KR20140121210A - 발효 마카 함유 피부 외용제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스속 및 스트렙토코쿠스속으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 의해 발효된 발효 마카를 함유하는 피부 외용제 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피부 외용제는 항산화 효과 및 세포 증식 효과가 뛰어난 발효 마카를 함유함으로써 자외선 등에 의한 피부노화 방지, 보습 및 주름 개선에 뛰어난 효과가 있을 것으로 기대된다.

Description

발효 마카 함유 피부 외용제{EXTERNAL PREPARATION FOR SKIN COMPRISING FERMENTED MACA}

본 발명은 발효 마카를 함유하는 피부 외용제, 특히 항산화효과 및 피부노화방지 효과가 뛰어난 피부 외용제에 관한 것이다.

피부에 탄력(tenseness)과 윤기(gloss)를 주고, 주름과 늘어짐의 발생을 방지하여 이른바 피부의 노화방지를 목적으로 하는 화장료는 여러가지 타입의 제품이 제안되고 있다. 대표적인 것으로는 다가 알콜류(글리세린과 소르비톨 등), 히아루론산(hyaluronic acids), 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; 예를 들면 아미노산, 젖산염, 소듐 피롤리돈 카르복실레이트(sodium pyrrolidone carboxylate) 및 우레아(urea)), 세포간지질(스핑고지질(sphingolipids), 인지질, 콜레스테롤), 피지류 이물질(올리브유, 호호바유(jojoba oil), 스쿠알란(squalane)) 등의 보습성분을 배합한 화장료; 또 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E 및 그 유도체, 비타민 F(리놀레산) 또는 비타민 H(글루타치온(glutathione)) 등의 비타민류, 호르몬류, 식물 추출물(글리시레트산 (glycyrrhetic acid), β-카로텐(β-carotene)), 동물 추출물(태반유체(placenta liquid), 로얄제리(royal jelly)) 등의 세포 부활 성분을 배합한 화장료가 있다.

일반적으로 피부의 노화현상의 척도가 되는 피부의 주름과 늘어짐을 형성하는 주요 원인으로 피부의 진피세포(dermal tissues)에서 구성성분의 질적, 양적 변화가 큰 영향을 미치고 있는 것으로 알려져 있다. 즉 진피조직에서는 섬유성 단백질성분으로 콜라겐 섬유와 탄성섬유(엘라스틴), 2종류가 존재하지만, 이것이 여러가지의 외적 또는 내적 요인에 의해 단백질 변성을 일으켜 피부의 탄력성을 저하시켜 결과적으로 주름과 늘어짐이 생성되는 것으로 알려져 있다.

이 단백질 변성을 일으키는 요인의 하나로 콜라겐 섬유간의 가교결합 (crosslinks)이 있다. 이 가교결합은 유년기 때는 콜라겐 섬유의 강도를 증가시키므로 중요하고, 가교효소에 의해 촉진된다. 그러나 이것이 충분히 성숙한 후에도 생체 내에서 효소의 작용없이 콜라겐 섬유 간에 불필요한 가교를 생성한다. 현재 활성산소가 상기 가교생성 단계에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 섬유아세포(fibroblast)에서 산출되고 섬유아세포 스스로가 생산하는 효소에 의해 분해된다. 이 산출과 분해의 발란스에 의해 콜라겐의 양이 조직내에서 적당히 유지되고 있다고 생각되고 있지만, 피부의 일광 노출부 또는 이른바 빛으로 노화된 피부에 있어서는 그 조직 내의 콜라겐 양이 현저히 감소하는 것이 알려져 있다.

더욱이 상기의 섬유성 성분의 사이는 조직간 기질 또는 무코다당류 (mucopolysaccharides; 주로 히아루론산(hyaluronic acid)으로 구성)로 채워져 있는데, 활성산소가 작용하면 무코다당류의 단편화(저분자화) 현상이 발생하는 것이 알려져 있다.

