CN1314950A - 微生物和植物中的维生素c生产 - Google Patents

微生物和植物中的维生素c生产 Download PDF

Info

Publication number
CN1314950A
CN1314950A CN99809475A CN99809475A CN1314950A CN 1314950 A CN1314950 A CN 1314950A CN 99809475 A CN99809475 A CN 99809475A CN 99809475 A CN99809475 A CN 99809475A CN 1314950 A CN1314950 A CN 1314950A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gdp
epimerase
seminose
seq
microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99809475A
Other languages
English (en)
Inventor
艾伦·贝里
杰弗里·A·朗宁
戴维·K·西弗森
理查德·P·伯林盖姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DCV Inc
Original Assignee
DCV Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DCV Inc filed Critical DCV Inc
Publication of CN1314950A publication Critical patent/CN1314950A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种产生维生素C(抗坏血酸,L－抗坏血酸,或AA)的生物合成方法。这类方法包括发酵经遗传修饰的微生物或植物来产生L－抗坏血酸。特别地,本发明涉及至少含有一个遗传修饰的微生物和植物的使用,目的在于增加一种涉及抗坏血酸生物合成路径的酶的活性。本发明还包括为提高抗坏血酸的生物合成性生产,对编码差向异构酶的核苷酸序列的使用,所述差向异构酶包括来源于L－抗坏血酸途径的GDP－D－甘露糖:GDP－L－半乳糖差向异构酶以及它们的同系物。本发明也涉及遗传修饰的微生物,如可用于生产L－抗坏血酸的微藻类、细菌和酵母的菌株,和可用于生产可消耗的植物性食品的遗传修饰植物。

Description

微生物和植物中的维生素C生产
发明领域
本发明涉及用经遗传修饰的微生物和植物生产维生素C(L-抗坏血酸)。特别地，本发明涉及将核苷酸糖差向异构酶用于在植物和微生物中进行抗坏血酸的生物生产。
发明背景
几乎所有的生命形式，包括植物和动物，或合成抗坏血酸(维生素C)，或用它作营养物。抗坏血酸的用途被人认识首先是作为一种人和动物饮食的补充剂，用于防止坏血病。但抗坏血酸也影响人的生理功能，如铁的吸收，对寒冷的耐受，对肾上腺皮质的维持，伤口的痊愈，多糖和胶原的合成，软骨、牙质、骨、牙齿的形成，毛细管的维持，也是一种有用的抗毒剂。
作为一种饮食的补充剂，抗坏血酸可从天然资源中如蔷薇果(rosehips)中分离，也可通过L-山梨糖的氧化而化学合成，或由弱氧化醋杆菌对D-葡萄糖酸钙的有氧发酵产生。Considine，“抗坏血酸”，Van Nostr和氏百科全书(Van Nostr和｀s Scientific Encyclopedia)第1卷，237-238页(1989)。抗坏血酸(主要是细胞内的)也已从微藻植株粉核小球藻的发酵中得到。见Skatrud的美国专利号5,001,059，该专利已转让给本发明的受让人。据信抗坏血酸在光合微生物的叶绿体中产生，用于中和光合作用中产生的高能电子。相应的，抗坏血酸的产生被认为是光合生物中的一种保护机制。
因此，能改善通过生物合成而产生抗坏血酸的能力的产物和方法有利于促进人类健康，也确实存在这方面的需要。
发明简述
本发明的一个实施方案涉及涉及一种在微生物中产生抗坏血酸或酯的方法。这种方法包括步骤：(a)培养带一种遗传修饰的微生物，该改良旨在增加选自下组的一种酶的活性：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase),GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶；和(b)回收由该微生物产生的抗坏血酸或酯。优选的，所述遗传修饰是为了增加一种选自下组的酶的活性：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。在本发明方法的一个实施方案中，该微生物进一步包括了降低一种酶活性的遗传修饰，该酶的底物不是GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，而是GDP-D-甘露糖。这种遗传修饰可以包括，如一种降低GDP-D-甘露糖脱氢酶作用的遗传修饰。
在一个实施方案中，所述遗传修饰是为了增强一种催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化的差向异构酶的作用，其中包括GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶。在一个实施方案中，所述差向异构酶结合NAPDH。在该方法的一个实施方案中，所述遗传修饰包括用表达该差向异构酶的重组核酸分子转化该微生物。这类差向异构酶的三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose)差向异构酶/还原酶的三级结构(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)相吻合。优选的，所述差向异构酶与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)三级结构中至少25％的Cα位点平均均方根偏差小于2.5埃，更优选小于1埃。
在一实施方案中，所述差向异构酶包含一个底物结合位点，该位点的三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)的底物结合位点的三级结构基本上相符。优选该底物结合位点的三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)的底物结合位点三级结构中至少25％的Cα位点平均均方根偏差小于约2.5埃。
在另一实施方案中，差向异构酶包含一个催化位点，该位点的三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)的催化位点的三级结构基本上相符。优选该催化位点的三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)的催化位点的三级结构中至少25％的Cα位点平均均方根偏差小于约1埃。优选该催化位点包括丝氨酸，酪氨酸，赖氨酸残基，在一实施方案中，丝氨酸，酪氨酸，赖氨酸残基三级结构的位置分别与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标表示的Ser107,Tyr136和Lys140残基的三级结构位置基本上相符。
在本方法的另一实施方案中，差向异构酶包含一个氨基酸序列，该序列用CLUSTAL匹配程序与SEQ ID NO:11匹配，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与至少50％，在另一实施方案中至少75％，和在又一方案中90％的在SEQ ID NO:11的non-Xaa残基有100％的相同。在另一实施方案中，差向异构酶包含一个氨基酸序列，该序列包含4个连续的氨基酸残基与从SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQID NO:10这组中选出的氨基酸序列中至少4个连续的氨基酸残基100％相同。在另一实施方案中，重组核酸分子包括一个核酸序列，该序列包括至少约12个连续的核苷酸与从SEQ IDNO:1,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9这组中选出的核酸序列中至少12个连续的核苷酸100％相同。
在本发明方法的另一实施方案中，差向异构酶包含一个氨基酸序列拥有一个特征结构：Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly。在另一实施方案中，重组核酸分子包括一个核酸序列，用Lipman-Pearson方法用Lipman-Pearson缺省参数测定，该序列与从SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9这组中选出的核酸序列有至少15％相同，在另一实施方案中至少20％相同，在另一实施方案中至少25％相同。
在本发明方法的另一实施方案中，重组核酸分子包括一个核酸序列，该序列在严谨杂交条件下，与编码一种GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核酸序列杂交。这种编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核酸序列包括从SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5选出的核酸序列，GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶包括从SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6这组中选出的一段氨基酸序列。
在本发明方法的一个实施方案中，微生物选自细菌，真菌，微藻。在一个实施方案中，这种微生物耐酸。优选的细菌包括，但不限于，固氮菌和假单胞菌。优选的真菌包括，但不限于，酵母，其中包括但不限于腌菜糖酵母。优选的微藻包括，但不限于，Prototheca和衣藻属的微藻，Prototheca的微藻特别优选。
在本发明方法的另一实施方案中，微生物是耐酸的，培养的步骤在pH低于约6.0，更优选在pH低于约5.5，还更优选在pH低于约5.0的条件下进行。在一个实施方案中，培养的步骤能在一个包括除了D-甘露糖以外碳源的发酵培养基中进行，在另一实施方案中，培养的步骤在一个包括葡萄糖的发酵培养基中进行。
在本发明方法的另一实施方案中，培养的步骤在限制镁(Mg)含量的发酵培养基中进行。优选的，培养的步骤在限制镁(Mg)含量的发酵培养基中进行。在一实施方案中，在细胞生长期，发酵培养基含镁少于0.5g/L，还更优选地，更优选地，在细胞生长期镁低于0.1g/L。
本发明的另一实施方案涉及产生抗坏血酸和它的酯的微生物。该微生物通过一个遗传修饰来增加一种从下面一组中选出的酶的活性，该组包括：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。优选地，遗传修饰增加一种酶的活性，该酶包括：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。更优选地，增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
在一实施方案中，微生物已经遗传修饰以表达一个编码差向异构酶的重组核酸分子，该酶催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的转化，具有一个三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点平均均方根偏差小于2。5埃，小于1埃更优选，该差向异构酶/还原酶由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表。在另一实施方案中，微生物已经遗传修饰以表达一个编码差向异构酶的重组核酸分子，该酶催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的转化，该酶包含一个氨基酸序列，用CLUSTAL匹配程序与SEQ ID NO:11匹配，这一氨基酸序列中的氨基酸残基与至少50％SEQ ID NO:11的non-Xaa残基有100％的相同。优选地微生物已在前面讨论的方法中公开。
本发明的另一实施方案涉及产生抗坏血酸和它的酯的植物。该植物通过一个遗传修饰来增加一种酶的活性，该酶选自：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。在一优选实施方案中，所述遗传修饰为增加一种选自下组的酶的活性：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。在更优选的实施方案中，这类遗传修饰是增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
在一实施方案中，所述植物还包括降低一种酶的作用的遗传修饰，该酶是除了GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶以外的另一种以GDP-D-甘露糖为底物的酶。这类遗传修饰包括降低GDP-D-甘露糖脱氢酶作用的遗传修饰。这类植物也包括经遗传修饰表达一个重组核酸分子的植物，该重组核酸分子编码一种催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化的酶，该酶有一个三级结构与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(其由具有Brookhaven蛋白数据库登陆码1bws的原子坐标表示)三级结构中至少25％Cα位点的平均均方根偏差小于2.5埃。在另一实施方案中，这类植物已经遗传修饰以表达一种编码差向异构酶的重组核酸分子，该酶催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化，其中该酶包含一个应用CLUSTAL匹配程序可与SEQ ID NO:11匹配的氨基酸序列，该序列中的氨基酸残基与SEQ ID NO:11的至少50％非-Xaa残基有100％相同性。
在一实施方案中，产生本发明抗坏血酸或其酯的植物是微藻。优选的微藻包括但不限于Prototheca和衣藻属的微藻，尤其优选Prototheca微藻。在另一实施方案中，所述植物是高等植物，优选可消耗的高等植物。
附图简述
图1A显示植物中从葡萄糖到GDP-D-甘露糖的转化。
图1B显示植物中从GDP-D-甘露糖到L-半乳糖-1-磷酸的转化。
图1C显示植物中从L-半乳糖到L-抗坏血酸的转化。
图2A显示Prototheca中特定碳原子自葡萄糖开始的流向。
图2B显示Prototheca中特定碳原子自葡萄糖开始的流向。
图3显示自Prototheca moriformis ATCC 75669衍生的突变系，以及它们产L-抗坏血酸的能力。
图4条形图显示NA45-3细胞株在含各种浓度镁离子的培养基中生长后，重悬于含各种浓度镁离子的培养基中，其中的静息细胞引起的底物转化。
图5线性图显示Prototheca菌株培养物中特定抗坏血酸的形成与相同培养物的细胞提取物中GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶之特异性活性的关系。
图6线性图显示在两种菌株ATCC 75669和EMS13-4中特异性差向异构酶活性与镁的限制程度的关系。
图7描述由Barber提出的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的主要催化机制(1979，生物化学杂志(J.Biol.Chem),254:7600-7603)。
图8A描述GDP-D-甘露糖-4,6-脱氢酶的催化机制(将GDP-D-甘露糖转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖)。
图8B描述GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的催化机制(将GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖转化为GDP-L-岩藻糖)。(Chang等，1988，生物化学杂志，263:1693-1697；Barber,1980，植物生理(Plant Physiol)，66:326-329)。
发明详述
本发明涉及用于生产维生素C(抗坏血酸，L-抗坏血酸，或AA)的生物合成方法和微生物和植物的生产。这类方法包括发酵遗传修饰的微生物以产生L-抗坏血酸。特别是，本发明涉及编码差向异构酶的核苷酸序列的使用，包括L-抗坏血酸途径中内源性GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，及与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶有结构同源性(如所编码的蛋白质的核苷酸/氨基酸序列和/或三级结构有同源性)的差向异构酶，以提高抗坏血酸的生物合成产量。本发明也涉及遗传修饰的微生物，如，用于生产L-抗坏血酸的微藻，细菌和酵母菌株，和用于生产可消费植物食品的经遗传修饰的植物。
本发明的一个实施方案涉及通过发酵遗传修饰的微生物生产L-抗坏血酸的方法。这类方法包括步骤：(a)在发酵培养基中培养带一种遗传修饰的微生物，以增加下面一种的酶的活性：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶；和(b)回收由抗坏血酸或其酯。列出的不同酶代表在植物维生素C生物合成途径中涉及的酶。目前还不清楚由GDP-L-半乳糖磷酸化酶代表的酶是磷酸化酶还是焦磷酸化酶(即，GDP-L-半乳糖焦磷酸化酶)。因此，这里使用术语“GDP-L-半乳糖磷酸化酶”指GDP-L-半乳糖磷酸化酶或GDP-L-半乳糖焦磷酸化酶。在本发明的一个方面，本方法包括在一个在发酵培养基中培养带一种遗传修饰的微生物的步骤，以增加催化从GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的差向异构酶的作用。本发明此方面将详述如下。
本发明的另一实施方案涉及一种经遗传修饰产生抗坏血酸或其酯的微生物。本发明的另一实施方案涉及一种经遗传修饰产生抗坏血酸或其酯的植物。经遗传修饰的微生物(如细菌、酵母、微藻)和植物(如高等植物，微藻)具有增加选自下组的一种酶额作用的遗传修饰：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖异构酶，GDP-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。在一个优选的实施方案中，经遗传修饰的微生物(如细菌，酵母，微藻)和植物(如高等植物，微藻)具有增加催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖之酶的作用的遗传修饰。在一个实施方案中，所述遗传修饰包括用上述差向异构酶转化微生物或植物。
为了通过本发明方法生产明显高产量的L-抗坏血酸，遗传修饰植物和/或微生物以增强L-抗坏血酸的生产。如本文所用，遗传修饰的植物(如高等植物或微藻)或微生物，如微藻(Prototheca，衣藻)，大肠杆菌，或酵母是在其基因组内进行修饰(即突变或改变)和/或经重组技术(即遗传工程)改变其正常(即野生型或天然)形式。在优选的实施方案中，根据本发明遗传修饰的植物或微生物已通过重组技术改造。植物或微生物的遗传修饰可通过经典菌株发育和/或分子遗传学技术包括遗传工程技术来完成。这类技术已基本在此公开，并另公开在如Sambrook等，1989，分子克隆：实验室指南，冷泉港实验室出版社；Roessler,1995，植物脂类代谢，46-48页；Roessler等，1994，“燃料的生物转化(Bioconversion for fuels)”一书，Himmel等编，美国化学协会，Washington D.C.,255-70页)。这些文献均全文引入本文作为参考。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物或微生物可包括天然遗传变体，以及下述植物或微生物，其中对核酸进行了插入，删除或修饰，包括内源性基因突变(如核苷酸的插入，删除，取代，和/或颠换)，所用方式使所述改造在植物或微生物中提供所需效果。如上述，遗传修饰的植物或微生物包括用重组技术改造的植物或微生物。
如本文所用，导致基因表达减少，对基因表达或对基因产物(即，由该基因编码的蛋白)的抑制增加，基因功能降低，或基因产物的功能降低的遗传修饰均可称为基因的(完全或部分)失活，删除，中断，阻断，下调，或作用降低。如导致编码蛋白功能降低的基因改造可以是蛋白编码基因的彻底删除(即该基因不存在，因此该蛋白不存在)，编码蛋白的基因中导致蛋白不完整或不翻译(如该蛋白不表达)的突变，或基因中减弱或消除该蛋白天然功能(如所表达的蛋白减少或没有酶活性)的突变。
导致基因表达增加或功能增加的遗传修饰可称为基因的扩增，过量产生，过量表达，激活，增强，添加，上调或作用增强。另外，改变基因的表达，功能或活性的遗传修饰可影响特定代谢途径中其它基因的作用和它们表达产物的活性(如通过抑制或竞争)。在该实施方案中，特定基因和/或其产物的作用(如活性)可通过对同一代谢途径中另一基因的遗传修饰而影响(如上调或下调)，或通过对以竞争，抑制，底物形成等方式影响目的途径的另一代谢途径中某基因的遗传修饰而影响。
通常，具有影响L-抗坏血酸生产的遗传修饰的植物或微生物具有至少一个遗传修饰，如上述，其导致与相同条件培养的野生型植物或微生物相比，L-抗坏血酸的产生途径中有变化。在L-抗坏血酸产生途径中的这类改造，改变了该植物或微生物产生L-抗坏血酸的能力。根据本发明，经遗传修饰的植物或微生物优选比同样条件下培养的野生型植物或微生物产生L-抗坏血酸的能力增强。
本发明基于本发明者对L-抗坏血酸(维生素C)在植物和微生物的生物合成途径的发现。在本发明之前，植物生产L-抗坏血酸的代谢途径没有完全阐明。本发明者证实L-抗坏血酸在植物，包括产L-抗坏血酸之微生物(如微藻)中的生产，是一种利用GDP-D-甘露糖并涉及糖磷酸酯和NDP-糖的途径。另外，本发明人惊讶地发现，在产L-抗坏血酸微藻包括Prototheca和Chlorella pyrenoidosa中，L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯均能快速转变成L-抗坏血酸。在植物中L-抗坏血酸产生的完整途径在图1A-1C中显示。更具体地，图1A显示了L-抗坏血酸的植物内产生过程，从甘露糖中间体产生GDP-D-甘露糖，而后GDP-D-甘露糖经GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶(也称作GDP-D-甘露糖-3,5-差向异构酶)转化为GDP-L-半乳糖(图1B)，然后向L-半乳糖-1-P、L-半乳糖、L-半乳糖酸(任选)、L-半乳糖酸-γ-内酯、及L-抗坏血酸转化(图1C)。图1B还说明利用各种中间产物如GDP-D-甘露糖的另一途径。该途径的某些方面已另行公开(Wheeler等，1998，天然393:365-369)，其全文引用作为参考。
L-抗坏血酸产生途径中能作为遗传修饰的目标而影响L-抗坏血酸生成的位点通常可划分为以下途径中的至少一种：(a)影响GDP-D-甘露糖产生的途径(如将一种碳源转化为GDP-D-甘露糖的途径)；(b)将GDP-D-甘露糖转化为其它化合物的途径；(c)与GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶作用相关或位于其下游的途径；(d)与L-抗坏血酸生产途径中任何中间产物的生成竞争底物的途径，所述中间产物尤其指GDP-D-甘露糖，GDP-L-半乳糖，L-半乳糖-1-磷酸，L-半乳糖，L-半乳糖酸-γ-内酯，和/或L-抗坏血酸；和(e)抑制L-抗坏血酸生产途径中任何中间产物的生成的途径，所述中间产物尤其指GDP-D-甘露糖，GDP-L-半乳糖，L-半乳糖-1-磷酸，L-半乳糖，L-半乳糖酸-γ-内酯，和/或L-抗坏血酸。
本发明方法中有用的经遗传修饰的植物或微生物通常在L-抗坏血酸生产途径中至少有一个遗传修饰，其使得L-抗坏血酸产量增加。在一个实施方案中，经遗传修饰的植物或微生物至少有一个遗传修饰使得：(a)GDP-D-甘露糖的产量增加，(b)抑制GDP-D-甘露糖转化为除GDP-L-半乳糖以外的化合物的途径；(c)增强GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用；(d)增强GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶下游酶的作用；(e)抑制与L-抗坏血酸生产途径中任何中间产物的生成竞争底物的途径，尤其与GDP-D-甘露糖，GDP-L-半乳糖，L-半乳糖-1-磷酸，L-半乳糖，L-半乳糖酸-γ-内酯，和/或L-抗坏血酸竞争的途径；和(f)抑制对L-抗坏血酸生产途径中任何中间产物的生成造成抑制的途径，尤其抑制GDP-D-甘露糖，GDP-L-半乳糖，L-半乳糖-1-磷酸，L-半乳糖，L-半乳糖酸-γ-内酯，和/或L-抗坏血酸的途径。
经植物或微生物的遗传修饰增加GDP-D-甘露糖的生产可通过如过量表达诸如己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶(PMI)，磷酸甘露糖变位酶(PMM)，和/或GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)来实现。对GDP-D-甘露糖转化为除GDP-L-半乳糖以外的化合物的途径进行抑制可通过如对多糖合成、GDP-D-鼠李糖合成、GDP-L-岩藻糖合成、和/或GDP-D-甘露糖醛酸合成的抑制来实现。增强L-抗坏血酸生成途径中GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶及其下游酶的效应的遗传修饰包括但不限于：过量表达该差向异构酶基因(即过量表达编码该差向异构酶基因或其同源基因(如下述)的重组核酸分子)，和/或使内源基因或重组基因突变以增强该基因的表达)，和/或过量表达L-抗坏血酸途径中该差向异构酶下游编码后续酶的基因。最后，对与L-抗坏血酸产生途径竞争或对其抑制的途径进行抑制可通过使对L-抗坏血酸途径中的酶，底物或产物造成抑制或形成竞争的酶，底物或产物被删除或突变来实现。
如上述，本发明方法中有用的经遗传修饰的植物或微生物在编码涉及L-抗坏血酸产生途径的酶的基因中有至少一个遗传修饰(如内源基因的突变或加入重组基因)。这类遗传修饰优选地增加(即增强)这类酶的作用以便与其它在相关代谢途径中的可能终产物相比，L-抗坏血酸优先产生。这类遗传修饰包括，但不限于编码这类酶的基因的过量表达，和删除，突变或编码这类酶的竞争物或抑制物的基因的下调。可对其基因进行遗传修饰的酶优选包括：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶(PMI)，磷酸甘露糖变位酶(PMM),GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP),GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。更优选地，本发明有用的经遗传修饰的植物或微生物含有增加一种酶作用的遗传修饰，该酶选自：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和/或L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。更优选地，本发明有用的经遗传修饰的植物或微生物有一个增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶作用的遗传修饰。这些酶和被这些酶催化的反应在图1A-1C中例示。
