CN105713859A - 短双歧杆菌及牛奶中多种抗生素残留的检测方法及应用 - Google Patents
短双歧杆菌及牛奶中多种抗生素残留的检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生命科学和食品安全领域。涉及一株分离自健康人肠道的短双歧杆菌及利用该菌株进行牛奶中抗生素残留的检测方法。分离的菌株为DSQH-1，保藏号为CGMCC No.8579；DSQH-1菌株对青霉素、四环素、红霉素等抗生素敏感；以该菌株为工作菌株所建立的牛奶中多种抗生素残留的检测方法包括：(1)菌株活化；(2)菌悬液制备；(3)筛检培养基制备；(4)定量检测培养基制备；(5)标准管制备；(6)标准曲线绘制；(7)样品准备；(8)样品筛检检测；(9)样品定量检测等步骤。本发明的检测方法操作简便、设备要求简单、灵敏度高、不易污染，适合大量样品的筛检和定量检测，也可用于生产者自检。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和食品安全领域；涉及一株短双歧杆菌及利用该菌株进行牛奶中抗生素残留的快速检测方法。
背景技术
牛奶安全不仅关系到广大人民群众的健康，也是乳品企业的命脉。牛奶中抗生素残留是牛奶安全的一个重要问题。随着畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高。为预防疾病和治疗乳房炎等疾病，抗生素类兽药在畜牧业的应用日益广泛，在应用抗生素治疗奶牛疾病在取得效果的同时，不规范使用抗生素如增加使用剂量和延长治疗期，甚至给泌乳期奶牛长期应用抗生素预防疾病等使牛奶中不仅存在抗生素残留，而且往往是残留抗生素含量较高。
我国许多乳制品不符合需进口国家和地区的要求，其中抗生素残留超标是重要限制因素。牛奶中抗生素残留不仅给牛奶生产及相关产业带来损失，同时也对消费者的身体健康带来诸多潜在的危害。随着人民生活水平的提高和对生物安全和食品安全的重视，抗生素残留已成为牛奶食品安全中全社会关注的重点。为适应国内外日益严格的要求，以及市场和进出口快速通关的需要，建立一种简单、快速、有效检测牛奶中多种抗生素残留的方法具有重要意义。
有关文献或方法中多种抗生素药物残留的检测方法基本上是对每一类药物进行分别检测，分析方法包括色谱法、色/质联用法、薄层色谱、免疫测定法和微生物抑制法等。我国常用磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，不易同时检测。同时对牛奶中多种抗生素残留进行检测有一定困难，目前我国食品卫生标准(GB/T4789.27-2008)中规定TTC法检测牛奶中抗生素残留，该法设备简单、费用低，但灵敏度低、易假阳性，在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等，但对链霉素不太敏感，对新霉素不敏感，消毒剂可干扰试验。
微生物抑制法操作简便，仪器设备和人员要求均不高，样品前处理简单，检测时间短等特点，一直被用于大批量样品的过筛。本发明主要应用对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类敏感的益生菌，建立一种快速筛检和定量检测青霉素、红霉素和四环素的微生物抑制法。
发明内容
本发明的目的是筛选出不易被杂菌污染影响并对残留抗生素敏感的双歧杆菌菌株，并由此建立一种简单、快速、灵敏的以该菌株为工作菌株进行牛奶中抗生素残留检测的筛选和定量检测方法，该方法采用残留抗生素对菌株的生长抑制作用来确认牛奶中是否有抗生素残留是否超过国家标准，可有效检测牛奶中残留抗生素存在状况及含量。
本发明提供一株对β内酰胺类抗生素敏感的并应用于牛奶中抗生素残留检测的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)DSQH-1。
本发明的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)DSQH-1，于2013年12月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)，保藏编号为CGMCCNo.8579。
本发明的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)DSQH-1分离自一名浙江省母乳喂养儿童(男性)粪便。
本发明的短双歧杆菌DSQH-1菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：短双歧杆菌DSQH-1菌株在TPY固体平板上的菌落直径1.2-1.5mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻；
(2)菌体形态：革兰染色阳性无芽孢杆菌，菌体呈棒杆状，一端或两端膨大，有弯曲或分叉现象，形成特有的“Y”、“V”形结构。
(3)生理生化特征：触酶阴性，分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和半乳糖，不分解淀粉、纤维二糖、L-阿拉伯糖、木糖、海藻糖、菊糖，硝酸盐还原阴性，靛基质试验阴性。
(4)培养特征：厌氧生长良好，有氧不生长。最适生长温度37℃-42℃，最低生长温度25℃，最高生长温度45℃；最适pH6.5-7.0，pH低于5.0或高于8.0不生长。
本发明还提供一种牛奶中抗生素残留的快速检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)菌株活化：将权利要求1所述的短双歧杆菌DSQH-1菌株接种于TPY固体培养基，37℃培养24-48h；