활성산소가 생체내 성분의 산화와 생체 노화의 원인의 하나로 깊게 관여하고 있다는 것은 잘 알려져 있으며, 피부에 있어서도 다른 장기와 마찬가지로 활성산소의 영향을 받는다. 피부는 항상 외부와 접하고 있어 항상 강한 산화 스트레스에 노출되어 있는 부위이다. 그렇기 때문에 피부는 이 끊임없는 산화 스트레스에 대하여 각종의 방어기작을 구비하고 있다. 예를 들면 각질층(horny layer)은 자외선을 반사, 흡수, 산란하는 물리적 광방어를 하고 있고, 또한 표피에서는 생성되는 활성산소를 소거하기 위하여 초과산화물 불균등화효소(SOD)로 대표되는 각종의 생체내 항산화물질이 존재한다. 예를 들면, 아미노산의 하나인 트립토판은 자외선 조사에 의해 초과산화물을 잘 발생하는 것으로 알려져 있지만, 상기 생체내 SOD의 작용으로 불활성화된다. 이와 같이 평상시의 상태에 있을 때는 각종의 산화반응의 진행은 미연에 방지되고 있지만, 과도하게 햇볕에 그을리거나 하는 비정상적인 산화 스트레스에 의해 이 방어기작이 파괴되어 피부염과 색소증가, 피부암 등의 원인이 되는 외에, 계속적인 산화 스트레스로 인한 피부 노화 등의 현상이 발생된다.

이와 같이, 활성산소의 발생을 방지하고 또한 그것을 제거하는 것이 피부의 주름과 늘어짐의 형성에 의한 피부 노화방지에 효과가 있다는 것이 밝혀지면서, 항산화특성을 갖는 다양한 물질을 피부 외용제에 적용하려는 시도가 있다.

한편, 마카(Lepidium meyenii Walp)는 남미 페루의 안데스산맥 해발 4.000미터 이상의 고지를 원산으로 하는 십자화과식물로서, 페루의 인삼이라고 알려져 있다. 상기 마카는 고지의 혹독한 기후 속에서 자생하는 식물이며 영양가가 높은 식품으로 안데스 고지에서 기원전 2000년 전부터 재배되고 있다.

이러한 마카는 단백질, 불포화 지방산 및 미네랄이 풍부하며, 특히 마카분말은 탄수화물 55-60％, 단백질 9-12％, 지질 1-2％, 섬유질 8-9％, 다량의 필수아미노산, 철분 및 칼슘 등을 함유하는 영양식품으로 알려져 있다. 또한 상기 성분 이외에도 마카는 리놀렌산(Linolenic acid), 팔미트산(Palmitic acid) 및 올레인산(Oleic acid)과 같은 중요 지방산, 그리고 식물성 스테롤 및 미네랄도 다량 함유하고 있으며, 마카의 지표성분에는 마카엔(macaene)이나 마카마이드(macamide)와 같은 다른 식물에서는 발견되지 않는 고유의 불포화지방산이 존재하고, 이러한 성분들은 생리활성을 지니는 것으로 보고되고 있다. 특히 마카의 글루코시놀레이트(glucosinolate) 함량은 다른 십자화과 작물의 100배에 달하고, 이는 면역시스템을 조절하고 항암작용을 한다고 보고된 바 있다.

상기와 같은 장점을 갖는 마카 또는 발효 마카는 식품이나 음료수 용도로 주로 연구개발되고 있는데(대한민국특허공개 2012-115736호 참조), 본 발명자들은 발효 마카에 대해 연구한 결과 화장품과 같은 피부 외용제로서의 탁월한 효능을 갖는 발효 마카를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 발효 마카를 이용하여 자외선을 비롯한 각종 원인에 의해 발생되는 산화물질로부터 주어지는 스트레스를 세포 스스로 극복하도록 하며, 더 나아가 세포증식 촉진을 통하여 피부의 노화를 억제하고 주름을 개선하는 효과가 있는 피부 외용제를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 락토바실러스속 및 스트렙토코쿠스속으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 의해 발효된 발효 마카를 함유하는 피부 외용제를 제공한다.

본 발명은 또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여,

미생물을 배양하는 단계; 마카분말, 당 및 정제수를 포함하는 마카 배지를 준비하는 단계; 상기 마카 배지에 미생물을 접종하여 발효시킨 후 여과하여 발효 마카를 제조하는 단계; 및 상기 발효 마카와 피부 외용제용 성분을 배합하는 단계를 포함하는 피부 외용제 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 피부 외용제는 항산화 효과 및 세포 증식 효과가 뛰어난 발효 마카를 함유함으로써 자외선 등에 의한 피부노화 방지, 보습 및 주름 개선에 뛰어난 효과가 있을 것으로 기대된다.