在本发明之前，因为不知道L-抗坏血酸生物合成(即产生)途径，先前的诱变和筛选努力局限于仅能检测非致死突变。本发明的一个实施方案涉及删除一个使L-抗坏血酸合成中碳原子的流向转向的关键竞争酶。如果该酶对于生长于葡萄糖上绝对必需，那么缺少该酶(因此增加流向L-抗坏血酸的碳碳原子)的突变体将不能存活也无法用在先筛选工作进行检测。其中一种酶是磷酸果糖酸酶(PFK)(图2A)。PFK是生长于葡萄糖上所必需的，并且是把碳从L-抗坏血酸生物合成中转出的关键步骤。PFK的删除将使得细胞无法在基于葡萄糖的培养基上生长。通过改变温度而筛选PFK失活的条件突变体，可以如在允许发酵条件下使细胞生长并实现对L-抗坏血酸的加工，而将温度变为非允许条件时L-抗坏血酸的产生(从葡萄糖)受抑制。此例中，温度的变化将阻止碳原子从葡萄糖经PFK进入糖酵解，从而使碳原子进入L-抗坏血酸代谢途径。该方法不仅为天然的产L-抗坏血酸生物所用，还为本文所述L-抗坏血酸重组系统(遗传工作的植物或微生物)所用。
了解L-抗坏血酸产生途径中限速酶的特性和机制可设计该酶的特异性抑制物，其也抑制生长。筛选这类抑制物抗性突变体可分离包含L-抗坏血酸途径的酶且具有更优化动力学特性的菌株。因此，本发明的一个实施方案是鉴定同时也抑制生长的酶抑制物。再用这些抑制物筛选能克服这类抑制作用并能高水平产生L-抗坏血酸的基因突变体。在该实施方案中，所获植物或微生物是非重组菌株，可在必要时通过重组技术进一步改造。在产L-抗坏血酸的重组菌株中，可用随机诱变和筛选作为增加L-抗坏血酸产量的最后步骤。
在另一个实施方案中，直接对产L-抗坏血酸生物进行遗传修饰。这样可利用此前经典菌株改良工作中获得的数据进行改造，且可能更重要的是，可利用经典菌株改良期间出现的不明良性突变体。此外，表达天然基因相对于异源基因几乎很少遇到问题。用于开发微藻遗传系统的最优化系统是针对莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。优选地，对这类遗传修饰的生产型生物的开发包括：用克隆的选择标志基因如URA 3分离有特殊营养要求的突变体(与在酵母和真菌系统中用的Ura3突变体相似)；或识别和克隆对有毒化合物有特异性抗性的基因(这与在细菌系统中使用抗生素抗性基因类似，而在酵母和其它真菌中，需要反复插入/删除标志基因，除非已开发了几种不同的选择标志)；用于将DNA导入生产型生物并获得稳定转化和表达的转化系统；和一个(优选几个)在生物中高水平表达克隆的基因的启动子系统。
本发明的另一实施方案(详述如下)是将产L-抗坏血酸生物(即高等植物和微藻)中关键基因或等位变体及其同源基因放入便于分子遗传操作的植物或微生物中，包括内源产L-抗坏血酸的微生物和合适的植物。如可根据在低pH值时的生长要求(在葡萄糖上)鉴定适当的非致病生物(即耐酸生物，详述如下)。
可在任何适宜的宿主生物中重组生产的一个合适选择是编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶及其同系物，和任何在一级结构(即序列)或三级结构(即，三维)水平上，与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶，或UDP-半乳糖-4-差向异构酶有结构相似的其它差向异构酶。很多微生物即使不产生L-抗坏血酸也产生GDP-D-甘露糖作为外源多糖和糖蛋白生成的前体。下面将详细讨论本发明的这一部分。
参考图1A-1C，很多生物中至少含有从葡萄糖-6-磷酸到GDP-D-甘露糖途径的某些酶。实际上，诸如维涅兰德固氮菌和铜绿假单胞菌等细菌中包含整个序列，并构成外源多糖藻酸盐生物合成的早期步骤。因此有可能阻止这些生物产生L-抗坏血酸的唯一方式是GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的缺乏。在如此众多生物中PMI,PMM和GMP(见图1A)的存在显得重要的原因有二。第一，通过依靠已有的早期途径上的酶和加入需要的克隆基因(差向异构酶及可能的其它成分)，这些生物本身可以作为L-抗坏血酸生产的可替换宿主。第二，编码PMI,PMM和GMP的基因可以克隆进入新的生物，在其中与克隆的差向异构酶一起编码从葡萄糖-6-磷酸到GDP-L-半乳糖的整个途径。
为了从不同生物中筛选基因组DNA或cDNA文库，并分离编码这些酶如GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的核酸分子，可使用各种标准分子和生化技术，如可以从诸如Prototheca等生物中纯化GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，测定其N末端氨基酸序列(必要时包括内部肽片段的序列)，此信息可用于设计从该生物DNA中扩增基因片段所需的简并引物，然后用此片段作探针筛选文库，将与该探针杂交的片段克隆进该生物或其它适合的生产型生物。植物酶在细菌如大肠杆菌中以活性形式表达有许多先例。此外，酵母也适于开发L-抗坏血酸生产的异源系统。
应理解本发明公开了一种方法，其包括使用能在发酵过程中产生商业有效量的L-抗坏血酸的微生物的使用(即其产L-抗坏血酸的能力比在相同条件下培养的野生型微生物强)。该方法通过对L-抗坏血酸途径中蛋白的一种或多种编码基因进行遗传修饰，导致产生(表达)比相应野生型蛋白功能改变(如增加或降低)的蛋白。优选通过重组技术实施这类遗传修饰。本领域技术人员将倾向于，诸如用编码特定酶的核酸分子转化植物或微生物，而产生特定功能已如本文其它处所述改变(如产GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的能力增强)的遗传修饰植物或微生物，可以产生大量符合所需功能要求的微生物，虽然可能需依赖多种不同的遗传修饰。如在特定核酸序列上的不同随机核苷酸删除和/或取代可以产生相同的表型(如该序列编码的酶活性降低)。本发明包括任何这类遗传修饰，其导致具有本文所述特征的植物和微生物的产生。
在本发明发酵方法中优选使用的微生物是已如上述公开进行了遗传修饰的细菌，真菌或微藻。虽然本发明包括利用对途径中关键组分的认识及本文提供的指导进行了遗传修饰，从而可产生L-抗坏血酸的微生物，但对本发明有用的微生物更优选能生产L-抗坏血酸的微藻。还更优选对本发明有用的微生物是耐酸微生物，如Prototheca和衣藻。耐酸酵母和细菌已为本领域所知。耐酸微生物详述见下。具体优选的微藻包括Prototheca和衣藻，最优选Prototheca。所有已知的Prototheca种都产生L-抗坏血酸。通过Prototheca和衣藻类微藻生产抗坏血酸详述于：1998年8月11日颁发的美国专利号5,792,631，和1999年5月4日颁发的美国专利号5,900,370，均已全文引入作参考。本发明优选使用的细菌包括，但不限于固氮菌，假单胞菌和埃希氏菌，虽然耐酸细菌更优选。本发明优选使用的真菌包括酵母，更优选糖酵母属酵母。在本发明发酵方法中使用的微生物是也可称为生产型生物。根据本发明，微藻在本文中即可作为微生物也可作为植物。
按照本发明，用于遗传修饰的优选植物是适于被动物包括人消耗的植物。更优选这类植物是能天然产生L-抗坏血酸的植物，但其它植物也能通过这里提供的方法经遗传修饰生产L-抗坏血酸。
Prototheca和Chlorella pyrenoidosa的L-抗坏血酸生产途径将作为本发明的具体实施方案描述如下。优选其它植物，特别是其它微生物，具有相似的L-抗坏血酸途径和基因和该途径中结构和功能相似的蛋白。优选对不能天然产生L-抗坏血酸的植物和微生物本发明进行改造，以产生L-抗坏血酸。这样，下述与Prototheca和衣藻有关的原则也适用于其它植物和微生物，包括遗传修饰的植物和微生物。
本发明的一个实施方案中，L-抗坏血酸产生途径中的酶活性通过该途径中酶的放大表达(即过量表达)来增加，特别是，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，该差向异构酶的同系物，和/或该差向异构酶下游的酶。酶的过量表达可通过如导入编码此酶的重组核酸分子而实现。优选将编码L-抗坏血酸生产途径中酶的基因置于人工启动子的控制下。该启动子可以是任何启动子，只要其使酶的表达在该生产型生物中确保足量的L-抗坏血酸。优选的启动子是组成型(不是诱导型)启动子，这样也无需加入昂贵的诱导物。根据本发明，重组核酸分子的基因量(拷贝数)根据最大产量的要求而不同。在一个实施方案中，编码L-抗坏血酸生产途径中基因的重组核酸分子被整合进该微生物的染色体中。
本发明的另一实施方案提供一种微生物，其L-抗坏血酸产生途径中有一或多种酶与底物的亲和力增加。与底物亲和力增加的酶能由遗传修饰或蛋白质工程的适当方法产生。如基于计算机的蛋白质工程能用来设计具有更大的稳定性和对底物更大亲和力的差向异构酶蛋白。见如，Maulik等，1997，分子生物技术：治疗应用和策略，Wiley-Liss,Inc，全文引用作为参考。
编码L-抗坏血酸产生途径中蛋白的重组核酸分子能用任何适当的遗传修饰方法改造而增加或减少该蛋白的功能(即活性)，如按所需增加L-抗坏血酸产量。例如，编码蛋白的重组核酸分子能通过任何方法如易错PCR实施核苷酸的插入，删除，和/或取代。在该方法中，该基因在特定条件下扩增，所述条件致使扩增所用DNA聚合酶产生高频掺入错误。于是，在PCR产物中得到高频率突变。通过检验突变基因致使待检微生物比携带非突变重组核酸分子的微生物L-抗坏血酸的生产增加的能力，可筛选基因突变体的增强的底物亲和力、增强的酶活性、或降低/增强的抑制能力。
本发明的另一实施方案包括一种微生物，其竞争性附反应受到阻碍，包括所有以GDP-D-甘露糖为底物但不产生L-抗坏血酸的反应。在一个优选的实施方案中，提供了与GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶竞争GDP-D-甘露糖底物的酶的编码基因完全或部分失活(作用降低)的微生物。这类酶包括GDP-D-甘露聚糖酶和/或GDP-D-甘露糖脱氢酶。如本文所用，基因的失活可指导致该基因活性(即表达或功能)降低，包括活性减弱或完全丧失的任何修饰。
如上述，通过本发明中遗传修饰微生物的发酵来生产L-抗坏血酸的一个具体优选方法包括在发酵培养基中培养微生物的步骤，该微生物具有使催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的差向异构酶活性增加的遗传修饰。根据本发明，这类差向异构酶包括上述L-抗坏血酸途径中内源的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和任何其它在一级结构(即序列)或三级结构(即三维)水平上，与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶，或UDP-半乳糖-4-差向异构酶有结构相似的差向异构酶。这类结构同源性在下文详述。优选这类差向异构酶能催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖。在一个实施方案中，所述遗传修饰包括用表达这类差向异构酶的重组核酸分子转化该微生物。
因此，本发明方法和生物中所含差向异构酶包括，在L-抗坏血酸天然生物合成途径中工作的内源差向异构酶(本文指GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶)，GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶，和能催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖并与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶，或UDP-半乳糖-4-差向异构酶结构相似的任何其它差向异构酶。本发明能催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化的差向异构酶可以通过生化和功能特征以及结构特征来识别。如本发明差向异构酶能作用于GDP-D-甘露糖底物，更特别地，这类差向异构酶能催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化。需要理解这类能力不一定是差向异构酶在其内源(即天然)环境下作用的正常或天然的功能。如GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶在其天然环境中的正常条件下，催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-岩藻糖的转化而不直接作用于GDP-D-甘露糖(见图8A,B)，但本发明是利用差向异构酶能或经改造后能催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化的能力生产抗坏血酸。因此，本发明包括：用于抗坏血酸生产中有期望酶活的，能具有这类期望酶活的，和/或能经改造或诱导具有这类期望酶活的差向异构酶。
在一个实施方案中，本发明的差向异构酶包括催化如图7所述反应的差向异构酶。在另一个实施方案中，本发明的差向异构酶包括催化如图8B描述的第一个反应中的差向异构酶。在一个实施方案中，本发明一个差向异构酶与NAPDH结合。在另一个实施方案中，本发明差向异构酶的酶活性依赖NAPDH。
如上所述，本发明人已发现在植物或微生物L-抗坏血酸生物合成途径中的一个关键酶是GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶(参见图1A-1C)。这里描述的本发明的一个实施方案是为了对该酶及其结构类似物进行改造以增加遗传工程植物和/或微生物的L-抗坏血酸产量。更具体地，L-抗坏血酸途径的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶被认为在序列和三级结构水平上是结构同系物；GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶被认为能在L-抗坏血酸生物合成途径中起作用；GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶或其同系物可能比GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶更能增加遗传修饰的植物和/或微生物中L-抗坏血酸的生产。而且，本发明人公开了用编码全部或部分GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核苷酸序列作探针鉴定编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的基因。相似地，本发明人公开了用编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶基因的核苷酸序列设计寡核苷酸引物，用于经PCR鉴定并克隆编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的基因。
不束缚于理论，本发明人认为下列证据支持新概念：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶在序列和/或三级结构水平上有显著的结构同源性，GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶和/或其同系物可用于抗坏血酸的生产和/或分离内源GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶。
虽然在本发明以前，并不知道GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶(也称为GDP-D-甘露糖-3,5-差向异构酶)在L-抗坏血酸生物合成中起关键作用，但它被描述成能总体上催化GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的可逆反应(Barber,1971,Arch.Biochem.Biophys.147:619-623；Barber,1975，Arch.Biochem.Biophys.167:718-722；Barber,1979，生物化学杂志254:7600-7603；Hebda等，1979,Arch.Biochem.Biophys.194:496-502；Barber和Hebda,1982，酶学方法(Meth.Enzymol.) 83:522-525)。虽然有这些研究，但GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的特性一直未得到明确认识，其编码基因也没有被克隆和测序。自从Barber的开创性工作以后，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的活性由本申请的承让人在无色的微藻Prototheca moriformis中测到，在拟南芥和豌豆胚轴中也测到了(Wheeler等，1998，同上)。
Barber(1979，生物化学杂志，254:7600-7603)提出了部分纯化自衣藻Chlorella pyrenoidosa的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的机制。提出的GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的整个转化过程包括：氧化C-4位的己糖基为酮基中间体，形成烯二醇(ene-diol)，通过双键的再水化以及酮基的立体专一性还原在C-3和C-5位发生构象转化。提议的机制见图7。
基于Barber的工作，Feingold和Avigad(1980，植物生物化学，第3卷：糖；结构和功能，P.K.Stompf和E.E.Conn编，学术出版社(AcademicPress),NY)在提出的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的机制上作了更详细的阐述。该机制基于以下假设：差向异构酶包含紧密结合的NAD+，一个氢阴离子从底物(GDP-D-甘露糖)C-4转移到与酶结合的NAD+上从而把该酶转化为还原形式(NADH)，产生酶-结合GDP-4-酮基-D-甘露糖。后者将通过烯二醇机制差向异构化。终产物(GDP-L-半乳糖)在将最初从C-4移去的氢阴离子立体专一的转移后，从酶上释放出来，同时产生氧化型的酶。
L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)是细菌脂多糖，哺乳动物和植物的糖蛋白及植物细胞壁多糖的一个成分。L-岩藻糖从GDP-D-甘露糖经GDP-D-甘露糖-4,6-脱氢酶(一个依赖NAD(P)的酶)，和一个双功能GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(依赖NADPH)，在科学文献中也被称作GDP-岩藻糖合成酶的依次作用而重新合成(Rizzi等，1998，结构6:1453-1465；Somers等，1998，结构6:1601-1612)。L-岩藻糖的这一生物合成途径看起来是普遍的(Rizzi等，1998，结构6:1453-1465)。GDP-D-甘露糖-4,6-脱氢酶和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的机制在图8A,B中显示(Chang等，1988，生物化学杂志，263:1693-1697；Barber,1980，植物生理学，66:326-329)。
将图7和图8A,B比较显示Barber提出的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的机制与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的反应机制类似。同样的机制也显示在两种TDP-6-脱氧-己糖自TDP-D-葡萄糖的生物合成中发生的差向异构反应中，这两种己糖是TDP-L-鼠李糖和TDP-6-脱氧-L-塔罗糖(Liu和Thorson,1994，微生物年鉴(Ann.Rev.Microbiol)48:223-256)。但在后一情形中，最终C-4的还原由该差向异构酶中分离的依赖NADPH的还原酶催化。这些还原酶具有对应于TDP-L-鼠李糖或TDP-6-脱氧-L-塔罗糖的立体专一性(Liu和Thorson,1994，微生物年鉴48:223-256)。
在上述所有机制中，在C-4的最终还原需要NAD(P)H(参见图8B)。在Hebda等的工作中(1979,Arch.Biochem.Biophys.194:496-502)，报告C.pyrenoidosa的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的活性不需要NAD,NADP或NADH。奇怪的是，未检测NADPH。基于与图7和8A,B所示类似的机制，本发明人认为C.pyrenoidosa的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶可能在最后的还原步骤中需要NADPH。为什么体外没有加入NADPH可以测到活性还不知道，但NADPH与酶的紧密结合可以解释这一现象。另一方面，如果Feingold和Avigad提出的机制(1980，植物生物化学，卷3,101-170页：糖；结构和功能，P.K.Stompf和E.E.Conn编，学术出版社，NY)是正确的，这类产生于差向异构酶反应的第一个氧化步骤，被还原的酶结合的辅因子将在最后一步C-4位酮基还原醇的反应中作为电子源。这样在体外无需加入活性所需的外源还原辅因子。
最近，编码双功能GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的人基因被克隆出来并进行了序列分析(Tonetti等，1996，生物化学杂志，271:27274-27279)。人GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的氨基酸序列与大肠杆菌GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶有明显的同源性(29％)(Tonetti等，1998,Acta Cryst,D54:684-686；Somers等，1998，结构6:1601-1612，这里都全文引用作为参考)。Tonetti等和Somers等还发现了大肠杆菌GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶(也称为GDP-岩藻糖合成酶)的三级(三维)结构，并提到其与另一种酶UDP-半乳糖-4-差向异构酶(GalE)结构上显著同源。这些差向异构酶在序列水平上也有明显的同源性。既然编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的基因尚未克隆和测序，与编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的基因或编码UDP-半乳糖-4-差向异构酶的基因之间的同源性就没有揭示过。但是，基于GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶反应产物(即分别是GDP-L-半乳糖和GDP-6-脱氧-半乳糖[即GDP-L-岩藻糖])的相似性和相同的催化机制(图7和图8A,B)，本发明人相信编码这些酶的基因会有很高程度的序列同源性和三级结构同源性。
GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶明显的结构同源性使GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶或其同系物可以在L-抗坏血酸生物合成途径中起作用，并且在遗传修饰的植物和/或微生物中GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶可能比GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶更能增加L-抗坏血酸的生产。而且，编码全部或部分GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核苷酸序列可以用作识别编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的基因。同样的，编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶基因的核苷酸序列可用来设计寡核苷酸引物，用于经PCR识别并克隆编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的基因。
用GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶取代GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶在植物或微生物中增加L-抗坏血酸分生物合成的能力取决于GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶直接作用于GDP-D-甘露糖而形成GDP-L-半乳糖的能力。有证据显示该可能性确实存在。拟南芥murl突变体的GDP-D-甘露糖-4,6-脱氢酶活性缺失(Bonin等，1997，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:2085-2090)。这些突变体因此在GDP-L-岩藻糖的生物合成中受阻，结果植物气生部分的初生细胞壁中L-岩藻糖量低于正常情况的2％(Zablackis等，1996，科学272:1808-1810)。该murl突变体比野生型植物更脆弱，略微矮小，有正常的生活周期(Zablackis等，272:1808-1810)。当murl突变体在外源L-岩藻糖存在时生长，该植物中L-岩藻糖的含量恢复到野生型的水平(Bonin等，1997，美国国家科学院院报94:2085-2090)。有人(Zablackis等，1996，科学272:1808-1810)发现murl突变体在初生细胞壁的半纤维素木葡聚糖(xyloglucan)成分中含代替正常L-岩藻糖的L-半乳糖。在木葡聚糖成分中通常不会发现L-半乳糖，但在murl突变体中L-半乳糖部分代替了末端L-岩藻糖残基。Bonin等(1997，美国国家科学院院报94:2085-2090)推测在murl突变体缺乏GDP-D-甘露糖-4,6-脱氢酶时，通常参与L-岩藻糖合成的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶可直接利用GDP-D-甘露糖形成GDP-L-半乳糖。但另一种可能是涉及拟南芥L-抗坏血酸的生物合成的酶在murl突变体中合成GDP-L-半乳糖。如果这是真的，将意味着在野生型植物中，存在某些机制阻止L-抗坏血酸途径中形成的GDP-L-半乳糖进入细胞壁生物合成途径并取代GDP-L-岩藻糖(与之竞争)掺入木葡聚糖(因为L-半乳糖在野生型植物的初生细胞壁中不存在)。
