CN109536619A - 一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括实时荧光PCR反应体系，所述实时荧光PCR反应体系包括至少一种引物对及MGB探针。本发明还公开了一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法、引物对和探针及其应用。本发明所述试剂盒、引物对和探针应用于实时荧光PCR方法时具有简单快速、荧光本底信号弱、灵敏度更高，并且通过扩增曲线Ct值进行结果判定更加客观、重复性强的优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。
Description
本申请是申请日为2018年12月14日、申请号为201811534404.3、发明创造名称为“一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，包括鉴别引物对及荧光探针。
背景技术
近年来，随着药典标准的提高，多种生化原料粗品需明确动物种属来源。2016年10月19日，国家食品药品监督管理总局发布《药品生产质量管理规范生化药品附录(征求意见稿)》，其中第四十条关于种属鉴别提到，生化药品的原材料来源应相对稳定，应明确动物的种属及器官组织。必要时对原材料的动物种属进行鉴别。此征求意见稿已于2017年09月01日起实施。此处的“动物”是指非人动物。目前动物来源的生化原料药物有100多种，主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽等。
动物源性成分鉴别有物理学、化学、免疫学和分子生物学等方法。由于生产过程中的提取、纯化等工艺，不能用常规的理化方法来鉴别生化原料的种属来源，而分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)法具有快速、灵敏、特异性强的特点，已在肝素等生化药品或原料药的动物源性成分检测中有所应用。2014年FDA发布名为《多重荧光定量PCR检测原料药中反刍动物DNA用于监控肝素粗品质量》的指导原则，从肝素原料药中残留DNA的提取、纯化到反刍源性成分的实时荧光PCR检测各方面做了详细介绍。但鉴于肝素是一种多糖，指导原则中所述DNA提取方法不适用于蛋白类生化原料粗品，且指导原则所述方法仅可区分猪源性成分和反刍源性成分，而对于牛、羊等反刍源性成分无法进一步区分；另外，该实时荧光PCR检测试剂价格昂贵。专利申请CN 201710193080.0《鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对》中公开了一种常规PCR的检测方法，但是该方法检测过程繁琐，需通过电泳肉眼观测条带，结果判定受主观因素影响较大。
实时荧光定量PCR是一种常见的PCR技术，其主要是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的结果能够通过扩增曲线Ct值进行判定，更加客观，其与常规PCR相比，本身准确性和灵敏度就更高。其中，影响实时荧光定量PCR结果的关键之处在于所用引物对和探针的设计、以及引物对和探针之间的组成配合。如何设计出合适的引物和探针，所得结果的灵敏度与常规PCR方法相当或者更高，以及到底能够提高多少，这些都是不可预知的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有鉴别蛋白类生化原料粗品的检测方法检测过程繁琐、结果判定受主观因素影响较大、荧光本底信号强以及灵敏度不够高等缺陷，提供了一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用，特别是鉴别蛋白类生化原料粗品中动物、特别是偶蹄目动物源性成分的实时荧光PCR方法、试剂盒、引物对和探针。本发明所述试剂盒、引物对和探针应用于实时荧光PCR方法时具有简单快速、荧光本底信号弱、灵敏度更高，并且通过扩增曲线Ct值进行结果判定更加客观、重复性强的优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。
为了减弱荧光本底信号的强度，本发明人尝试采用实时荧光PCR来鉴别蛋白类生化原料粗品。本发明与专利申请CN201710193080.0均是针对相同靶基因设计的种属特异性引物，但专利申请CN201710193080.0中的引物和探针是针对基因序列的全长进行的设计，而实时荧光PCR要求扩增的片段长度在50-150bp，因此必须寻找一段长为100-200bp并且需要相对要保守的片段来设计引物与探针。猪和羊的靶向序列的同源性非常高，而越短的扩增片段引物的设计难度就越高。本发明人经过诸多试验和研究，终于寻找到合适的靶向片段，并且进行多种尝试之后，终于设计出能够达到优异效果的引物对和探针。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括实时荧光PCR反应体系，所述实时荧光PCR反应体系包括以下至少一种引物对及MGB(Minor Groove Binder，小沟结合)探针，
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.3所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.3所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，简称NFQ)；
和，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.6所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.6所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团；
和，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.9所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.9所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团。
较佳地，所述荧光基团为5-羧基荧光素(FAM)。
较佳地，所述实时荧光PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq酶。
本发明中，所述实时荧光PCR反应体系中Mg2+的浓度可为本领域常规，优选为2mM。