도 1은 마카 발효액의 세포 증식율 실험결과이다.
도 2는 마카의 발효 전과 발효 후의 DPPH 유리라디칼(free radical) 소거활성측정 결과이다.
도 3은 마카의 발효 전과 발효 후의 퍼옥실 라디칼 소거 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 마카의 발효 전과 발효 후의 하이드록실 라디칼 소거 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 마카의 발효 전과 발효 후의 SOD 유사활성을 측정한 결과이다.
도 6은 마카 발효 전과 발효 후의 아질산염 소거능을 측정한 결과이다.
도 7은 Raw 264.7 세포주에 대한 마카 발효액의 세포 독성을 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 피부 외용제는 락토바실러스속 및 스트렙토코쿠스속으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 의해 발효된 발효 마카를 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발효 마카는 락토바실러스속 미생물 및 스트렙토코쿠스속 미생물의 혼합 미생물에 발효된 것이 바람직하다. 락토바실러스속과 스트렙토코쿠스속의 2 종의 미생물을 혼합사용하여 발효하면 유산균이 생성하는 각종 유기산 및 효소에 의해 마카에 존재하는 활성물질의 추출이 용이하게 되며, 더 나아가 두 유산균의 혼합발효를 통하여 높은 활성으로 생산되는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)에 의해 마카에 존재하는 배당체 형태의 플라보노이드를 비배당체 형태인 어글리콘(aglycone)으로 활성화시켜 주어 발효를 통한 마카의 효능을 극대화할 수 있다. 플라보노이드가 배당체에서 비배당체로 전환될 때 항산화 혹은 항노화활성이 향상되는 현상을 고려할 때 혼합발효에 의한 효소활성의 증가는 발효 마카에서 매우 중요한 요소이다.

상기 락토바실러스속 미생물 및 스트렙토코쿠스속 미생물의 혼합비는 10 ~ 1 : 1 ~ 10 일 수 있다. 더욱 바람직하게는 5 ~ 1 : 1 ~ 5 일 수 있다.

바람직하게는, 상기 락토바실러스속 미생물은 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 불가리커스이다. 또한, 상기 스트렙토코쿠스속 미생물은 스트렙토코쿠스 더모필러스 인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 피부 외용제 중 발효 마카의 함량은 0.1 내지 20 중량% 일 수 있다. 발효 마카의 함량이 0.1 중량% 미만이면 그 효과를 기대하기 어렵고, 20 중량% 초과하면 비용 대비 효과가 떨어질 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 피부 외용제는 식물성 발효오일을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 식물성 발효오일의 함량은 0.1 내지 20 중량%일 수 있다.

식물성 발효 오일은 본 출원인의 대한민국 특허출원 2012-0093218호에 기재된 바와 같이 미생물에 의한 발효 방법으로 얻을 수 있으며, 포수력에 따른 유화안정성 향상, 사용감 및 향미 개선, 보습력 향상 등의 효과가 있기 때문에 발효 마카와 함께 첨가하면 더욱 바람직하다.

본 발명의 피부 외용제 형태는 그 효과를 충분히 발휘할 수 있으면 임의로 선택가능하며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 스프레이, 팩, 피부접착용 패치, 드레싱, 함수성 첨부제 또는 함수성이 없는 첨부제 등 피부에 적용가능한 모든 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 피부 외용제에는 피부나 점막에 적용되는 화장료나 외용의 의약품ㆍ의약부외품에 배합되는 각종 성분을 적용량 배합할 수 있다.

이러한 성분은,

(1) 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 구연산과 같은 카르본산류; 토코페롤, 디부틸히드록시톨루엔과 같은 페놀류),

(2) 방부제(예를 들면, 데히드로초산, 살리실산, 에데트산 이나트륨과 같은 카르본산류; 파라옥시벤조산 에틸, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 이소프로필, 티몰과 같은 페놀류),

(3) 보습제(예를 들면, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜과 같은 글리콜류; 히알론산과 같은 유기염류; 요소와 같은 아미드류),

(4) 점조제(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 화합물; 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 카르복시프로필셀룰로오스와 같은 셀룰로오스류),

(5) 완충제(예를 들면, 구연산, 락트산, 주석산과 같은 유기산류; 염산, 붕산과 같은 무기산류; 인산이수소나트륨, 구연산나트륨과 같은 염류; 트리에탄올아민과 같은 유기염기류; 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 무기 염기),

(6) 흡착제(예를 들면, 카올린, 벤토나이트와 같은 함수 규산알루미늄류; 수산화알루미나마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 무기염류),