(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的短双歧杆菌DSQH-1菌株TPY液体中，37℃、200rpm震荡培养4-5小时，3000rpm离心5分钟，用PBS调整菌液OD600的值为0.15-0.20，4℃保存；
(3)筛检培养基制备：以重量计，取蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉1.0g，氯化钠1.0g，牛肉膏1.0g，K2HPO40.6g，KH2PO40.6g，吐温-800.1mL，蒸馏水100mL。加入黄豆浸液300mL，调节pH至6.5-6.8，分装每管10ml，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(4)定量检测培养基制备，以重量计，取蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4.7H2O0.5g，MnSO4.4H2O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801ML，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至6.5-6.8，分装每管19.5mL，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(5)标准管制备：取青霉素、四环素和红霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；氨苄青霉素100μg/L、50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；四环素500μg/L、450μg/L、400μg/L、350μg/L、300μg/L、250μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；红霉素100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；
(6)标准曲线制备：取步骤(3)制备的定量检测培养基，分别加入步骤(5)不同浓度的抗生素标准工作液400μL，以0μg/L为生长对照。混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长下各浓度检测管的吸光度值，以标准系列管中加入抗生素浓度值为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线；
(7)样品准备：取样品10mL于无菌试管中，80℃水浴30分钟；
(8)样品检测：筛检取步骤(7)所得的样品，等体积加入到步骤(4)所得的筛检检测管中，加入步骤(2)所得的菌液，40℃厌氧培养6-8小时；牛奶出现凝固或出现红色为抗生素残留低于国家标准，不凝固、呈黄色为抗生素残留超标。定量检测取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(4)所得的检测管中，加入步骤(2)所得的菌液，40℃厌氧培养12-16小时；以培养基调零，测定样品管阴性对照管的OD600，从标准曲线上读取抗生素浓度值(μg/L)。
本发明的工作菌株为短双歧杆菌DSQH-1，保藏编号为CGMCCNo.8579。
本发明所述的牛奶样品包括：液态乳、复原乳。
本发明所述的氨苄青霉素标准曲线是通过下述方法得到：利用氨苄青霉素储备液配制浓度分别为100μg/L、50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液，以0μg/L为阴性对照。取各浓度的氨苄青霉素标准工作液400μL加入到19.5mL的定量检测培养基中混匀，再加入检测菌液100μL，40℃厌氧培养12-16h，测定600nm波长下各浓度检测管的吸光度值，以抗生素浓度值为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线回归方程为Y＝-166.72X+95.431(Y：样品中氨苄青霉素浓度μg/L，X：反应管的OD600值)，线性范围为1-100μg/L，R2为0.9941。
本发明所述的四环素标准曲线是通过下述方法得到：利用四环素储备液配制浓度分别为50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、250μg/L、300μg/L、350μg/L、400μg/L、450μg/L、500μg/L的四环素标准工作液，以0μg/L为阴性对照。方法同前，得到标准曲线回归方程为Y＝-858.84X+461.7(Y：样品中四环素浓度μg/L，X：反应管的OD600值)，线性范围为50-500μg/L，R2为0.9944。
本发明所述的红环素标准曲线是通过下述方法得到：利用红环素储备液配制浓度分别为100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液，以0μg/L为阴性对照。方法同前，得到标准曲线回归方程为Y＝-174.17X+122.61(Y：样品中红环素浓度μg/L，X：反应管的OD600值)，线性范围为10-100μg/L，R2为0.9976。