因为GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶在反应机制上相似，并因为DP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶能直接作用于GDP-D-甘露糖形成GDP-L-半乳糖，本发明人相信编码所有针对GDP-D-甘露糖的差向异构酶和差向异构酶/还原酶的基因具有高度同源性。这样，本发明的一个方面涉及使用与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶具有明显同源性(在一级，二级和/或三级结构水平)的任意差向异构酶(和编码它的核酸序列)，目的在于增加L-抗坏血酸生物合成产量。
因此，如上所述，本发明的一个实施方案涉及在微生物中生产抗坏血酸或其酯的方法，包括培养一种经遗传修饰的微生物，该遗传修饰是要增加催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的差向异构酶的作用。本发明也包括经遗传修饰的微生物和植物，对它们的遗传修饰是为了增加催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的差向异构酶的作用。
按照本发明，在L-抗坏血酸生产途径中GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶作用的增加可以通过遗传修饰来实现，所述遗传修饰包括，但不限于过量表达GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶基因，其同源基因，或任何重组核酸序列，其编码的异构酶在一级结构(核酸或氨基酸序列)或三级结构(即三维蛋白)上与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶，或UDP-半乳糖-4-差向异构酶同源，如通过过量表达编码差向异构酶基因或其同源基因的重组核酸分子和/或通过突变内源基因或重组基因以增强该基因的表达。
根据本发明，在三级结构上与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构有同源性的酶是这样一种酶，它具有的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构基本相符(表12)。在另一个实施方案中，在三级结构上与GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构有同源性的酶是这样一种酶，它具有的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1GFS的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构基本相符。如本文所用，蛋白的“三级结构”或“三维结构”是可替换的术语，指组成该蛋白质三维空间的成分及其排列的方式。术语“基本符合”指差向异构酶至少有部分三级结构在空间上与一特定原子坐标组(如由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的那些)至少部分特定的三维构象充分相似，这样以该特定原子坐标组为基础估计确定该酶三维构象的原子坐标，就可对该酶至少该部分的三级结构模型化或计算(即，通过分子取代)。
更具体地，基本符合一组特定原子坐标的三级结构在至少约25％的Cα位点与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的三级结构相比，平均均方根偏差(RMSD)小于约2.5埃，更优选小于约2埃，按优选性递增，小于约1.5埃，小于约1埃，小于约0.5埃，最优选小于约0.3埃。在另一个实验方案中，基本符合一组特定原子坐标的三级结构在至少约50％的Cα位点与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在另一个实验方案中，这类结构在至少约75％的Cα位点与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在另一个实验方案中，这类结构在约100％的Cα位点与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)。计算RMSD的方法在本领域为人所熟知。测定一种或多种蛋白三级结构同源性的不同软件在本技术领域为人所知，并可公开得到，如QUANTA(Molecular Simulations Inc。)
按本方法及本发明遗传修饰的生物，催化从GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化优选的差向异构酶有一个底物结合位点，其三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的底物结合位点的三级结构基本上相符。优选地，该酶底物结合位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构相比，在至少25％的Cα位点中平均均方根偏差(RMSD)小于约2.5埃，更优选小于约2埃，按优选性递增，小于约1.5埃，小于约1埃，小于约0.5埃，最优选小于约0.3埃。在其它实验方案中，该差向异构酶底物结合位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构相比，在至少50％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在另一实验方案中，该差向异构酶底物结合位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构相比，在至少75％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在另一实验方案中，该差向异构酶底物结合位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构相比，在约100％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构在Rizzi等，1998，同上中详述。另外，由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1GFS的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶底物结合位点的三级结构在Somers等，1998，同上中详述。
本发明另一优选的差向异构酶包含一个催化位点，其三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的催化位点的三级结构基本上相符。优选地，该差向异构酶催化位点的三级结构在至少25％的Cα位点上与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构相比，平均均方根偏差小于约2.5埃，更优选小于约2埃，按优选性递增，小于约1.5埃，小于约1埃，小于约0.5埃，最优选小于约0.3埃。在其它实施方案中，该差向异构酶催化位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构相比，在至少50％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在另一实施方案中，该差向异构酶催化位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构相比，在至少75％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。在又一实施方案中，该差向异构酶催化位点的三级结构与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构相比，在约100％的Cα位点中具有上述平均均方根偏差(RMSD)。
在一个实施方案中，本发明包括的差向异构酶在其一个催化位点中包括丝氨酸，酪氨酸和赖氨酸残基。在一优选实施方案中，丝氨酸，酪氨酸，赖氨酸残基的三级结构位置分别与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的Ser107,Tyr136和Lys140残基的三级结构位置基本上相符。由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构在Rizzi等，1998，同上中详述。另外，由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1GFS的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶催化位点的三级结构在Somers等，1998，同上中详述。
在一个更优选的实施方案中，上述“基本符合”可进一步定义为包括氨基酸侧链的原子。如本文所用，短语“共有氨基酸侧链”是指其为基本符合一组给定原子坐标的结构和确实由这类原子坐标代表的结构所共有。优选地，基本符合一组特定原子坐标的结构是在至少25％的共有氨基酸侧链上与由该组原子坐标代表的三级结构相比，平均均方根偏差(RMSD)小于约2.5埃，更优选小于约2埃，按优选性递增，小于约1.5埃，小于约1埃，小于约0.5埃，最优选小于约0.3埃。在另一实施方案中，基本符合一组特定原子坐标的结构是在至少50％的共有氨基酸侧链上与由该组原子坐标代表的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)，在又一实施方案中，该结构在至少75％的氨基酸侧链上与由该组原子坐标代表的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)，在又一实施方案中，该结构在约100％的氨基酸侧链上与由该组原子坐标代表的三级结构相比，具有上述平均均方根偏差(RMSD)。
基本符合一组特定原子坐标的差向异构酶的三级结构可用合适的模型化计算机程序如MODELER(A.Sali和T.L.Blundell，分子生物学杂志，卷234:779-815,1993，如在InsightⅡ同源软件包(InsightⅡ(97.0),MSI，圣地亚哥)中实施的)，使用诸如衍生自如下数据的信息而模型化：(1)该差向异构酶的氨基酸序列；(2)由该特定原子坐标组代表的蛋白质相关部分的具有三维构象的氨基酸序列；和(3)该特定三维构象的原子坐标。或，基本符合一特定原子坐标组的差向异构酶的三级结构可用分析该差向异构酶晶体结构时产生的数据来模型化。基本符合一特定原子坐标组的差向异构酶的三级结构也可用如分子取代这样的方法计算出来。分子取代的方法为本领域的技术人员熟知(主要见Bmnger，酶学方法，卷276,558-580页，1997；Navaza和Saludjian，酶学方法，卷276,581-594页，1997；Tong和Rossmann，酶学方法，卷276,594-611页，1997；和Bentley，酶学方法，卷276,611-619页，1997；这里全文引用每篇文献作为参考)并在软件程序如XPLOR(Brunger等，科学，卷235,458页1987)中运行。另外，可用主要由Sali，生物技术当前观点(Current Opinion in Biotechnology)，卷6,437-451,1995所述的技术使结构模型化，并可在程序包如Homology 95.0(在Biosym/MSI,San Diego,CA提供的Insight Ⅱ程序中)中实施运算。使用Homology 95.0要求将已知三维结构的氨基酸序列与将要模型化的目标结构的氨基酸序列对比。对比可以是成对对比或包括其它相关序列的多序列对比(如用主要由Rost，酶学方法，卷266,525-539,1996所述的方法)以增加精确性。结构保守性区域可通过比较相关结构特征而鉴定，或通过检查已知结构和目标结构的序列同源性程度而鉴定。用已知结构的坐标指定目标结构的特定坐标。目标结构其它区域的坐标可利用如Brookhaven国家实验室，Upton,NY.支持的蛋白质数据库中找到的已知结构中的片段产生。目标结构侧链的构象可参照空间合理性并利用旋转异构体库及它们的出现频率来确定。(主要如Ponder和Richards，分子生物学杂志，卷193,775-791页，1987所述)。所得目标结构的模型可通过分子机制(诸如Biosym/MSI提供的Discover程序中所含)来精确确定以保证该模型在化学和构象上是合理的。
根据本发明，在核酸序列一级结构水平上与编码GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶的核酸序列有同源性(即是其同系物)的差向异构酶包括下列核酸序列编码的任何酶：该序列与编码GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶的核酸序列，优选选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQID NO:7或SEQ ID NO:9的序列有至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，甚至更优选至少约30％的同源性。相似的，与GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶的氨基酸序列有同源性(即是其同源物)的差向异构酶包括具有下列氨基酸序列的任何酶：该序列与GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶或UDP-半乳糖-4-差向异构酶的氨基酸序列，优选选自SEQ ID NO:2,SEQID NO:4,SEQID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10的序列有至少约15％，优选约20％，更优选约25％，甚至更优选30％的同源性。
根据本发明的一个实施方案，两个或多个核酸或氨基酸序列的同源性或相同百分比用本领域已知用于对比和/或计算相同百分比的方法计算。如为比较两个或多个上述序列的同源性/目同百分比，使用DNASTAR中的模块(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)。具体地，为计算两个核酸或氨基酸序列的相同百分比，优选使用DNASTAR程序中MegAlign模块提供的Lipman-Person方法，参数如下(本文也称为Lipman-Pearson标准缺省参数)：
(1)Ktuple=2
(2)空隙罚分=4
(3)空隙长度罚分=12
使用Lipman-Person方法和这些参数时，大肠杆菌GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶(SEQ ID NO:4)和人GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶(FX)(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列相同百分比是27.7％，与Tonetti等1998,Acta Cryst.D54:684-686中记述的27％相同性相当。
根据本发明的另一个实施方案，对比两或多个核酸或氨基酸序列，以产生一个共有序列或评估这些序列上各种位点的相似性时，也可用同为DNASTAR中模块的CLUSTAL对比程序(如CLUSTAL,CLUSTAL V,CLUSTAL W)，所用参数如下(本文也称为CLUSTAL标准缺省参数)：
多重对比参数(即用于2个以上序列)：
(1)空隙罚分=10
(2)空隙长度罚分=10；
成对对比参数(即用于两个序列)：
(1)Ktuple=1；
(2)空隙罚分=3；
(3)窗=5；
(4)所保留的对角线(Diagonals saved)=5；
根据本发明，GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶可以是来自任何生物，包括拟南芥，大肠杆菌和人的GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶。编码拟南芥GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的核酸序列这里由SEQ ID NO:1代表。SEQ ID NO:1编码的GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶具有这里由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列。编码大肠杆菌GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的核酸序列这里由SEQID NO:3代表。SEQ ID NO:3编码的GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶具有这里由SEQ ID NO:4代表的氨基酸序列。编码人类GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的核酸序列这里由SEQ ID NO:5代表。SEQID NO:5编码的GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶具有这里由SEQID NO:6代表的氨基酸序列。
根据本发明，UDP-半乳糖-4-差向异构酶可以是来自任何生物，包括大肠杆菌和人的UDP-半乳糖-4-差向异构酶。编码大肠杆菌UDP-半乳糖-4-差向异构酶的核酸序列这里由SEQ ID NO:7代表，SEQ ID NO:7编码的UDP-半乳糖-4-差向异构酶具有这里由SEQ ID NO:8代表的氨基酸序列。编码人类UDP-半乳糖-4-差向异构酶的核酸序列这里由SEQ ID NO:9代表，SEQID NO:9编码的UDP-半乳糖-4-差向异构酶具有这里由SEQ ID NO:10代表的氨基酸序列。
在一优选的实施方案中，本发明包括的差向异构酶具有一个氨基酸序列，该序列用诸如CLUSTAL对比程序与SEQ ID NO:11对比时，其中的氨基酸残基与SEQ ID NO:11的至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约100％的非-Xaa残基100％相同。将100％匹配于SEQ ID NO:11的非-Xaa残基数除以SEQ ID NO:11中非-Xaa残基总数可得到与非-Xaa残基100％相同的残基的相同百分比。编码本发明差向异构酶的优选核酸序列包括下述核酸序列，其编码具有与SEQ ID NO:11有上述相同性之氨基酸序列的差向异构酶。使用CLUSTAL对比程序的这类对比是基于本文前面公开的相同参数。SEQ ID NO:11代表差向异构酶的一种共有氨基酸序列，其通过对比SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO:8的氨基酸序列的至少部分而产生(如Somer等，1998，结构6:1601-1612所述)并几乎可用CLUSTAL重复。
在另一个实施方案中，属于本发明的差向异构酶包括在其催化位点含丝氨酸，酪氨酸和赖氨酸的差向异构酶。优选地，这类丝氨酸，酪氨酸和赖氨酸残基在该差向异构酶氨基酸序列上的位置是，用CLUSTAL对比程序对应于SEQ ID NO:11之共有序列的Ser105,Tyr134,Lys138位点，SEQ IDNO:2的Ser109,Tyr138,Lys142位点，SEQ ID NO:4的Ser107,Tyr136，Lys140位点，SEQ ID NO:6的Ser114,Tyr143,Lys147位点，SEQ ID NO:8的Ser124,Tyr149,Lys153位点，或SEQ ID NO:10的Ser132,Tyr157,Lys161位点。
在另一个实施方案中，具有同源于编码GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶之氨基酸序列的氨基酸序列的差向异构酶包括具有氨基酸基序：Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly的任何差向异构酶，该基序发现于，如SEQ ID NO:11之共有序列的位点8到14,SEQ ID NO:2的位点12到18,SEQ ID NO:4的位点10到16,SEQ ID NO:6的位点14到20,SEQ ID NO:8的位点7到13,SEQ ID NO:10的位点9到15。这类基序可通过用CLUSTAL对比程序与上面确认的氨基酸序列中的相同基序对比来鉴定。
在又一个实施方案中，本发明的差向异构酶包括底物结合位点含如下氨基酸残基的差向异构酶，所述氨基酸残基用CLUSTAL对比程序与SEQID NO:4的氨基酸位点Asn177,Ser178,Arg187,Arg209,Lys283,Asn165,Ser107,Ser108,Cys109,Asn133,Tyr136和His179中的至少50％可比。与位点Ser107,Tyr136,Asn165,Arg209的对比优选100％相同(即在对比参数下，残基完全匹配)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的差向异构酶包含至少4个连续氨基酸残基，其与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:10的氨基酸序列中至少4个连续氨基酸残基100％相同，如以Lipman-Pearson标准缺省参数用Lipman-Pearson方法所测定或如以CLUSTAL标准缺省参数用CLUSTAL程序所对比的那样。本发明中术语“连续”指在不间断序列中连接。一个序列与另一个序列“100％相同”指第一个序列与第二个序列完全匹配，核苷酸或氨基酸之间没有空隙。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的差向异构酶由如下核酸序列编码，该序列包含至少12个连续的核苷酸残基，其与选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:10的核酸序列中至少12个连续的氨基酸残基100％相同，如以Lipman-Pearson标准缺省参数用Lipman-Pearson方法所测定或如以CLUSTAL标准缺省参数用CLUSTAL程序所对比的那样。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的差向异构酶由如下核酸序列编码，该序列在严谨杂交条件下与选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQID NO:7或SEQ ID NO:9的核酸序列杂交。如本文使用的，严谨杂交条件指用核酸分子鉴定类似核酸分子的标准杂交条件。这类条件已公开，如在：Sambrook等，1989分子克隆：实验室指南，冷泉港实验室出版社，1989。Sambrook等，同上已全文引入作为参考(尤其见9.31-9.62页)。另外，用于计算适当杂交和洗脱条件以得到允许不同程度核苷酸错配的杂交的公式也已公开，如在Meinkoth等，1984,Anal.Biochem.138,267-284；Meinkoth等，同上已全文引入作为参考。
更具体地，本文的严谨杂交和洗脱条件指允许与杂交反应中作为探针的核酸分子有至少70％，更优选至少约75％，最优选至少约80％的序列相同性的核酸分子分离的条件。这类条件根据是进行DNA:RNA杂交还是DNA:DNA杂交而不同。DNA:DNA杂合体的理论解链温度比DNA:RNA杂合体低10℃。在具体实施方案中，DNA:DNA杂交的严谨条件包括在离子强度6XSSC(0.9M Na+)下，以约20℃到约35℃之间，更优选约28℃到约40℃之间，甚至更优选约35℃到约45℃之间的一个温度杂交。在具体实施方案中，DNA∶RNA的严谨杂交条件包括在离子强度6XSSC(0.9M Na+)下，以约30℃到约45℃之间，更优选约38℃到约50℃之间，甚至更优选约45℃到约55℃之间的一个温度杂交。这些值是基于超过100个核苷酸、0％甲酰胺和G+C含量约40％的分子的解链温度的计算结果。另外，Tm可如Sambrook等，同上，9.31到9.62页所述凭经验计算。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的差向异构酶由选自SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:9的核酸序列或它们的片段编码，其中该片段编码的蛋白在诸如生理条件下能催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的转化。在另一个实施方案中，本发明的差向异构酶包含选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:10的氨基酸序列或它们的片段，其中该片段能催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的转化。需要理解编码这里确定的氨基酸序列的核酸序列因简并性可有所变化。如本文所用，核苷酸简并性指一个氨基酸可由不同核苷酸密码子编码。
本发明的一个实施方案涉及对催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化的差向异构酶的鉴定方法。优选地，该方法用于鉴定内源性(即在微生物和/或植物的天然L-抗坏血酸生物合成途径中)催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶。这类方法可包括以下步骤：(a)在严谨杂交条件下，使核酸分子源与长度为至少12个核苷酸的寡核苷酸接触，其中该寡核苷酸因其在严谨条件下与选自SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的核酸序列杂交的能力而得以鉴定。(b)鉴定该核酸分子源中能在严谨杂交条件与该寡核苷酸杂交的核酸分子。通过这类方法鉴定的核酸分子可随后用标准分子生物学技术从该来源中分离。优选地，核酸分子源从具有抗坏血酸产生途径的微生物或植物中获得。这类核酸分子源可以是从生物分离出的和/或能通过与诸如探针或PCR引物等寡核苷酸杂交而筛选得到的任何核酸分子源。这类来源包括基因组和cDNA文库和分离的RNA。
为了从各种生物中筛选cDNA文库并分离编码GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶及相关差向异构酶等酶的核酸分子，可使用任何变化了的标准分子和生物化学技术。如可用GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的核酸序列中最保守的区域设计寡核苷酸引物，优选简并引物，且这类引物可用于从分离自目的生物(如具有L-抗坏血酸途径的微生物或植物)的核酸(如基因组或cDNA文库)中经聚合酶链式反应(PCR)扩增出相同或相关的差向异构酶，包括该抗坏血酸途径的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶。相似的，可用GDP-4-酮基-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的核酸序列中最保守的区域设计寡核苷酸引物，且这类探针可用于鉴定和分离基因组或cDNA文库中在低，中，或高严谨条件下与该探针杂交的核酸分子。