(7) 기제(예를 들면, 백색 바셀린, Tween60, Tween80, 유동 파라핀, 밀랍, 바셀린, 피마자유, 실리콘유, 경화 피마자유, 천연고무, 야자유 지방산 디에탄올아미드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 천연고무 라텍스, 1,3-펜타디엔 공중합수지와 같은 유기물; 폴리부텐, 합성 고무 SBR, 모노스테아르산폴리에틸렌 글리콜, 모노스테아르산폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌세트스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌올레일세틸 에테르, 실리콘, 아크릴산 전분, 폴리아크릴산나트륨, 메타아크릴산ㆍ아크릴산 n-부틸 코폴리머, 카르복시비닐 폴리머와 같은 고분자화합물; 스테아르산과 같은 지방산류; 세타놀, 미리스틸알코올과 같은 알코올류; 미리스틴산 옥타도데실, 미리스틴산 이소프로필, 옥탄산 세틸과 같은 지방산 에스테르류),

(8) 용제(예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 1,3-부틸렌글리콜, n-옥타데실알코올, 크로타미톤, 트리(카푸릴산ㆍ카푸론)글리세린과 같은 탄수화물),

(9) 안정화제(예를 들면, 메타인산나트륨, 산화아연, 산화티탄과 같은 무기염류; 폴리옥시에틸렌라우릴황산 에테르 황산나트륨, 라우릴 황산나트륨과 같은 유기 염류),

(10) 점착제(예를 들면, 폴리아크릴산나트륨, 디프로필렌글리콜과 같은 고분자 화합물), 유화제(예를 들면, 모노올레핀산 솔비탄, 모노올레핀산 폴리옥시에틸렌솔비탄, D-솔비톨, 모노라우린산 폴리글리세린, 폴리옥시에틸렌라우릴 에테르 황산나트륨 등),

(11) 유화제 또는 계면활성제(예를 들면, 모노라우린산 폴리글리세린, 폴리옥시에틸렌올레일 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌세틸알코올 에테르, 폴리옥시에테르모노올레인산 에스테르, 모노스테아린산글리세린, 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 등),

(12) 이외에, 향료, 색소(염료, 안료), 금속 봉쇄제, 방취제, 피막 형성제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제, 비타민류 등을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따른 피부 외용제는, 피부 외용제용 첨가제로서, 유성분, 유화제 및 보습제를 함유할 수 있다. 이때, 발효 마카, 유성분, 유화제 및 보습제의 중량비가 1~10 : 1~20 : 1~10 : 5~50 인 것이 바람직하다.

유성분으로써는, 전술한 식물성 발효 오일 외에도, 예를 들어, 동백류, 마카디미어넛츠유, 올리브유, 아주까리유, 잇꽃유, 대두유, 다실(茶實)유, 카카오 기름, 야자유, 경화야자유, 팜유, 연무왁스(haze wax), 경화아주까리유, 비이즈왁스(bees wax), 칸데릴라왁스(candelilla wax), 카르나우바왁스(carnauba wax), 라놀라, 액상라놀린, 죠죠바왁스, 연질라놀린, 폴리옥시에틸렌라놀린알콜에테르, 폴리옥시에틸렌콜레스테롤에테르 등의 천연유지류, 스쿠알렌, 파라핀, 셀레신, 와세린, 마이크로크리스탈린왁스 등의 탄화수소계유지류, 미리스틴산이소프로필, 미리스틸산옥틸도데실, 팔미틴산이소프로필, 12-히드록시스테아린산콜레스테릴, 디-2-에틸헥실산에틸렌글리콜, 디펜타에리스리톨지방산에스테르, 테트라-2-에틸헥실산펜타에리스리톨, 트리-2-에틸헥실산클리세린, 트리이소스테아린산트리메틸올프로판, 세틸-2-에틸헥사노에이트, 아주까리유지방산메틸에스테르 등의 합성유성성분, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 메틸하이드로디엔폴리실록산 등의 사슬상폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸폴리실록산, 테트라메틸테트라하이드로디엔폴리실록산등의 고리상 폴리실록산, 3차원 그물눈구조를 형성할 수 있는 실리콘수지 및 실리콘 고무등의 실리콘류 등을 들 수 있다.

유화제는 전술한 바와 같이, 모노라우린산 폴리글리세린, 폴리옥시에틸렌올레일 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌세틸알코올 에테르, 폴리옥시에테르모노올레인산 에스테르, 모노스테아린산글리세린, 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 등을 예로 들 수 있다.