本发明使用的检测下限通过下述方法得到：配制浓度为0μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、5μg/L、10μg/L的氨苄青霉素标准溶液；配制浓度为5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L的四环素标准液，配制浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L的红霉素标准液，均以0μg/L为阴性对照。取各浓度的氨苄青霉素标准工作液400μL加入到19.5mL的定量检测培养基中混匀，再加入检测菌液100μL，40℃厌氧培养12-16h，测定600nm波长下各浓度检测管的吸光度值，以产生抑菌作用的最小浓度为最低检测限。定量检测的最低检测限为氨苄青霉素2μg/L，四环素50μg/L，红霉素10μg/L。
本发明方法中，重复3次测定已知抗生素含量的牛奶样品，相对标准偏差为氨苄青霉素2.84-7.13，红霉素1.80-3.95，四环素2.55-4.02，表明本发明方法的检测精确度较高。
本发明方法的回收率，加入不同浓度抗生素标准溶液到已知的牛奶样品中，重复分析3次，得到的平均回收率为氨苄青霉素77.37％，红霉素87.13％，四环素82.60％。
本发明的优点及效果：
(1)本发明短双歧杆菌DSQH-1菌株具有以下特点：对红霉素、哌拉西林、四环素、青霉素G、对氨苄西林等敏感；专性厌氧，培养过程中不易受杂菌污染；菌株稳定性好，易于保存和操作；为益生菌，对人体和环境友好，不会造成实验室和环境污染。
(2)本发明方法的原理是基于抗生素对双歧杆菌DSQH-1菌株具有抑制作用，利用此特性，将双歧杆菌DSQH-1菌株对样品进行发酵处理，跟踪发酵过程并根据发酵特点来判断样品中是否存在抗生素残留。
(3)本发明方法的筛检方法操作简单，可直接通过观察培养基凝固或指示剂变色判读结果，判断方法简便、准确，适合食品质量安全检查，实用性强。
(4)本发明方法的定量检测方法简便易行，不需特殊精密仪器，灵敏度和精确度高，回收率均大于70％，变异系数均小于10％，符合牛奶中抗生素残留筛检的准确度和精密度要求。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是示例性性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1短双歧杆菌菌株的分离与鉴定
以浙江省健康男青年的粪便作为分离样品，1g粪便用10mLPBS混悬稀释后，接种于TPY固体培养基，37℃、厌氧培养48小时，获得本发明所述的短双歧杆菌DSQH-1，鉴定为短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)，已于2013年12月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.8579。
TPY琼脂培养基、TPY液体培养基为青岛高科园海博生物技术有限公司产品。
本发明的短双歧杆菌DSQH-1菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：短双歧杆菌DSQH-1菌株在TPY固体平板上的菌落直径1.2-1.5mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻；
(2)菌体形态：革兰染色阳性无芽孢杆菌，菌体呈棒杆状，一端或两端膨大，有弯曲或分叉现象，形成特有的“Y”、“V”形结构。
(3)生理生化特征：触酶阴性，分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和半乳糖，不分解淀粉、纤维二糖、L-阿拉伯糖、木糖、海藻糖、菊糖，硝酸盐还原阴性，靛基质试验阴性。
(4)培养特征：厌氧生长良好，有氧不生长。最适生长温度37℃-42℃，最低生长温度25℃，最高生长温度45℃；最适pH6.5-7.0，pH低于5.0或高于8.0不生长。
本发明的短双歧杆菌DSQH-1菌株对抗生素的敏感性试验
采用纸片琼脂扩散(K-B)法，选取不同的抗生素纸片，以本发明短双歧杆菌DSQH-1菌株为测试菌，用TPY琼脂平板培养基，置37℃、厌氧培养24小时观察，测定不通抗生素对DSQH-1菌株的抑菌性能。
上述试验做3次重复，参照CLSI标准判定。
表1DSQH-1菌株对不同抗生素的敏感性试验结果
实验结果：本发明短双歧杆菌DSQH-1菌株对β内酰胺类(氨苄青霉素、青霉素G、哌拉西林、头孢吡肟)、四环素、红霉素敏感，可作为筛检牛奶中抗生素残留的工作菌株。
实施例2：牛奶样品中抗生素残留的检测
(1)菌株活化：将短双歧杆菌DSQH-1菌株接种于TPY固体培养基，37℃培养24-48h；
(2)菌悬液制备：将步骤(1)所得的短双歧杆菌DSQH-1菌株接种于TPY液体中，37℃、200rpm震荡培养4-5小时，3000rpm离心5分钟，用PBS调整菌液OD600的值为0.15-0.20，4℃保存；
(3)所得的菌液，40℃厌氧培养12-16小时；以培养基调零，测定样品管阴性对照管的OD600，从标准曲线上读取抗生素浓度值(μg/L)。
(4)筛检培养基制备：以重量计，取蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉1.0g，氯化钠1.0g，牛肉膏1.0g，K2HPO40.6g，KH2PO40.6g，吐温-800.1ML，蒸馏水100mL。