CN111235281B

CN111235281B - 一种检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111235281B
Application number: CN201911125324.7A
Authority: CN
Inventors: 谢建辉; 刘宝年; 杨沁蕊
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN111235281A

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种复合扩增试剂盒及其在生物检材的组织来源鉴定中的应用。本发明通过对人体液中18个基因的转录产物复合扩增检测，特别是对多个基因的信使RNA和环形RNA同时检测，能显著提高被检测基因的敏感性，本发明可广泛应用于法医学生物检材的组织来源鉴定，具有非常高的法医学应用价值。

Description

一种检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种复合扩增试剂盒及其在生物检材的组织来源鉴定中的应用；尤其涉及一种检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术

在法医学领域，生物检材的组织来源鉴定也称之为体液鉴定，是法医学检测的重要环节。检测实践显示，案件现场遗留的生物检材，如血痕、精斑、阴道分泌物等，它们的组织来源信息有助于推断案件发生过程和重建案件现场，为案件的侦察和审判提供重要证据。

现有技术鉴定生物检材的体液来源的方法很多。早期采用的方法主要是基于酶促反应或免疫学方法，其方法通常快速/简便，但存在需要检材量大、特异性和敏感性差等缺陷，因此，发展新型的体液鉴定技术方法具有非常重要的实用价值和现实意义；目前研究及使用的体液鉴定方法主要有三种，其中，第一种方法是信使RNA检测法，是目前研究最广泛、且已部分应用于法医学案件的鉴定，该方法可以同时提取DNA和RNA，节省检材，可以进行多重复合扩增反应，同时检测多种体液标记分子，短时间内获得更多信息量；然而，信使RNA面临一个容易降解的问题，对于检测陈旧、降解生物检材尚存有局限性；第二种是微小RNA(microRNA)检测法；所述microRNA是一类非编码小分子RNA，长度约18-25个核苷酸，研究表明其不易降解，能解决信使RNA易降解的问题，但是由于microRNA太短，不能进行复合扩增，使得microRNA检测极其不方便；第三种是DNA甲基化标记检测法；DNA甲基化是碱基的复制后共价修饰，是储存表观遗传学信息的主要形式；但此方法消耗DNA，且操作方法比较繁琐，同时机体DNA甲基化受到很多因素影响，如年龄、营养等，这些因素限制了DNA甲基化标记在体液鉴定中的应用。

复合扩增检测是指在一个检测体系里同时检测多个生物标记，能极大地提高检测效率，且节约检材使用量。相比微小RNA检测法和DNA甲基化标记检测法，信使RNA检测不仅可以同时对RNA和DNA共抽提以不影响DNA检测，同时可以利用PCR产物长度差异同时对多个遗传标记进行区分，这使得信使RNA检测具有更加显著的实际应用价值。有研究已筛选出一系列体液特异性的信使RNA标记，也有报道多个基于信使RNA检测的复合扩增试剂盒。

有研究报道了不同体液特异表达的基因，如：外周血特异表达的基因δ氨乙酰丙酸合成酶2(δ-aminolevulinatesynthase 2，ALAS2)、血红蛋白β亚基(hemoglobin subunitbeta，HBB)、锚定蛋白1(Ankyrin 1，ANK1)等；月经血特异表达的基因基质金属蛋白酶7、10和11(matrix metallopeptidase 7、10和11；MMP7、MMP10和MMP11)等；精液特异表达的基因前列腺特异性抗原(kallikrein related peptidase 3，KLK3)、鱼精蛋白1和2(protamine1和2，PRM1和PRM2)、谷氨酰胺转胺酶4(Transglutaminase 4，TGM4)等；尿液特异表达的基因尿调节素(Uromodulin，UMOD)、肌醇加氧酶(myo-inositol oxygenase，MIOX)等；阴道分泌物特异表达的基因雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、细胞色素P450家族2亚家族B成员7的假基因(cytochrome P450 family 2 subfamily B member 7，pseudogene，CYP2B7P1)、丝氨酸肽酶抑制剂Kazal 5型(serine peptidase inhibitor，Kazal type 5，SPINK5)等；唾液特异表达的基因粘蛋白7(mucin 7，MUC7)、富酪蛋白(statherin，STATH)、富组蛋白3(histatin 3，HTN3)等。常用于作为内部参考的基因有β-肌动蛋白(beta-actin，ACTB)、核糖体RNA18S亚基(ribosomal RNA 18S，18S-rRNA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)等。

