CN108285923A - 一种基因转录产物的检测方法及其应用 - Google Patents

一种基因转录产物的检测方法及其应用 Download PDF

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CN108285923A CN201710014481.5A CN201710014481A CN108285923A CN 108285923 A CN108285923 A CN 108285923A CN 201710014481 A CN201710014481 A CN 201710014481A CN 108285923 A CN108285923 A CN 108285923A
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谢建辉
张雅琪
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Fudan University
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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种基因转录产物的检测方法及其应用，本发明采用同时检测人同一基因的信使RNA和环状RNA表达的检测方法，能显著提高被检测基因的稳定性，和显著提高检测的敏感性，本方法可以广泛用于法医学生物检材组织来源鉴定的检测，具有非常高的法医学价值。

Description

一种基因转录产物的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种基因转录产物的检测方法及其应用。
背景技术
在法医学领域，生物检材的组织/体液来源鉴定是法医学检测的重要环节。犯罪现场遗留的生物检材的来源鉴定可以有助于推断案件发生过程和重建现场，为案件的性质定性。如在一些可疑性犯罪案件中，只进行DNA分型不足以将案件定性为性犯罪，如果能确证有精液和阴道分泌液的成分，则可为案件的定性提供强有力的证据。
现有技术公开了法医学鉴定体液来源的方法很多，早期的方法是基于酶促反应或免疫学检测，其方法通常快速/简便，但是需要的检材量大/耗时/特异性敏感性差，且检测结果依赖操作者的水平和经验。目前主要有三种体液鉴定的方法，是基于三种不同的遗传标记，其中，第一种，信使RNA检测法，是目前研究最为广泛且已被用于体液鉴定；现已发现很多体液相关特异表达且表达量高的生物标记分子，此方法具有很大的优点，可以同时提取DNA和RNA，节省检材，而通常法医检案都是微量检材；另外可以进行多重复合扩增反应，同时检测多种体液标记分子，短时间内获得更多信息量；但是信使RNA存在有致命的缺点，就是容易降解，而法医检材通常是降解/陈旧的检材；第二种，微小RNA（microRNA）检测法，microRNA是一类非编码小分子RNA，长度约18-25个核苷酸，很短，研究表明其不易降解，解决了信使RNA容易降解的问题，且其具有组织/细胞特异性表达的特性；但是由于太短，不能进行复合扩增；第三种，DNA甲基化标记检测法，DNA甲基化是碱基的复制后共价修饰，是储存表观遗传学信息的主要形式；但是此法消耗DNA，微量检材不适用，同时机体DNA甲基化受到很多因素影响，如年龄；研究发现随年龄增长，基因甲基化水平总体下降，但是某些特定的DNA甲基化却增高。因此业内需要一个更加稳定、敏感且简便的检测方法。
环形RNA（circular RNA，circRNA）是最近报道的一类非编码小RNA分子，circRNA是在pre-mRNA剪切过程中，外显子的5'端与3'端以反向剪切（backsplicing）形式形成3',5'磷脂键连接的环形RNA，广泛存在于哺乳动物的各种不同类型的细胞中。目前该技术领域对于circRNA的功能研究较少，现有的研究表明，circRNA具有micro分子海绵、调控基因表达等功能，并与细胞功能和疾病具有密切作用。circRNA有如下特点：1）环形结构，无3’末端poly A尾，无5’末端加帽结构；2）耐受RNase R 的降解；3）组织/细胞特异性表达；4）含量丰富；这些特征使得circRNA可能在法医学领域是一类非常理想的生物标记分子。由于circRNA的稳定性和组织表达特异性，可以使之运用于体液鉴定，特别地，对于陈旧检材、降解检材和微量检材检测可能更具有优越性。
δ氨乙酰丙酸合成酶2（δ-aminolevulinatesynthase 2，ALAS2）是外周血特异表达的基因，以往的研究使用ALAS2的信使RNA用于外周血的鉴定。基质金属蛋白酶7（matrixmetallopeptidase 7，MMP7）是月经血特异表达的基因，以往的研究使用MMP7的信使RNA用于月经血的鉴定。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基因转录产物的检测方法及其应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的限制，提供一种灵敏性更高的法医学生物检材组织来源的检测方法，具体涉及一种同时检测人同一基因的信使RNA和环状RNA表达的检测方法，该方法可以应用于法医学生物检材组织来源的检测。
本发明基于发明人在长期的研究中发现同时检测信使RNA和环状RNA可以提高法医学生物检材组织来源的鉴别能力，特别是对于陈旧检材、降解检材和微量检材具有非常高的鉴别能力。