加入黄豆浸液300mL，调节pH至6.5-6.8，分装每管10ml，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(5)定量检测培养基制备，以重量计，取蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4.7H2O0.5g，MnSO4.4H2O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801ML，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至6.5-6.8，分装每管19.5ml，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(6)标准管制备：取青霉素、四环素和红霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；氨苄青霉素100μg/L、50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；四环素500μg/L、450μg/L、400μg/L、350μg/L、300μg/L、250μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；红霉素100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用。
(7)标准曲线绘制：取步骤(4)制备的定量检测培养基，分别加入不同浓度的抗生素标准工作液400μL，以0μg/L为生长对照。混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长下各检测管的吸光度值，以标准系列管中加入抗生素浓度值为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。
(8)样品准备：取样品10mL于无菌试管中，80℃水浴半小时；
(9)样品筛检检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(3)所得的筛检培养基中，40℃、厌氧培养6小时，取出直接观察或加入0.02％甲基红指示剂观察结果；选择4μg/L的青霉素标准品溶液、50μg/L红霉素、100μg/L四环素标准品溶液为快速筛检阳性对照管指示管，以0μg/L为生长对照；
(10)样品定量检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(4)所得的定量检测培养基，40℃、厌氧培养12-16小时。混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长吸光度值，从标准曲线上读取残留抗生素值。
试验1：假阴性率试验
取标准无抗奶样品10mL，加入抗生素标准液，使牛奶中的抗生素浓度为MRL，测定方法同实施例2，重复测定50次，观察阴性结果出现的概率，计算假阴性率。
试验结果牛奶中氨苄青霉素为4μg/L假阴性率为0，2μg/L假阴性率为6％；四环素为μg/L假阴性率为0，μg/L；红霉素μg/L假阴性率为2％。
试验2：检测限的确定
分别用不同浓度的抗生素(氨苄青霉素0μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、5μg/L、10μg/L；四环素5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L，红霉素5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L)标准品溶液和阴性对照(0μg/L)作为待测样品，进行样品检测。分析检测结果，确定本发明检测方法的定量检测的最低检测限为氨苄青霉素2μg/L，四环素50μg/L，红霉素10μg/L。
试验3：回收率测定
将抗生素标准品以不同浓度添加到牛奶样品中，按以上实施案例2步骤测定其含量，每一样品平行5份，测定结果如表2，各抗生素的平均回收率为氨苄青霉素77.37％、红霉素87.13％、四环素82.60％。
表2不同抗生素的添加回收试验
试验4：牛奶样品抗生素残留筛检试验
将含不同浓度的抗生素(氨苄青霉素100μg/L、50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L；四环素25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L，红霉素10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L)标准品溶液的牛奶作为待测样品(以0μg/L为阴性对照)，等体积加入到步骤(4)所得的筛检检测管中，加入步骤(2)所得的菌液，40℃、厌氧培养6-8小时；牛奶出现凝固或出现红色为抗生素残留低于国家标准，不凝固、呈黄色为抗生素残留超标。筛检法开始出现凝固和红色的最低浓度为氨苄青霉素4μg/L、红霉素25μg/L、四环素100μg/L。筛检试验结果与我国批准的动物性食品中最高残留限量(牛奶：氨苄青霉素10μg/L，红霉素40μg/L，四环素100μg/L)符合或相当，可满足大量样品的筛检。
试验5：牛奶样品中抗生素残留定量检测
将含不同浓度标准抗生素(氨苄青霉素50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L、2μg/L，红霉素100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L；四环素500μg/L、400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L)的牛奶作为待测样品(以0μg/L为阴性对照)，加入到步骤(4)所得的检测管中，加入步骤(2)所得的菌液，40℃厌氧培养12-16小时；以培养基调零，测定样品管阴性对照管的OD600，从标准曲线上读取抗生素浓度值(μg/L)。测得结果如表3。
表3加入不同浓度抗生素标准牛奶的定量检测结果
Claims (7)
