CN116849365A - 一株巨大芽孢杆菌菌株si-jd-01在制备美白组合物中的应用及用其制备的美白组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株巨大芽孢杆菌菌株SI‑JD‑01在制备美白组合物中的应用及用其制备的美白组合物，属于微生物应用技术领域。该菌株的保藏编号为CCTCC M2023278。美白包括抑制酪氨酸酶活性；美白组合物，其包含作为有效成分的以下物质：巨大芽孢杆菌菌株SI‑JD‑01，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、溶胞物或发酵液的提取物有益效果：本发明所采用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、其溶胞物或其发酵液的提取物、或包含其的用于皮肤美白的组合物有效地抑制黑色素生成，从而具有预防、改善和/或治疗由黑色素生成过多引起的症状或疾病的效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌菌株SI-JD-01在制备美白组合物中的应用及用其制备的美白组合物。
背景技术
皮肤颜色受多种内在以及外在因素的影响，实际上取决于黑色素的数量及其在皮肤中的分散程度。皮肤美白效果主要是与黑色素生成抑制活性和自由基清除能力密切有关，还通过可以加快皮肤代谢及角质层脱落达到美白效果。其中最重要的途径就是抑制黑色素的生成。
传统的美白药物一般是通过抑制黑素细胞的成熟从而降低黑色素的生成，但是容易产生不良反应。所以这些年来化妆领域研究的美白产品，大多数是通过选择地抑制酪氨酸酶(TYR)的活性，以减少黑色素的沉着，同时能避免对正常成熟的黑素细胞产生毒性，降低使用的不良反应。但现有的美白产品往往价格高昂，有些还存在刺激性大、易变色、效果不佳等情况。
公布号为CN116004435A的中国专利申请文献，公开了一种巨大芽孢杆菌及其应用。该菌株命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，株号为Tu27，保藏号为CCTCCNO：M20221115。该菌株对峙培养对水稻病原真菌生长具有抑制效果；该菌株可合成具有抗菌、杀菌活性的纳米银。该菌株合成的纳米银的粒径为15±6nm，尺寸较小，而且对稻瘟病菌的生长具有明显的抑制作用。但该菌株并不具有美白活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何提出一种具有美白活性的巨大芽孢杆菌及其应用的组合物。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
本发明的第一方面提出一株巨大芽孢杆菌菌株SI-JD-01在制备美白组合物中的应用，所述巨大芽孢杆菌SI-JD-01的保藏编号为CCTCC M 2023278。
有益效果：本发明所采用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、其溶胞物或其发酵液的提取物、或包含其的用于皮肤美白的组合物有效地抑制黑色素生成，从而具有预防、改善和/或治疗由黑色素生成过多引起的症状或疾病的效果。
优选的，所述美白包括抑制酪氨酸酶活性。
本发明的第二方面提出一种美白组合物，其包含作为有效成分的以下物质：上述的巨大芽孢杆菌SI-JD-01，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、溶胞物或发酵液的提取物。
优选的，所述有效成分是指可单独表现出所需活性的成分或与自身无活性的载体等一起表现出所需活性的成分。
优选的，所述巨大芽孢杆菌菌株可通过如下方式制备成冻干粉来使用：对菌株进行培养，将发酵液进行离心分离后，用无菌生理盐水进行洗涤，然后分散在溶剂如无菌油中并进行冷冻干燥以制备冻干粉。
优选的，所述菌株的溶胞物是指通过用化学或物理性的力使菌株本身破碎而获得的产物。
优选的，所述菌株溶胞物的蛋白浓度为0.125-0.5mg/mL。
优选的，所述菌株的发酵液是指培养菌株的培养基中所含的部分或全部物质，而与发酵液的形态无关，包含如菌株培养产物的代谢物或分泌物的物质或其溶胞物，菌株本身也可包含于发酵液中。
本发明的第三方面提出一种上述美白组合物在制备具有美白作用的食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
优选的，所述化妆品为护肤品。
优选的，所述化妆品的剂型选自爽肤乳、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、滋润乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳、沐浴露中的一种或多种。
本发明的优点在于：
1、本发明所采用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、其溶胞物或其发酵液的提取物、或包含其的用于皮肤美白的组合物有效地抑制黑色素生成，从而具有预防、改善和/或治疗由黑色素生成过多引起的症状或疾病的效果。
2、本发明所采用的巨大芽孢杆菌菌株，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、其溶胞物或其发酵液的提取物、或包含其的组合物，可预防、改善和/或治疗选自因黑色素生成增加而在皮肤上局部发生的暗斑、雀斑、黑斑、母斑、黑素瘤、药物造成的色素沉着、炎症造成的色素沉着及皮肤炎造成的色素沉着中的一种或多种皮肤色素沉着。
附图说明
图1为本发明的巨大芽孢杆菌SI-JD-01溶胞物对自由基清除率的影响图；
图2为本发明的巨大芽孢杆菌SI-JD-01溶胞物对皮肤细胞安全性及增殖的影响图；
图3为本发明的巨大芽孢杆菌SI-JD-01溶胞物对UVA造成的细胞损伤的影响图；
图4为本发明的巨大芽孢杆菌SI-JD-01溶胞物对B16细胞黑色素生成的影响图；
