JP2022055482A

JP2022055482A - 皮膚細菌叢向上剤及び皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤

Info

Publication number: JP2022055482A
Application number: JP2020162935A
Authority: JP
Inventors: 美咲畑中; Misaki Hatanaka
Original assignee: Asahi Group Foods Ltd
Current assignee: Asahi Group Foods Ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-04-08
Also published as: TW202220681A

Abstract

【課題】安全性が高く、皮膚細菌叢を良好な状態とすることができる皮膚細菌叢向上剤及び皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の提供。【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）により乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを含む皮膚細菌叢向上剤、及び前記皮膚細菌叢向上剤を含む皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤である。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚細菌叢向上剤及び皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤に関する。

ヒトには数百種・数百兆個の細菌が生息し、口腔、胃、腸、皮膚など全身におよび、それぞれ異なった菌種や組成をもった固有の細菌叢を形成している。近年、もっとも研究が進んでいる腸内細菌叢（「腸内フローラ」と称することもある）は、様々な生理作用を有していることが知られている。例えば、有用な作用として、病原菌の定着阻害、免疫系の活性化、ビタミンの産生などが挙げられ、有害な作用として、腐敗産物や発がん物質の産生、各種腸疾患へ関与などが挙げられる。そのため、腸内細菌叢は、健康と密接な関係があるといえる。

また、皮膚細菌叢（「皮膚フローラ」、「肌細菌叢」、「肌フローラ」と称することもある。）も、近年、非常に注目が集まっており、皮膚細菌叢のバランスが良好で安定な状態であれば、肌の健康も保たれやすいと言われている。皮膚細菌叢の主要な菌属として、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、β－Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱、γ－Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱が挙げられ、肌の状態によって、皮膚細菌叢が異なることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。γ－Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の腸内細菌科に属する菌種の中で、肌での存在比率が比較的高い、Ｃｅｄｅｃｅａｌａｐａｇｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ、及びＲａｏｕｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａといった菌種や、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｕｒｅｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の菌種は、炎症を誘発する可能性を有する有害菌（例えば、非特許文献１～５参照）が存在することが知られている。

さらに、特定の疾患と皮膚細菌叢に関連があることも報告されており、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓにニキビの増悪作用があることや、アトピー性皮膚炎の増悪にＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓが関連していることも多数報告されている（例えば、非特許文献１、５参照）。一方、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓと同じ菌属に属するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対する抗菌ペプチドを産生すること、肌バリアを強化することで保湿力を高め、肌の免疫力を上げる作用があり、皮膚細菌叢の中で、有用菌として働くことが報告されている（例えば、非特許文献１、５参照）。

これまでに、皮膚の状態を評価する方法として、皮膚細菌叢におけるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の割合を指標とする方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、安全性が高く、皮膚細菌叢を良好な状態とすることができる素材として十分満足できるものは未だ提供されておらず、その速やかな開発が強く求められているのが現状である。

なお、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）により乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイは、保湿剤（例えば、特許文献２参照）、表皮細胞分化及び角化促進剤（例えば、特許文献３参照）、皮膚における紫外線感受性抑制剤（例えば、特許文献４参照）などの有効成分として用いることができることが報告されている。