本发明通过鉴定ALAS2的信使RNA和环状RNA共同含有的核酸区域及MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有的核酸区域，并针对共同含有的核酸区域分别设计特异性检测引物，用于生物检材组织来源的鉴定。
本发明的第一个方面是提供一种基因转录产物的检测方法，使用引物对对同一基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测。
作为优选的方案，本发明所述的基因转录产物的检测方法，所述的引物对是根据同一基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域来设计的，并通过聚合酶链反应筛选获得。
本发明所述的基因转录产物的检测方法是通过聚合酶链反应检测ALAS2和/或MMP7的信使RNA和环状RNA表达，尤其是同时检测ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA表达，用于提高基因表达检测的检测能力。除ALAS2和/或MMP7外，还可以进一步检测血红蛋白亚基α（HBA）、红蛋白亚基β（HBB）、基质金属蛋白酶10（MMP10）、基质金属蛋白酶11（MMP11）、左右决定因子2（LEFTY2）基因中的一种或多种。
作为进一步优选的方案，所述的检测方法中引物对为SEQ ID NO: 1和/或SEQ IDNO: 2。
作为更进一步优选的方案，所述引物对为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
作为更进一步优选的方案，所述的检测方法中所述的核酸序列区域为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO: 4。
作为更进一步优选的方案，所述的核酸序列区域为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4。
作为更进一步优选的方案，使用SEQ ID NO: 1引物对对ALAS2转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述的核酸序列区域为SEQ ID NO: 3。
作为更进一步优选的方案，使用SEQ ID NO: 2引物对对MMP7转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述的核酸序列区域为SEQ ID NO: 4。
作为更进一步优选的方案，本发明所述的基因转录产物的检测方法每个引物对中至少有一条引物的5’端被荧光分子标记。
作为更进一步优选的方案，本发明所述的基因转录产物的检测方法中荧光分子选自Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6’-FAM。
作为一种最优选的方案，使用SEQ ID NO: 1引物对和SEQ ID NO: 2引物对分别对ALAS2和MMP7转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述共同含有的核酸序列区域分别为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4，
具体的，本发明的检测方法，其包括步骤：
1）首先通过生物信息学和分子生物学方法等鉴定ALAS2和MMP7各自的信使RNA和环状RNA共同含有的核酸序列区域，本发明中ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有的核酸序列区域分别为SEQ No: 3和SEQ No: 4；
2）针对1）获得的共同含有的核酸序列区域设计引物，进一步通过聚合酶链反应筛选获得ALAS2和MMP7的特异性引物；本发明中ALAS2和MMP7的特异性引物对分别为SEQ No: 1和SEQ No: 2；
3）分别合成ALAS2和MMP7的特异性引物对，同一基因引物对中的一条或两条的5’端是使用了荧光分子标记，荧光分子可以是Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6’-FAM；
4）使用3）获得引物对分别对ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA进行检测，并与常规的信使RNA检测方法进行对比。
同时检测ALAS2和/或MMP7的信使RNA和环状RNA表达的应用，可以大大提高法医学生物检材组织来源鉴定的鉴别能力。
本发明的第二个方面提供一种引物组合物，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO:2。
作为优选的方案，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和SEQ IDNO:2。
本发明的第三个方面提供一种引物组合物在法医学基因检测中的应用，通过所述引物组合物对ALAS2和/或MMP7基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测。
本发明的第四个方面提供一种包含检测ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA的引物组合物的试剂盒。
作为优选的方案，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和/或SEQID NO:2。
作为进一步优选的方案，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