本发明中，所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度可为本领域常规，优选均为0.2mM。
本发明中，所述2’-脱氧核苷三磷酸可为本领域常规，即dNTP，通常是包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等在内的统称，N通常指代A、T、G、C等中的一种，A、T、G、C分别指代本领域常规的碱基。
本发明中，所述Taq酶的活力单位可为本领域常规，优选为0.025U/μl。
本发明中，所述引物对的浓度可为本领域常规，优选分别为10μmol/L。
本发明中，所述探针的浓度可为本领域常规，优选为10μmol/L。
在本发明某一较佳实施例中，所述PCR反应缓冲液为Ex Taq缓冲液，所述Taq酶为Takara Ex Taq酶。
较佳地，所述动物为偶蹄目动物；更佳地，所述偶蹄目动物为猪、牛和/或羊。
本发明中，所述蛋白类生化原料粗品指的是生物医药领域中，蛋白类生化药品的原材料。
较佳地，所述蛋白类生化原料粗品为糜蛋白酶原、垂体后叶颗粒或玻璃酸酶粗品。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，其包括以下步骤：
1)提取待检样品中的DNA；
2)利用上述试剂盒中的实时荧光PCR反应体系扩增上述DNA；
3)分析检测结果。
较佳地，上述步骤1)中所述DNA为使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒或GMO提取试剂盒提取获得。理论上说，与上述提取试剂盒提取原理相同的任何市售试剂盒均可用于本发明蛋白类生化原料粗品中残留DNA的提取。本发明用于提取蛋白类生化原料粗品DNA的试剂盒首先在裂解液中使用蛋白酶K消化降解药物蛋白，将与之结合的DNA释放出来，从而达到残留核酸的提取效果。
较佳地，上述步骤2)中所述实时荧光PCR反应体系扩增的反应程序为：(1)95℃预变性10s；(2)95℃变性5s；(3)70℃退火30s、并采集荧光；(4)步骤(2)-(3)循环40次。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的引物对和/或MGB探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，和/或，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.3所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.3所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团；
和/或，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，和/或，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.6所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.6所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团；
和/或，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，和/或，所述MGB探针包括序列如SEQ ID NO.9所示的核酸(即，该核酸的序列如SEQ ID NO.9所示)、荧光基团和非荧光淬灭基团。
较佳地，所述荧光基团为5-羧基荧光素。
较佳地，所述蛋白类生化原料粗品为糜蛋白酶原、垂体后叶颗粒或玻璃酸酶粗品。
较佳地，所述动物为偶蹄目动物；更佳地，所述偶蹄目动物为猪、牛和/或羊。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：上述引物对和/或MGB探针在鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述实时荧光PCR方法简单快速，所述试剂盒、引物对和探针应用于鉴别蛋白类生化原料粗品中时具有荧光本底信号弱、灵敏度更高，并且通过扩增曲线Ct值进行结果判定更加客观、重复性强的优点。利用本发明的方法通过实时荧光PCR扩增反应即可准确地鉴别蛋白类生化原料粗品的不同种属来源，特别能够区分反刍类源性动物如牛和羊的成分，在本发明某一较佳实施例中，本发明所述方法对猪、牛、羊源性成分的检测限均可达1pg，与背景技术中提到的专利申请CN201710193080.0的检测灵敏度(猪1pg、牛1pg、羊10pg)相比，羊源性检测成分检测灵敏度提高10倍。
附图说明
图1为猪源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图，其中水为阴性对照。
图2为牛源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图，其中水为阴性对照。
图3为羊源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图，其中水为阴性对照。
图4为猪源性引物及探针对猪阳性对照基因组DNA不同浓度梯度的扩增信号图。图中P4～P8浓度依次为100、10、1、0.1、0.01pg/μL。
图5为牛源性引物及探针对牛阳性对照基因组DNA不同浓度梯度的扩增信号图。图中B3～B8浓度依次为1000、100、10、1、0.1、0.01pg/μL。
图6为羊源性引物及探针对羊阳性对照基因组DNA不同浓度梯度的扩增信号图。图中S4～S7浓度依次为100、10、1、0.1pg/μL。
图7为实施例5中猪、牛、羊源性引物及探针检测糜蛋白酶原粗品中残留DNA的扩增信号图。
图8为实施例6中猪、牛、羊源性引物及探针检测垂体后叶颗粒粗品中残留DNA的扩增信号图。
图9为实施例7中猪、牛、羊源性引物及探针检测玻璃酸酶粗品中残留DNA的扩增信号图。
图10为对比例中猪源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图，其中水为阴性对照。
图11为对比例中牛源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图。
图12为对比例中羊源性引物及探针对猪、牛、羊阳性对照基因组DNA的实时荧光PCR扩增信号图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
用于PCR扩增反应的Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液以及脱氧核糖核苷三磷酸均购自大连宝生物有限公司。