图5为本发明的巨大芽孢杆菌SI-JD-01溶胞物对B16细胞酪氨酸酶抑制率的影响图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)菌株的分离与鉴定：
该菌株2022年05月16日发现于中国科学院合肥物质科学研究院综合实验楼南楼306实验室，从室内环境空气中采集，通过对环境空气来源菌株的系统性筛选，发现了一株能够抑制金黄色葡萄球菌生长的菌株，将该菌株在血琼脂平板上进行划线纯化；使用布鲁克公司的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)和MALDI Biotyper 3.1软件初步鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，评分为2.420；利用细菌通用引物(27F/1492R)进行16S rRNA基因扩增，PCR产物送测后获得的基因序列(GenBankAccession：OR064032)在NCBI中进行比对分析，并使用MEGA 11.0软件构建该菌株的系统发育树，明确该菌株的分类地位。
(2)菌株的菌落形态和菌体结构：
血琼脂平板上，该菌株的菌落为浅黄色、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明、圆形凸起，周围无α溶血环。光学显微镜下观察，该菌株的菌体呈圆形或卵圆形，成对或短链状排列，无荚膜，无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色为阳性。
该巨大芽孢杆菌菌株SI-JD-01已于2023年3月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏名称为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium SI-JD-01，保藏编号为CCTCC No：M 2023278。
实施例2：
制备巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株的发酵液及溶胞物
将所述实施例1中鉴定的巨大芽孢杆菌SI-JD-01菌株接种到培养基(10g/L的氯化钠、5g/L的酵母提取物、10g/L的蛋白胨)上，在37℃、200rpm的条件下进行3天的培养，以获得巨大芽孢杆菌菌株的发酵液。此外，将所获得的巨大芽孢杆菌菌株的发酵液超声破碎，800W超声破碎2次，每次15min，破碎液经0.22μm滤膜过滤除菌，即为巨大芽孢杆菌的溶胞物，通过溶胞物中蛋白浓度相对定量计算效应物质含量(见下表)。其中，下述批次是指在同样的实验条件下，在不同时期收集的巨大芽孢杆菌溶胞物样品。
表1巨大芽孢杆菌溶胞物的效应物含量
| 样品 | 溶胞物蛋白浓度(μg/mL) |
| 批次1 | 2546.9 |
| 批次2 | 2781.2 |
| 批次3 | 2560 |
| 批次4 | 2478.3 |
| 批次5 | 2615.9 |
| 批次6 | 2472.4 |
| 批次7 | 2555.6 |
| 批次8 | 2479.5 |
| 批次9 | 2269.8 |
| 批次10 | 2714.7 |
实施例3：
巨大芽孢杆菌溶胞物对自由基清除率的影响
1-二苯基-2-三硝基苯(DPPH)是一种稳定的氮中心有机自由基。DPPH法于1958年被提出，广泛用于测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。
取巨大芽孢杆菌溶胞物和对照菌株(大肠杆菌标准菌株OP50)溶胞物溶液，使用LB肉汤培养基分别配制蛋白浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL的溶胞物溶液，取0.1mL加入试管中，再加入0.1mLDPPH乙醇溶液，混匀，室温下避光在暗处反应30min，在525nm处测定OD值，按照下面公式计算清除率：清除率(％)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％，式中：T0：0.1mL样品液加0.1mL 95％乙醇的吸光度；T：0.1mL样品液加0.1mL DPPH溶液的吸光度；C0：0.1mL水加0.1mL 95％乙醇的吸光度；C：0.1mL水加0.1mL DPPH溶液的吸光度。
从图1结果可知，巨大芽孢杆菌溶胞物的清除自由基能力优异，同等浓度下自由基清除率优于大肠杆菌标准菌株(P<0.05)，差异具有统计学意义。
实施例4：
巨大芽孢杆菌溶胞物对皮肤细胞安全性及细胞增殖率的影响
角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。
按照如下方法测试巨大芽孢杆菌溶胞物对皮肤细胞安全性及增殖率的影响。其中，上述人永生化表皮细胞(HaCAT)是永生化的人角质形成细胞系，因其细胞形态、功能和正常人角质形成细胞类似；相比细胞系，人原代成纤维细胞(FB细胞)更能模拟人体皮肤功能。
具体地，将在所述实施例1中获得的从空气中分离出的巨大芽孢杆菌菌株的发酵液超声破碎后，用LB肉汤培养基配制成不同浓度溶液，以不含样品的LB肉汤培养基为空白对照。将浓度为5.0×105细胞/mL的皮肤细胞分别以100μL接种到96孔细胞培养板上，并进行24小时的培养后，加入100μL蛋白浓度分别为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL的巨大芽孢杆菌溶胞物进行处理，再进行24小时的培养。对于每种浓度，重复实验3次。利用MTT分析法来比较细胞的生物活性，细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，参比空白对照评估对HaCAT细胞或者FB细胞增殖的影响。空白对照组的生物活性视为100％。
其结果，一方面确认到所述从空气分离出的巨大芽孢杆菌菌株对皮肤细胞的生长没有影响，从而对皮肤细胞具有安全性。另一方面表明，巨大芽孢杆菌溶胞物对皮肤细胞表皮HaCAT细胞和成纤维细胞都有一定的增殖促进作用。