特開２０１７－２０９０５５号公報特開２００５－２０６５７８号公報国際公開第２００６／１３７５１３号国際公開第２００６／０９５７６４号

ＵｗｅＷｏｌｌｉｎａ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅｉｎａｔｏｐｉｃＤｅｒｍａｔｉｔｉｓ、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｏｍｅｔｉｃａｎｄＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、（２０１７）、１０：５１－５６ＣｈａｖｅｚＨｅｒｒｅｒａｅｔａｌ．、ＤｅａｔｈｒｅｌａｔｅｄｔｏＣｅｄｅｃｅａｌａｐａｇｅｉｉｎａｓｏｆｔｔｉｓｓｕｅｂｕｌｌａｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａｃａｓｅｒｅｐｏｒｔ、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＣａｓｅＲｅｐｏｒｔｓ、（２０１８）１２：３２８ＪａｌａｌＭａｒｄａｎｅｈｅｔａｌ．、ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅｆｒｏｍＣｏｎｓｕｍｅｄＰｏｗｄｅｒｅｄＩｎｆａｎｔＦｏｒｍｕｌａＭｉｌｋ（ＰＩＦ）ｉｎｔｈｅＮｅｏｎａｔａｌＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＵｎｉｔ（ＮＩＣＵ）、ＡｃｔａＭｅｄｉｃａＩｒａｎｉｃａ、Ｖｏｌ．５４、Ｎｏ．１（２０１６）、３９－４３ＰｉｓｅｔｈＳｅｎｇｅｔａｌ．、ＥｍｅｒｇｉｎｇｒｏｌｅｏｆＲａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａｉｎｈｕｍａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ａｓｅｒｉｅｓｏｆｃａｓｅｓａｎｄｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ、４５（２０１６）、６５－７１ＥｌｉｚａｂｅｔｈＡ．Ｇｒｉｃｅｅｔａｌ．、Ｔｈｅｓｋｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ、ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、９（２０１１）、２４４－２５３

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性が高く、皮膚細菌叢を良好な状態とすることができる皮膚細菌叢向上剤及び皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイが、皮膚細菌叢を良好な状態とする作用を有することを知見した。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを含むことを特徴とする皮膚細菌叢向上剤である。
＜２＞皮膚細菌叢の向上が、皮膚細菌叢における有用菌の割合の維持、有用菌の割合の増加、及び有害菌の割合の低減からなる群から選択される少なくとも１つである前記＜１＞に記載の皮膚細菌叢向上剤である。
＜３＞有害菌が、炎症を誘発する可能性を有する細菌である前記＜２＞に記載の皮膚細菌叢向上剤である。
＜４＞ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ－６０６０）である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の皮膚細菌叢向上剤である。
＜５＞前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の皮膚細菌叢向上剤を含むことを特徴とする皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤である。

本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性が高く、皮膚細菌叢を良好な状態とすることができる皮膚細菌叢向上剤及び皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤を提供することができる。

図１は、試験例１において皮膚水分量を測定した結果を示す図である。図２は、試験例１においてキメ体積率を測定した結果を示す図である。図３は、試験例１においてキメ個数を測定した結果を示す図である。図４は、試験例２において各種乳酸菌を用いた発酵乳ホエイによる有害菌の増殖抑制作用を測定した結果を示す図である。

（皮膚細菌叢向上剤）
本発明の皮膚細菌叢向上剤は、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイ（以下、「ＬＨ発酵乳ホエイ」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。

前記皮膚細菌叢向上剤は、皮膚細菌叢の状態を向上する作用を有するものである。
本明細書において、皮膚細菌叢の状態を向上するとは、皮膚細菌叢の状態を良好な状態（「健康な状態」と称することもある）とすることをいい、これには良好な状態を維持することも含まれる。
前記皮膚細菌叢向上剤は、皮膚細菌叢における有用菌の割合の維持、有用菌の割合の増加、及び有害菌の割合の低減からなる群から選択される少なくとも１つの作用を有することが好ましい。

前記有用菌としては、肌を良好な状態とするものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどが挙げられる。

前記有害菌としては、肌の状態に悪影響を及ぼすものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炎症を誘発する可能性を有するγ－Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱の腸内細菌科に属する腸内細菌科の菌種やＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓなどが挙げられる。

前記炎症を誘発する可能性を有する有害菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｃｅｄｅｃｅａｌａｐａｇｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ、及びＲａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。

前ＬＨ発酵乳ホエイが有する皮膚細菌叢の状態を向上する作用を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記ＬＨ発酵乳ホエイがこのような優れた作用を有し、皮膚細菌叢向上剤として有用であることは、従来は全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。