보습제도 전술한 바와 같이, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜과 같은 글리콜류; 히알루론산과 같은 유기염류; 요소와 같은 아미드류를 예로 들 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제는 미생물을 배양하는 단계; 마카분말, 당 및 정제수를 포함하는 마카 배지를 준비하는 단계; 상기 마카 배지에 미생물을 접종하여 발효시킨 후 여과하여 발효 마카를 제조하는 단계; 및 상기 발효 마카와 피부 외용제용 성분을 배합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 마카 발효에 사용한 미생물은 락토바실러스속 및 스트렙토코쿠스속으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물이다. 통상적인 방법 및 조건에서 이들 미생물을 배양할 수 있다. 예를 들면, MRS 배지와 같은 적절한 배양액 내에서 미생물을 1차 배양한 후, 배양액의 양을 단계적으로 상승시키면서, 2차 및 3차 배양하여 스케일업(scale up) 함으로서 배양공정을 진행할 수 있다. 상기와 같은 배양과정에서, 배양액의 종류, 배양조건 및 스케일업의 수준은 특별히 한정되지 않으며, 대상이 되는 미생물 및 목적하는 미생물의 수준에 따라 적절히 선택될 수 있다.

마카 분말의 제조방법은 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 일반적으로 알려진 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 마카분말의 제조 공정의 일례를 들면 하기와 같다. 우선, 마카를 정선, 세척, 살균 및 세절공정을 거친 후에 유동층 건조기에서 1차 건조한다. 그 후, 적당한 크기, 예를 들면 약 50메쉬 정도로 분쇄한 후 마카 분말을 제조할 수 있으나 특별히 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 제조된 마카 분말을 당 및 정제수와 배합하여 마카 배지를 조제한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 마카 배지는 마카분말, 당 및 정제수가 2~50 : 0.1~3 : 50~95의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

당은 글루코스, 올리고당 등 미생물이 잘 배양될 수 있는 성분을 이용하면 되며 특별히 한정되는 것은 아니다.

상기 배지는 통상적인 방법 및 조건으로 살균 및 냉각시킬 수 있다. 살균 및 냉각이 완료된 마카 배지에, 배양한 미생물을 접종하여 발효시킨 다음, 막여과기로 여과하여 발효 마카액을 제조한다. 이때, 발효조건은 20~35℃의 발효온도에서 발효조의 회전 속도를 50~70RPM으로 유지시키면서, 4~10일 동안 수행하는 것이 바람직하다. 그러나 상기 발효조건은 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 발효 마카액에 따라 적절히 변경될 수 있다. 또한, 발효 공정의 종료 시점 역시 특별히 한정되지 않으나, 배지 내의 pH의 변화 및 미생물의 배양 상태를 확인하면서, 배지 내의 균수가 g당 약 1억 마리 이상이 되는 때에 종료하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 있어 상기 발효공정이 종료된 후에는 발효 마카액을 분리할 수 있도록, 발효공정 후의 발효액을 약 0.45 ㎛이하의 막여과기로 여과한 후, 제성하는 단계를 거쳐 발효 마카액을 제조하는 것이 바람직하다. 그러나, 발효 마카액을 분리하는 방법이 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명의 구체적인 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 범위가 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 개량이 가능하다. 이하 실시예에서 백분율(%) 및 비율은 다른 언급이 없는한 중량을 기준으로 한다.

실시예

마카 발효액 제조예

1. 미생물 배양

락토바실러스속(Lactobacillus sp) Lactobacillus casei, 스트렙토코쿠스속(Streptococcus sp.) Streptococcus thermophilus를 사용하였다. 2종의 균주는 MRS 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양조건은 35℃에서 80rpm으로 진탕배양기에서 72시간 동안 1차 배양하였다. 1차 배양액은 마카 배지 접종에 사용하였다.

2. 마카 배지제조

마카 배지는 마카 분말 2~50%, 글루코스 0.2%, 정제수 89.8%를 혼합한 후 110℃에서 30분간 가압멸균시켰다.

3. 마카 발효액 제조

상기 배양된 락토바실러스속 과 스트렙토코쿠스속 유산균을 1:1로 혼합하여 마카 배지에 2% 접종하고 25℃에서 5일간 발효하였다. 발효가 종료되면 마카 발효액을 원심분리하여 상등액을 0.22㎛의 실린지 필터로 여과하였다. 도 1은 마카 발효에 사용한 균주의 morphology 이다.

마카 발효액 항산화력

1. 플라보노이드 함량 측정

플라보노이드 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 이차대사산물로 식물계에 널리 분포되어 있으며 유리 라디칼(free radical)을 제거함으로써 산화를 억제하여 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막아 항암, 항균, 노화방지 및 심장질환 예방하는 등의 생리활성 물질로 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에 활용되고 있다.