作为更进一步优选的方案，所述试剂盒进一步包含PCR扩增相关试剂。
作为更进一步的优选方案，所述试剂盒在法医鉴定核酸样品分析中的应用。
作为更进一步的优选方案，所述核酸样品可来自于血液、血斑、月经血、月经血斑及含有血液或月经血的混合物、混合斑。
与现有技术相比，本发明公开的同时检测信使RNA和环形RNA的方法用于法医学检材的组织来源鉴定具有显著优势，特别是对于陈旧检材、降解检材及微量检材具有很高的鉴别能力，可以被广泛地应用于法医学检材的组织来源鉴定等法医实践工作中，具有非常高的法医学应用价值。
附图说明
1、图1为ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有区域（方框区域内）。
2、图2为ALAS2和MMP7的环状RNA的表达百分比分析。
3、图3为评估同时检测ALAS2和MMP7的信使RNA和环状RNA方法的检测敏感性。
4、图4为使用同时检测MMP7的信使RNA和环状RNA的引物检测降解检材。
5、图5为3基因复合扩增法检测精液、外周血和月经血三种生物检材。
具体实施方式
虽然发明内容部分已将本发明的原理进行了详细的描述，应该清楚地理解的是，下面将结合具体的实施方式进一步阐明本发明的技术内容，所述实施例不是意在限制本发明的保护范围，而是意图更加详尽地公开本发明的技术内容。如果任何的修改和/或改变对本领域的技术人员来说是显而易见的，也将包含在本发明的构思之中。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1 同时检测同一基因转录的信使RNA和环状RNA方法的建立
（一）ALAS2、MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有区域的确定
首先通过生物信息学方法确定ALAS2、MMP7的外显子结构（如图1所示），根据ALAS2、MMP7的外显子序列设计一系列向外型引物（outward-facing primers）进行聚合酶链反应。外周血和月经血的总RNA通过常规试剂盒抽提并使用紫外分光光度计定量。总RNAs使用试剂盒含有的随机引物进行反转录获得cDNA，以此作为模板进行聚合酶链反应。扩增产物通过琼脂糖凝胶分离，并通过DNA纯化试剂盒回收扩增产物。回收的扩增产物连接T载体，并通过Sanger测序确证环状RNA3’和5’连接的位置，以此确定环状RNA含有核酸序列区域。通过上述一系列的实验，最终确定ALAS2、MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有区域的为图1黑色方框内区域，它们的核酸序列分别为是SEQ ID NO: 3和是SEQ ID NO: 4。
（二）特异性引物设计及环状RNA含量评估
根据ALAS2、MMP7的信使RNA和环状RNA共同含有区域的核酸序列，使用Primer5软件分别设计引物，并通过生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。通过聚合酶链反应对ALAS2、MMP7的引物特异性进行筛选，最终确定ALAS2、MMP7的特异性引物序列分别为SEQ IDNO: 1和是SEQ ID NO: 2。本发明中，我们将SEQ ID NO: 1和是SEQ ID NO: 2分别命名为LC-ALAS2和LC-MMP7。
一对引物的任一一条不在信使RNA和环状RNA共同含有区域，都不能检测环状RNA，只能检测信使RNA；不位于信使RNA和环状RNA共同含有区域的特异性引物序列来自于文献报道（Forensic Sci Int Genet. 2011;5(5):449-58; Forensic Sci Int Genet. 2012;6(5):565-77），并利用这一特性检测信使RNA含量。利用位于信使RNA和环状RNA共同含有区域的引物检测信使RNA和环状RNA的总量，通过计算可以得出环状RNA含量的百分比。
外周血和月经血的cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测并经image J 软件分析。结果表明四个个体中平均ALAS2基因的环状RNA占总RNA的30%左右，MMP7基因的环状RNA占总RNA的40%左右（如图2所示）。
实施例2 同时检测同一基因转录的信使RNA和环状RNA方法的应用
首先我们对同时检测同一基因转录的信使RNA和环状RNA方法对于基因表达检测敏感性方面进行调查，并使用文献报道的引物作为对照。文献（Forensic Sci Int Genet.2011;5(5):449-58）报道的ALAS2引物为正向：TGTGTCCGTCTGGTGTAGTA、反向：AAACTTACTGGTGCCTGAGA。文献（Forensic Sci Int Genet. 2012; 6(5):565-77）报道的MMP7引物为正向：GAACAGGCTCAGGACTATCTC、反向：TAACATTCCAGTTATAGGTAGGCC。
首先通过系列稀释的方法进行敏感性研究，外周血和月经血来源的总RNA浓度梯度系列范围为0.2ng-0.003ng，每组浓度的RNA分别通过随机引物反转成cDNA待用。每对引物中的一条引物的5’端标记6-FAM荧光分子。以上述的cDNA作为模板，分别使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增。PCR产物进行毛细管电泳和使用GeneMapper® ID软件分析，以分子量标准物CC5（Promega公司）作为确定PCR产物的大小（序列所含碱基个数），RFUs>100为检测线。结果如表1所示，与文献（Forensic Sci Int Genet. 2011;5(5):449-58;Forensic Sci Int Genet. 2012; 6(5):565-77）报道的只检测信使RNA的引物相比，使用同时检测信使RNA和环状RNA的引物明显提高了检测能力，在非常微量的情况下，能检测到的阳性结果个数明显要多。