＜ＬＨ発酵乳ホエイ＞
－ラクトバチルス・ヘルベティカス－
前記ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、菌体外プロテイナーゼ活性の高い菌株が好ましい。例えば、Ｔｗｉｎｉｎｇらの方法（Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３３４１０（１９８４））をもとにしたＹａｍａｍｏｔｏらの方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．らＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）１１４，７４０）に準じて測定したＵ／ＯＤ５９０の値が４００以上を示す菌株が好ましい。また、下記の菌学的性質を有するラクトバチルス・ヘルベティカス菌株を用いることができる。

［菌学的性質］
１．形態学的性質：
１）細胞の形状；桿菌
２）運動性；なし
３）胞子の有無；なし
４）グラム染色性；陽性
２．生理学的性質：
１）カタラーゼ；陰性
２）インドール生成；陰性
３）硝酸塩の還元；陰性
４）酸素に対する態度；通性嫌気性菌
５）グルコースによりホモ乳酸発酵によりＤＬ（－）乳酸を生成し、ガスの産生はない。

前記ラクトバチルス・ヘルベティカスの中でも、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株が好ましい。前記ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株は、１９９７年８月１５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ－６０６０として、寄託されている。このラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。

前記ＬＨ発酵乳ホエイの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ラクトバチルス・ヘルベティカスを直接又は前記ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む発酵乳スターターを乳に添加し、発酵温度等の発酵条件を適宜選択して発酵させることにより得ることができる。

有効成分である前記ＬＨ発酵乳ホエイは、得られる発酵乳から遠心分離、ろ過等の常法の分離操作によりホエイを分離することにより得られるが、使用に際しては、分離せずに発酵乳の状態で、また分離したホエイを適宜、分画、濃縮、精製等して用いることができる他、該ホエイやその濃縮物を凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末として用いることもできる。

前記ラクトバチルス・ヘルベティカスは、あらかじめ前培養しておいた十分に活性の高いスターターとして用いることが好ましい。初発菌数は、好ましくは１０^５～１０^９個／ｍＬ程度である。

前記発酵においては、本発明の効果を損なわない限り、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外の乳酸菌や酵母などのその他の菌が含まれていてもよい。

原料の乳としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等の動物乳、豆乳等の植物乳、これらの加工乳である脱脂乳、還元乳、粉乳、コンデンスミルク等が挙げられ、牛乳、豆乳、これらの加工乳が好ましく、牛乳又はその加工乳が特に好ましい。
乳の固形分濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、脱脂乳を用いる場合の無脂乳固形分濃度は、通常３～１５質量％程度であり、生産性的には６～１５質量％が好ましい。

前記発酵は、通常静置若しくは撹拌培養により、例えば、発酵温度２５～４５℃、好ましくは３０～４５℃、発酵時間３～７２時間、好ましくは１２～３６時間で、乳酸酸度が１．５以上になった時点で発酵を停止する方法により行なうことができる。

前記ＬＨ発酵乳ホエイの皮膚細菌叢向上剤における含有量としては、特に制限はなく、前記ＬＨ発酵乳ホエイの生理活性等によって適宜調整することができる。前記皮膚細菌叢向上剤は、前記ＬＨ発酵乳ホエイのみからなるものであってもよい。

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記その他の成分の皮膚細菌叢向上剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜用途＞
本発明の皮膚細菌叢向上剤の用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、後述する皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の有効成分として好適に用いることができる。

前記皮膚細菌叢向上剤は、日常的に使用することが可能であり、有効成分であるＬＨ発酵乳ホエイの働きによって、皮膚細菌叢の向上作用を極めて効果的に発揮させることができる。

前記皮膚細菌叢向上剤の１日当たりの使用量としては、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであり、特に制限はないが、例えばヒト成人１人の１日当たりの顔への皮膚塗布量として、前記ＬＨ発酵乳ホエイが０．０１～２０質量％で配合された皮膚細菌叢向上剤０．０１～５ｇを均一に塗布することが好ましく、０．１～０．５ｇを均一に塗布することがより好ましい。この１日量を、１度に摂取してもよく、複数回に分割して摂取することもできる。

前記皮膚細菌叢向上剤の使用時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚細菌叢の向上が必要な環境等に接する前に継続的若しくは断続的に使用してもよいし、そのような環境に接した後に、継続的又は断続的に使用してもよい。