시료 1mL에 5% NaNO₂를 30㎕ 첨가한 다음 5분간 실온에서 반응시킨 후, 10% AICI₃ 30㎕와 1M NaOH 200㎕를 혼합하여 반응액의 흡광도값을 510nm에서 측정하였다. 표준물질로 카테킨(Catechin)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 mM CE/mL단위로 산출하였다.

표 1에 마카 발효 전과 마카 발효 후의 플라보노이드 함량을 나타내었다. 플라보노이드 함량은 발효 전 2.6359mM CE/mL, 발효 후 1.9546mM CE/mL을 나타내었다. 이는 마카 발효 전보다 발효 후의 플라보노이드 함량이 높게 나타났다. 이로부터 마카 배지에서 2종의 유산균에 의한 발효과정을 통해 비배당체(aglycone)의 형태로 변화하여 비배당체인 플라보노이드 함량이 증가한 것을 알 수 있다.

	마카 발효액	마카 수용액
플라보노이드 함량 (mM CE/mL)	2.6359	1.9546

2. 전자공여능 측정

마카 발효액 50㎕에 0.2mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 150㎕를 가하여 혼합하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우를 백분율(%)로 산출하였다.

마카 발효 전과 발효 후의 DPPH에 의한 전자공여능을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과 발효에 의한 마카의 항산화력은 30% 높게 나타났으며 마카의 항산화력은 플라보노이드 함량과 관계없이 2종의 유산균의 발효과정에 의해 생성되는 생리활성물질에 의하여 증가한 것으로 보인다.

반면, Maca(Lepidium meyenii) 발효균주의 탐색과 마카발효물의 특성에 관한 학위논문(2012, 건국대학교, 박준우)에 의하면 사카로마이세스속 미생물을 마카배지에 발효시켰을 때는 발효 전과 발효 후의 DPPH 라디칼 소거능이 9% 증가에 불과하였다. 이와 같이 사카로마이세스속 미생물보다 락토바실러스속과 스트렙토코쿠스속의 혼합유산균이 발효하였을 때 마카의 생리활성 성분이 대폭 상승하는 효과를 나타내었다.

3. ORAC ( Oxygen radical absorbance capacity assay )

ORAC 분석법은 radical chain breaking antioxidant capacity를 측정하는 방법이다. 따라서 보통 전자공여능 측정이 페놀(phenol)류 등의 함량을 예측하는 데 유효한 반면에 ORAC은 친수성(hydrophilic)과 소수성(hydrophobic) 성분 모두에 반응하기 때문에 응용범위가 넓다는 장점을 가지고 있다.

마카 발효액을 75mM 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)에 녹여 퍼옥시 라디칼(peroxy radical)의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 측정하여 ORAC 값을 측정하였다. 퍼옥시 라디칼의 생성을 위해 2,2-azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride (AAPH)를 사용하였고, 표준물질로 트롤록스(trolox)를 사용하여 측정하였다. 시료의 제조는 75mM 포스페이트 버퍼를 이용하여 시료를 농도별로 제조한 다음 37℃에서 15분간 정치하였다. 그 후 시료 25㎕에 0.2M의 fluorescein을 150㎕ 첨가하고, 즉시 0.144nM AAPH 25㎕를 첨가하였다. 측정 전 쉐이킹(shaking)을 해준 후 형광분광광도계로 형광물질의 감소 정도를 37℃에서 60분간 (2분당 1회) 485nm에서 전자가 여기되고, 530nm에서 방출되게 조절하여 측정하였다. 표준물질은 트롤록스로 측정하였고, 시료의 저해 능력은 트롤록스 당량(trolox equivalents)으로 표현하고, 시료의 AUC(the area under the curve)를 표준곡선에 의해 정량을 하였다.

AAPH에 의한 퍼옥시 라디칼의 생성과 소멸에 따른 fluoresecent의 감소율을 트롤록스 당량(uM)으로 환산한 결과, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 마카 발효 전과 발효 후를 비교하였을 때 마카 발효 후 추출액이 높은 트롤록스 당량(uM)을 나타내는 것을 알 수 있다. 이는 앞서 실험한 플라보노이드 함량과 전자공여능, 그리고 후술될 SOD 유사활성 결과와 비슷한 경향을 나타낸다.

4. SOD 유사활성

SOD는 몸 안에 생성된 활성산소종의 하나인 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical)을 산소분자와 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 대표적인 항산화효소이다. SOD 유사활성을 가지는 물질은 주로 저분자 물질로 파이토케미컬(Phytochmical)에 속하며 SOD와 유사한 역할을 하여 슈퍼옥사이드로부터 생체를 보호하며 인체 내의 슈퍼옥사이드를 제거함으로써 노화억제와 더불어 산화적 장애의 방어효과를 가진다고 알려져 있다.