实践显示，法医案件现场环境复杂多变，从案件现场获取的生物检材大都经历过不同程度的降解，信使RNA易降解的特性使其在法医体液鉴定中的应用受到限制。环形RNA(circular RNA，circRNA)是在pre-mRNA剪切过程中，外显子的5′端与3′端以反向剪切(backsplicing)形式形成3′，5′磷脂键连接的RNA，广泛存在于哺乳动物的各种不同类型的细胞中。circRNA有如下特点：1)环形结构，无3’末端poly A尾，无5’末端加帽结构；2)耐受RNase R酶的降解；3)组织/细胞类型特异性表达；4)含量丰富。这些特征使得circRNA在法医学领域是一类非常理想的检测标记。由于circRNA的稳定性和组织表达特异性，可以应用于体液鉴定，特别对于陈旧检材、降解检材和微量检材检测更具有优越性。

迄今，目前报道的体液鉴定的试剂盒在检测信使RNA标记的时候大都没有纳入相应环形RNA的检测。基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供一种复合扩增试剂盒及其在生物检材的组织来源鉴定中的应用；尤其涉及一种检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒及其应用。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，为解决现有技术存在的缺陷，提供一种灵敏性更高的生物检材组织来源的检测方法，尤其涉及一种检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒及其应用，本发明涉及的检测方法能同时检测人18个基因的转录产物，适用于生物检材的组织来源的鉴定。

基于本申请的研究基础，鉴定了一系列体液生物标记的环形RNA，发现同时检测信使RNA和环形RNA可以更加有效地对生物检材组织来源的进行鉴别，特别是对于陈旧检材、降解检材和微量检材具有非常高的鉴别能力，能增加生物标记的敏感性，提高生物标记的稳定性。

本发明中，确定ALAS2和HBB作为血液特异性标记，MMP7、MMP10和MMP11作为月经血特异性标记，HTN3、STATH和MUC7作为唾液特异性标记，SPINK5、ESR1和CYP2B7P1作为阴道分泌物特异性标记，KLK3、PRM1和PRM2作为精液特异性标记，MIOX和UMOD作为尿液特异性标记、18S-rRNA和ACTB作为内参基因。

进一步，本发明构建并优化了检测包含上述18个生物标记的复合扩增试剂盒，所述试剂盒通过优化所述的18个基因的特异性引物、引物混合比例以及聚合酶链反应条件实现同时检测人18个基因的转录产物的复合扩增体系，可用于同时鉴别人血液、月经血、唾液、阴道分泌物、精液和尿液等生物检材。

更具体的，本发明的第一个方面是提供了一种复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含引物组合物，所述引物组合物包含以下引物序列：ALAS2引物SEQ ID NO：1～2、HBB引物SEQID NO：3～4、MMP7引物SEQ ID NO：5～6、MMP10引物SEQ ID NO：7～8、MMP11引物SEQ ID NO：9～10、KLK3引物SEQ ID NO：11～12、PRM1引物SEQ ID NO：13～14、PRM2引物SEQ ID NO：15～16、MIOX引物SEQ ID NO：17～18、UMOD引物SEQ ID NO：19～20、ESR1引物SEQ ID NO：21～22、CYP2B7P1引物SEQ ID NO：23～24、SPINK5引物SEQ ID NO：25～26、MUC7引物SEQ ID NO：27～28、STATH引物SEQ ID NO：29～30、HTN3引物SEQ ID NO：31～32、18S-rRNA引物SEQ IDNO：33～34、ACTB引物SEQ ID NO：35～36；每个基因的引物对序列信息如表1所示。

表1 18个基因的引物对序列和扩增反应终浓度

作为优选的方案，所述的复合扩增试剂盒包含引物组合物，其中每个基因的引物对中至少有一条引物的5’端被荧光分子标记。

作为进一步优选的方案，所述的荧光分子选自Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6’-FAM中的1种或多种。

