CN112708687B - 肠道菌群在肝性脑病检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肠道菌群在肝性脑病检测中的应用，所述肠道菌群为肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌。本发明首次发现了特定菌群在肝性脑病中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现肝性脑病的诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断，操作简单、特异性高、敏感性强。

Description

肠道菌群在肝性脑病检测中的应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及肠道菌群在肝性脑病检测中的应用。
背景技术
肝性脑病(HE)又称肝性昏迷，是指严重肝病引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合征，其主要临床表现是意识障碍、行为失常和昏迷。因肝病的类型、肝细胞损害的程度、起病的急缓以及诱因的不同而有所差异。由于导致肝性脑病的基础疾病不同，其临床表现也比较复杂、多变，早期症状的变异性是本病的特点。但也有其共性的表现：即反映为神经精神症状及体征。既有原发肝脏基础疾病的表现，又有其特有的临床表现，一般表现为性格、行为、智能改变和意识障碍。
引起肝性脑病的原发病有重症病毒性肝炎、重症中毒性肝炎、药物性肝病、妊娠期急性脂肪肝、各型肝硬化、门-体静脉分流术后、原发性肝癌以及其他弥漫性肝病的终末期，而以肝硬化患者发生肝性脑病最多见，约占70％。诱发肝性脑病的因素很多，如上消化道出血、高蛋白饮食、大量排钾利尿、放腹水，使用安眠、镇静、麻醉药，便秘、尿毒症、感染或手术创伤等。这些因素大体都是通过：①使神经毒质产生增多或提高神经毒质的毒性效应。②提高脑组织对各种毒性物质的敏感性。③增加血-脑脊液屏障的通透性而诱发脑病。
常规的肝性脑病的诊断主要基于以下6中临床检测：
1.血氨
慢性肝性脑病、pse患者多半有血氨升高。但急性肝性脑病患者血氨可以正常。
2.脑电图
大脑细胞活动时所发出的电活动，正常人的脑电图呈α波，每秒8～13次。肝性脑病患者的脑电图表现为节律变慢。Ⅱ-Ⅲ期患者表现为δ波或三相波，每秒4～7次；昏迷时表现为高波幅的δ波，每秒少于4次。脑电图的改变特异性不强，尿毒症、呼吸衰竭、低血糖亦可有类似改变。此外，脑电图对亚临床肝性脑病和i期肝性脑病的诊断价值较小。
3.诱发电位诱发电位
是大脑皮质或皮质下层接受到由各种感觉器官受刺激的信息后所产生的电位，其有别于脑电图所记录的大脑自发性电活动。根据受刺激感觉的不同部位可将诱发电位分为视觉诱发电位(VEP)、脑干听觉诱发电位(BAEP)和躯体感觉诱发电位(SEP)，诱发电位检查多用于轻微肝性脑病的诊断和研究。尚有一种p300事件相关电位，其与传统的诱发电位相比，具有不受刺激部位生理特性影响的特点。轻微肝性脑病患者的p300潜伏期延长。
4.心理智能测验心理智能测验
适合于肝性脑病的诊断和轻微肝性脑病的筛选。其缺点是受年龄、教育程度的影响。老年人和教育层次比较低者在进行测试时较为迟钝，影响结果。其他可用于检测轻微肝性脑病的方法尚有划线及系列打点试验。
5.影像学检查
急性肝性脑病患者进行头部CT或MRI检查时可发现脑水肿。慢性肝性脑病患者则可发现有不同程度的脑萎缩。此外，MRI检查可发现基底神经节有T1加权信号增强，与锰在该处沉积有关。开展的磁共振波谱分析(MRS)是一种在高磁场强(1.5t以上)磁共振扫描机上测定活体某些部位代谢物含量的方法。用质子(h1)mrs检测慢性肝病患者大脑枕部灰质和顶部皮质可发现某些有机渗透物质如胆碱、谷氨酰胺、肌酸等的含量发生变化。肝性脑病、轻微肝性脑病甚至一般的肝硬化患者均有某种程度的改变。
6.临界视觉闪烁频率检测
轻度星形细胞肿胀是早期的病理改变，而星形细胞肿胀(alztrimerⅡ型)会改变胶质-神经元的信号传导，视网膜胶质细胞在时形态学变化与aiztrimierⅡ型星形细胞相似，故视网膜胶质细胞病变可作为时大脑胶质星形细胞病变的标致，通过测定临界视觉闪炼频率可定量诊断，初步应用结果认为方法敏感，简单而可靠，可用于发现及检测轻微肝性脑病。
肠道细菌是指人肠道正常微生物，能够促进一些人体必需矿物质元素的吸收，生成多种人体生命活动所需要的维生素，利用现有的物质合成蛋白质等其他物质。对人体消化功能、抵抗疾病，以及神经调节之类意想不到的多种方面具有紧密的影响。根据不同细菌在总体中占有的比重，它们可以被分为主要与次要菌群。就人体肠道而言，细菌是其中的主要成分。其数目达到一百兆个，大约有五百至一千种不同的菌种。这些大量细菌大约可以分为三大类：有益细菌、中性细菌以及有害细菌。这个微型生态系统并非一直处于完全平衡的状态，它具有动态性，并且与人体状态有着密切关联.而一旦菌群失调，就很有可能会引起疾病，一些病情的加剧也是由于菌群引起的。从多种方面而言，肠道菌群的研究都是十分重要的。肠道菌群的检测主要是针对肠道内菌群的多少和类别进行测定。常见的方法有最基本的细菌培养，目前较为广泛的聚合酶链式反应技术、基于PCR基础上的16SrDNA指纹图谱技术。还有荧光原位杂交，基因芯片，宏基因组测序技术等一些新兴技术。
人体肠道中的微生物群落与宿主之间的关系极为密切，据研究，肠道菌群失调与多种临床疾病密切相关。中国授权专利CN107586862B公开了肠道菌群在儿童反复呼吸道感染诊断中的应用，本发明通过对儿童反复呼吸道感染患者进行16SrRNA测序，首次发现了在患者中存在丰度差异的菌群。对差异菌群进一步分析，发现其用于疾病的诊断具有较高的敏感性和特异性，提示可以通过检测菌群的丰度实现儿童反复呼吸道感染的早期精确诊断。
目前，尚未有文献公开肠道菌群与肝性脑病的关系。除免疫功能和营养状况的原因，肠道菌群在肝性脑病过程中的作用并不明确，探究肠道菌群在肝性脑病过程中的作用机制，寻找可用来进行肝性脑病早期诊断的微生物标志物具有重要的意义。
发明内容
基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于一种通过检测肠道菌群进行肝性脑病检测的方案。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及肝性脑病检测试剂盒，其特征在于包括：检测肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌丰度的试剂中的至少一种、两种或者三种。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌丰度的试剂独立地选自所述菌的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌丰度的试剂包括能够检测所述菌的16SrRNA引物