或者，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶可从诸如Prototheca等生物中纯化，N末端氨基酸序列可以被测定(包括内部肽段的序列)，并且该信息能用于设计简并引物以从该生物cDNA扩增基因片段。该片段可随后用于探测该cDNA文库，并随后在该生物或其它合适的生产型生物中克隆出与该探针杂交的片段。植物酶在细菌如大肠杆菌中以活性形式表达已有大量先例。另外，酵母也是开发异源系统生产L-抗坏血酸的合适候选。
如上对根据本发明增加L-抗坏血酸途径中酶作用的论述，在本发明的一个实施方案中，催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化的差向异构酶的作用是通过扩大表达这类酶(即，过量表达)来实现的。差向异构酶的过量表达可以通过，如导入编码该差向异构酶的重组核酸分子来实现。编码本发明的差向异构酶的基因优选在人工启动子控制下克隆。该启动子可以是任何启动子，只要其使差向异构酶的表达水平能维持生产型生物中L-抗坏血酸的足够水平。优选的启动子是组成型(而不是诱导型)的启动子，因此无需加入昂贵的诱导剂。本发明重组核酸分子的基因量(拷贝数)根据最大产量的要求而不同。在一个实施方案中，编码本发明差向异构酶的重组核酸分子整合在该微生物的染色体中。
本发明的另一个实施方案提供了一种微生物，它具有一种或多种本发明的与其底物亲和力增强的差向异构酶。与其底物亲和力增强的差向异构酶能通过任何合适的遗传修饰或蛋白质工程产生。如基于计算机的的蛋白质工程能用来设计具有更大的稳定性和对底物更大亲和力的差向异构酶蛋白。见如，Maulik等，1997，分子生物技术：治疗应用和策略，Wiley-Liss,Inc.，这里全文引用作为参考。
如上面提到的，在本发明生产L-抗坏血酸的方法中，具有经遗传修饰的L-抗坏血酸生产途径的微生物在用于生产L-抗坏血酸的发酵培养基中培养。合适或有效的发酵培养基指培养本发明经遗传修饰的微生物时，能产生L-抗坏血酸的任何培养基。这类培养基通常为含水培养基，其中含可同化的碳源、氮源和磷酸源。这类培养基还可包含合适的盐，矿物质，金属和其它营养物质。如这里所述遗传修饰微生物的优势是，虽然这类遗传修饰能显著改变L-抗坏血酸的生产，但可通过对它们的设计使该生产生物不新增任何营养需求。因此，以葡萄糖作为唯一碳源的限盐(minimal-salt)培养基可用作发酵培养基。限盐-葡萄糖培养基在L-抗坏血酸发酵中的使用也有利于L-抗坏血酸产物的回收和纯化。
在本发明的一个操作模式中，发酵期间监测发酵培养基的碳源浓度，如葡萄糖浓度。发酵培养基的葡萄糖浓度能用已知技术监测，如使用葡萄糖氧化酶实验或高压液相色谱，它们可用于监测上清液如发酵培养基的无细胞成分中的葡萄糖浓度。如前面阐述的，碳源浓度应保持在发生细胞生长抑制的水平以下。以葡萄糖为碳源时，虽然这样的浓度可能在不同生物中不同，但葡萄糖浓度大于约60g/L时发生细胞生长抑制，并易于通过实验测定。相应的，当葡萄糖用作碳源时，发酵培养基中的葡萄糖浓度维持在约1g/L到约100g/L之间，更优选地，在约2g/L到约50g/L之间，还更优选地，在约5g/L到约20g/L之间。虽然碳源浓度可通过加入如一种基本纯的葡萄糖溶液而维持在所需的水平，但优选通过加入原始发酵培养基的等分试样来维持发酵培养基的碳源浓度。优选使用原始发酵培养基的等分试样，因为同时可维持培养基中其它营养物(如氮源和磷酸源)的浓度。同样，痕量金属浓度可通过在发酵培养基中加入痕量金属溶液的等分试样来维持。
在本发明发酵过程的一个实施方案中，如上所述制备发酵培养基。在发酵培养基中接种一定量的本发明遗传修饰微生物之活性培养物，其量足以在生长一定时间后能产生高密度细胞。通常细胞接种量按干重算为约0.1g/L到约15g/L，优选约0.5g/L到约10g/L，更优选约1g/L到约5g/L。而后继续培养细胞使其密度达到约10g/L到约100g/L，优选约20g/L到约80g/L，更优选约50g/L到约70g/L。微生物在发酵期间达到所需细胞密度的培养时间通常小于约200小时，优选小于约120小时，更优选小于约96小时。
本发明方法中有用的微生物可以用传统发酵模式培养，所述模式包括，但不限于，分批培养，补料分批培养和连续培养。但是，优选用补料分批培养的模式。这类情况下，发酵期间会耗尽培养基的某些成分。可用相对较高浓度的这类成分启动发酵过程，从而能培养更长时间再不得不加料。这些成分的优选范围在整个发酵期间通过在耗尽时加料来维持。发酵培养基中各成分的水平能通过，如定期取样发酵液并测定浓度来监测。另外，一旦开始了标准发酵程序，可在发酵期间根据已知水平定时加料。正如本领域技术人员所知，营养物消耗的速度在发酵期间随着培养基中细胞密度的增加而增加。而且，为了避免外源微生物进入发酵培养基，加料用本领域已知的无菌加料方法进行。另外，可在发酵期间加入少量消泡剂。
本发明人已测定，发酵培养基中高水平的镁可抑制L-抗坏血酸的生产，因为其抑制生产途径的早期酶，但途径中晚期(即从L-半乳糖到L-抗坏血酸)的酶并未受到消极影响(见实施例)。因此在本发明方法优选的一个实施方案中，培养的步骤在镁(Mg2+)受限制的发酵培养基中进行。甚而更优选地，在细胞生长期发酵时限制镁。优选地，在发酵的细胞生长期发酵培养基包含低于约0.5g/L的Mg2+，甚而更优选地，低于约0.2g/L的Mg2+，甚而更优选地，低于约0.1g/L的Mg2+。
发酵培养基的温度可以是任何适合生长和抗坏血酸产生的温度，并可根据所用生产微生物的生长要求调节。如在接种物接种发酵培养基之前，发酵培养基可以放到并维持在约20℃到约45℃的范围内，优选地温度在约25℃到约40℃的范围内，更优选地在约30℃到约38℃的范围内。
本发明另一实施方案补充和/或控制发酵培养基中的其它成分和参数，作为生产微生物维持和/或增加L-抗坏血酸的生产所必需。如在一实施方案中，监测发酵培养基中pH值的波动。在本发明的发酵方法中，pH值优选地维持在约pH 6.0到pH 8.0之间，更优选地，在约pH 7.0。在本发明的方法中，如果发酵培养基的起始pH是pH 7.0，将监测发酵培养基的pH值是否明显偏离pH 7.0，并通过如加入氢氧化钠进行相应的调整。在本发明一优选实施方案中，用于L-抗坏血酸生产的经遗传修饰的微生物包括耐酸的微生物。这类微生物包括，如Prototheca和小球藻属的微藻(见美国专利号5,792,631，同上和美国专利号5,900,370，同上)。
通过培养耐酸微生物生产抗坏血酸与已知生产抗坏血酸的方法相比具有明显的优势。优势之一是这类生物嗜酸，可在低pH下发酵，发酵培养基pH值通常低于约6。在此pH值下，该微生物在发酵中生产的胞外抗坏血酸相对比较稳定，因为在发酵培养基中氧对抗坏血酸的氧化速度降低了。相应的，用符合本发明方法的耐酸微生物生产L-抗坏血酸可获得高产率。另外，无需为避免抗坏血酸的氧化而将溶解氧控制在极低含量。此外，该优势还允许使用连续回收法，因为可处理胞外培养物以回收抗坏血酸产物。
因而当以耐酸微生物为生产微生物时，本方法可在低pH值时进行。该方法的好处在于，在低pH值时，由该微生物产生的胞外抗坏血酸的降解速度低于当发酵培养基的pH值较高时。如在发酵培养基中加入接种物之前，可调整发酵培养基的pH值，并在发酵期间继续监测。通常，将发酵培养基的pH值调整并维持在低于约6，优选低于5.5，更优选低于约5。可通过在发酵培养基中加入氨来控制发酵培养基的pH值。当用氨控制pH值时，氨也也可就便作为发酵培养基中的氮源。
为了维持细胞生长和细胞代谢以生成L-抗坏血酸，也可在发酵过程中使发酵培养基中维持一定的溶解氧含量。发酵培养基中氧的浓度可用已知方法测定，如通过氧探测电极的使用。氧可通过本领域已知方法加入发酵培养基，如通过搅拌或摇动来搅动培养基并通气。优选，发酵培养基中氧的浓度为培养基中氧饱和值的约20％到100％之间，氧饱和值是基于大气压和约30℃到40℃的温度范围内，发酵培养基中氧的溶解度。发酵期间氧浓度可能会周期性的下降到该范围以下，但并不会对发酵产生不良影响。
本发明的遗传修饰微生物经改造可产生显著量的胞外L-抗坏血酸。胞外L-抗坏血酸可用传统分离和纯化技术从发酵培养基中回收。如可过滤或离心发酵培养液去除微生物，细胞碎片和其它颗粒物质，L-抗坏血酸可从无细胞的上清液中用传统方法回收，诸如离子交换，层析，抽提，溶剂萃取，膜分离，电渗析，反向渗透，蒸馏，化学衍生和结晶。
Cayle的美国专利号4,595,659提供了这类L-抗坏血酸回收的一个实例(这里全文引用作为参考)，其公开了发酵液经离子交换树脂吸附和洗脱而分离L-抗坏血酸，再脱色，蒸发并结晶的方法。另外，K.Shimiztu在Agr.Biol.Chem.31:346-353(1967)中描述了通过阴离子交换树脂连续多床提取系统从发酵液中分离结构相似的异抗坏血酸的方法，这里全文引用作为参考。
也可回收根据本发明产生的胞内L-抗坏血酸，其有各种用途。如可裂解微生物细胞，通过各种已知技术回收所释放的抗坏血酸。或可通过洗涤细胞，经渗滤等来提取抗坏血酸，从而回收胞内抗坏血酸。
经遗传修饰开发产L-抗坏血酸能力增强的微生物可用经典菌株开发技术和分子遗传技术，尤其重组技术(遗传工程)来实现。通常，L-抗坏血酸生产能力增加的微生物的产生策略是(1)使能负影响(如抑制)L-抗坏血酸生产的竞争或抑制途径的至少一个，优选多个失活或删除，更主要是(2)通过增加L-抗坏血酸生产途径中酶的编码基因的作用而扩大其生产。
在一个实施方案中，L-抗坏血酸生产能力增加之微生物的产生策略是通过增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用而扩大L-抗坏血酸的生产，如上述。该策略包括遗传修饰内源GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶以使L-抗坏血酸产量增加，和/或表达/过量表达催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖的转化的重组差向异构酶，包括表达重组GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶和/或其同源物，和其它重组差向异构酶如GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-差向异构酶还原酶及与上面详述的差向异构酶有结构同源性的差向异构酶。
应理解生产生物可通过重组技术遗传修饰，其中将本文公开的编码L-抗坏血酸生产途径中蛋白的核酸分子转化至适当宿主中，该宿主与产生上述核酸分子的生物是植物界中的不同成员。如在本发明的一个实施方案中，将编码高等植物GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的重组核酸分子转化至微藻宿主中以过量表达该差向异构酶，并增加微藻类生产微生物中L-抗坏血酸的生产。
如前述，在一个实施方案中，经遗传修饰的微生物是已有核酸分子经核苷酸的删除，插入，取代，和/或倒位而被删除，插入，或修饰，使该微生物获得所需效应。优选遗传修饰之微生物经重组技术改造，如将分离的核酸分子导入微生物中。如遗传修饰之微生物可用编码目的蛋白(如期望增加表达的蛋白)的重组核酸分子转染。转染的核酸分子能保持在染色体外或整合到转染(即重组)的宿主细胞染色体的一个或多个位点上，其方式能维持表达。优选本发明宿主细胞一旦被核酸分子转染，则该核酸分子将整合到该宿主细胞基因组中。整合的突出优势在于核酸分子可在细胞中稳定维持。在优选的实施方案中，将整合的核酸分子可操作连接于能诱导该核酸分子的受控表达的转录控制序列(如下所述)上。
核酸分子可随机或定点地整合至宿主细胞基因组中。这类整合方法为本领域已知。如大肠杆菌菌株ATCC 47002包含使其不能维持携带ColE1复制起点之质粒的突变。当这类质粒转移至该菌株中时，对该质粒上遗传标记的选择导致该质粒整合到染色体上。这类菌株可用如在大肠杆菌lacZ基因之5`和3`末端之间含目的基因及选择标记的质粒转化。lacZ序列将接纳的DNA引导至染色体中lacZ基因上。lacZ位点的整合使编码β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因被经目的基因打断的部分lacZ基因取代。可用β-半乳糖苷酶阴性筛选成功的整合体。
遗传修饰之微生物也可通过将核酸分子经噬菌体转导等方法导入受体细胞基因组而产生。使用重组技术和转导噬菌体技术产生本发明的多种不同遗传修饰微生物的方法为本领域所已知。
根据本发明，基因，如GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶基因，包括与天然差向异构酶基因相关的所有核酸序列，如控制该基因所编码差向异构酶蛋白的产生的调控序列(诸如，但不限于，转录，翻译或翻译后控制区域)和编码区本身。在另一实施方案中，基因，如GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶基因，可以是包含与指定GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶基因之核酸序列相似但不完全相同的序列的等位变体。具有指定核酸序列的GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶基因的等位变体，是在基因组中与具有该指定核酸序列的基因出现于基本相同位点，但因突变或重组等所致天然变异，而具有相似但不完全相同的序列的基因。等位变体的编码蛋白通常具有其对应基因之编码蛋白的相似活性。等位变体还包括该基因5`或3`非翻译区域(如调控区域)的改变。等位变体为本领域的技术人员所熟知并且可望发现于某种微生物或植物和/或两种或更多的微生物和植物中。
依据本发明，分离的核酸分子是取自其天然环境(即由于人为操作)的核酸分子。因此，“分离的”并不表明该核酸分子被纯化的程度。分离的核酸分子可包含DNA,RNA，或DNA或RNA的衍生物。核酸分子的大小并无限制，除了实用方面的限制，因为该核酸分子可能包含一个基因的一部分，一整个基因，或多个基因，或其部分。
本发明分离的核酸分子可从自然界以完整因或能与该基因形成稳定杂交体的部分基因形式分离得到。分离的核酸分子可用重组DNA技术(例如多聚酶链反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成产生。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其类似物，所述类似物包括，但不限于，天然等位变体和修饰的核酸分子(其中已有核苷酸的插入，删除，替换，和/或倒位使该微生物获得所需效应)。核酸序列的结构类似物在上面已有详述。优选的，核酸序列的类似物编码一种蛋白质其氨基酸序列非常相似于天然蛋白质的氨基酸序列，编码该类似物的核酸序列能够在严谨条件下与编码该天然蛋白质的核酸分子杂交(即，与编码该天然蛋白质氨基酸序列的核酸链互补)。核酸分子类似物编码蛋白质类似物。正如在此所用，类似蛋白包括的蛋白质其氨基酸已被删除(如肽等该蛋白质的截短形式)，插入，倒位，取代和/或衍生(如通过糖基化，磷酸化，乙酰化，肉豆蔻酰化，异戊烯化(prenylation)，棕榈酸化，酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)以使该蛋白质和/或该微生物获得所需效应(例如增强或减弱蛋白质的作用)。
核酸分子类似物可利用许多方法产生，这些方法为本领域的技术人员所知(参见，例如Sambrook等，同上.)。例如核酸分子可利用多种技术进行修饰，这些技术包括，但不限于，经典的诱变技术和重组DNA技术，诸如指定点诱变，核酸分子经化学处理以诱导突变，利用限制酶裂解核酸片段，连接核酸片段，核酸序列选定区域的PCR扩增和/或诱变，寡聚核苷酸混合物的合成以及各组混合物的连接以“构建”核酸分子混合物及其组合。核酸分子类似物可选自修饰核酸的混合物，该核酸混合物通过筛选该核酸编码的蛋白质的功能和/或与野生型基因的杂交选出。
尽管术语“核酸分子”原义是指天然核酸分子而术语“核酸序列”原义是指核酸分子的核苷酸序列，这两个术语可交互使用，尤其是关系到能够编码涉及L-抗坏血酸产生路径的基因的核酸分子，或核酸序列时。
了解本发明的某些核酸分子的核酸序列使得本领域的技术人员可，例如(a)拷贝这些核酸分子和/或(b)获得包括至少一部分这样的核酸分子的核酸分子(例如核包括全长基因，全长编码区，调控序列，截短的编码区的酸分子)。这类核酸分子可通过多种方法获得，包括传统的克隆技术，该技术使用寡聚核苷酸探针筛选合适的文库或DNA和使用寡聚核苷酸引物对合适的文库或DNA进行PCR扩增。优选的进行筛选或从中扩增核酸分子的文库包括细菌和酵母基因组DNA文库，尤其是，微藻基因组DNA文库。克隆和扩增基因的技术公开在，例如Sambrook等，同上。
本发明包括一种重组载体，该载体包括至少一种本发明分离的核酸分子，该重组载体插入任何一种能够将该核酸分子引入本发明的宿主微生物的载体中。这样的载体可包含某些核酸序列，所述核酸序列并非天然与待插入载体的分离的核酸分子相邻。该载体可是RNA或DNA，通常为质粒。重组载体可用于克隆，测序，和/或核酸分子的其它处理。在此称重组分子并在下文予以更详细描述的一类重组载体可用于核酸分子的表达。优选的重组载体能够于转化的细菌细胞，酵母细胞，尤其微藻细胞中复制。
将核酸分子转化入细胞可采用任何一种方法完成，所述方法可将核酸分子插入细胞。转化技术包括，但不限于，转染，电穿孔，显微注射和biolistics。
重组细胞优选用一种或多种重组分子转化宿主细胞而产生，其中每一重组分子包括可操作地连接于含一或多个转录控制序列之表达载体的一或多种核酸分子。术语可操作地连接指以某种方式将核酸分子插入表达载体因而该核酸分子能够在被转化入宿主细胞后得到表达。此处所用的表达载体是能够转化宿主细胞并有效表达特定核酸分子的DNA或RNA载体。优选，该表达载体还能够在宿主细胞中复制。本发明中，表达载体通常为质粒。本发明的表达载体包括任何在酵母宿主细胞，细菌宿主细胞，以及优选的微藻宿主细胞中起作用(即指导基因表达)的载体。
本发明的核酸分子能够可操作地连接到包含调控序列的表达载体上，该调控序列包括转录控制序列，翻译控制序列，复制起点，以及其它相容于该重组细胞和控制本发明的核酸分子表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的开始，延长，和结束的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录开始的序列，如启动子，增强子，操纵子和阻遏蛋白。适合的转录控制序列包括任何能在酵母细胞或细菌细胞或优选的，微藻细胞中发挥作用的转录控制序列。有多种这类转录控制序列为本领域的技术人员所知。
本领域技术人员可理解使用重组DNA技术能够改进转化的核酸分子的表达，通过操纵，例如宿主细胞中该核酸分子的拷贝数，那些核酸分子被转录的效率，所得转录子被翻译的效率，翻译后修饰的效率。可用于增加本发明的核酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将核酸分子可操作地连接到高拷贝数的质粒上，将核酸分子整合到宿主细胞染色体上，将载体稳定序列添加入质粒，取代或修饰转录控制信号(例如启动子，操纵子，增强子)，取代或修饰翻译控制信号，修饰本发明的核酸分子以适应宿主细胞的密码子使用，删除使转录子不稳定的序列，使用暂时性区分发酵期间重组细胞的生长与重组酶的产生的控制信号。本发明表达的重组蛋白的活性可通过将编码这类蛋白质的核酸分子裂解，修饰，或衍生得到改进。
下面提供的实验结果是为举例说明而不是限定本发明的范围。
                      实施例
实施例1
本实施例阐明植物中葡萄糖经GDP-D-甘露糖到L-抗坏血酸的途径。
由于本发明者以前已经揭示Prototheca从葡萄糖合成L-抗坏血酸(AA)，所以值得检查一下培养物中葡萄糖的一些早期转化产物。过去，本发明者依据动物中公开的L-抗坏血酸合成路径和植物中的假设路径，注重葡萄糖到有机酸的路径。本发明者在此证实从葡萄糖到L-抗坏血酸的路径不涉及有机酸，但涉及糖的磷酸酯和核苷酸的二磷酸糖(NDP-糖)。
在本发明之前，已经知道所有细胞在合成多糖时首先合成NDP-糖。然后该糖部分组合成聚糖，而解离的NDP则进入再循环。已知有多种多糖，其命名通常是基于糖残基在聚糖中的相对比例。例如“半乳甘露糖”主要包含半乳糖，甘露糖仅占一小部分。本发明者从Prototheca菌株分离的“生物聚合物”经分析发现D-半乳糖占80％，鼠李糖(D-型还是L-型未定)占18％，L-阿拉伯糖占2％。本发明者在此提供实施例阐明组成Prototheca中生物聚合物的各种NDP-糖是如何形成的，以及L-抗坏血酸合成与生物聚合物中糖残基形式的NDP-糖形成之间有什么关联。
常见的NDP-糖UDP-葡萄糖显示在图2B。其由植物中UDP-D-葡萄糖焦磷酸化酶催化葡萄糖-1-P产生。植物可利用UDP-D-葡萄糖-4-差向异构酶将UDP-葡萄糖改变构像形成UDP-D-半乳糖。UDP-D-半乳糖的形成也可以是经半乳糖激酶将D-半乳糖磷酸化成D-半乳糖-1-P,D-半乳糖-1-P再经UDP-D-半乳糖焦磷酸化酶催化成UDP-D-半乳糖。这些已知路径被认为产生Prototheca生物聚合物中的D-半乳糖。UDP-L-阿拉伯糖可由下列已知反应产生，这些反应开始于UDP-D-葡萄糖氧化成UDP-D-葡萄糖醛酸(由UDP-D-葡萄糖脱氢酶催化)，再脱羧形成UDP-D-木糖，然后差向异构成UDP-L-阿拉伯糖。如此产生生物聚合物中阿拉伯糖。已知UDP-L-鼠李糖产生于UDP-D-葡萄糖，因此Prototheca生物聚合物中所有三个糖部分都可从途经葡萄糖-1-P和UDP-葡萄糖的路径产生。此外，假如生物聚合物中的鼠李糖是D-鼠李糖，那么它就不是产生于UDP-D-葡萄糖，而是由GDP-D-甘露糖氧化而成(参见图1)。
GDP-D-鼠李糖通过将葡萄糖依次转化为D-葡萄糖-6-P,D-果糖-6-P,D-甘露糖-6-P,D-甘露糖-1-P,GDP-D-甘露糖，GDP-D-鼠李糖而形成。本发明者感兴趣之处在于这条途径通过GDP-D-甘露糖。植物中外源的甘露糖已知可被转化成D-甘露糖-6-P，然后可进入上述路径。本发明者培养的Prototheca细胞将D-甘露糖转化成L-抗坏血酸，与从葡萄糖转换相比相同或更有效(参见实施例4)。几年前就已经知道Chlorella pyrenoidosa中GDP-D-甘露糖由GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶催化为GDP-L-半乳糖的转化机制(参见，Barber,1971,Arch.Biochem.Biophys.147:619-623，在此全文引用作为参考)。本发明者在此已经发现Prototheca和Chlorella pyrenoidosa的菌株将L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯迅速转化成L-抗坏血酸。在本发明之前，已经知道有几种植物体系将L-半乳糖酸-γ-内酯转化成L-抗坏血酸，但还不知道这一步骤之前的合成步骤。根据公开发表的文献和现有实验依据，本发明者测定了植物L-抗坏血酸的生物合成路径经由GDP-D-甘露糖并涉及糖的磷酸酯和NDP-糖。推断的路径显示在图1。其中与本发明方法可利用的遗传修饰微生物的设计和生产有关的重要之处包括：
1．指引D-葡萄糖到D-果糖-6-P的酶是糖酵解途径的最初几个不明步骤中已知的酶。
2．涉及D-果糖-6-P转化为GDP-D-甘露糖的酶已在植物，酵母，和细菌，尤其维涅兰德固氮菌和铜绿假单胞菌中明确鉴定，它们转化GDP-D-甘露糖成GDP-D-甘露糖醛酸，其为藻酸盐的前体(参见如，SaCorreia等，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:3224-3231；Koplin等，1992，细菌学杂志(J.Bacteriol.)174:191-199；Oesterhelt等，1996，植物科学(Plant Science)121:19-27；Feingold等，1980，植物生物化学(The Biochemistry of Plants)：第3卷：糖，结构与功能，PK.Stampf和E.E.Conn编，学院出版社，纽约，页码：101-170；Smith等，1992，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)12:2924-2930；Boles等，1994，欧洲医学杂志(Eur.J.Med.)220:83-96；Hashimoto等，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272:16308-16314，均全文引用作为参考)。
3．Barber(1971，同上，和1975)在Chlorella pyrenoidosa中鉴定了将GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖和-半乳糖-1-P的酶活性。
4．本发明者在此揭示Prototheca细胞将L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯向L-抗坏血酸的快速转化。
5．L-半乳糖酸-γ-内酯与L-半乳糖酸可通过调节溶液的pH值而相互转化；加碱使该平衡倒向L-半乳糖酸，加酸使该平衡倒向内酯。除了这类非酶途径之外，细胞可能具有酶途径实现这一转化。
6．植物中，GDP-L-岩藻糖也可从GDP-D-甘露糖产生，假设其用于掺入多糖。Roberts(1971)用标记的D-甘露糖育种玉米根尖，发现多糖中有标记，特别是在D-甘露糖，L-半乳糖，和L-岩藻糖残基中。未在D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，或D-木糖中检测到该标记。Prototheca和C.pyrenoidosa细胞有能力将L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)转化为带二吡啶基的产物，该产物经HPLC检测不是L-抗坏血酸。本发明者相信该产物是L-抗坏血酸的6-脱氧类似物。
实施例2
本实施例显示在Prototheca中，类似其它植物(Loewus,F.A.1988.在：J.Priess(编)，植物生物化学，14:85-107.纽约，学院出版社)以及衣藻Chlorellapyrenoidosa(Renstrom等，1983.植物科学通讯(Plant Sci.Lett.)28:299-305)，抗坏血酸(AA)经由葡萄糖的生产通过能保留葡萄糖的碳骨架构像的生物合成途径进行。