实施例1原料粗品中残余的基因组DNA的提取
(1)本发明所述的实时荧光PCR方法中使用的基因组DNA可以为商购所得，或者使用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒B518251进行提取，其中样品处理量应为说明书所述量的10倍，这是因为粗品中残留DNA样本量一般较低，增加样品量以提取收集到适用于检测的DNA。具体步骤为：
将蛋白类生化原料粗品研磨成粉末，每250mg样品粉末加入1800μL细胞裂解液1，再加入200μL蛋白酶K溶液，震荡混匀后，56℃水浴2h至细胞完全裂解；(2)加入裂解液2000μL后充分颠倒混匀，70℃水浴10min；(3)水浴结束后，5000rpm离心5min，吸取上清液至新管；(4)在上清液中加入无水乙醇2000μL，充分颠倒混匀；(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；(6)若溶液体积较大，重复步骤(5)进行多次反复加载；(7)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液1(使用前按标示比例加入乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(8)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入乙醇)，10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；(9)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打开盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；(10)取出吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
实施例2实时荧光PCR扩增
(1)引物及探针设计
设计猪、牛、羊源性种属特异性引物及探针，分别为：
a.针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因EU623453.1设计引物对Sus及探针：
猪源正向引物：5’–AACCCCCCGCAATGTCTCAATAC–3’(详见SEQ ID NO.1)；
猪源反向引物：5’–GTTGCGGTCTGTCAGTAGTATAGTAATG–3’(详见SEQ ID NO.2)；
猪源荧光探针：5’–MGB-FAM–TGGCAGGGATAGTAGAAGT–NFQ–3’(核酸序列详见SEQ IDNO.3)。
b.针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因DQ487094.1设计引物对Bos及探针：
牛源正向引物：5’–TCTACTGAAGCTCCTGCATGGG–3’(详见SEQ ID NO.4)；
牛源反向引物：5’–ATAGTTGAAGCTGGGGCAGGAA–3’(详见SEQ ID NO.5)；
牛源荧光探针：5’–MGB-FAM–AGGGTACACGGTTCAGCCTG–NFQ–3’(核酸序列详见SEQID NO.6)。
c.针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因EU834864.1设计引物对Ovis及探针：
羊源正向引物：5’–AACCCCCTGCGATGTCACAGTAT–3’(详见SEQ ID NO.7)；
羊源反向引物：5’–GTTTCGGTCCGTTAGTAGTATTGTGATA–3’(详见SEQ ID NO.8)；
羊源荧光探针：5’–MGB-FAM–AGGAAGTGAGAGAAGGAGA–NFQ–3’(核酸序列详见SEQ IDNO.9)。
(2)实时荧光PCR扩增
a.实时荧光PCR反应体系
以实施例1所得的待测样品残留基因组DNA为模板，采用上述设计的猪、牛、羊源性种属特异性引物及探针分别进行实时荧光PCR扩增，反应体系见表1：
表1.反应体系
| DNA模板 | 1μL |
| 正向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 反向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 荧光探针(10μmol/L) | 1μL |
| 2×premix Taq(Ex Taq version 2.0) | 12.5μL |
| 双蒸水 | 至25μL |
b.实时荧光PCR扩增程序
①95℃预变性10s；②95℃变性5s：③70℃退火30s并采集荧光；④步骤②-③循环40次。
(3)结果判定
结果判定标准如表2所示。
表2.结果判定标准
实施例3猪、牛、羊源性引物及探针分别对猪、牛、羊阳性基因组DNA进行PCR扩增
猪、牛、羊基因组DNA为Zyagen公司产品PG-313、BG-313、SG-313，浓度为1000ng/μL。其中，猪、羊基因组DNA用双蒸水稀释成浓度为100pg/μL，牛基因组DNA稀释为1000pg/μL。作为DNA模板；设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板(结果图中简称为“水”)。
(1)实时荧光PCR扩增
采用上述DNA模板，实施例2中的引物及探针、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增，所用引物和荧光探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)扩增结果
本发明设计的猪、牛、羊源性成分鉴别引物及探针仅对相应物种的基因组DNA进行扩增，对另外两个物种无扩增，结果分别如图1、2、3所示，相应的Ct值如表3所示。从表3和图1、2、3中可以看出，本发明所述方法检测结果准确，具有特异性。
表3
“-”表示未检测到任何荧光信号，显示Undetermined。
实施例4猪、牛、羊源性引物及探针分别对猪、牛、羊基因组DNA的检测灵敏度实验
(1)DNA模板的配制：
将实施例3中所述的猪、牛、羊基因组DNA用双蒸水进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释液浓度依次为：1000、100、10、1、0.1、0.01pg/μL的DNA模板；同时设置空白对照，用1μL双蒸水代替DNA模板。
(2)实时荧光PCR扩增：采用(1)中的DNA模板，实施例2中的引物、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(3)扩增结果：