表1系列稀释法评估同时检测信使RNA和环状RNA 方法的鉴定能力
另外一种评估敏感性的方法采用混合法，稀释混合外周血和精液RNA，使外周血与精液RNA的浓度比为1：100；稀释混合月经血和精液RNA，使月经血与精液RNA的浓度比为1：100。将上述混合RNA分别使用随机引物反转录生成cDNA，再分别用相应的荧光标记引物进行PCR扩增，通过毛细管电泳和使用GeneMapper分析。结果如图3所示，与文献（Forensic Sci IntGenet. 2011;5(5):449-58; Forensic Sci Int Genet. 2012; 6(5):565-77）报道的只检测信使RNA的引物相比，使用同时检测信使RNA和环状RNA的引物的靶基因的峰高明显要高，明显提高了检测能力。
对降解生物检材进行研究，人月经血做降解处理：剪取卫生巾上小片置于37度恒温箱中1天、4天、8天、13天、18天。每个时间段分别抽提RNA、使用随机引物反转、用相应荧光标记引物进行PCR扩增、毛细管电泳分离和使用GeneMapper检测分析。如图4所示，在未降解样品中，使用同时检测信使RNA和环状RNA的引物检测具有更高的峰值。在降解13天和18天，使用同时检测信使RNA和环状RNA的引物检测能够明显检测到阳性峰。因此同时检测信使RNA和环状RNA方法在降解检材检测中具有更高的鉴别能力。
对陈旧血痕进行鉴定研究，取11份人血痕样品，每份样品在室温干燥环境下保存，其保存时间如表2。分别抽提RNA、使用随机引物反转、用相应荧光标记的引物进行PCR扩增、毛细管电泳分离、GeneMapper检测分析。结果如表2所示，11份样本中，使用文献（ForensicSci Int Genet. 2011;5(5):449-58）报道的只检测信使RNA的引物进行检测都为阴性结果，使用同时检测信使RNA和环状RNA的引物进行检测都为阳性结果，进一步证实同时检测信使RNA和环状RNA能够明显提高鉴定能力。
表2使用同时检测信使RNA和环状RNA方法对陈旧血痕的鉴定
陈旧血痕 时间（月） 文献引物* LC-ALAS2
1 82 阴性 1129
2 69 阴性 1136
3 78 阴性 733
4 73 阴性 2421
5 71 阴性 945
6 78 阴性 1045
7 74 阴性 947
8 81 阴性 1164
9 74 阴性 1553
10 69 阴性 2353
11 74 阴性 964
*相对荧光单位
实施例3 通过复合扩增法对生物检材的检测鉴定
在一个PCR 体系中同时扩增多个靶位点，不仅提高单次检测的信息量，同时也减少了检材的使用量。本发明通过一个PCR 体系中同时检测ALAS2、MMP7和18S rRNA，构建3基因的复合扩增对生物检材的进行鉴定，其中18S rRNA作为内标，ALAS2作为外周血的特异生物标记，MMP7为月经血的生物标记，在同一PCR 体系中，引物终浓度如表3所示。
表3复合扩增中各引物的浓度
PCR反应条件为：94℃/5分钟→28个循环（94℃/30秒，58℃/30秒，72℃/40秒）→72℃/10分钟→4℃保持。
聚合酶链反应产物经毛细管电泳检测发现，人外周血和月经血中都表达ALAS2，但是MMP7仅在月经血中表达，在人外周血中不表达。而精液中都没有检测到ALAS2和MMP7的表达（如图5所示）；此外，人唾液和男性尿液也没有检测到ALAS2和MMP7的表达，因此，LC-ALAS2可用于鉴定人血液成分，LC-MMP7可用于鉴定人月经血成分。
以上所述的实施例，只是本发明较优的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
序列表
SEQ ID NO: 1
F: ACCTTCGTGGATGAGGTCCAT
R: CACGGGTGCTGGCAATGTAG
SEQ ID NO: 2
F: GTCATAGAAATAATGCAGAAGCCC
R: CAGTTCCCCATACAACTTTCCTG
SEQ ID NO: 3
GTGCCATCTGTCCCCTCGAGGAGTTGTGTGATGTGTCCCACCAGTATGGGGCCCTGACCTTCGTGGATGAGGTCCATGCTGTAGGACTGTATGGGTCCCGGGGCGCTGGGATTGGGGAGCGTGATGGAATTATGCATAAGATTGACATCATCTCTGGAACTCTTGGCAAGGCCTTTGGCTGTGTGGGCGGCTACATTGCCAGCACCCGTGACTTGGTGGACATGGTGCGCTCCTATGCTGCAGGCTTCATCTTTACCACTTCTCTGCCCCCCATGGTGCTCTCTGGAGCTCTAGAATCTGTGCGGCTGCTCAAGGGAGAGGAGGGCCAAGCCCTGAGGCGAGCCCACCAGCGCAATGTCAAGCACATGCGCCAGCTACTCATGGACAGGGGCCTTCCTGTCATCCCCTGCCCCAGCCACATCATCCCCATCCGGGTGGGCAATGCAGCACTCAACAGCAAGCTCTGTGATCTCCTGCTCTCCAAGCATGGCATCTATGTGCAGGCCATCAACTACCCAACTGTCCCCCGGGGTGAAGAGCTCCTGCGCTTGGCACCCTCCCCCCACCACAGCCCTCAGATGATGGAAGATTTTGTGGAGAAGCTGCTGCTGGCTTGGACTGCGGTGGGGCTGCCCCTCCAGGATGTGTCTGTGGCTGCCTGCAATTTCTGTCGCCGTCCTGTACACTTTGAGCTCATGAGTGAGTGGGAACGTTCCTACTTCGGGAACATGGGGCCCCAGTATGTCACCACCTATGCCTGA