本発明の皮膚細菌叢向上剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

また、本発明の皮膚細菌叢向上剤は、皮膚細菌叢向上作用や皮膚細菌叢に関する研究のための試薬としても用いることができる。

（皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤）
本発明の皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤は、本発明の皮膚細菌叢向上剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。

＜皮膚細菌叢向上剤＞
前記皮膚細菌叢向上剤は、上述した本発明の皮膚細菌叢向上剤である。

前記皮膚細菌叢向上剤の皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤における含有量としては、特に制限はなく、前記皮膚細菌叢向上剤に含まれるＬＨ発酵乳ホエイの生理活性等によって適宜調整することができ、例えば、前記ＬＨ発酵乳ホエイの量として、０．０１～２０質量％であることが好ましく、０．０５～１０質量％であることがより好ましい。なお、前記ＬＨ発酵乳ホエイの量とは、乾燥し固体とした場合の質量を意味する。
前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤は、前記皮膚細菌叢向上剤のみからなるものであってもよい。

＜その他の成分＞
前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の利用形態に応じて適宜選択することができ、例えば、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤などが挙げられる。また、公知の皮膚細菌叢を良好な状態にする作用を有する物質を含んでいてもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記皮膚外用剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化粧品、医薬部外品、医薬品などが挙げられる。これらの中でも、後述する試験例で示すように、前記皮膚外用剤を塗布した場合に、皮膚水分量や肌のキメが良好となることから、化粧品として好適に用いることができる。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化粧水、クリーム、乳液、美容液、ローション、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、ハップ剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーションなどが挙げられる。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤形等に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の方法を用いて種々の成分を混合又は乳化等を行い、製造することができる。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤は、日常的に使用することが可能であり、有効成分であるＬＨ発酵乳ホエイの働きによって、皮膚細菌叢の向上作用を極めて効果的に発揮させることができる。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の１日当たりの使用量としては、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであり、特に制限はないが、例えばヒト成人１人の１日当たりの顔への皮膚塗布量として、前記ＬＨ発酵乳ホエイが０．０１～２０質量％で配合された皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤０．０１～５ｇを均一に塗布することが好ましく、０．１～０．５ｇを均一に塗布することがより好ましい。この１日量を、１度に摂取してもよく、複数回に分割して摂取することもできる。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤の使用時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚細菌叢の向上が必要な環境等に接する前に継続的若しくは断続的に使用してもよいし、そのような環境に接した後に、継続的又は断続的に使用してもよい。

前記皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、本発明の試験例、処方例を説明するが、本発明は、これらの試験例、処方例に何ら限定されるものではない。

（試験例１）
化粧水として、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ－６０６０）により乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを５質量％含有する化粧水（Ｌａｃｔｉｎａモイストローション、アサヒカルピスウェルネス株式会社製）を用意した。

＜試験方法＞
４５歳から５９歳の平均年齢５４．０±３．３歳の日本人女性１５名に、朝晩の洗顔後に上記化粧水を１週間塗布してもらった。

－皮膚細菌叢解析－
塗布試験開始前の朝と塗布１週間後の朝の洗顔前に、生理食塩水に浸した綿棒を使って額と頬を５～６回こすり、サンプルを採取した。
採取したサンプルからＤＮＡ抽出を行い、ＩＯＮ１６Ｓｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて増幅した１６Ｓリボソームタンパク質のＶ２～Ｖ４及びＶ６～Ｖ９領域の配列を、次世代シーケンサー（ＩｏｎＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ^ＴＭ（ＰＧＭ^ＴＭ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で解析した。
得られた配列に対してブラスト（Ｂｌａｓｔ）サーチを行い、９５％以上の同一性を有する株の中で最も高い相同株を各株に割り当てた。なお、低品質の塩基及び１２０ｂｐ以下の短い断片と、相同性が９５％未満の配列は除外した。
結果を表１に示す。