本发明设计的猪源特异性引物及探针对猪基因组DNA的检测限为1pg，牛源特异性引物及探针对牛基因组DNA的检测限为1pg，羊源特异性引物及探针对羊基因组DNA的检测限为1pg，结果分别如图4、5、6所示，相应的Ct值如表4、5、6所示。
表4
表5
表6
由图中可以看出，本发明所述方法检测结果具有较高的灵敏度。本发明检测限猪、牛、羊均为1pg，与背景技术中提到的专利申请CN201710193080.0的检测灵敏度(猪1pg、牛1pg、羊10pg)相比，羊源性检测成分检测灵敏度提高10倍，而牛源、猪源的灵敏度与其相当。
实施例5糜蛋白酶原粗品中猪、牛、羊源性动物成分的检测
(1)牛源糜蛋白酶原粗品中残留基因组DNA的提取
使用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒B518251进行提取，其中样品处理量应为说明书所述量的10倍，这是因为粗品中残留DNA样本量一般较低，增加样品量以提取收集到适用于检测的DNA。具体步骤为：①将糜蛋白酶原粗品(市售牛源产品)研磨成粉末，称取250mg样品粉末加入1800μL细胞裂解液1，再加入200μL蛋白酶K溶液，震荡混匀后，56℃水浴2h至细胞完全裂解；②加入2000μL裂解液2后充分颠倒混匀，70℃水浴10min；③水浴结束后，5000rpm离心5min，吸取上清液至新管；④在上清液中加入2000μL无水乙醇，充分颠倒混匀；⑤将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；⑥若溶液体积较大，重复步骤⑤进行多次反复加载；⑦将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液1(使用前按标示比例加入乙醇)。10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；⑧将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL洗液2(使用前按标示比例加入乙醇)。10000rpm离心30s，倒掉收集管废液；⑨将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的洗液2，将吸附柱打开盖子于室温中放置20min，以彻底晾干吸附材料中残留的洗液2；⑩取出吸附柱，放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
(2)实时荧光PCR扩增：采用(1)中所得DNA模板，实施例2中的引物及探针、PCR体系以及扩增程序进行PCR扩增。
(3)扩增结果：
本发明设计的种属特异性引物及探针检测糜蛋白酶原粗品为牛源，无猪、羊源性成分污染，结果如图7所示，其中牛源引物探针检测糜蛋白酶原粗品Ct值为27.02；羊源引物探针检测Ct值为-；猪源引物探针检测Ct值为35.83。因此，根据本发所述方法检测糜蛋白酶原粗品为牛源。
实施例6垂体后叶颗粒粗品中猪、牛、羊源性动物成分的检测
猪源垂体后叶颗粒粗品(市售猪源产品)中残留基因组DNA的提取和实时荧光PCR扩增步骤均与参照实施例5中的(1)和(2)，本发明设计的种属特异性引物及探针检测垂体后叶颗粒粗品为猪源，无牛、羊源性成分污染，结果如图8所示，其中猪源引物探针检测垂体后叶颗粒Ct值为26.55；牛源引物探针检测Ct值为“-”；羊源引物探针检测Ct值为38.08。因此，根据本发所述方法检测垂体后叶颗粒粗品为猪源。
实施例7玻璃酸酶粗品中猪、牛、羊源性动物成分的检测
羊源玻璃酸酶粗品(市售羊源产品)中残留基因组DNA的提取和实时荧光PCR扩增步骤均与参照实施例5中的(1)和(2)，本发明设计的种属特异性引物及探针检测玻璃酸酶粗品为羊源，无牛、猪源性成分污染，结果如图9所示。羊源引物探针检测玻璃酸酶粗品Ct值为28.32；牛源性引物探针检测Ct值为38.47；猪源性引物探针检测Ct值为-。因此，根据本发所述方法检测玻璃酸酶粗品为羊源。
同理，本发明的上述检测方法也可用于检测禽类、马、驴等动物源性的生化原料粗品样品中是否混有猪、牛、羊源性成分，在此不具体赘述。
对比例：
针对上述细胞色素氧化酶亚基I相同靶基因分别设计的其它引物和探针，具体为：
猪源
猪源正向引物：5’-GCCTTTCCACGTATAAAC-3’(详见SEQ ID NO.10)
猪源反向引物：5’-GGGTATACAGTTCATCCA-3’(详见SEQ ID NO.11)
猪源探针：5’-FAM-TTCTGACTACTTCCACCATCCTTCC-Eclipse-3’(核酸序列详见SEQID NO.12)
牛源
牛源正向引物：5’-GAGAGTAGTAGTAGTACGG-3’(详见SEQ ID NO.13)
牛源反向引物：5’-GCCATCAACTTCATTACA-3’(详见SEQ ID NO.14)
牛源探针：5’-FAM-CCCCGCAATGTCACAATACCAAA-Eclipse-3’(核酸序列详见SEQ IDNO.15)
羊源
羊源正向引物：5’-CCTTGTTTGTATGATCTGTA-3’(详见SEQ ID NO.16)
羊源反向引物：5’-GGTTGTATTCAGGTTTCG-3’(详见SEQ ID NO.17)
羊源探针：5’-FAM-CGTACTTCTCCTTCTCTCACTTCCTG-Eclipse-3’(核酸序列详见SEQID NO.18)
采用实施例3的DNA模板，并且采用上述猪、牛、羊源性种属特异性引物及探针分别进行实时荧光PCR扩增，所用模板DNA为浓度为100ng/ml的猪、牛、羊标准DNA。反应体系见表7：
表7.反应体系
| DNA模板 | 1μL |
| 正向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 反向引物(10μmol/L) | 1μL |
| 荧光探针(10μmol/L) | 1μL |
| 2×premix Taq(Ex Taq version 2.0) | 12.5μL |
| 双蒸水 | 至25μL |
b.实时荧光PCR扩增程序
①95℃预变性10s；②95℃变性5s：③70℃退火30s并采集荧光；④步骤②-③循环40次。
结果如图10～12所示，由图中可见，荧光背景信号过高，并且荧光扩增曲线升高幅度低，扩增反应效果微弱，无法用于检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海上药第一生化药业有限公司
<120> 一种试剂盒、方法、引物对和探针及其应用
<130> P180117564CD
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源正向引物
<400> 1