菌株UV77-247在振荡烧瓶中以葡萄糖总量(40g/L)的10％为1-13C-标记葡萄糖的条件培养至中等细胞密度。按标准限制镁含量筛选方法培养(参见实施例3)。培养上清澄清后，去离子化以脱盐，冻干，经核磁共振(NMR)分析确定带13C标记之AA分子的位置。每种情况下，约85％的标记出现在AA的C-1位置，余下的大多数标记出现在AA的C-6位置。这充分表明AA从葡萄糖通过保留碳链构像的路径合成，即，葡萄糖的C-1变成了AA的C-1。这常见于植物(Loewus,F.A.1988.抗坏血酸及其代谢产物。在：植物生物化学J.Priess编，14:85-107.纽约，学院出版社)。另一方面，动物(Mapson,L.W.和F.A.Isherwood 1956.生物化学杂志(Biochem.J.)64:151-157；Loewus,F.A.1960.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)235(4):937-939)和原生生物如眼虫属(Shigeoka,S.等，1979.营养学维生素学杂志(J.Nutr.Sci.Vitaminol.)25:299-307)中合成AA的路径涉及构像的倒置，即葡萄糖的C-1变成了AA的C-6。对路径中倒置/非倒置特点的证实是确定AA生物合成路径的重要步骤，因为两种路径需要不同的酶反应。AA中发现C-6标记被认为是由于葡萄糖的代谢及随后的糖元异生。糖酵解过程中葡萄糖的代谢通过丙糖-磷酸中间产物进行。此后，葡萄糖的C-1和C-6碳在生化意义上变得相当。己糖磷酸可由丙糖-磷酸经糖原异生过程产生，该过程基本上相反于降解途径。结果，C-1-标记的葡萄糖至丙糖-磷酸的代谢及随后的糖元异生将导致己糖磷酸分子的生成，且该分子的C-1或C-6被标记或两者都被标记。假如这些己糖磷酸是AA的前体，那么可预期AA会出现相似的标记。与该“同位素混合”一致的发现是，由1-13C-标记的葡萄糖衍生的蔗糖在1,6,1′和6′位出现标记。
葡萄糖还能够经戊糖磷酸途径代谢，其总的平衡方程式如下:
3葡萄糖-6-磷酸→2果糖-6-磷酸+甘油醛-3-磷酸+3二氧化碳
根据已知的生物化学知识，可预期葡萄糖每个碳的标记(表1左栏)将出现在表中所示其它分子的各位置，而这些模式将反映在由C-2和C-3标记的葡萄糖生成的AA中。
表1戊糖磷酸途径中葡萄糖代谢产物的预期碳标记
葡萄糖的标记碳               标记碳的位置
 CO2    F6P(1) F6P(2) G3P
    1   +     -     -   -
    2   -    1.3     1   -
    3   -     2    2.3   -
    4   -     4     4   1
    5   -     5     5   2
    6   -     6     6   3
加C-2或C-3标记的葡萄糖培养，分析所得培养物中回收的AA的标记模式(表2)。
表2细胞经2-13C和3-13C-葡萄糖培养后AA的标记模式
AA中的碳位置     培养后同位素信号的增加
C-2标记的葡萄糖 C-3标记的葡萄糖
    123456     1.010.00.502.20     0.40.99.92.80.20
上述数据再次提示从葡萄糖到AA保留了原有构像的途径。如用C-1标记葡萄糖进行的实验一样，约1/5的标记出现在与葡萄糖标记呈“镜像”的位置上(C-5对应于标记葡萄糖的C-2,C-4对应于标记葡萄糖的C-3)，表明糖元异生的水平与以前观察到的结果一致。
其它位置出现的少量，但是明显的增长与戊糖磷酸途径中的流向一致。如以上预计，当细胞加2-13C葡萄糖培养后通过该途径的碳流将在位置1和3产生同位素增长，当细胞加3-13C葡萄糖培养后通过该途径的碳流将在位置2产生同位素增长。确实观察到了这样的结果。另预计，细胞加2-13C葡萄糖培养后C-1位的同位素增长为C-3位的2倍。这些数据表明有少量但可检测到的碳流通过戊糖磷酸途径。
实施例3
本实施例显示产生，筛选和分离Prototheca属突变体的方法，该突变体与起始菌株ATCC 75669相比AA生产力已改变。
ATCC编号75669，定名为Prototheca moriformis RSP1385(单细胞衣藻)依据国际公认的为专利程序目的保藏微生物的布达佩斯条约于1994年2月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville，马里兰，20852，美国。Prototheca种和菌株的初步筛选报道在美国专利号5,900,370，同上。表3列出了用于菌株生长和维持的培养基配方。发酵罐中的葡萄糖以一水葡萄糖方式提供并按无水形式计算。痕量金属溶液的配方见表4。标准生长温度是35℃。所有的微生物均无菌培养。
表3用于培养并维持Prototheca菌株的培养基所有用量除非特别指明均以g/l为单位
成分          液体                  琼脂
  标准   镁限制     斜面 Ferrozine平板 标准平板
  磷酸二氢钾    1.3     1.3     2.0     0.27     2.0
  磷酸氢二钾    3.8     3.8     2.0     1.4     2.0
二水柠檬酸三钠    7.7     7.7     2.6     1.3     2.6
  七水硫酸镁   0.40     0.02     0.4     0.01     0.4
    硫酸铵    3.7     3.7     1.0     1.0     1.0
 痕量金属溶液    2ml     2ml     2ml     2ml     2ml
 七水硫酸亚铁   1.5mg    4.5mg    1.5mg       -    1.5mg
  二水氯化钙      -    0.25      -       -      -
  一水硫酸锰      -    0.08      -       -      -
   酵母浸膏      -     -     2.5       -      -
    琼脂      -     -     15     15(贵)     15
高压灭菌前pH值     7.2     7.2     7.2     7.2     7.2
表4痕量金属溶液
    化合物     分子量 各溶液浓度 每升工作液中各原液的ml
    蒸馏水       -     -     823
    盐酸       -     浓     20
流水硫酸钴     237.9     24.0     6.5
    硼酸     61.8     38.1     24
七水硫酸锌     287.5     35.3     50
一水硫酸锰     169.0     24.6     50
二水钼酸钠     242.0     23.8     2.0
二水氯化钙     147.0       -     11.4g
二水硫酸钒     199.0     10.0     8.0
六水硝酸镍     290.8     5.0     8.0
亚硒酸钠     173.0     5.0     8.0
突变分离株需经下列一或多种试剂处理而产生：亚硝酸(NA)；乙基甲烷磺酸盐(EMS)；或紫外灯(UV)。通常，在标准液体培养基中培养的葡萄糖耗尽的细胞在25mM磷酸盐缓冲液，pH7.2中洗涤并重新悬浮，稀释成每mL约107个集落形成单位(cfu/mL)，暴露在突变原中直到约99％的细胞都被杀死，避光培养4-8小时，然后涂布到标准琼脂培养基，或包含有不同试剂的琼脂培养基上。
随机挑取标准琼脂培养基上的一些突变菌落并传代到母板上。将其它分离板倒置于氯仿上以裂解菌落表面的细胞并让其释放AA。通过将2,6-二氯苯酚-吲哚苯酚(1.25g/L溶于70％乙醇)溶液喷洒于处理板上以检出释放的AA。AA将该兰色氧化还原染料还原成无色状态的能力是AA常规检验的依据(Omaye等，1979.酶学方法(Meth.Enzymol.)62:3-11.)。假如突变产生细胞产生的菌落的透明圈显著大于该组其它突变菌落的典型透明圈，则在母板上保留该菌落以进一步分析。其它突变产生细胞被涂布到培养板上，该培养板将AA检测系统直接融合进琼脂。该检测系统以AA将铁离子还原成亚铁离子的能力为依据。化合物ferrozine(3-(2-吡啶基)-5,6-双(4-苯基磺酸)-1,2,4-三吖嗪)在琼脂中与亚铁离子形成复合物并发生紫色反应。ferrozine琼脂配方见表3。颜色反应最深的菌落在母板上保留。当筛选不产生AA的菌株(阻断性突变体)时，挑选在相对深色菌落背景上挑选白色菌落。
进行试管培养物的初步筛选时，将母板细胞接种到16×125mm的试管中4mL限镁培养基中，试管在300rpm的转动培养架上以倾斜位置振荡培养4天。倒出培养3天和4天的培养物做AA测定和细胞密度测定。做AA测定时，培养物以1500xg离心5分钟，移出上清进行比色测定或高压液相色谱(HPLC)。有希望的分离株用试管培养重新测试。经过试管筛选的分离物用振荡烧瓶培养测试。
做烧瓶培养物的二次筛选时，细胞接种到带折流板的250mL振荡烧瓶中的50mL标准培养基中，180rpm的转动培养架上培养直到葡萄糖耗尽(24-48小时)。将第一系列培养物接种第二系列烧瓶，培养基为含足量镁的标准培养基，细胞密度为0.15A620，培养24小时。然后将培养物1/50稀释后转移到第三系列烧瓶中，培养基为限镁培养基，培养96小时。期间按要求从烧瓶取样做AA分析和细胞密度测定。做上清液AA分析的样品5000xg离心5分钟。做总培养物AA分析的样品离心前先以等量的5％三氯醋酸(TCA)提取15分钟。然后取上清液做比色测定或HPLC分析。
AA比色测定的方法，依据Omaye等(1979.酶学方法(Meth.Enzymol.)62:3-11)的方法稍加改动。取25μL上清液加到96-孔微孔板中，添加125μL显色剂。显色剂包括4份0.5％含水的2,2′-二吡啶基和1份溶于27％(v/v)o-磷酸的8.3mM硫酸铁铵，两种成份在使用前才混合。1小时后，读取520nm的吸收值。通过比较AA标准样品的吸收值换算出AA的浓度。
HPLC分析参照Running等(1994)的方法。上清液在Bio-Rad的HPX-87H有机酸柱(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)上，以13mM硝酸做溶剂，室温下0.7mL/分钟的流速进行层析。使用Waters 441检测仪(Millipore Corp.,Milford,MA)在254nm检测，或使用Waters 481检测仪在245nm检测。该系统可区分AA的L-型和D-型同分异构体。
测定细胞密度的干重时，取5mL全培养物样品5000xg离心5分钟，用蒸馏水洗1次，细胞团洗入校准后的铝制称重盘中。让细胞在105℃干燥8-24小时。由差异计算出细胞重量。
表5显示Prototheca各种突变株合成AA的能力。
表5烧瓶筛选中各种Prototheca突变株的AA合成能力
菌株 限制镁培养期间特异性AA形成，mg AA/L/培养物A620
  培养2天     培养4天
ATCC 75669     22     35
 EMS 13-4     79     166
 UV213-1     0     0
 UV218-1     0     0
 UV244-1     0     0
 UV244-15     58     68
 UV77-247     56     83
 UV140-1     67     100
    UV164-6     91     131
    NA21-14     27     78
    UV82-21     0     0
    UV127-10     50     95
    SP2-3     3     4
这些分离株的谱系在图3的家族树中以图形展示。定名为Protothecamotriformis EMS13-4(单细胞衣藻)的ATCC号___依据国际公认的为专利程序目的保藏微生物的布达佩斯条约于1999年5月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassa,VA20110,USA。定名为Prototheca moriformis UV127-10(单细胞衣藻)的ATCC号___依据国际公认的为专利程序目的保藏微生物的布达佩斯条约于1999年5月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 UniversityBoulevard,Manassa,VA 20110,USA。定名为Prototheca moriformis SP2-3(单细胞衣藻)的ATCC号___依据国际公认的为专利程序目的保藏微生物的布达佩斯条约于1999年5月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassa,VA 20110,USA。
实施例4
下面的实施例显示Prototheca的生长和休眠细胞都能快速的将L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯转化为AA,Prototheca将D-甘露糖转化为AA的速度要比将D-葡萄糖转化为AA更快。
突变株UV77-247的振荡烧瓶培养物在标准液体培养基中培养至葡萄糖耗尽(表3)。细胞洗涤两次并悬浮在完全培养基中，该培养基的葡萄糖由下列化合物之一代替。细胞悬浮液在35℃振荡培养24小时，整个悬浮液如上用TCA提取并测定AA。
表6-8显示菌株UV77-247的生长和休眠细胞都能快速的将L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯转化为AA。这些实验中，D-果糖和D-半乳糖转化成AA的速度与D-葡萄糖相同，提示它们经由与D-葡萄糖相同的途径代谢为AA。文献中提到的作为AA生物合成中间产物的有机酸包括山梨糖醛酮(sorbosone)可被转换成AA,Saito等(1990植物生理学(Plant Physiol.)94:1496-1500)提示该山梨糖醛酮为中间产物。
表6菌株UV77-247的休眠细胞对化合物的转化
    底物(50mM) 总AA,mg/L 相对于无底物对照组的AA
    L-半乳糖     965     623
 L-半乳糖酸-γ-内酯     818     476
    D-果糖     590     248
    D-葡糖醛酮     589     247
    D-葡萄糖     584     242
    D-半乳糖     542     200
 D-葡萄糖(10mM)     388     46
 D-葡萄糖酸内酯     382     40
 D-葡萄糖酸-γ-内酯     366     24
    D-葡糖醛酸     364     22
    L-山梨糖醛酮     342     0
    无底物     342     0
 2-酮基-D-葡萄糖酸     341     -1
 D-异抗坏血酸(10mM)     330     -12
 D-葡萄糖醛酸内酯     329     -13
    D-葡萄糖酸     309     -33
    D-半乳糖醛酸     297     -45
    L-idonate     296     -46
由于菌株UV77-247转化L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯到AA的速度比其转化葡萄糖的快得多，这提示这些化合物是AA生物合成路径中的中间产物而且是在葡萄糖“下游”的中间产物。
表7和表8的数据还显示，UV77-247的生长和休眠细胞转化D-甘露糖到AA的速度比转化葡萄糖的更快。
表7菌株UV77-247的休眠细胞所致化合物到AA的转化
化合物             抗坏血酸，mg/L
    25.5h     30h     47h
    L-半乳糖     667     718     620
 L-半乳糖酸-γ-内酯     644     681     749
    D-葡糖醛酮     465     462     354
    D-甘露糖     448     462     399
    D-果糖     402     408     367
    d-葡萄糖     395     404     351
    D-半乳糖     352     361     337
    无化合物     287     288     258
表8菌株UV77-247的生长细胞所致化合物到AA的转化
化合物 抗坏血酸，mg/L     A620   AA/A620
 25.5 h              44 h
    L-半乳糖     249     506     4.5     112
    D-甘露糖     228     488     5.6     87
 L-半乳糖酸-γ-内酯     214     342     5.0     68
    D-葡萄糖     178     398     5.9     67
    D-果糖     181     383     5.9     65
    D-葡糖醛酮     176     362     5.7     64
    D-半乳糖     185     380     5.9     64
    无化合物     182     249     4.4     57
    D-葡萄糖酸(K)     178     262     5.0     52
    L-idonate(Na)     182     232     4.7     49
 2-酮基-D-葡萄糖酸     182     255     5.3     48
 2-脱氧-D-葡萄糖     181     227     4.8     47
 D-葡萄糖酸内酯     165     218     5.0     44
 D-葡萄糖酸(Na)     173     241     5.6     43
 L-葡萄糖酸-γ-内酯     152     195     5.0     39
    L-山梨糖醛酮     178     160     4.7     34
 D-葡萄糖酸-δ-内酯     130     190     5.7     33
    D-半乳糖醛酸     130     180     6.0     30
这些细胞转化L-半乳糖，L-半乳糖酸-γ-内酯和D-甘露糖到AA的速度都比它们转化葡萄糖的快，提示甘露糖在AA生物合成路径中从葡萄糖开始向“下游”发挥作用。
实施例5
用上面描述的方法装配一系列突变体。有代表性的突变体的特异AA生成显示在表5中。这些分离株的谱系在图3的家族树中以图形展示。
这些分离株都检测了转换化合物的能力，所述化合物可被菌株UV77-247转换成AA。测试方法同实施例4。测试结果如表9所示。
表9AA合成能力不同的Prototheca突变株休眠细胞所致化合物向AA的转化
菌株     绝对AA,mg/L
缓冲液 葡萄糖 L-半乳糖 L-半乳糖酸-γ-内酯 甘露糖 果糖
EMS 13-4     53     97     191     173     139  ND
 UV127-10     45     140     213     140     128  143
    SP2-3     19     19     204     146     24     27
    NA21-14     61     80     147     158     118    115
    UV82-21     15     16     183     175     18     17
    UV213-1     16     15     170     135     17     16
    UV218-1     16     18     136     176     19     21
    UV244-1     16     16     164     162     16     16
    UV244-15     26     77     30     21     94     89
    UV244-16     28     64     53     53     53     66
ND表示未测定
这些结果提示，不能有效地将果糖和甘露糖转换成AA的这些菌株的突变性封闭点在途径中L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯之前(其上游)。
实施例6
下面的实施例显示镁抑制AA合成的早期步骤。
为了阐明镁是否确实抑制AA合成的问题，将菌株NA45-3(ATCC209681)培养在镁(Mg)含量受限制的培养基和镁含量充足的培养基中。定名为Prototheca moriformis NA45-3(来源：ATCC号75669的重复突变；真核藻类。Chlorophyta门，Chlorophyceae纲，Chloroccales目)的ATCC号209681依据国际公认的为专利程序目的保藏微生物的布达佩斯条约于1998年3月13日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110,USA。收集两种培养物的细胞并悬浮在限制Mg含量的培养基的无细胞上清液中，一半细胞悬浮液加入额外的镁达到富含镁的水平。4种条件下的测定方法如下。
表10用以检测镁对AA产生的效应的条件
条件          镁浓度，g/L
    生长期间     测试期间
    1Mg＞1Mg      0.02      0.02
    1Mg＞10Mg      0.02      0.2
    10Mg＞1Mg      0.2      0.02
    10Mg＞10Mg      0.2      0.2
将先前显示可合成AA的底物，即D-葡萄糖，D-葡糖醛酮，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，和L-半乳糖酸-γ-内酯，以20g/L的浓度加到4种细胞悬浮液中。24小时后测定累积的AA并与没有添加底物的对照组比较。结果显示在图4中。
当生长在限制镁(Mg)含量培养基中的细胞与低镁培养基(1Mg＞1Mg条件)中底物温育时，与对照组相比都显示出明显而相似的AA累积。当这些细胞细胞在富含镁培养基(1Mg＞10Mg条件)中温育时，除D-甘露糖和L-半乳糖酸-γ-内酯外的所有底物的AA累积都减少了约40％，提示1)D-葡萄糖，D-葡萄糖醛酮，D-果糖，和D-半乳糖转化成AA的限速步骤被镁抑制，或2)镁激活了一种酶使得这些底物被转换成其它的化合物，减少了用于合成AA的底物量。另一方面，D-甘露糖和L-半乳糖酸-γ-内酯的转换似乎不受悬浮液中镁浓度的影响，表明，或1)镁抑制的酶并未参与这些底物向AA的转化，或2)D-甘露糖和L-半乳糖酸-γ-内酯进入的路径远在可受需要镁的酶参与的副反应影响的某点下游。
当细胞培养在富含镁的培养基中生长时，从任何D-型糖转换出的AA极少，且与悬浮液中的镁浓度无关。然而，与细胞培养在限制镁(Mg)含量的培养基中相比，从L-半乳糖酸-γ-内酯转换成的AA却增加了。这提示合成路径早期的酶在富含镁的培养基中受到抑制。因此，D-型底物都有相似的表现，唯一例外的是从D-甘露糖到AA的转换，该转换显然不受镁的抑制。这意味着D-甘露糖进入AA生物合成路径之处不同于别的D-型糖。
图2A和图2B显示植物中葡萄糖的某些代谢结果。图中将碳转入糖酵解的第一个酶促步骤是果糖-6-P被磷酸果糖激酶(PFK)催化成果糖-1,6-2P。该反应基本上不可逆转，并引至熟知的TCA循环和氧化磷酸化，伴随着ATP和NADH/NADPH的生成。PFK绝对需要镁。假如镁受到限制，这一反应就可能减速并最终停止，阻止碳流参与糖酵解和以后的反应，并导致细胞在即使有过量的葡萄糖时也终止分裂。可希望果糖-6-P在这些条件下累积，用于图1和图2所示的AA合成路径。
实施例7
下面的实施例显示Protothca中AA的生产与AA途径中酶活性水平的关系。
磷酸甘露糖异构酶(PMI)测定
首先测定PMI活性(见图1)。10个代表不同AA生产力的菌株按标准培养以测定其AA-合成能力。细胞培养96h后收获进行限制镁(Mg)含量培养，用含50mM Tris/10mM MgCl2,pH7.5的缓冲液洗涤并重新悬浮。悬浮后的细胞用挤压(French Press)裂解，30,000xg离心30分钟，Sephadex G-25(Pharmacia PD-10柱)脱盐。通过添加不同量的提取物到含0.15U磷酸葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.9),0.5U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)，和1.0mMNADP的Tris/Mg缓冲液中逆向进行反应。反应通过添加3mM(终浓度)甘露糖-6-磷酸启动。最终反应体积为1.0mL。所有成份均溶解于Tris/Mg缓冲液中。读取A340/分钟的变化以判定活性。这些活性测定值减掉缺乏M-6-P底物的相同反应混合物的活性值。通过矫正反应物中蛋白质浓度计算特异性活性。初始提取物的蛋白质含量用Bradford方法测定，使用Bio-RadLaboratories(Hercules,CA)的试剂盒。所有酶和核苷酸均购自SigmaChemical Co.(St.Louis,MO)。
磷酸甘露糖变位酶(PMM)测定
磷酸甘露糖变位酶在同样的菌株中以方法相同测定，不过这些测定反应混合物还含有0.25mM葡萄糖-1,6-二磷酸，0.5U商品PMI，而且反应通过添加3.0mM(终浓度)甘露糖-1-磷酸而不是甘露糖-6-磷酸来启动。
磷酸果糖激酶(PFK)测定
为了证明在限制镁(Mg)含量培养条件下AA浓度的升高是由于正常代谢时糖酵解(PFK)真正第一步的活性减弱导致碳源的分流，还对这些菌株进行测定以证实该酶活性的存在。细胞的培养，洗涤和裂解同前。提取物在脱盐前100,1000xg离心90分钟。接下来进行的反应要添加不同量的提取物到Tris/Mg缓冲液中，该缓冲液含有1.5mM二硫苏糖醇，0.86U醛缩酶(EC 4.1.2.13),1.4 Uα-甘油磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8),14U丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1),0.11mM NADH，和1.0mM ATP。反应的启动靠添加5mM(终浓度)果糖-6-磷酸。最终反应体积为1.0mL。所有成份均溶解于Tris/Mg缓冲液中。读取A340/分钟的变化以判定活性。这些活性测定值减掉没有F-6-P底物的相同反应混合物的活性值。通过矫正反应物中蛋白质浓度计算出特异的活性。初始提取物的蛋白质含量测定方法同上。
GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)测定
同样这些突变株还测定了假设途径中的下一种酶，GMP。不同菌株按标准培养在限制镁(Mg)含量培养基(43-48小时后收获进行限制镁(Mg)含量培养)和富含镁培养基(在葡萄糖耗尽之前收获所有细胞)中。细胞洗涤后重新悬浮在50mM磷酸缓冲液，pH7.0中，其含有20％(v/v)甘油和0.1M氯化纳(3mL缓冲液/g细胞湿重)，用French press裂解。初提物15,000xg离心15分钟。接下来进行的反应要添加不同量的提取物到50mM磷/4mM氯化镁缓冲液中，该缓冲液含有1mM GTP。反应的启动靠添加1mM(终浓度)甘露糖-1-磷酸。最终反应体积为0.1mL。反应混合物在30℃温育10分钟，滤过0.45umPVDF注射滤器，用HPLC分析GDP-甘露糖。使用SupelcosilSAX1柱(4.6×250mm)，使用的溶剂梯度(1mL/分钟)为：A-6mM磷酸钾，pH3.6；B-500mM磷酸钾，pH4.5。梯度为：0-3分钟，100％A；3-10分钟，79％A；10-15分钟，29％A。柱的温度为30℃。对显示酶活性与蛋白质的含量成比例的两次测定进行平均。不含底物和不含提取物的对照也进行了测定。通过矫正反应物中蛋白质浓度计算出特异的活性。初始提取物的蛋白质含量测定方法同上。
GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶测定
进一步的试验测定了假设途径中下一种酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的活性。菌株按标准培养，43-48小时后收获进行限制镁(Mg)含量培养，洗涤，重新悬浮在缓冲液中，该缓冲液含有50mM MOPS/5mMEDTA,pH7.2。洗涤后的细胞团在French press中裂解，20,000xg离心20分钟。同前面一样进行蛋白质测定并将蛋白质浓度系列稀释，成0.4-2.2mg蛋白质/mL。每份取50μL稀释液加到10μL 6.3mM GDP-D-甘露糖中，该GDP-D-甘露糖底物的一部分在其甘露糖部分大都标记上14C。该底物稀释到反应混合物中之前的放射活性为16μCi/mL。反应进行10分钟后终止，将20μL混合物移入微型离心管，管中含有20μL 250mM三氟乙酸(TFA)，该TFA含有D-甘露糖和L-半乳糖各1.0g/L。密封这些离心管并煮沸10分钟，冷却后，在Beckman MicrofugeE离心60秒，每种水解产物取出5μL点样到20×20cm塑料背衬的EM Science Silica gel 60薄层平板(#5748/7)上，用钝针头制成1cm的泳道。干燥后，平板在乙酸乙酯∶异丙醇∶水为65∶22.3∶12.7的条件下进行2.5小时的层析共两次(两次之间平板需干燥)。用溶解在含0.89M硫酸和0.17mM冰醋酸的62％乙醇溶液中的0.5％对甲氧基苯甲醛吹干，然后105℃加热约15分钟，使平板干燥，然后才能观察游离糖的斑点。将L-半乳糖和D-甘露糖的斑点从平板上裁下用闪烁计数器(Beckman 2800型)计数。零时对照计数时，取每种提取物的稀释液16.7μL加到23.3μL上述的标记底物中，该底物已用TFA/甘露糖/半乳糖溶液按1∶7稀释。
表11总结了待检菌株5种酶的测定结果，及它们的特异性AA生成。
表11特定Prototheca突变株的特异性酶活性(mU)*
菌株   AA特异性形成 PMI PMM PFK           GMP 差向异构酶
限制镁 富含镁
 UV164-6     78.4  0.79
 EMS 13-4     73.7  10.8  69.6  13.5  2.6  6.8  0.78
 UV140-1     69.9  0.78
 NA45-3     61.4  0.58
 UV77-247     44.4  0.52
 UV127-10     40.1  11.1  45.8  24.4  4.3  5.9  0.39
 UV244-15     24.5  14.3  41.5  3.1  5.3  0.42
 NA21-14     23.6  12.1  60.3  47.4  2.4  7.6  0.27
 ATCC75669     21.9  0.28
 UV244-16     5.0  16.5  85.6  4.3  5.2
  SP2-3     2.0  17.7  47.0  64.5  2.0  7.5  0.03
 UV218-1     0.4  15.9  72.1  2.7  7.0  0.83
 UV213-1     0.1  19.7  47.7  32.6  3.2  6.7  0.60
 UV82-21     0.0  14.6  70.6  30.4  4.1  7.5  0.15
 UV244-1     0.0  18.2  51.1  5.5  12  0.15
*单位：PMI和PMM，每分钟每mg蛋白还原的nmol NADP；PFK，每分钟每mg蛋白氧化的nmol NADH；GMP，每分钟每mg蛋白产生的nmolGDP-D-甘露糖；差向异构酶，每分钟每mg蛋白产生的nmol GDP-L-半乳糖。
显示在酶活性与AA合成能力之间密切相关的唯一酶是GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶。这一相关表示在图5中。所有产生可检出量AA的菌株都可检测到差向异构酶活性。反过来却不是这样：有4个菌株没有或很少合成AA却有明显的差向异构酶活性。这些菌株可能具有影响差向异构酶下游之酶步骤的突变。由于所有试验菌株都能够从L-半乳糖和L-半乳糖酸-γ-内酯合成AA(参见实施例4和5)，这4株突变株的遗传损伤应在GDP-L-半乳糖和游离的L-半乳糖之间。
实施例8
下面的实施例显示GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶活性与两菌株受镁限制程度的关系，所述两菌株一为未诱变的亲本株ATCC 75669，一为最佳AA生产菌株之一，EMS 13-(ATCC__)。
每种菌株按标准培养在4个烧瓶中。4天之内两菌株每隔24小时收获1份培养物进行限镁培养。每个菌株还有1个烧瓶于24小时收获后进行富镁培养。收获时所有培养物都有葡萄糖剩余。图6以图表显示EMS13-4和ATCC 75669在限镁培养时的AA生产力和差向异构酶活性。EMS13-4的差向异构酶活性在各时间点都明显高于ATCC 75669中的。随着EMS13-4的镁限制增加，其AA生产力与差向异构酶活性也同时迅速提高。ATCC 75669中随着镁的限制增加，AA生产力略有提高，但差向异构酶活性不受影响。
实施例9
下面的实施例显示用两种大肠杆菌菌株的提取物做差向异构酶实验的结果，这两种菌株克隆了大肠杆菌GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶的基因。
大肠杆菌K12 wca基因簇决定胆烷酸的生成；wcaG编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-差向异构酶/还原酶。
大肠杆菌wcaG序列(SEQ ID NO:3的核苷酸4-966)经PCR扩增自大肠杆菌W3110基因组DNA，该扩增使用引物WG EcoRⅠ5(5′TAGAATTCAGTAAACAACGAGTTTTTATTGCTGG3′；SEQ ID NO:12)和WG Xhol 3(5′AACTCGAGTTACCCCCAAAGCGGTCTTGATTC 3′；SEQ IDNO:13)。该973-bp PCR扩增产物被连接入载体pPCR-Script SK(+)(Stratagene,LaJolla,CA)。该质粒的973-bp ExoRⅡ/XhoⅠ片段被插入pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)的ExoRⅡ/XhoⅠ位点，以构建pSW67-1质粒。质粒pGEX-5X-1是GST基因融合载体，其将一个26-kDa的GST部分加在目的蛋白的N-末端。大肠杆菌BL21(DE3)经pSW67-1和pGEX-5X-1转化，产生菌株BL21(DE3)/pSW67-1和BL21(DE3)/pGEX-5X-1。
大肠杆菌wcaG序列(核苷酸SEQ ID NO:3的1-966)也经PCR扩增自大肠杆菌W3110的基因组DNA，该扩增使用引物WG EcoRⅠ5-2(5′CTGGAGTCGAATTCATGAGTAAACAACGAG 3′；SEQ ID NO:14)和WGPstⅠ 3(5′AACTGCAGTTACCCCCGAAAGCGGTCTTGATTC 3′；SEQ ID NO:15)。该976-bp PCR扩增产物被连接入载体pPCR-Script(Stratagene)。该质粒的976-bp ExoRⅡ/PstⅠ片段被插入表达载体pPKK223-3(AmershamPharmacia Biotech)的ExoRⅡ/PstⅠ位点，以构建pSW75-2质粒。大肠杆菌JM105经pKK223-3和pSW75-2转化，产生菌株JM105/pKK223-3和JM105/pSW75-2。
6个菌株全部以双份振荡培养在37℃的2 x YTA培养基中直到600nm的光密度达到0.8-1.0(约3小时)。2 x YTA培养基包含16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸膏，5g/L氯化纳和100mg/L氨苄青霉素。每种培养物通过加异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)到终浓度1mM加以诱导。12份培养物全部再培养4小时，用0.9％NaCl洗涤，然后将细胞冷冻在-80℃。在用细胞团制备提取物之前，每份培养物取少量进行质粒DNA小量制备以证实这些菌株中存在相应的质粒。每种培养物的蛋白制剂还进行SDS凝胶电泳以证实与预期相应大小的蛋白的表达。冷冻细胞团解冻后，重新悬浮在pH7.2的2.5mL MOPS/EDTA缓冲液中，在French press中(10,000psi)裂解，20,000x g离心20分钟，同前上测定蛋白并稀释成0.01,0.1,1.0和3mg/mL蛋白。
菌株BL21(DE3)/pGEX-5X-1经诱导得到26-kDa蛋白质的高水平表达，表明有天然GST蛋白质的合成。菌株BL21(DE3)/pSW67-1经诱导得到62-kDa蛋白质的高水平表达，表明与wcaG基因产物(36k)融合之天然GST蛋白(26k)的合成。该融合蛋白的等分试样用蛋白酶Factor Xa(New Engl和Biolabs,Beverly,MA)处理，该酶在GST/wcaG结合点附近裂解。菌株JM105/p SW75-2经诱导得到36-kDa蛋白质的高水平表达，表明有wcaG基因产物的合成。在菌株JM105/pKK223-3中未检测到这类蛋白(只有载体)。
然后在实施例7所述标准差向异构酶试验中检验提取物，以测定包含wcaG产物的任何提取物是否都能将GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖。待测提取物是：
BL21(DE3)组
1．BL21(DE3)未诱导
2．BL21(DE3)经1mM IPTG诱导
3．BL21(DE3)/pGEX-5X-1未诱导
4．BL21(DE3)/PGEX-5X-1经1mM IPTG诱导
5．BL21(DE3)/pSW67-1未诱导
6．BL21(DE3)/pSW67-1经1mM IPTG诱导；融合蛋白完整
7．BL21(DE3)/pSW67-1经1mM IPTG诱导；GST部分被裂解
JM105组
1．JM105未诱导
2．JM105经1mM IPTG诱导
3．JM105/pKK223-3未诱导
4．JM105/pKK223-3经1mM IPTG诱导
5．JM105/pSW75-2未诱导
6．JM105/pSW75-2经1mM IPTG诱导
BL21(DE3)组的提取物1和7与JM105组的提取物1和6经预试检测GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶样活性。在此起始实验中，无一份样品检测到差向异构酶活性。此时，这样的结果可有几种可能性。第一，可能wcaG基因产物不能催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化，尽管还需检测另几个参数才能下此结论。第二，可能该检测条件适合检测内源性GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的活性，而wcaG基因产物没有GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶样活性。因此，应当检测不同的条件。另外，还需要进行重复试验以证实预试条件的准确性。第三，尽管BL21(DE3)和JM105克隆株合成了预期大小的蛋白质，但是尚未对该构建体进行测序以确认wcaG基因产物的正确编码序列并因此排除可能使wcaG基因产物失活的PCR失误或克隆失误。第四，克隆序列产生的蛋白质具有全长，但没有活性，如由于错误的三级结构(折叠)。第五，基因过度表达，致使不可溶性失活蛋白产物(包涵体)的累积。将来的试验将尝试证实该构建体具有或可诱导而具有催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化的能力，以及利用该序列分离内源性GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的能力。
表12提供了Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标。
                                 表12HEADER      差向异构酶/还原酶                   27-SEP-98 1BWSTITLE       大肠埃希菌的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖TITLE    2  差向异构酶/还原酶的结晶结构。该酶TITLE    3  为GDP-L-岩藻糖的生物合成中的关键酶COMPND    MOL_ID:1；COMPND   2  分子：    GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶COMPND   3  中国：A；COMPND   4  遗传修饰：有；CCMPND   5  生物学单位：同型二聚体SOURCE    MOL_ID:1；SOURCE   2  生物体学名：大肠埃希菌：SOURCE   3  表达系统：大肠埃希菌KEYWDS      差向异构酶/还原酶，GDP-L-岩藻糖生物合成EXPDTA    X-线衍射AUTHOR   DE M.RIZZITONETTIFLQRAREVDAT   1  13-JAN-99 1BWS 0JRNL        作者    DE D.RIZZITONETTIVIGEVANISTURLABISSOFLORAJRNL        标题    大肠杆菌的GDP-4-酮基-6-脱氧-JRNL        标题 2  甘露糖差向异构酶/还原酶，GDP-L-JRNL        标题 3  岩藻糖生物合成中的一种关键酶JRNL        标题 4  展示RED蛋白同系物超家族的JRNL        标题 5  结构特征JRNL        REF     结构(伦敦)                                  1998JRHL        REFN                                                  9999REMARK   1REMARK   2REMARK   2  分辨率2.2埃REMARK   3REMARK   3  详述REMARK   3  程序    ：TNTREMRK    3  作者    ：TRONRUDTEN EYCK,MATTHEWSREMARK   3REMARK   3  详述所用数据REMARK   3  分辨率上限(埃)2.2REMARK   3  分辨率下限(埃)：15.0REMARK    3    临界值                    (SIGMA(F))；0.0REMARK    3    完整性范围                     (％)；99.7REMARK    3    反射数                            ；24481REMARK    3REMARK    3    使用超过sigma临界值的数据REMARK    3    交叉有效方法：无REMARK    3    自由R值检测组选择：0REMARK    3    R值(工作组+检测组)：0REMARK    3    R值(工作组)：03    自由R值：0REMARK    3    自由R值检测组大小(％)：0REMARK    3    自由R值检测组计数：0REMARK    3REMARK    3    使用所有数据，无SIGMA界值REMARK    3    R值(工作组+检测组，无界值)：0REMARK    3    R值(工作组，无界值)：0.202REMARK    3    自由R值(无界值)：0.287REMARK    3    自由R值检测组大小(％，无界值)：0REMARK    3    自由R值检测组计数(无界值)：0REMARK    3    反射总数(无界值)：0REMARK    3REMARK    3    详述时所用的非氢原子数REMARK    3    蛋白质原子数：2527REMARK    3    核酸原子数：0REMARK    3    其它原子数：109REMARK    3REMARK    3    WILSON B VALUE (FROM FCALC,A**2):0REMARK    3REMARK    3    与理论值的RMS偏差RMS重量计数REMARK    3    键长(A):0.016；0；0REMARK    3    键角(度)：1.65；0；0REMARK    3    折射角(度)：0；0；0REMARK    3    PSEUDOROTATION ANGLES (度) 0；0；0.REMARK    3    TRIGONAL CARBON PLANES    (A):0；0；0；REMARK    3    GENERAL PLANES            (A):0；0；0；REMARK    3    同位素的温度(A**2):0；0；0REMARK    3    非化学健连接(A):0；0；0REMARK    3REMARK    3    错误的手性中心(计数)：无REMARK    3REMARK    3    主要解决模式REMARK    3    所用方法：无REMARK    3    KSQL    ；无REMARK    3    BSOL    ；无REMARK    3REMARK    3  限制库REMARK    3  立体化学：无REMARK    3  同位素的温度限制：无REMARK    3REMARK    3  其它限制：无REMARK    4REMARK    4  1BWS COMPLIES WITH FORMAT V.2.2,16-DEC-1996REMARK    5REMARK    5  警告REMARK    5  1BWS：这是第1层发布REMARK    5REMARK    5  请注意该路径是在保藏者检查并认可REMARK    5  后发布的，无PDB人员介入REMARK    5  辅助文件AUXIBWS.RPT可得自PDBFTRREMARK    5  服务器且可通过3DB浏览器进入REMARK    5  THE FILE CONTAINS THE OUTPUT OF THE PROGRAM WHAT CHECK ANDREMARK    5  OTHER DIAGNOSTICS.REMARK    5REMARK    5  该路径中使用的命名法，包括HET残基名称和HET ATOMREMARK    5  名称均未被PDB处理员标准化当该标准化完成并得到REMARK    5  保藏者认可后将很快发布第2层路径REMARK    5  该第2层路径将与适当的REVDAT记录一起REMARK    5  作为第一个的校正使用REMARK    5REMARK    5REMARK    5  进一步资料包括检查该REMARK    5  路径时所用的有效标准REMARK    5  和指示数据组均可从PDBREMARK    5  网址HTTP:/WWW.PDB.BNT.GOV得到REMARK  200REMARK  200  实验详细资料REMARK  200  实验类型：X射线衍射REMARK  200  数据采集日：1997年8月REMARK  200  温度(绝对温标)：120REMARK  200  PH:6.5REMARK  200  所用结晶数：1REMARK  200REMARK  200  同步加速器(有/无)：无REMARK  200  放射源：无REMARK  200  光束：无REMARK  200  X-射线生成仪型号：RIGAKU RU200REMARK  200  单色或LAUE(M/L):MREMARK  200  波长或波长范围(A):15418REMARK  200  单色仪：无REMARK  200  光学仪器：无REMARK  200REMARK  200 DETECTOR TYPE                        :IMAGE PLATEREMARK  200 DETECTOR MANUFACTURER                :RAXISREMARK  200 INTENSITY-INTEGRATION SOFTWARE       :MOSFIMREMARK  200 DATA SCALING SOFTWARE                :SCALAREMARK  200REMARK  200  单反射数： 24481REMARK  200  分辨率上限(A):2.2REMARK  200  分辨率下限(A):15.0REMARK  200  否定标准(SIGMA(I))：无REMARK  200REMARK  200  OVERALL.REMARK  200  完整性范围(％)：99.7REMARK  200  数据重复：4.3REMARK  200  R合并(I):0.057REMARK  200  R SYM                    (I):0REMARK  200  <I/SIGMA(I)>用于数据设置    ：13.6REMARK  200REMARK  200  最高分辨率范围内REMARK  200  分辨率上限(A)：无REMARK  200  分辨率下限(A)：无REMARK  200  完整性范围(％)：无REMARK  200  范围内的数据重复：无REMARK  200  R范围合并(I)：无REMARK  200  R SYM FOR SHELL       (I)：无REMARK  200  <I/SIGMA(I)>FOR SHELL    ：无REMARK  200REMARK  200  衍射方法：无REMARK  200  用于测定结构的方法：MIRREMARK  200  所用软件：无REMARK  200  启始模式：无REMARK  200REMARK  200  REMARK:NULLREMARK  280REMARK  280  结晶REMARK  280  溶剂含量，VS(％):0REMARK  280  MATTHEWS 系数2VM(埃)**3/DA):0REMARK  280REMARK  280  结晶条件：无REMARK  290REMARK  290  晶体构象对称REMARK  290  空间组对称操作符：P3221REMARK  290REMARK  290    SYMOP    对称REMARK  290    NNNMMM    操作符REMARK 290    1555    X,Y,ZREMARK 290    2555    -Y,X-Y,Z+2/3REMARK 290    3555    Y-X,-X,Z+1/3REMARK 290    4555    Y,X,-ZREMARK 290    5555    X-Y,-Y,1/3-ZREMARK 290    6555    -X,Y-X,2/3-ZREMARK 290REMARK 290    WHERE NNN->操作编码REMARK 290          MMM->翻译载体REMARK 290REMARK 290 结晶对称转化REMARK 290 以下为ATOM/HETATM转化REMARK 290 该路径中产生晶体构象的记录REMARK 290 相关分子REMARK 290 SMTRY1 1 1.000000 0.000000 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 1 0.000000 1.000000 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 1 0.000000 0.000000 1.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY1 2-0.500045-0.865974 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 2 0.866077-0.499955 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 2 0.000000 0.000000 1.000000    50.58553REMARK 290 SMTRY1 3-0.499955 0.865974 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 3-0.866077-0.500045 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 3 0.000000 0.000000 1.000000    25.29276REMARK 290 SMTRY1 4-0.500045 0.865922 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 4 0.866077 0.500045 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 4 0.000000 0.000000-1.