1.一株短双歧杆菌，其特征在于，所述菌株为短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)DSQH-1，已于2013年12月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8579。
2.一种牛奶中抗生素残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)菌株活化：将权利要求1所述的短双歧杆菌DSQH-1菌株接种于TPY固体培养基，37℃培养24-48h；
(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的短双歧杆菌DSQH-1菌株TPY液体中，37℃、200rpm震荡培养4-5小时，3000rpm离心5分钟，用PBS调整菌液OD600的值为0.12-0.15，4℃保存；
(3)筛检培养基制备：以重量计，蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉1.0g，氯化钠1.0g，牛肉膏1.0g，K2HPO40.6g，KH2PO40.6g，吐温-800.1ML，蒸馏水100mL。加入黄豆浸液300mL，调节pH至6.5-6.8，分装每管10mL，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(4)定量检测培养基制备，以重量计，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4.7H2O0.5g，MnSO4.4H2O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801ML，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至6.5-6.8，分装每管19.5ml，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用；
(5)标准管制备：取青霉素、四环素和红霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；氨苄青霉素100μg/L、50μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；四环素500μg/L、450μg/L、400μg/L、350μg/L、300μg/L、250μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；红霉素100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；
(6)标准曲线绘制：取步骤(4)制备的定量检测培养基，分别加入步骤(5)不同浓度的抗生素标准工作液400μL，以0μg/L为生长对照；混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长下各检测管的吸光度值，以标准系列管中加入抗生素浓度值为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线；
(7)样品准备：取样品10mL于无菌试管中，80℃水浴半小时；
(8)样品筛检检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(3)所得的筛检培养基中，40℃、厌氧培养6小时，取出直接观察或加入0.02％甲基红指示剂观察结果；选择4μg/L的青霉素标准品溶液、50μg/L红霉素、100μg/L四环素标准品溶液为快速筛检阳性对照管指示管，以0μg/L为生长对照；
(9)样品定量检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(4)所得的定量检测培养基，40℃、厌氧培养12-16小时；混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长吸光度值，从标准曲线上读取残留抗生素值。
3.根据权利要求2所述牛奶中抗生素残留检测方法，其特征在于，可同时对牛奶中青霉素、四环素和红霉素残留进行筛检。
4.根据权利要求2所述牛奶中抗生素残留检测方法，其特征在于，可同时对牛奶中青霉素、四环素和红霉素残留进行定量检测。
5.根据权利要求2所述牛奶中抗生素残留检测方法，其特征在于，筛检培养基以重量计，蛋白胨，2.5g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉1.0g，氯化钠1.0g，牛肉膏1.0g，K2HPO40.6g，KH2PO40.6g，吐温-800.1ML蒸馏水100mL；加入黄豆浸液300mL，调节pH至6.5-6.8，包装后115℃高压灭菌15-20分钟，冷却后置4℃保存、备用。
6.根据权利要求2所述牛奶中抗生素残留检测方法，其特征在于，样品筛检检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(3)所得的筛检培养基中，40℃、厌氧培养6小时，取出直接观察或加入0.02％甲基红指示剂观察结果。
7.根据权利要求2所述牛奶中抗生素残留检测方法，其特征在于，样品定量检测：取步骤(7)所得的样品，加入到步骤(4)所得的定量检测培养基，40℃、厌氧培养12-16小时；混匀后加入步骤(2)制备的菌液100μL，混匀后40℃、厌氧培养12-16小时；测定600nm波长吸光度值，从标准曲线上读取残留抗生素值。
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