作为进一步优选的方案，所述复合扩增试剂盒还包含PCR扩增相关的试剂。

作为进一步优选的方案，每个引物在PCR扩增反应体系中的终浓度是经过优化的，每个引物在PCR扩增反应体系中的终浓度如表1所示。

本发明所述的引物序列为：

SEQ ID NO：1

ACCTTCGTGGATGAGGTCCAT

SEQ ID NO：2

CTGGCAATGTAGCCGCCCAC

SEQ ID NO：3

AGGAGAAGTCTGCCGTTACTG

SEQ ID NO：4

CCGAGCACTTTCTTGCCATGA

SEQ ID NO：5

GTCATAGAAATAATGCAGAAGCCC

SEQ ID NO：6

CAGTTCCCCATACAACTTTCCTG

SEQ ID NO：7

TGACAAGGAAAAGAAGAAAAC

SEQ ID NO：8

GAAGTAGAAAAATCCAAATGC

SEQ ID NO：9

CAAGACTCACCGAGAAGGGG

SEQ ID NO：10

TAGCGAAAGGTGTAGAAGGCG

SEQ ID NO：11

CACCTGCTCGGGTGATTCTG

SEQ ID NO：12

TTTCCACTTCCGGTAATGCACCA

SEQ ID NO：13

GCCAGGTACAGATGCTGTCGCAG

SEQ ID NO：14

TTAGTGTCTTCTACATCGCGGTCT

SEQ ID NO：15

GGCGCAAAAGACGCTCC

SEQ ID NO：16

TTTTTTTTTTGCCCAGGAAGCTTAGTGCC

SEQ ID NO：17

ATCCTCGATACAGCACAGAGC

SEQ ID NO：18

TTTTTAGTGGAACCGGATCATGTAGA

SEQ ID NO：19

CTAGTCTACCTGCACTGTGAAGTC

SEQ ID NO：20

GCCCCAAGCTGCTAAAAGC

SEQ ID NO：21

ATTATGGAGTCTGGTCCTGTGAG

SEQ ID NO：22

GCTCTTCCTCCTGTTTTTATCAA

SEQ ID NO：23

GATGGGAAAGCGGAGTGTG

SEQ ID NO：24

TTTTTTGTTGGCGGTAATGGAATG

SEQ ID NO：25

GCATTTAGCAAGAGCTCCCA

SEQ ID NO：26

TTTTTTCCCCTTCACTTTTTACACCA

SEQ ID NO：27

CTAAAAGCAAGCAACTGGAT

SEQ ID NO：28

AAGTGAGATTTGGGTGATTG

SEQ ID NO：29

TTTTTTGCCTTCATCTTGGCTCT

SEQ ID NO：30

CCCATAACCGAATCTTCCAA

SEQ ID NO：31

TCTTCAGTAATCACGGGGCAT

SEQ ID NO：32

TCTTCAAAAAGCAGTGGTAGT

SEQ ID NO：33

CTCAACACGGGAAACCTCAC

SEQ ID NO：34

TTTTTCGCTCCACCAACTAAGAACG

SEQ ID NO：35

TGACGTGGACATCCGCAAAG

SEQ ID NO：36

CTGGAAGGTGGACAGCGAGG

本发明的第二方面是提供一种复合扩增试剂盒用于生物检材组织来源鉴定的方法。所述的鉴定的方法是同时检测每种体液至少1个生物标记的信使RNA和环形RNA。同时检测生物标记的信使RNA和环形RNA表达的应用，可以大大提高生物检材组织来源鉴定的鉴别能力。

作为优选的方案，共同检测血液生物标记ALAS2的信使RNA和环形RNA，共同检测月经血生物标记MMP7和MMP10的信使RNA和环形RNA，共同检测唾液生物标记HTN3的信使RNA和环形RNA，共同检测阴道分泌物生物标记SPINK5、ESR1和CYP2B7P1的信使RNA和环形RNA，共同检测精液生物标记KLK3和PRM2的信使RNA和环形RNA，共同检测尿液生物标记MIOX的信使RNA和环形RNA。

具体操作步骤为：

1)分别获取ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、MIOX、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3的信使RNA和环形RNA共同含有的核酸序列区域。

2)针对1)获得的共同含有的核酸序列区域设计引物，进一步通过聚合酶链反应筛选获得ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、MIOX、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3的特异性引物。

本发明中ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、MIOX、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3的特异性引物对分别为SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：15～16、SEQ ID NO：17～18、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：23～24、SEQ IDNO：25～26和SEQ ID NO：31～32。

3)分别设计获得HBB、MMP11、PRM1、UMOD、MUC7、STATH、18S-rRNA和ACTB特异性引物。HBB、MMP11、PRM1、UMOD、MUC7、STATH、18S-rRNA和ACTB的特异性引物对分别为SEQ IDNO：3～4、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：19～20、SEQ ID NO：27～28、SEQ ID NO：29～30、SEQ ID NO：33～34和SEQ ID NO：35～36。