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY1 5 1.000000 0.000104 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 5 0.000000-1.000000 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 5 0.000000 0.000000-1.000000    25.29276REMARK 290 SMTRY1 6-0.499955-0.866026 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY2 6-0.866077 0.499955 0.000000    0.00000REMARK 290 SMTRY3 6 0.000000 0.000000-1.000000    50.58553REMARK 290REMARK 290 REMARK:NULLREMARK 465REMARK 465 忽略的残基REMARK 465 以下残基不位于REMARK 465 实验(M=模式编号；RES=残基名称：C=链REMARK 465 识别码；SSSEQ=序列编号；I=插入密码：REMARK 46SREMARK 465 M RES C SSSEOIREMARK 465   MET A     1REMARK 465   SER A     2REMARK 465   ASP A   317REMARK 465   ARG A   318REMARK 465    PHE A    319REMARK 465    ARG A    320REMARK 465    GLY A    321REMARK 800REMARK 800    位点REMARK 800    位点特征：CATREMARK 800    位点描述：REMARK 800    催化性残基REMARK 800REMARK 800    位点特征：CATREMARK 800    位点描述：REMARK 800    催化性残基REMARK 800REMARK 800    位点特征：CATREMARK 800    位点描述：REMARK 800    催化性残基REMARK 800DBREF  1BWS A    3    316    SWS P320S5 FCL ECOLISEORES 1  A 321 MET SER LYS GLN ARG VAL PHE ILE ALA GLY HIS ARG GLYSEORES 2  A 321 MET VAL GLY SER ALA ILE ARG ARG GLN LEU GLU GLN ARGSEORES 4  A 321 ASN LEU LEU ASP SER ARG ALA VAL HIS ASP PHE PHE ALASEORES 5  A 321 SER GLU ARG ILE ASP GLN VAL TYR LEU ALA ALA ALA LYSSEORES 6  A 321 VAL GLY GLY ILE VAL ALA ASN ASN THR TYR PRO ALA ASPSEORES 7  A 321 PHE ILE TYR GLN ASN MET MET ILE GLU SER ASN ILE ILESEORES 8  A 321 HIS ALA ALA HIS GLN ASN ASP VAL ASN LYS LEU LEU PHESEORES 9  A 321 LEU GLY SER SER CYS ILE TYR PRO LYS LEU ALA LYS GLNSEORES 10 A 321 PRO MET ALA GLU SER GLU LEU LEU GLN GLY THR LEU GLUSEORES 11 A 321 PRO THR ASN GLU PRO TYR ALA ILE ALA LYS ILE ALA GLYSEORES 12 A 321 ILE LYS LEU CYS GLU SER TYR ASN ARG GLN TYR GLY ARGSEORES 13 A 321 ASP TYR ARG SER VAL MET PRO THR ASN LEU TYR GLY PROSEORES 14 A 321 HIS ASP ASN PHE HIS PRO SER ASN SER HIS VAL ILE PROSEORES 15 A 321 ALA LEU LEU ARG ARG PHE HIS GLU ALA THR ALA GLN ASNSEORES 16 A 321 ALA PRO ASP VAL VAL VAL TRP GLY SER GLY THR PRO METSEORES 17 A 321 ARG GLU PHE LEU HIS VAL ASP ASP MET ALA ALA ALA SERSEORES 18 A 321 ILE HIS VAL MET GLU LEU ALA HIS GLU VAL TRP LEU GLUSEORES 20 A 321 GLY VAL ASP CYS THR ILE ARG ASP VAL ALA GLN THR ILESEOPES 21 A 321 ALA LYS VAL VAL GLY TYR LYS GLY ARG VAL VAL PHE ASPSEORES 22 A 321 ALA SER LYS PRO ASP GLY THR PRO ARG LYS LEU LEU ASPSEORES 24 A 321 SER LEU GLU ALA GLY LEU ALA SER THR TYR GLN TRP PHESEORES 25 A 321 LEU GLU ASN GLN ASP ARG PHE ARG GLYHET    NDP     1    0HETNAM    NDP烟酰胺腺嘌吟二核苷磷酸HETSYN        NDP NADPFORMUL   2    NDP    C21 H23 N7 O17 P3 3-FORMUL   3    HOH    *109(H2 O1)HELIX    1    1 MET A    14    GLN A    25  1    12HELIX    2    2 SER A    44    GLU A    54  1    11HELIX    3    3 ILE A    69    THR A    74  1     6HELIX    4    4 PRO A    76    ASN A    97  1    22HELIX    5    5 SER A   108    ILE A   110  5     3HELIX    6    6 GLU A   121    GLU A   123  5     3HELIX    7    7 GLU A   134    TYR A   154  1    21HELIX    8    8 VAL A   180    ALA A   193  1    14HELIX    9    9 VAL A   214    GLU A   226  1    13HELIX   10   10 HIS A   229    GLU A   234  1     6HELIX   11   11 ILE A   253    VAL A   264  1    12HELIX   12   12 THR A   288    GLN A   292  1     5HELIX   13   13 LEU A   301    GLU A   314  1    14SHEET    1    A 6 VAL A  29 VAL A  32 0SHEET    2    A 6 GLN A   4 ALA A   9 1    N GLN A  4    O GLU A    30SHEET    3    A 6 GLN A  58 LEU A  61 1    N GLN A 58    O PHE A     7SHEET    4    A 6 LYS A 101 LEU A 105 1    N LYS A 101   O VAL A    59SHEET    5    A 6 ASP A 157 PRO A 163 1    N ASP A 157   O LEU A   102SHEET    6    A 6 ILE A 243 VAL A 245 1    N ILE A 243   O MET A   162SHEET    1    B 2 ASN A 165 TYR A 167 0SHEET    2    B 2 PHE A 211 HIS A 213 1    N LEU A 212   O ASN A   165SHEET    1    C 2 ASP A 198 TRP A 202 0SHEET    2    C 2 ARG A 269 ASP A 273 1    N ARG A 269   O VAL A   199SITE     1  CAT 1 TYR    136SITE     2  CAT 1 LYS    140SITE     3  CAT 1 SER    107CRYST1  104.200 104.200    75.880 90.00    90.00 120.00 P 32 2 1    6ORIGX1    1.000000 0.000000 0.000000    0.00000ORIGX2    0.000000 1.000000 0.000000    0.00000ORIGX3    0.000000 0.000000 1.000000    0.00000SCALE1    0.009597 0.005541 0.000000    0.00000SCALE2    0.000000 0.011081 0.000000    0.00000SCALE3    0.000000 0.000000 0.013179    0.00000HETATM    1 O    HOH    1    55.652-16.806 22.535 1.00  8.73    OHETATM    2 O    HOH    3    58.494-10.639 18.740 1.00 13.17    OHETATM    3 O    HOH    4    58,230-11.715 27.770 1.00 19.07    OHETATM    4 O    HOH    5    57.252 -3.759 30.107 1.00 11.21    OHETATM    5 O    HOH    6    58.298-10.011 25.527 1.00 15.74    OHETATM    6 O    HOH    7    49.321  6.583 38.815 1.00 19.33    OHETATM    7 O    HOH    8    53.785 -4.262 22.464 1.00 10.94    OHETATM    8 O    HOH    10   74.652  2.888  9.141 1.00 17.80    OHETATM    9 O    HOH    11    49.761 0.826 32.896 1.00 22.02    OHETATM   10  O   HOH    12      55.530 -11.162  28.526  1.00 11.39           OHETATM   11  O   HOH    13      75.027   7.034  27.353  1.00 16.30           OHETATM   12  O   HOH    14      49.994  -2.314  11.032  1.00 21.33           OHETATM   13  O   HOH    15      61.323  -8.959  29.657  1.00 22.84           OEETATM   14  O   HOH    16      61.029 -11.560  29.131  1.00 21.24           OHETATM   15  O   HOH    17      50.684   5.881  10.130  1.00 15.88           OHETATM   16  O   HOH    18      64.506  -6.302  32.989  1.00 21.05           OHETATM   17  O   HOH    19      57.856 -16.398  25.085  1.00 22.86           OHETATM   18  O   HOH    20      38.979  26.536  19.070  1.00 21.08           OHETATM   19  O   HOH    21      38.042  33.487  21.909  1.00 19.01           OHETATM   20  O   HOH    24      38.172  35.775  20.827  1.00 33.46           OHETATM   21  O   HOH    25      70.916 -11.128  15.244  1.00 31.37           OHETATM   22  O   HOH    26      54.205  19.360  28.396  1.00 35.76           OHETATM   23  O   HOH    27      50.436   2.654  16.783  1.00 12.25           OHETATM   24  O   HOH    28      69.692  19.108  38.979  1.00 49.77           OHETATM   25  O   HOH    29      56.432  -8.877  19.303  1.00 22.52           OHETATM   26  O   HOH    30      60.832   3.415  42.349  1.00 17.39           OHETATM   27  O   HOH    31      53.889 -12.706  29.764  1.00 22.40           OHETATM   28  O   HOH    32      37.887  26.373  28.058  1.00 18.09           OHETATM   29  O   HOH    33      49.201  11.173  26.867  1.00 33.95           OHETATM   30  O   HOH    34      46.762  -0.278  31.394  1.00 20.63           OHETATM   31  O   HOH    35      41.731  27.568  43.302  1.00 27.39           OHETATM   32  O   HOH    36      66.827  11.202  28.929  1.00 13.23           OHETATM   33  O   HOH    37      46.834  14.396  40.819  1.00 46.02           OHETATM   34  O   HOH    38      61.342   1.064  43.868  1.00 26.68           OHETATM   35  O   HOH    42      70.597  16.422  37.837  1.00 19.26           OHETATM   36  O   HOH    44      72.275  -9.089  33.407  1.00 22.11           OHETATM   37  O   HOH    45      42.685  34.461  33.955  1.00 17.32           OHETATM   38  O   HOH    46      53.480  13.394  38.364  1.00 20.19           OHETATM   39  O   HOH    47      56.085  21.757  44.744  1.00 33.50           OHETATM   40  O   HOH    48      35.741  32.691  23.517  1.00 19.49           OHETATM   41  O   HOH    49      40.458  36.700  34.312  1.00 34.53           OHETATM   42  O   HOH    50      75.440   7.267  29.948  1.00 18.07           OHETATM   43  O   HOH    51      47.476  18.347  20.851  1.00 34.16           OHETATM   44  O   HOH    53      52.837 -16.344  19.587  1.00 25.92           OHETATM   45  O   HOH    55      46.415   9.073  20.108  1.00 31.91           OHETATM   46  O   HOH    57      45.912  35.170  36.133  1.00 35.55           OHETATM   47  O   HOH    58      60.247  -2.880  41.919  1.00 16.85           OHETATM   48  O   HOH    60      64.974   6.086  24.501  1.00 32.16           OHETATM   49  O   HOH    61      52.103   4.683   4.978  1.00 35.72           OHETATM   50  O   HOH    62      50.888  40.154  36.463  1.00 38.35           OHETATM   51  O   HOH    63      44.373  31.233  37.336  1.00 20.07           OHETATM   52  O   HOH    64      57.280  27.757  42.451  1.00 21.74           OHETATM   53  O   HOH    65      58.409  23.769  45.517  1.00 58.42           OHETATM   54  O   HOH    66      68.690 -11.764  35.335  1.00 57.07           OHETATM   55  O   HOH    67      42.746  25.153  23.465  1.00 27.05           OHETATM   56  O   HOH    68      53.638 -16.457  32.292  1.00 31.71           OHETATM   57  O   HOH    69      33.390  41.716  31.408  1.00 29.92           OHETATM   58  O   HOH    70      57.768  17.897  42.434  1.00 25.75           OHETATM   59  O   HOH    71      75 647   9.164  11.766  1.00 35.13           OHETATM   60  O   HOH    72      62.032  33.292  44.749  1.00 46.18           OHETATM   61  O   HOH    73      47.310  14.312  34.285  1.00 31.18           OHETATM   62  O   HOH    74      79.660  -3.947  15.913  1.00 34.63           OHETATM   63  O   HOH    75      46.929   5.343   4.550  1.00 23.14           OHETATM   64  O   HOH    76      73.475  12.039  28.412  1.00 27.26           OHETATM   65  O   HOH    77      46.297  -6.982  30.032  1.00 43.41           OHETATM   66  O   HOH    78      68.528  -3.422  40.869  1.00 38.47           OHETATM   67  O   HOH    79      62.080  -1.448  42.803  1.00 24.60           OHETATM   68  O   HOH    80      65.330  18.150  40.726  1.00 41.00           OHETATM   69  O   HOH    81      51.775  16.128  37.607  1.00 25.11           OHETATM   70  O   HOH    83      54.266  28.682  43.313  1.00 27.61           OHFTATM   71  O   HOH    85      73.291 -15.479  20.603  1.00 37.54           OHETATM   72  O   HOH    86      34.760  21.479  28.544  1.00 43.87           OHETATM   73  O   HOH    87      37.326  24.131  29.677  1.00 24.47           OHETATM   74  O   HOH    88      65.168  20.148   6.735  1.00 26.10           OHETATM   75  O   HOH    89      59.196  12.089  13.630  1.00 25.24           OHETATM   76  O   HOH    91      66.576  -6.235  40.279  1.00 43.11           OHETATM   77  O   HOH    93      37.339  29.394  25.515  1.00 27.56           OHETATM   78  O   HOH    94      52.339 -17.014  42.271  1.00 48.96           OHETATM   79  O   HOH    95      40.511  32.927  31.717  1.00 22.46           OHETATM   80  O   HOH    96      78.580  13.121  34.138  1.00 27.98           OHETATM   81  O   HOH    97      65.090  15.704  34.876  1.00 18.96           OHETATM   82  O   HOH    99      84.562   2.951  27.181  1.00 35.92           OHETATM   83  O   HOH   100      50.386   9.761   9.646  1.00 23.18           OHETATM   84  O   HOH   101      67.649  -0.851  38.764  1.00 24.99           OHETATM   85  O   HOH   102      44.001   4.293  34.315  1.00 31.13           OHETATM   86  O   HOH   103      59.386  -5.071  26.211  1.00 29.10           OHETATM   87  O   HOH   104      77.364   4.745  41.506  1.00 35 32           OHETATM   88  O   HOH   105      59.034  21.201  32.414  1.00 23.43           OHETATM   89  O   HOH   106      42.463  34.698  14.327  1.00 38.86           OHETATM   90  O   HOH   107      70.217  14.292  20.864  1.00 42.39           OHETATM   91  O   HOH   108      76.999   8.130  25.862  1.00 32.91           OHETATM   92  O   HOH   109      49.766  29.937  22.173  1.00 42.52           OHETATM   93  O   HOH   110      72.473  13.536  38.823  1.00 33.32           OHETATM   94  O   HOH   111      64.328 -12.084  38.608  1.00 37.99           OHETATM   95  O   HOH   112      60.161  16.382  42.682  1.00 35.68           OHETATM   96  O   HOH   113      47.602  13.639  27.016  1.00 26.01           OHETATM   97  O   HOH   115      64.606  11.644  40.107  1.00 30.33           OHETATM   98  O   HOH   116      61.231 -15.137  27.255  1.00 38.76           OHETATM   99  O   HOH   117      65.324 -11.223  35.098  1.00 30.45           OHETATM  100  O   HOH   119      56.602  17.219  44.932  1.00 36.53           OHETATM  101  O   HOH   120      37.564  19.860  23.135  1.00 31.27           OHETATM  102  O   HOH   121      64.845   5.057  21.132  1.00 45.57           OHETATM  103  O   HOH   123      63.391  16.801  26.898  1.00 38.46           OHETATM  104  O   HOH   124      42.567   6.134  32.635  1.00 31.56           OHETATM  105  O   HOH   125      72.485  13.236  35.059  1.00 29.61           OHETATM  106  O   HOH   126      65.229   3.650  44.032  1.00 36.86           OHETATM  107  O   HOH   127      37.089   7.148  31.083  1.00 39.58           OHETATM  108  O   HOH   128      73.327  10.546  12.123  1.00 34.97           OHETATM  109  O   HOH   129      74.450  10.299  26.598  1.00 30.80           OHETATM  110 AO5* NDP A   1      67.524  13.055  26.692  1.00 36.42           OHETATM  111 AC5* NDP A   1      