SEQ ID NO: 4
CCCGCGTCATAGAAATAATGCAGAAGCCCAGATGTGGAGTGCCAGATGTTGCAGAATACTCACTATTTCCAAATAGCCCAAAATGGACTTCCAAAGTGGTCACCTACAGGATCGTATCATATACTCGAGACTTACCGCATATTACAGTGGATCGATTAGTGTCAAAGGCTTTAAACATGTGGGGCAAAGAGATCCCCCTGCATTTCAGGAAAGTTGTATGGGGAACTGCTGACATCATGATTGGCTTTGCGCGAGGAGCTCATGGGGACTCCTACCCATTTGATGGGCCAGGAAACACGCTGGCTCATGCCTTTGCGCCTGGGACAGGTCTCGGAGGAGATGCTCACTTCGATGAGGATGAACGCTGGACGGATGGTAGCAGTCTAG
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种基因转录产物的检测方法及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物对1 F
<400> 1
accttcgtgg atgaggtcca t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对1 R
<400> 2
cacgggtgct ggcaatgtag 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对2 F
<400> 3
gtcatagaaa taatgcagaa gccc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对2 R
<400> 4
cagttcccca tacaactttc ctg 23
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> ALAS2转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域
<400> 5
gtgccatctg tcccctcgag gagttgtgtg atgtgtccca ccagtatggg gccctgacct 60
tcgtggatga ggtccatgct gtaggactgt atgggtcccg gggcgctggg attggggagc 120
gtgatggaat tatgcataag attgacatca tctctggaac tcttggcaag gcctttggct 180
gtgtgggcgg ctacattgcc agcacccgtg acttggtgga catggtgcgc tcctatgctg 240
caggcttcat ctttaccact tctctgcccc ccatggtgct ctctggagct ctagaatctg 300
tgcggctgct caagggagag gagggccaag ccctgaggcg agcccaccag cgcaatgtca 360
agcacatgcg ccagctactc atggacaggg gccttcctgt catcccctgc cccagccaca 420
tcatccccat ccgggtgggc aatgcagcac tcaacagcaa gctctgtgat ctcctgctct 480
ccaagcatgg catctatgtg caggccatca actacccaac tgtcccccgg ggtgaagagc 540
tcctgcgctt ggcaccctcc ccccaccaca gccctcagat gatggaagat tttgtggaga 600
agctgctgct ggcttggact gcggtggggc tgcccctcca ggatgtgtct gtggctgcct 660
gcaatttctg tcgccgtcct gtacactttg agctcatgag tgagtgggaa cgttcctact 720
tcgggaacat ggggccccag tatgtcacca cctatgcctg a 761
<210> 6
<211> 387
<212> DNA
<213> MMP7转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域
<400> 6
cccgcgtcat agaaataatg cagaagccca gatgtggagt gccagatgtt gcagaatact 60
cactatttcc aaatagccca aaatggactt ccaaagtggt cacctacagg atcgtatcat 120
atactcgaga cttaccgcat attacagtgg atcgattagt gtcaaaggct ttaaacatgt 180
ggggcaaaga gatccccctg catttcagga aagttgtatg gggaactgct gacatcatga 240