시료 0.2mL에 Tris-HCl buffer (pH 8.5) 3mL와 기질물질인 7.2mM의 파이로갈롤(pyrogallol) 0.2mL를 가하여 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 이 용액에 1N HCl 0.2mL를 가하여 반응을 정지시킨 다음 420nm에서 흡광도를 측정하였다.

슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Superoxide dismutase) 유사활성 측정은 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 산출하였다.

도 5는 마카의 발효 전과 발효 후의 SOD 유사활성을 측정한 결과이다. 마카 발효 전은 9.52%, 발효 후는 21.39%로 마카 발효액의 SOD 유사활성이 높게 나타났다. 이러한 결과는 전자공여능 결과와 유의적인 상관관계가 존재하는 것을 보여준다.

5. 아질산염 소거능

1mM NaNO₂ 용액 1ml에 적정농도 시료 1ml를 가하고 0.1N HCl(pH 1.2)로 반응용액의 pH를 1.2로 조정한 후 전체량을 10ml로 만들었고, 이 용액을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 용액에 Griess 시약 0.4mL과 2% 초산용액 5ml씩 가하여 잘 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정, 잔존하는 아질산양을 측정하였다. 공 시험은 Griess 시약 대신 증류수를 0.4ml가하여 동일하게 행하였다. 아질산염 소거작용은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우를 백분율(%)로 산출하였다.

마카 발효전과 발효 후의 아질산염 소거능을 측정한 결과는 도 6과 같다.

그 결과 마카 발효 전은 62.38%, 발효 후는 85.23%로 높은 소거능을 나타내었으며, 이는 2종의 유산균이 발효과정을 통해 아질산염이 흡수되거나 혹은 균체에서 분비되는 효소가 아질산염을 환원시키는 등의 기작으로 아질산염이 소거될 것으로 판단된다. 또한 아질산염 pH값이 낮을수록 소거능이 우수하다고 알려져 있다. 따라서 마카 발효전과 발효 후의 pH값에도 아질산염 소거능과 관계가 있을 것으로 생각된다.

마카 발효액 세포 증식율

1. 세포증식율 ( MTT assay )

마카 발효액이 Raw 264.7세포주에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마카 발효액을 0.01~0.5%의 농도로 처리한 후 MTT assay로 측정하였다.

Raw 264.7 세포는 DMEM 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(Thermo Fisher scientific, USA)에서 배양하였다. DMEM 배지에 배양된 세포를 24 well plate에 1×10⁴cell/mL의 농도로 분주한 다음 18시간 후 DMEM 배지에 마카 발효액을 농도별로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다.

이후 각 well은 Phosphate Buffer Saline (PBS)용액으로 1회 세척하고 5mg/mL MTT시약(Sigma, USA) 50㎕과 새 배지 450㎕을 첨가하여 3~4시간 배양한 후 상등액을 제거하였다. 각 well에 생성된 formazan결정을 Dimethylsulfoxide (DMSO)로 배지의 동량을 가한 뒤 차광상태에서 30분간 가볍게 흔든 다음 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

Raw 264.7세포주에 대한 마카 발효액의 세포 독성을 측정한 결과 2.5%의 농도에서 100%에 가까운 세포 생존율을 나타내었다(도 7 참조). 이와 같이 세포독성 실험결과를 바탕으로 마카 발효액은 Raw 264.7 세포주에 대한 안전성을 갖고 있음을 확인할 수 있다.

2. Nitric oxide ( NO ) 생성 억제 측정

96 well plate에 well 당 5×10⁴ cell/mL의 Raw 264.7 세포를 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈정 배지에 최종농도가 0.01~2.5%가 되도록 마카 발효액을 처리한 후 염증 유도인자인 LPS를 1㎍/mL의 농도로 처리하였다. 48시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성정도를 측정하였다. 세포배양액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 10분동안 차광된 상태에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조구와 마카 발효액은 0.01%~2.5% 농도별로 염증유발인자 LPS를 처리 후의 Nitric oxide(NO) 생성 억제 효과를 비교하였다. 마카 발효액은 0.313~2.5㎍/mL 농도에서 각각 50%~68%의 NO를 소거하였으며, 농도의존적으로 NO 소거율이 나타나는 것으로 확인하였다. 이러한 결과를 볼 때 마카 발효액이 항염활성이 우수한 것으로 판단된다.