本发明另一方面还涉及检测微生物丰度的试剂在制备诊断肝性脑病的产品中的应用，其特征在于所述微生物选自绿假单胞菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌丰度的试剂中的至少一种、两种或者三种。
在本发明的一个优选实施方式中，所述肝性脑病是指慢性肝性脑病和/或急性肝性脑病。
有益效果
本发明首次发现了特定菌群在肝性脑病中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现肝性脑病的诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断，操作简单、特异性高、敏感性强。
附图说明
图1是示出肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌联合诊断的ROC曲线的图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
1、研究对象和样本收集
研究在瑞安市人民医院收集的30例中枢肝性脑病患者(慢性肝性脑病18例和急性肝性脑病12例)和30例年龄、性别无显著性差别的健康对照组。
分别收集实验对象的粪便样本，将样本冰冻并保存在-80℃冰箱内。详细记录患者的临床信息，包括性别、年龄等。本研究经本院伦理委员会审核与批准，并获得患者的知情同意。
2、DNA抽提和测序
使用DNA提取试剂盒自样本中提取DNA，操作步骤按说明书进行。
采用TransGen AP221-02(TransStart Fastpfu DNA Polymerase)进行PCR扩增反应，全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit进行文库的构建，具体步骤按照说明书进行。
以DNA片段为模板，PCR合成目标待测DNA片段，cBot上进行桥式PCR扩增，生成DNA簇，Hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。
3、数据分析
3.1数据预处理
使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PEreads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Usearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDPclassifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。
3.2肠道菌群物种差异分析
使用wilcox秩和检验对两组的不同水平上的物种水平进行检验，估算每个物种丰度对差异效果影响的大小。
3.3肠道菌群的随机森林分析
使用R包random Forest(随机森林)，输入各样本的分组信息，以及每个样本的属的丰度，设置决策树为500，分析属在疾病中的重要性。
4、结果
结果显示，与健康人群相比，肝性脑病患者在肠出血型大肠埃希菌(Enterohemorrhagic E.coli)、溶血孪生球菌(G.haemolysans)和肯茨创伤球菌(G.helcococcus)的水平呈现显著性差异(P＜0.05)。
实施例2荧光定量PCR验证相关菌群
1、对上述菌群进行大样本QPCR验证，按照实施例1中的样本收集方式收集健康人群和中枢肝性脑病患者的粪便样本各30例。
2、粪便细菌DNA的提取与定量
使用粪便基因组DNA提取试剂盒自粪便标本中提取细菌DNA，操作步骤按说明书进行；
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA测定所提粪便细菌总DNA浓度与纯度，并将所有样品DNA的质量浓度统一至100mg/L。
3、实时荧光定量PCR
1)引物设计与合成
根据细菌16SrRNA基因的V3-V4区序列对。设计特异性引物，并以16SrRNA通用引物作为参考基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2)QPCR扩增检验
配置20μl反应体系：模板DNA2μl，FAST START UNIVERSAL SYBR GREEN MASTER(ROX)10μl，ddH2O7μl，浓度为10μM待检测细菌的上下游引物各0.5μl；反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃2min，共35个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
3)ROC曲线分析
使用R语言中的pROC包分析肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，通过ROC曲线确定AUC值，结果如下表1所示。其中，肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌联合诊断的ROC曲线如图1所示。
表1：诊断AUC值
Figure BDA0002934410020000061
Figure BDA0002934410020000071
结果显示，与健康人相比，肝性脑病患者中的肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌呈现显著性差异(P<0.05)，同16SrRNA测序结果一致。肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌联合诊断的AUC值为0.816，应用于肝性脑病疾病具有较高的准确性。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (1)

1.检测粪便样本中微生物丰度的试剂在制备诊断肝性脑病的产品中的应用，其特征在于所述微生物为粪便样本中的肠出血型大肠埃希菌、溶血孪生球菌和肯茨创伤球菌，所述肝性脑病是指慢性肝性脑病或急性肝性脑病，所述试剂包括检测所述微生物的16SrRNA引物。
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