表１に示したように、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを含む化粧水を塗布した場合に、炎症を誘発する可能性のある有害菌である、Ｃｅｄｅｃｅａｌａｐａｇｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ、及びＲａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａの割合が低下することが明らかとなった（１５名全員）。
また、統計的な有意差はないものの、肌の保湿作用に関連し、有害菌の増殖を抑制する作用を有し、有用菌として知られているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの割合が１５名中９名で増加することが確認され、有害菌として知られているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの割合が１５名中８名で減少することが確認された。
したがって、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイが、皮膚細菌叢を健康な状態にシフトさせ、その状態を維持する可能性が示唆された。

－皮膚水分量、皮膚のキメ（キメ体積率、キメ個数）－
塗布試験開始前と塗布１週間後に、右頬の皮膚水分量、皮膚のキメ（キメ体積率、キメ個数）の測定を行った。
皮膚水分量の測定は、コルネオメーターＣＭ８２５（株式会社インテグラル社製）を用いて行った。結果を図１に示す。
皮膚のキメの測定は、皮膚のレプリカを作製し、分析システム（反射用レプリカ解析システム、アサヒバイオメッド社）を用いて行った。キメ体積率の測定結果を図２に、キメ個数の測定結果を図３に示す。

図１～図３に示したように、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを含む化粧水を塗布した後では、皮膚水分量、キメ体積率、キメ個数が有意に増加しており、皮膚外用剤として有用であることも確認された。

（試験例２：培養実験による発酵乳ホエイの有害菌抑制作用）
試験例１において認められた有害菌抑制作用が、ラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイの直接的な効果であるかを下記のようにしてｉｎｖｉｔｒｏ試験で確認した。

＜発酵乳ホエイの調製＞
固形率９質量％の脱脂粉乳からなる乳培地に、下記のいずれかの乳酸菌を接種して（最終植菌量：菌数１～２×１０^６個／ｍＬ）、３５℃で２４時間、静置培養し、発酵乳を得た。得られた発酵乳を限外ろ過（ＭＷ＜５ｋＤａ）し、各発酵乳ホエイを得た。
［乳酸菌］
下記の乳酸菌を用いた。なお、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株以外の乳酸菌は、それぞれの基準株を用いた。
・ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株
・ラクトバチルス・ヘルベティカス
・ラクトバチルス・デルブリッキィ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）
・ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
・ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）
・ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）
・ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）

＜試験方法＞
（１）ニュートリエントブロス（日本ＢＤ社製）に、Ｃｅｄｅｃｅａｌａｐａｇｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ、又はＲａｏｕｌｔｅｌｌａｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａを植菌し、前培養した。
（２）ニュートリエントブロスに、上記で調製した各発酵乳ホエイを５質量％添加し、上記（１）で培養した３菌種のいずれかを３％植菌し、３７℃で１６～２４時間培養した。発酵乳ホエイを添加しない群をコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。
（３）培養後のＯＤ（６００ｎｍ）を測定し、コントロール群のＯＤ値を１００としたときの相対値を算出した。
（４）試験を３回行い、平均値を算出し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で統計解析を実施した。結果を図４に示す。

図４に示したように、乳酸菌の中でもラクトバチルス・ヘルベティカスにより乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイにのみ、肌常在菌中の有害菌を抑制させる作用があることが明らかとなった。

（処方例１：軟膏）
常法に従って下記組成の軟膏を製造した。なお、発酵乳ホエイは、試験例２において、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株を用いて調製した発酵乳ホエイを使用した。
・発酵乳ホエイ・・・０．０５質量％
・塩化ベンザルコニウム・・・０．１質量％
・尿素・・・２０．０質量％
・白色ワセリン・・・１５．０質量％
・軽質流動パラフィン・・・６．０質量％
・セタノール・・・３．０質量％
・ステアリルアルコール・・・３．０質量％
・モノステアリン酸グリセリル・・・５．０質量％
・香料・・・適量
・防腐剤・・・適量
・緩衝剤・・・１．０質量％
・精製水・・・残部
全量１００．０質量％