4)分别合成ALAS2、HBB、MMP7、MMP10、MMP11、KLK3、PRM1、PRM2、MIOX、UMOD、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5、MUC7、STATH、HTN3、18S-rRNA和ACTB的荧光标记引物，每个基因引物中至少一条的5’端是被荧光分子标记的，荧光分子可以是Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6’-FAM。

5)在4)的基础上，等量混合ALAS2、HBB、MMP7、MMP10、MMP11、KLK3、PRM1、PRM2、MIOX、UMOD、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5、MUC7、STATH、HTN3、18S-rRNA和ACTB的荧光标记引物，形成引物混合物，通过PCR扩增及毛细管电泳检测人血液、月经血、唾液、阴道分泌物、精液和尿液生物检材，评估复合扩增的检测效果。

6)在5)的基础上，优化体系中不同引物对的浓度，优化聚合酶链反应条件。

7)在6)的基础上，分别对复合扩增体系的检测特异性、检测敏感性、对环形RNA检测以及对混合样本的检测进行评估，建立优化的复合扩增试剂盒。

本发明的第三方面提供一种复合扩增试剂盒在生物检材的组织来源鉴定中的应用，通过复合扩增同时检测18个基因的转录产物，所述的基因为ALAS2、HBB、MMP7、MMP10、MMP11、KLK3、PRM1、PRM2、MIOX、UMOD、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5、MUC7、STATH、HTN3、18S-rRNA和ACTB。

在前述应用中，所述的基因ALAS2和HBB为血液特异性标记，MMP7、MMP10和MMP11为月经血特异性标记；KLK3、PRM1和PRM2为精液特异性标记；MIOX和UMOD为尿液特异性标记；ESR1、CYP2B7P1和SPINK5为阴道分泌物特异性标记；MUC7、STATH和HTN3为唾液特异性标记；18S-rRNA和ACTB为内参基因。

在前述应用中，所述生物检材包括但不限于血液、血斑、月经血、月经血斑，精液、精斑、尿液、尿渍、阴道分泌物、阴道拭子、唾液、口腔拭子或它们的混合物。

与现有技术相比，本发明公开的同时检测人18个生物标记的复合扩增试剂盒用于生物检材的组织来源鉴定具有显著优势，特别是对于陈旧检材、降解检材及微量检材等具有很高的鉴别能力，可以广泛地应用于法医学生物检材的组织来源鉴定等实践工作，具有非常高的法医学应用价值。

附图说明

图1为复合扩增试剂盒对6种体液和空白对照的检测结果图。

图2为复合扩增试剂盒对18个基因的环形RNA检测的结果图。

图3为复合扩增试剂盒对血液和精液混合样本的检测结果图。

图4为复合扩增试剂盒对阴道分泌物和精液混合样本的检测结果图。

具体实施方式

虽然发明内容部分已将本发明的原理进行了详细的描述，应该清楚地理解的是，下面将结合具体的实施方式进一步阐明本发明的技术内容，所述实施例不是意在限制本发明的保护范围，而是意图更加详尽地公开本发明的技术内容。如果任何的修改和/或改变对本领域的技术人员来说是显而易见的，也将包含在本发明的构思之中。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 生物标记的选择及各生物标记检测靶区域的确定

(一)体液生物标记的选择

首先通过分析法医体液鉴定领域报道的生物标记结合发明人的研究结果确定18个在特异性和敏感性方面都具有明显优势的生物标记。要求每种体液类型包含至少两个特异性的生物标记。

具体包括血液特异性标记ALAS2和HBB，月经血特异性标记MMP7、MMP10和MMP11，唾液特异性标记HTN3、STATH和MUC7，阴道分泌物特异性标记SPINK5、ESR1和CYP2B7P1，精液特异性标记KLK3和PRM2，尿液特异性标记MIOX和UMOD，内参基因标记18S-rRNA和ACTB。

(二)生物标记引物的设计和筛选

通过生物信息学方法获得ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、MIOX、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3信使RNA的核酸序列，同时根据发明人的研究结果获得这些基因所表达的环形RNA核酸序列。选择其信使RNA与其同时转录的多种环形RNA共同含有的核酸区域作为检测的靶区域，使用Primer5软件分别对ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、MIOX、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3设计特异性引物。通过定量聚合酶链反应对ALAS2、MMP7、MMP10、KLK3、PRM2、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5和HTN3的引物特异性进行筛选，选择溶解曲线单一且扩增效率高的引物作为进一步的研究对象。