aaccccccgc aatgtctcaa tac 23
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源反向引物
<400> 2
gttgcggtct gtcagtagta tagtaatg 28
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源荧光探针中的核酸序列
<400> 3
tggcagggat agtagaagt 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源正向引物
<400> 4
tctactgaag ctcctgcatg gg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源反向引物
<400> 5
atagttgaag ctggggcagg aa 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源荧光探针中的核酸序列
<400> 6
agggtacacg gttcagcctg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源正向引物
<400> 7
aaccccctgc gatgtcacag tat 23
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源反向引物
<400> 8
gtttcggtcc gttagtagta ttgtgata 28
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源荧光探针中的核酸序列
<400> 9
aggaagtgag agaaggaga 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源正向引物
<400> 10
gcctttccac gtataaac 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源反向引物
<400> 11
gggtatacag ttcatcca 18
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 猪源探针中的核酸序列
<400> 12
ttctgactac ttccaccatc cttcc 25
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源正向引物
<400> 13
gagagtagta gtagtacgg 19
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源反向引物
<400> 14
gccatcaact tcattaca 18
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 牛源探针中的核酸序列
<400> 15
ccccgcaatg tcacaatacc aaa 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源正向引物
<400> 16
ccttgtttgt atgatctgta 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源反向引物
<400> 17
ggttgtattc aggtttcg 18
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羊源探针中的核酸序列
<400> 18
cgtacttctc cttctctcac ttcctg 26
Claims (10)
1.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的引物对和/或MGB探针，其特征在于，所述引物对包括鉴别猪源性成分的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；
和/或，所述MGB探针包括鉴别猪源性成分的序列如SEQ ID NO.3所示的核酸、荧光基团和非荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的引物对和/或MGB探针，其特征在于，所述引物对还包括鉴别牛源性成分的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对；
和/或，所述MGB探针还包括鉴别牛源性成分的序列如SEQ ID NO.6所示的核酸、荧光基团和非荧光淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的引物对和/或MGB探针，其特征在于，所述荧光基团为5-羧基荧光素。
4.如权利要求1～3任一项所述的引物对和/或MGB探针，其特征在于，所述蛋白类生化原料粗品为糜蛋白酶原、垂体后叶颗粒或玻璃酸酶粗品。
5.如权利要求1～4任一项所述的引物对和/或MGB探针，其特征在于，所述动物为偶蹄目动物，优选猪和/或牛。
6.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括实时荧光PCR反应体系，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系包括如权利要求1～5任一项所述的引物对和/或MGB探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq酶；较佳地：
所述实时荧光PCR反应体系中Mg2+的浓度为2mM；
和/或，所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度均为0.2mM；
和/或，所述Taq酶的活力单位为0.025U/μl；
和/或，所述引物对的浓度分别为10μmol/L；
和/或，所述探针的浓度为10μmol/L。
8.一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)提取待检样品中的DNA；
2)利用如权利要求6或7所述试剂盒中的实时荧光PCR反应体系扩增上述DNA；
3)分析检测结果；
较佳地，步骤1)中所述DNA为使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒或GMO提取试剂盒提取获得。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述实时荧光PCR反应体系扩增的反应程序为：(1)95℃预变性10s；(2)95℃变性5s；(3)70℃退火30s、采集荧光；(4)步骤(2)-(3)循环40次。