（処方例２：ローション）
常法に従って下記組成のローションを製造した。なお、発酵乳ホエイは、試験例２において、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株を用いて調製した発酵乳ホエイを使用した。
・発酵乳ホエイ・・・５．０質量％
・乳酸・・・０．１質量％
・フルーツ酸・・・０．１質量％
・グリセリン・・・４．０質量％
・カオリン・・・１．０質量％
・カラミン・・・０．７質量％
・カンフル・・・０．２質量％
・エタノール・・・１４．０質量％
・香料・・・適量
・精製水・・・残部
全量１００．０質量％

（処方例３：クリーム）
常法に従って下記組成のクリームを製造した。なお、発酵乳ホエイは、試験例２において、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株を用いて調製した発酵乳ホエイを使用した。
・発酵乳ホエイ・・・８．０質量％
・天然ビタミンＥ・・・０．１質量％
・カンゾウフラボノイド・・・０．００５質量％
・固形パラフィン・・・５．０質量％
・ミツロウ・・・１０．０質量％
・ワセリン・・・１５．０質量％
・流動パラフィン・・・４１．０質量％
・１，３－ブチレングリコール・・・４．０質量％
・モノステアリン酸グリセリン・・・２．０質量％
・モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０）・・・２．０質量％
・各種アミノ酸・・・１．０質量％
・ホウ砂・・・０．２質量％
・防腐剤・・・適量
・香料・・・適量
・酸化防止剤・・・適量
・精製水・・・残部
全量１００．０質量％

（処方例４：乳液）
常法に従って下記組成の乳液を製造した。なお、発酵乳ホエイは、試験例２において、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株を用いて調製した発酵乳ホエイを使用した。
・発酵乳ホエイ・・・１．０質量％
・乳酸・・・２．０質量％
・ステアリルアルコール・・・０．５質量％
・硬化パーム油・・・３．０質量％
・流動パラフィン・・・３５．０質量％
・ジプロピレングリコール・・・６．０質量％
・ポリエチレングリコール（４００）・・・４．０質量％
・セスキオレイン酸ソルビタン・・・１．６質量％
・ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル・・・２．４質量％
・カルボキシビニルポリマー・・・１．５質量％
・水酸化カリウム・・・０．１質量％
・キレート剤・・・適量
・防腐剤・・・適量
・香料・・・適量
・精製水・・・残部
全量１００．０質量％

（処方例５：美容液）
常法に従って下記組成の美容液を製造した。なお、発酵乳ホエイは、試験例２において、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株を用いて調製した発酵乳ホエイを使用した。
・発酵乳ホエイ・・・３．０質量％
・フルーツ酸・・・０．５質量％
・ジプロピレングリコール・・・５．０質量％
・ポリエチレングリコール（４００）・・・５．０質量％
・エタノール・・・１０．０質量％
・カルボキシビニルポリマー・・・０．５質量％
・アルギン酸ナトリウム・・・０．５質量％
・水酸化カリウム・・・０．２質量％
・モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・・・１．０質量％
・モノオレイン酸ソルビット・・・０．５質量％
・オレイルアルコール・・・０．５質量％
・プラセンタエキス・・・０．２質量％
・酢酸ｄｌ－α－トコフェロール・・・０．２質量％
・香料・・・適量
・防腐剤・・・適量
・褪色防止剤・・・適量
・精製水・・・残部
全量１００．０質量％

ＦＥＲＭＢＰ－６０６０

Claims

ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）により乳を発酵させて得られる発酵乳ホエイを含むことを特徴とする皮膚細菌叢向上剤。
皮膚細菌叢の向上が、皮膚細菌叢における有用菌の割合の維持、有用菌の割合の増加、及び有害菌の割合の低減からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１に記載の皮膚細菌叢向上剤。
有害菌が、炎症を誘発する可能性を有する細菌である請求項２に記載の皮膚細菌叢向上剤。
ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ－６０６０）である請求項１から３のいずれかに記載の皮膚細菌叢向上剤。
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚細菌叢向上剤を含むことを特徴とする皮膚細菌叢向上用皮膚外用剤。