ttggctttgc gcgaggagct catggggact cctacccatt tgatgggcca ggaaacacgc 300
tggctcatgc ctttgcgcct gggacaggtc tcggaggaga tgctcacttc gatgaggatg 360
aacgctggac ggatggtagc agtctag 387

Claims (21)

1.一种基因转录产物的检测方法，其特征在于，其包括：使用引物对同时检测同一基因转录的信使RNA和环形RNA。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物对是根据同一基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域设计，并通过聚合酶链反应筛选获得。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的同一基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域，通过一代测序、二代测序或联合测序途径获得。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的基因为ALAS2和/或MMP7。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的基因为ALAS2和MMP7。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的基因还包括血红蛋白亚基α（HBA）、血红蛋白亚基β（HBB）、基质金属蛋白酶10（MMP10）、基质金属蛋白酶11（MMP11）、左右决定因子2（LEFTY2）基因中的一种或多种。
7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2。
8.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
9.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述的共同含有的核酸序列区域为SEQ ID NO: 3和/或SEQ ID NO: 4。
10.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述的核酸序列区域为SEQID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
11.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，使用SEQ ID NO:1引物对对ALAS2转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述的核酸序列区域为SEQ ID NO: 3。
12.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，使用SEQ ID NO: 2引物对对MMP7转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述的核酸序列区域为SEQ ID NO: 4。
13.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，使用SEQ ID NO: 1引物对和SEQ ID NO: 2引物对分别对ALAS2和MMP7转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测，所述的核酸序列区域分别为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
14.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2。
15.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含的引物对序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
16.根据权利要求14或15所述的引物组合物，其特征在于，每个引物对中至少有一条引物的5’端被荧光分子标记。
17.根据权利要求16所述的引物组合物，其特征在于，所述的荧光分子选自Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6’-FAM。
18.权利要求14-17所述的引物组合物在用于制备法医学基因检测制剂中的应用，其中，通过所述的引物组合物对ALAS2和/或MMP7基因转录的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域进行检测。
19.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求14-17任一所述的引物组合物及PCR扩增相关试剂。
20.权利要求11-117所述的引物组合物、权利要求19所述的试剂盒在制备法医鉴定用核酸样品分析制剂中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述核酸样品来自于血液、血斑、月经血、月经血斑及含有血液或月经血的混合物、混合斑。
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