10.如权利要求1～5任一项所述的引物对和/或MGB探针在鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024017382A1 (zh) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 中国食品药品检定研究院 | 检测猪源dna的引物及检测方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112029830A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-04 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种提高pcr鉴定蛋白类生化原料粗品中猪牛羊源成分灵敏度的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080113349A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-05-15 | Pranvera Ikonomi | Method for detecting the presence of mammalian organisms using specific cytochrome c oxidase I (COI) and/or cytochrome b subsequences by a PCR based assay |
| CN103757116A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-04-30 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针 |
| CN105177150A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-23 | 上海市农业科学院 | 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法 |
| CN105755149A (zh) * | 2016-04-30 | 2016-07-13 | 江苏省家禽科学研究所 | 基于线粒体coⅰ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别pcr专用引物对及pcr鉴定方法和试剂盒 |
| CN105803100A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-27 | 中国科学院微生物研究所 | 用于鉴定哺乳动物肉类的引物及方法 |
| CN106967802A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 上海上药第生化药业有限公司 | 鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对 |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080113349A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-05-15 | Pranvera Ikonomi | Method for detecting the presence of mammalian organisms using specific cytochrome c oxidase I (COI) and/or cytochrome b subsequences by a PCR based assay |
| CN103757116A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-04-30 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针 |
| CN105177150A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-23 | 上海市农业科学院 | 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法 |
| CN105755149A (zh) * | 2016-04-30 | 2016-07-13 | 江苏省家禽科学研究所 | 基于线粒体coⅰ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别pcr专用引物对及pcr鉴定方法和试剂盒 |
| CN105803100A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-27 | 中国科学院微生物研究所 | 用于鉴定哺乳动物肉类的引物及方法 |
| CN106967802A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 上海上药第生化药业有限公司 | 鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对 |
| CN108624659A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-10-09 | 武汉轻工大学 | 一种检测肉类制品成分的实时定量pcr方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 国家认证认可监督委员会编: ""高致病性禽流感病毒荧光RT-PCR定性检测能力验证报告"", 《国家认监委实验室能力验证技术报告汇编 2006年》 * |
| 朱水芳 等: ""实时荧光聚合酶链反应PCR检测技术"", 《实时荧光聚合酶链反应PCR检测技术》 * |
| 李伟 等: ""三、荧光定量PCR的方法"", 《分子诊断学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024017382A1 (zh) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 中国食品药品检定研究院 | 检测猪源dna的引物及检测方法 |
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