生物标记HBB、MMP11、PRM1、UMOD、MUC7、STATH、18S-rRNA和ACTB的信使RNA的检测靶区域和引物对来自已有的报道研究，并通过定量聚合酶链反应对HBB、MMP11、PRM1、UMOD、MUC7、STATH、18S-rRNA和ACTB的引物特异性进行筛选，选择溶解曲线单一且扩增效率高的引物作为进一步的研究对象。

(三)生物标记引物的验证

合成上述18个生物标记的引物对，并且每个引物对中的一条引物的5’端标记6-FAM荧光分子。分别使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管电泳和使用

ID软件分析，以分子量标准物500

(ThermoFisher公司)作为分子量标准，RFU＞50为检测基线。根据毛细管电泳结果进一步验证引物的检测特异性，同时获得每对引物的确切扩增子大小。

实施例2 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的构建

首先对上述获得的18对荧光标记的特异性引物按照相同的量进行混合，得到一个包含18对引物的引物混合物。使用这个引物混合物分别对血液，月经血，精液，尿液，阴道分泌物和唾液的cDNA进行检测，然后对每个的聚合酶链反应产物进行毛细管电泳。PCR反应条件为：95℃/5分钟→28个循环(95℃/30秒，60℃/90秒，72℃/30秒)→68℃/1小时→4℃保持。

使用

ID软件对原始数据进行分析，根据电泳图上各标记的基因峰对引物序列、引物浓度进行优化，如优化引物序列避免引物间非特异性扩增、峰特别高的标记降低体系中相应引物用量、峰特别低的标记增加体系中相应引物用量等。同时对聚合酶链反应的条件进行优化。最终使得每种体液中特异性标记峰相对平衡且尽可能少地出现非特异扩增峰，从而建立完善的复合扩增试剂盒。复合扩增试剂盒检测效果如图1所示。

实施例3 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的应用

本发明对同时检测18个生物标记的复合扩增检测试剂盒对于基因表达特异性方面进行调查。首先用上述已优化的检测体系对30个人的血液样本、22个人的精液样本、23个人的月经血样本、28个人的唾液样本、40个人的阴道分泌物样本、14个男性的尿液样本和12个女性的尿液样本分别进行检测，检测结果如表2所示。

表2 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的检测特异性

血液标记ALAS2只在人血液和月经血中被检测到，而血液标记HBB除了在血液和月经血中被检测到以外还在尿液样本中被检测到，但未在其他体液类型中检测到HBB；

月经血标记MMP7即在月经血中被检测到，也在尿液中被检测到以及部分阴道分泌物中检测到，但未在其他体液类型中检测到MMP7，月经血标记MMP10和MMP11仅在月经血中被检测到；

精液标记PRM1和PRM2只在精液中被检测到，可以用来鉴定精液。而KLK3除了在精液中被检测到，还可在男性尿液中被检测到，但未能在女性尿液中被检测到，且未在其他体液类型中检测到KLK3；

尿液样本标记MIOX和UMOD仅在尿液中被检测到；

阴道分泌物标记ESR1即在阴道分泌物中被检测到，还可以在月经血样本中被检测到，但未在其他体液类型中检测到ESR1；阴道分泌物标记CYP2B7P1和SPINK5在阴道分泌物中广泛被检测到，但二者在个别唾液样本中被检测到，但未在其他体液类型中检测到CYP2B7P1和SPINK5；

唾液标记MUC7，STATH和HTN3仅在唾液中被检测到；

内参基因18S-rRNA和ACTB可以在所有样本中被检测到；

结果表明所述的生物标记具有很好的体液类型特异性，能有效地用于法医学体液鉴定。

实施例4 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的应用

本发明对同时检测18个生物标记的复合扩增检测试剂盒对于基因表达检测敏感性方面进行调查，采用系列稀释的方法进行敏感性研究。具体方法如下：

1)外周血、唾液和精液样本按照5μl-0.01μl的体液量进行系列稀释后分别抽提获得总RNA；

2)然后分别用10μl的总RNA通过随机引物进行逆转录后得到cDNA；

3)阴道分泌物、月经血和尿液来源的总RNA浓度梯度系列范围为10ng-0.05ng，每组浓度的RNA分别通过随机引物逆转录成cDNA；

4)取1μl上述的cDNA作为模板分别进行PCR，PCR产物进行毛细管电泳分析，RFU＞50作为检测基线；

实验结果如表3所示，在28个PCR循环数的情况下，该复合扩增体系具有相当高的检测敏感性。

表3 系列稀释法评估复合扩增试剂盒的鉴定能力

实施例5 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的应用

本发明对同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒在检测基因的环形RNA方面进行调查。具体方法如下：