제제예

실시예 1. 마카 발효액 화장료조성물 제조

제조예에서 제조된 마카 발효액 1%, 부틸렌글리콜 10%, 1,2-헥산디올 2%, 정제수 87%를 배합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 2. 외용 크림제

정제수에 보습제 및 마카 발효액을 가하고 70℃로 가열, 조정하였다. 식물성 발효오일 및 유성분들을 가열 용해 후, 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 앞의 수상에 가하고 호모믹서로 유화 입자를 균일화한 다음, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.

중분류	소분류	함량(g)
유성분	세토스테아릴알코올	6
	스테아린산	2
	발효올리브오일	15
	스쿠알렌	1
	옥틸도데카놀	3
유화제	POE(25)세틸알코올에테르	3
	모노스테아린산글리세린	2
보습제	1,3-부틸렌글리콜	3
	글리세린	2
마카 발효액		5
방부제	프로필파라벤	적당량
	메틸파라벤	적당량
정제수		잔량

실시예 3. 외용 로션제

표 3의 성분을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조하였다.

중분류	소분류	함량(g)
유성분	세토스테아릴알코올	1
	식물성 발효오일	8
	스쿠알렌	1
	디메틸폴리실록산	2
유화제	POE(25)모노올레인산에스테르	1
	글리세롤 모노스테아린산 에스테르	1
보습제	1,3-부틸렌글리콜	4
	글리세린	4
마카 발효액		5
방부제	프로필파라벤	적당량
	메틸파라벤	적당량
정제수		잔량

비교예 1 및 2

발효 마카액을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2 및 3과 동일한 조성으로 비교예 1 및 2의 조성물을 각각 제조하였다.

피부 보습 및 탄력도 증가 효과

35~50 세까지의 여성 60 명을 20 명씩 3 개의 군으로 나누어 그룹 1은 오른쪽 얼굴에 비교예 1을 왼쪽 얼굴에는 실시예 1을, 그룹 2는 오른쪽 얼굴에 비교예 1을 왼쪽 얼굴에는 실시예 2를, 그룹 3은 오른쪽 얼굴에 비교예 2를 왼쪽 얼굴에 실시예 3을 그 안면부에 1 일 2 회씩 1 개월간 도포하도록 하였다. 피부 탄력성을 Cutometer SEM575로 측정하고 피부 보습은 Corneometer CM825에 의해 측정하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 탄력성 및 보습 측정은 초기에 비해 증가한 탄력성 및 보습력을 %로 나타내었다.

구분	피부보습 효과(%)	피부탄력도 효과(%)
실시예 1	33.1	60
실시예 2	57	65
실시예 3	54	64
비교예 1	30.9	57
비교예 2	29.7	54

상기 결과로부터 본 발명에 따른 발효 마카 함유 조성물을 장기간 도포하게 되면 피부 보습 및 탄력도 개선 효과가 각각 17.7 %와 7.5 % 증가하는 것을 확인할 수 있다.

이와 같은 시험결과는 본 발명의 조성물이 피부외용제로 사용되었을 때 피부 보습력을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것으로, 본 발명에 따른 발효 마카가 화장품과 같은 피부 외용제 원료로써 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

Claims (10)

1. 락토바실러스속 및 스트렙토코쿠스속으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 의해 발효된 발효 마카를 함유하는 피부 외용제.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 발효 마카가 락토바실러스속 미생물 및 스트렙토코쿠스속 미생물의 혼합 미생물에 발효된 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 락토바실러스속 미생물 및 스트렙토코쿠스속 미생물의 혼합비가 10 ~ 1 : 1 ~ 10 인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스속 미생물은 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 불가리커스인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스속 미생물은 스트렙토코쿠스 더모필러스인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
6. 제 1 항에 있어서, 발효 마카의 함량이 0.01 ~ 20 중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
7. 제 1 항에 있어서, 식물성 발효오일을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
8. 제 7 항에 있어서, 식물성 발효오일의 함량이 0.1 ~ 20 중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
   
9. 미생물을 배양하는 단계;
   마카분말, 당 및 정제수를 포함하는 마카 배지를 준비하는 단계;
   상기 마카 배지에 미생물을 접종하여 발효시킨 후 여과하여 발효 마카를 제조하는 단계; 및
   상기 발효 마카와 피부 외용제용 성분을 배합하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 피부 외용제 제조 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 마카 배지는 마카분말, 당 및 정제수가 2 ~ 50 : 0.1 ~ 3 : 50 ~ 95의 중량비로 혼합된 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 제조 방법.

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