 것으로 나타났다. 실제, HA의 존재 하에 재현탁한 박테리아 세포를 이용해 입수한 부착 지수는 PBS에 재현탁한 박테리아 세포를 이용해 수득한 값과 비교해 더 우수하였다. 아마도 이러한 개선은 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 세포의 부착 안정성을 개선하는 HaCaT 피부 모델 층을 구축하는 HA의 기계적 효과 때문일 것이다.
락티카세이바실러스
파라카세이
m.biome
LIVESKIN88
(
DSM
33788) 마스크는 염증 자극 하에 HaCaT 세포에서 NF-κB 활성화를 조절한다.
NF-κB는 숙주 면역 및 염증 반응에서 중대한 조절인자인 유도성 전사 인자의 일 군을 구성한다. NF-κB는 몇가지 전염증성 사이토카인의 전사를 활성화하므로, 이는 피부 염증 과정과 밀접하게 연관되어 있다. 피부 병태로는 표피 과형성증, 과각화증, 이상각화증, 과립층 소실, T-세포 침윤 및 미세 농양 형성 등이 있다. 이러한 특징은 T 세포가 중추적인 역할을 수행하는 것으로 잘 확립되어 있는 인간 염증성 피부 장애, 즉 건선의 홀마크인 것으로 간주된다.
HA 제품에 재현탁한 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 항-염증 특성을 HaCaT/NF-κB 리포터 시스템을 사용해 분석하였다. 실험은 재조합 HaCaT 세포층을 베이스라인 시점에, 그리고 TNF-α를 이용한 전-염증 자극의 존재 하에 4시간 동안 자극하여 수행하였다.
TNF-α 첨가는 NF-κB의 활성화 수준을 약 2배 증가시켰다 (도 29). 특히, 양쪽 경우에 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 또는 HA의 존재는 염증 상황과 비교해 NF-κB 활성화의 감소를 보장하였다 (각각 27% 및 13% 감소). 이들 2가지 성분을 모두 이용하였을 경우 통계학적으로 유의한 강한 효과가 달성되었으며, 이는 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)과 HA 간의 상가적인 또는 상승적인 작용을 시사한다.
산화 스트레스 하
HaCaT
세포에서
ROS
생산에 대한
락티카세이바실러스
파라
카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 효과
용어 반응성 산소 종 (ROS)은 주로 산소 분자와 일부 기타 화학적 반응성 분자들로부터 파생되는 유리 라디칼을 지칭하며, 이는 산소 분자의 점진적인 환원 반응 중에 발생한다. 프로바이오틱 균주는 하이드록시 라디칼과 슈퍼옥사이드 음이온을 소거하고 항산화제를 생산하는 것으로 보고된 바 있다. 가장 널리 연구된 균주는 현재 비피도박테리움과 락토바실러스이다.
DPPH 분석은 DPPH 라디칼을 소거하는 샘플의 능력을 토대로 한다. 이 실험에서 여러가지 프로바이오틱 현탁물 (락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788), 락토바실러스 파라카세이 DG 및 락토바실러스 파라카세이 SHIROTA)을 이용해 ROS 소거 활성을 양성 대조군으로서 아스코르브산과 비교해 평가하였다.
락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 및 락토바실러스 파라카세이 DG는 최상의 소거 효과를 발휘하였다. 이들 결과는, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 피부 산화 스트레스 상황을 낮추는데 기여할 수 있는 강력한 스캐빈저 효과를 가진다는 것을 시사한다 (도 30). 세포내 ROS 수준에서 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 효과를 검증하기 위해, 프로바이오틱으로 처리한 HaCaT 각질 형성 세포를 H2O2로 유발하였다 (도 31). 그 후, ROS 수준을 DCF-DA 용액을 이용해 분석하였다. 무처리 세포에서는 H2O2가 1500 μmol/L (Ctrl +) 농도에서 HaCaT 각질 형성 세포에서 세포내 ROS 수준을 현저하게 증가시켰다. 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)로 처리된 세포에서는 H2O2-유발성 ROS에 대해 저해 효과가 나타났다. 이러한 증거는, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 H2O2 노출로 인해 생성된 ROS를 소거함으로써 HaCaT 각질 형성 세포를 보호함을, 시사해준다.
스타필로코커스
아우레우스
감염에 대항하는
락티카세이바실러스
파라카세이
m.biome
LIVESKIN88
(
DSM
33788)의
효과
병원체에 대항하는 항미생물 활성은 피부에서 건강한 미생물 균형을 유지하는 잠재적인 프로바이오틱 균주를 선별하는데 고려되는 다른 중요한 특성이다.
본 분석에서, 몇가지 락토바실러스 균주들을 분석하였으며, 이들 모두 인간 피부에 병원성인 스타필로코커스 아우레우스 병원체 균주에 대해 높은 길항 활성을 나타내었다. 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)은 검사한 병원체 균주들에 대해 높은 길항 효과를 나타내었으며, 참조 균주 락토바실러스 카세이 Shirota와 비교해 더 높은 저해 능력을 가지고 있었다 (도 32).
결론
수득한 데이터는 HA 마스크와 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 상승적인 효과를 입증해준다: 마스크 + 프로바이오틱은, 프로바이오틱 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)이 HaCaT 상피 형성에 긍정적인 효과가 있으며, 동시에 HA가 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788) 부착 특성에 긍정적인 효과가 있는 것으로, 입증되었다.
NF-κB 발현 조절에 대해 동일한 상승적인 효과가 밝혀졌으며, 이는 프로바이오틱 제품의 우수한 면역조절 활성을 강조한다. 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)은 또한 피부 노화로 인해 보통 생성되는 ROS에 대해 강력한 소거 효과를 통해 항산화 특성을 나타내었다. 아울러, 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)은 스타필로코커스 아우레우스에 대해 강한 항미생물 효과를 나타내었으며, 따라서 감염 치료 및 예방에 유용한 물질이다.
Claims (7)
- 하기 성분을 포함하는 상처 치유에 이용하기 위한 조성물:
- 락티카세이바실러스 파라카세이 (Lacticaseibacillus paracasei) m.biome LIVESKIN88 - DSM 33788; 및
- 히알루론산 또는 이의 염. - 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptococcus aureus)에 의해 유발되는 피부 감염 및/또는 염증에 대한 예방적 또는 근치적 치료에 이용하기 위한 박테리아 균주로서,
상기 균주가 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 - DSM 33788인, 박테리아 균주. - 피부 노화를 방지하기 위한 하기 성분을 포함하는 피부학적 또는 미용학적 조성물의 용도:
- 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 - DSM 33788; 및 선택적으로
- 히알루론산 또는 이의 염. - 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 - DSM 33788 및 선택적으로 적어도 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 스트렙토코커스 아우레우스에 의해 유발되는 피부 감염 및/또는 염증에 대한 예방적 또는 근치적 치료에 이용하기 위한 조성물.
- 피부 노화를 방지하기 위한 하기 성분을 포함하는 피부학적 또는 미용학적 조성물의 용도:
- 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788); 및 선택적으로
- 히알루론산 또는 이의 염. - 피부 산화 스트레스 상황을 감소시키기 위한 라디칼 스캐빈저 (radical scavenger) 효과로서 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)의 미용학적 용도.
- 인간 피부의 재생 과정에 미용학적 제품으로서 히알루론산 및 락티카세이바실러스 파라카세이 m.biome LIVESKIN88 (DSM 33788)을 포함하는 미용학적 조성물의 용도.
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