1)使用能够特异性降解线形RNA，而不会降解环形RNA的RNase R酶对各种体液的总RNA进行处理；

2)然后用随机引物逆转录后得到cDNA，以这些cDNA为模板进行PCR后毛细管电泳检测分析；

结果如图2所示，纳入环形RNA检测的标记在RNase R处理后依然可以检测到明显的阳性信号；

实验结果表明所述的复合扩增试剂盒对于环形RNA检测具有良好的效果，进一步表明该复合扩增试剂盒能用于一些陈旧检材和降解检材的体液来源鉴定。

实施例6 同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒的应用

本发明对同时检测18个生物标记的复合扩增试剂盒对于混合样本的检测方面进行调查，由于含有精液的混合体液在性侵案件中最常见，且对案件的定性具有重要意义，发明人重点对含有精液的混合体液进行了调查，具体方法如下：

1)发明人制作了10μl血液分别与5μl、2.5μl、0.5μl精液混合的混合样本，1/8个阴道分泌物拭子分别与5μl、2.5μl、0.5μl精液混合的混合样本；

2)对上述混合样本抽提总RNA后，用随机引物逆转录后得到cDNA；

3)再以2)得到cDNA为模版进行PCR，然后毛细管电泳分析；

血液和精液的混合样本检测结果如图3所示，三种系列的混合都能够获得很好的鉴别效果；阴道分泌物和精液的混合样本检测结果如图4所示，三种系列的混合都能够获得很好的鉴别效果；

实验结果表明该复合扩增试剂盒可以同时检测出混合样本中所对应体液的全部特异性标记和内参标记，从而表明该试剂盒具有好的检测特异性和检测敏感性。

以上所述的实施例，只是本发明较优的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种同时检测人18个基因的转录产物的复合扩增试剂盒，其特征在于，包括用于检测如下18个基因的转录产物的引物：ALAS2、HBB、MMP7、MMP10、MMP11、KLK3、PRM1、PRM2、MIOX、UMOD、ESR1、CYP2B7P1、SPINK5、MUC7、STATH、HTN3、18S-rRNA及ACTB；

所述的引物的序列是，ALAS2引物SEQ ID NO：1～2、HBB引物SEQ ID NO：3～4、MMP7引物SEQ ID NO：5～6、MMP10引物SEQ ID NO：7～8、MMP11引物SEQ ID NO：9～10、KLK3引物SEQID NO：11～12、PRM1引物SEQ IDNO：13～14、PRM2引物SEQ ID NO：15～16、MIOX引物SEQ IDNO：17～18、UMOD引物SEQ ID NO：19～20、ESR1引物SEQ ID NO：21～22、CYP2B7P1引物SEQID NO：23～24、SPINK5引物SEQ ID NO：25～26、MUC7引物SEQ ID NO：27～28、STATH引物SEQID NO：29～30、HTN3引物SEQ ID NO：31～32、18S-rRNA引物SEQ ID NO：33～34、ACTB引物SEQ ID NO：35～36；

同时检测人18个基因的转录产物中，使用包含18对引物的混合物进行PCR反应，PCR反应条件为95℃/5分钟→28个循环，每个循环反应条件为95℃/30秒，60℃/90秒，72℃/30秒，→68℃/1小时→4℃保持。

2.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述用于检测基因转录产物的引物，每个基因引物对中至少有一条引物的5’端是经过荧光分子标记的。

3.根据权利要求2所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光分子选自Fluorescein、JOE、TMR-ET、CXR-ET、PET、NED、VIC或6-FAM中的1种或多种。

4.根据权利要求1-3任一所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光标记复合扩增试剂盒还包含PCR扩增相关的试剂。

5.根据权利要求1-4任一所述的复合扩增试剂盒在生物检材的组织来源鉴定中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物检材来自血液、血斑、月经血、月经血斑，精液、精斑、尿液、尿渍、阴道分泌物、阴道拭子、唾液、口腔拭子或它们的混合物。