实施例5：
巨大芽孢杆菌溶胞物的抗紫外损伤的保护作用
皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(Ultraviolet,UV)照射是外源性老化形成的主要因素，所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是UVA(320-400nm)和少量的UVB(280-320nm)。许多资料表明照射到皮肤的的紫外线95％是由角质形成细胞吸收，因此我们用UVA照射人永生化表皮HaCAT细胞建立皮肤的光损伤模型，利用该模型评估巨大芽孢杆菌溶胞物对皮肤紫外损伤的保护作用。将浓度为5.0×105细胞/mL的人永生化表皮HaCaT细胞以100μL接种到96孔细胞培养板上，置于37℃的5％CO2细胞培养箱中培养24小时。实验处理前细胞换成不含血清的饥饿培养基培养6小时。将培养基换成PBS后，进行UVA(365nm)辐照，剂量为10J/cm2，照射15min，弃去PBS，再加入含有待测样品(蛋白浓度分别为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL的巨大芽孢杆菌溶胞物)100μL和细胞培养基100μL，继续培养24小时，用MTT法检测细胞活力。用没有UVA辐照组做为阴性对照组(UVA-)，单独UVA辐照组作为模型组(UVA+)。维生素C(Vc)和维生素E(Ve)作为阳性对照，其中Vc和Ve终浓度均为10μM。
由图3结果可知，巨大芽孢杆菌溶胞物(0.25mg/mL和0.5mg/mL)对UVA造成的细胞损伤有明显的保护作用，处理后细胞活力高于模型组(P<0.05)，差异具有统计学意义。
实施例6：
巨大芽孢杆菌溶胞物的皮肤美白效果：
将在所述实施例1中获得的从空气分离出的巨大芽孢杆菌菌株的溶胞物处理黑色素生成细胞(B16黑色素瘤细胞)上，以评估美白效果。将浓度为5.0×105细胞的B16细胞接种到24孔细胞培养板上，然后进行24小时的培养，以用于实验。为了诱导黑色素的生成，用1M的α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone，α-黑素细胞刺激素)进行处理，同时用0.125mg/mL至0.5mg/mL浓度的巨大芽孢杆菌菌株的溶胞物按不同浓度进行处理。对于每种浓度，重复实验3次。再进行72小时的培养后，测量405nm处的吸光度以比较培养基中黑色素的含量。基于将诱导黑色素生成的模型组的吸光度视为100％，用％来表示溶胞物处理组的诱导黑色素生成的程度。
采用L-Dopa氧化法测定样品对酪氨酸酶的抑制作用。小鼠黑色素瘤B16细胞以1.0×105密度培养在96孔板中，经24h后，分别将0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL浓度的巨大芽孢杆菌溶胞物加入到细胞中培养48h，而后弃去培养液，每孔加入含1％TritonX-100的PBS缓冲液100μL，然后加入50μL 0.2mg/mL的L-Dopa，37℃处理3h后再测定490nm的吸光值。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶抑制率＝[1-(实验组OD值/对照组OD值)]×100％
其结果，使用巨大芽孢杆菌溶胞物能够显著抑制B16细胞黑色素生成和酪氨酸酶活性(P<0.05)，差异具有统计学意义，并呈浓度依赖性，由此可知巨大芽孢杆菌菌株具有皮肤美白效果。
如上所述，已详细描述了本方面的特定部分，本领域技术人员应理解的是，这些具体的技术仅为优选实施例，本发明的范围不限于此。因此，本发明的保护范围将由所附权利要求书及其等同物限定。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一株巨大芽孢杆菌菌株SI-JD-01在制备美白组合物中的应用，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌SI-JD-01的保藏编号为CCTCC M 2023278。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述美白包括抑制酪氨酸酶活性。
3.一种美白组合物，其特征在于，其包含作为有效成分的以下物质：权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株SI-JD-01，其溶胞物，其发酵液，或所述菌株、溶胞物或发酵液的提取物。
4.根据权利要求3所述的美白组合物，其特征在于，所述有效成分是指单独表现出所需活性的成分或与自身无活性的载体一起表现出所需活性的成分。
5.根据权利要求3所述的美白组合物，其特征在于，所述菌株溶胞物是指通过用化学或物理性的力使菌株本身破碎而获得的产物。
6.根据权利要求4所述的美白组合物，其特征在于，所述菌株溶胞物的蛋白浓度为0.125-0.5mg/mL。
7.根据权利要求3所述的美白组合物，其特征在于，所述菌株的发酵液是指培养菌株的培养基中所含的部分或全部物质，而与发酵液的形态无关，包含如菌株培养产物的代谢物或分泌物的物质或其溶胞物，菌株本身也可包含于发酵液中。
8.一种如权利要求3-7任一项所述的美白组合物在制备具有美白作用的食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化妆品为护肤品。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化妆品的剂型选自爽肤乳、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、滋润乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳、沐浴露中的一种或多种。
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