68.089  12.297  25.614  1.00  9.30           CHETATM  112 AC4* NDP A   1      69.601  12.124  25.858  1.00 27.73           CHETATM  113 AO4* NDP A   1      70.193  11.258  24.848  1.00 22.87           OHETATM  114 AC3* NDP A   1      70.484  13.390  25.873  1.00 17.83           CHETATM  115 AO3* NDP A   1      71.192  13.436  27.066  1.00 16.11           OHETATM  116 AC2* NDP A   1      71.373  13.220  24.626  1.00 11.46           CHETATM  117 AO2* NDP A   1      72.623  13.886  24.655  1.00 31.96           OHETATM  118 AC1* NDP A   1      71.510  11.702  24.656  1.00 19.02           CHETATM  119  O3  NDP A   1      65.336  13.590  26.129  1.00 20.59           OHETATM  120 NO5* NDP A   1      63.536  11.943  26.448  1.00 28.99           OHETATM  121 NC5* NDP A   1      64.328  10.843  25.957  1.00 24.89           CHETATM  122 NC4* NDP A   1      63.467   9.646  25.686  1.00 31.79           CHETATM  123 NO4* NDP A   1      62.837   9.337  26.908  1.00 28.82           OHETATM  124 NC3* NDP A   1      62.340   9.837  24.665  1.00 11.50           CHETATM  125 NO3* NDP A   1      62.891   9.402  23.461  1.00 28.60           OHETATM  126 NC2* NDP A   1      61.152   8.996  25.138  1.00 28.11           CHETATM  127 NO2* NDP A   1      60.881   7.662  24.715  1.00 24.30           OHETATM  128 NC1* NDP A   1      61.547   8.875  26.580  1.00 35.35           CHETATM  129 AP2* NDP A   1      73.104  15.069  23.823  1.00 32.96           PHETATM  130 AOP1 NDP A   1      74.500  15.308  24.308  1.00 37.84           OHETATM  131 AOP2 NDP A   1      72.797  14.925  22.348  1.00 36.66           OHETATM  132 AOP3 NDP A   1      72.163  16.217  23.958  1.00 31.97           OHETATM  133  AP  NDP A   1      66.660  14.257  26.393  1.00 26.17          XXHETATM  134  AO1 NDP A   1      66.886  14.795  25.047  1.00 15.31          XXHETATM  135  AO2 NDP A   1      66.439  15.207  27.521  1.00 34.39          XXHETATM  136  AN9 NDP A   1      71.820  11.224  23.353  1.00 13.63          XXHETATM  137  AC8 NDP A   1      71.104  11.316  22.200  1.00 12.41          XXHETATM  138  AN7 NDP A   1      71.758  10.835  21.161  1.00 15.71          XXHETATM  139  AC5 NDP A   1      72.933  10.313  21.710  1.00 16.17          XXHETATM  140  AC6 NDP A   1      74.053   9.657  21.140  1.00 31.35          XXHETATM  141  AN6 NDP A   1      74.165   9.464  19.819  1.00 12.59          XXHETATM  142  AN1 NDP A   1      75.078   9.280  21.942  1.00 17.56          XXHETATM  143  AC2 NDP A   1      74.971   9.578  23.251  1.00 15.44          XXHETATM  144  AN3 NDP A   1      74.027  10.302  23.889  1.00 24.82          XXHETATM  145  AC4 NDP A   1      73.036  10.653  23.047   1.00 17.48          XXHETATM  146  NP  NDP A   1      64.183  13.106  27.191   1.00 25.47           NHETATM  147  NO1 NDP A   1      63.142  14.169  27.253   1.00 28.69           NHETATM  148  NO2 NDP A   1      64.837  12.643  28.492   1.00 24.32           NHETATM  149  NN1 NDP A   1      60.598   9.775  27.109   1.00 23.63           NHETATM  150  NC2 NDP A   1      60.143  10.905  26.442 -99.00 78.36           NHETATM  151  NC3 NDP A   1      59.070  11.648  27.007 -99.00100.00           NHETATM  152  NC7 NDP A   1      58.497  13.017  26.528 -99.00100.00           NHETATM  153  NO7 NDP A   1      59.358  13.703  25.972 -99.00100.00           NHETATM  154  NN7 NDP A   1      57.207  13.400  26.912 -99.00 84.38           NHETATM  155  NC4 NDP A   1      58.442  11.146  28.137 -99.00100.00           NHETATM  156  NC5 NDP A   1      58.912   9.963  28.754 -99.00100.00           NHETATM  157  NC6 NDP A   1      59.951   9.266  28.147 -99.00100.00           NATOM    158  N   LYS A   3      76.227  -5.632  44.315   1.00 61.49           NATOM    159  CA  LYS A   3      76.152  -4.302  43.684   1.00 58.00           CATOM    160  C   LYS A   3      75.985  -4.421  42.171   1.00 52.79           CATOM    161  O   LYS A   3      76.921  -4.737  41.419   1.00 44.76           OATOM    162  CB  LYS A   3      77.359  -3.417  44.030   1.00 59.74           CATOM    163  CG  LYS A   3      77.011  -1.944  44.314   1.00 50.87           CATOM    164  CD  LYS A   3      78.208  -1.161  44.894   1.00 61.21           CATOM    165  CE  LYS A   3      77.855  -0.377  46.186   1.00100.00           CATOM    166  NZ  LYS A   3      78.857  -0.401  47.343   1.00 70.61           NATOM    167  N   GLN A   4      74.746  -4.242  41.747   1.00 45.15           NATOM    168  CA  GLN A   4      74.408  -4.326  40.347   1.00 37.18           CATOM    169  C   GLN A   4      74.983  -3.166  39.561   1.00 34.93           CATOM    170  0   GLN A   4      75.127  -2.050  40.087   1.00 28.48           OATOM    171  CB  GLN A   4      72.915  -4.445  40.221   1.00 34.65           CATOM    172  CG  GLN A   4      72.456  -5.854  40.584   1.00 31.82           CATOM    173  CD  GLN A   4      72.570  -6.788  39.405   1.00 79.25           CATOM    174  OE1 GLN A   4      72.165  -6.452  38.286   1.00100.00           OATOM    175  NE2 GLN A   4      73.206  -7.925  39.623   1.00 80.24           NATOM    176  N   ARG A   5      75.475  -3.495  38.375   1.00 27.16           NATOM    177  CA  ARG A   5      76.146  -2.546  37.483   1.00 39.16           CATOM    178  C   ARG A   5      75.191  -2.018  36.433   1.00 38.22           CATOM    179  O   ARG A   5      74.938  -2.698  35.438   1.00 32.44           OATOM    180  CB  ARG A   5      77.398  -3.163  36.826   1.00 41.76           CATOM    181  CG  ARG A   5      78.692  -2.954  37.663   1.00 37.34           CATOM    182  CD  ARG A   5      80.015  -3.236  36.876   1.00 32.99           CATOM    183  NE  ARG A   5      81.036  -2.203  37.125   1.00 25.71           NATOM    184  CZ  ARG A   5      81.617  -1.488  36.169   1.00 32.53           CATOM    185  NH1 ARG A   5      81.293  -1.704  34.904   1.00 40.07           NATOM    186  NH2 ARG A   5      82.516  -0.551  36.474   1.00100.00           NATOM    187  N   VAL A   6      74.743  -0.773  36.659   1.00 32.08           NATOM    188  CA  VAL A   6      73.715  -0.082  35.881   1.00 28.89           CATOM    189  C   ZAL A   6      74.161   1.021  34.897   1.00 29.37           CATOM    190  O   VAL A   6      74.745   2.041  35.274  1.00 22 50           OATOM    191  CB  VAL A   6      72.577   0.378  36.813  1.00 23.52           CATOM    192  CG1 VAL A   6      71.366   0.960  36.006  1.00 20.29           CATOM    193  CG2 VAL A   6      72.108  -0.852  37.644  1.00 18.45           CATOM    194  N   PHE A   7      73.948   0.749  33.615  1.00 22.92           NATOM    195  CA  PHE A   7      74.267   1.710  32.573  1.00 27.15           CATOM    196  C   PHE A   7      72.975   2.423  32.192  1.00 20.24           CATOM    197  O   PHE A   7      71.994   1.788  31.815  1.00 20.71           OATOM    198  CB  PHE A   7      74.864   1.004  31.374  1.00 18.98           CATOM    199  CG  PHE A   7      74.916   1.836  30.115  1.00 21.83           CATOM    200  CD1 PHE A   7      75.521   3.087  30.108  1.00 19.36           CATOM    201  CD2 PHE A   7      74.483   1.284  28.886  1.00 23.50           CATOM    202  CE1 PHE A   7      75.614   3.828  28.902  1.00 27.52           CATOM    203  CE2 PHE A   7      74.548   1.996  27.685  1.00 19.33           CATOM    204  CZ  PHE A   7      75.128   3.255  27.673  1.00 18 59           CATOM    205  N   ILE A   8      72.959   3.727  32.454  1.00 18.75           NATOM    206  CA  ILE A   8      71.844   4.588  32.112  1.00 14.25           CATOM    207  C   ILE A   8      72.337   5.351  30.909  1.00 11.22           CATOM    208  O   ILE A   8      73.259   6.165  30.998  1.00 17.76           OATOM    209  CB  ILE A   8      71.507   5.605  33.212  1.00 14.15           CATOM    210  CG1 ILE A   8      71.356   4.949  34.582  1.00  8.24           CATOM    211  CG2 ILE A   8      70.183   6.342  32.874  1.00 16.85           CATOM    212  CD1 ILE A   8      71.091   5.961  35.707  1.00 10.32           CATOM    213  N   ALA A   9      71.896   4.906  29.752  1.00 16.42           NATOM    214  CA  ALA A   9      72.256   5.559  28.513  1.00 18.74           CATOM    215  C   ALA A   9      71.530   6.913  28.511  1.00 28.45           CATOM    216  O   ALA A   9      70.411   7.032  29.045  1.00 22.39           OATOM    217  CB  ALA A   9      71.808   4.731  27.311  1.00 14.43           CATOM    218  N   GLY A  10      72.199   7.922  27.940  1.00 20.06           NATOM    219  CA  GLY A  10      71.706   9.284  27.911  1.00 18.62           CATOM    220  C   GLY A  10      71.407   9.819  29.305  1.00 16.40           CATOM    221  O   GLY A  10      70.379  10.448  29.481  1.00 17.36           OATOM    222  N   HIS A  11      72.295   9.581  30.272  1.00 10.32           NATOM    223  CA  HIS A  11      72.068   9.966  31.688  1.00 13.90           CATOM    224  C   HIS A  11      72.008  11.504  31.916  1.00 21.52           CATOM    225  O   HIS A  11      71.700  11.994  32.983  1.00 13.22           OATOM    226  CB  HIS A  11      73.153   9.350  32.581  1.00 14.88           CATOM    227  CG  HIS A  11      74.502   9.948  32.326  1.00 23.73           CATOM    228  ND1 HIS A  11      75.239   9.648  31.197  1.00 24.90           NATOM    229  CD2 HIS A  11      75.167  10.952  32.956  1.00 16.35           CATOM    230  CE1 HIS A  11      76.317  10.407  31.170  1.00 22.54           CATOM    231  NE2 HIS A  11      76.271  11.240  32.197  1.00 17.56           NATOM    232  N   ARG A  12      72.310  12.288  30.908  1.00 22.31           NATOM    233  CA  ARG A  12      72.147  13.693  31.122  1.00 18.90           CATOM    234  C   ARG A  12      70.851  14.244  30.495  1.00 26.34           CATOM    225  O   ARG A  12      70.572  15.426  30.604  1.00 25.37           OATOM    236  CB  ARG A  12      73.352  14.418  30.587  1.00 25.93           CATOM    237  CG  ARG A  12      74.582  13.943  31.279  1.00 53.87           CATOM    238  CD  ARG A  12      75.757  14.619  30.699  1.00 32.53           CATOM    239  NE  ARG A  12      76.359  15.576  31.605  1.00 69.90           NATOM    240  CZ  ARG A  12      76.971  16.675  31.178  1.00100.00           CATOM    241  NH1 ARG A  12      77.001  16.948  29.867  1.00100.00           NATOM    242  NH2 ARG A  12      77.526  17.508  32.056  1.00100.00           NATCM    243  N   GLY A  13      70.078  13.420  29.800  1.00 18.25           NATOM    244  CA  GLY A  13      68.802  13.904  29.258  1.00 16.50           CATOM    245  C   GLY A  13      67.849  14.144  30.428  1.00 18.88           CATOM    246  O   GLY A  13      68.202  13.902  31.624  1.00 14.04           OATOM    247  N   MET A  14      66.653  14.632  30.103  1.00 16.00           NATOM    248  CA  MET A  14      65.688  14.981  31.128  1.00 13.49           CATOM    249  C   MET A  14      65.293  13.760  31.901  1.00 14.02           CATOM    250  O   MET A  14      65.408  13.713  33.145  1.00 17.06           OATOM    251  CB  MET A  14      64.442  15.605  30.524  1.00 11.57           CATOM    252  CG  MET A  14      63.320  15.628  31.559  1 00 20.77           CATOM    253  SD  MET A  14      61.926  16.766  31.110  1.00 29.16           SATOM    254  CE  MET A  14      62.527  17.108  29.574  1.00 30.68           CATOM    255  N   VAL A  15      64.798  12.769  31.158  1.00 25.23           NATOM    256  CA  VAL A  15      64.439  11.468  31.738  1.00 20.90           CATOM    257  C   VAL A  15      65.654  10.713  32.378  1.00 17.26           CATOM    258  O   VAL A  15      65.590  10.239  33.524  1.00 18.41           OATOM    259  CB  VAL A  15      63.752  10.550  30.680  1.00 23.25           CATOM    260  CG1 VAL A  15      63.330   9.253  31.310  1.00 15.71           CATOM    261  CG2 VAL A  15      62.528  11.193  30.183  1.00 13.40           CATOM    262  N   GLY A  16      66.784  10.642  31.665  1.00 20.39           NATCM    263  CA  GLY A  16      67.941   9.904  32.186  1.00 19.54           CATOM    264  C   GLY A  16      68.522  10.432  33.492  1.00 29.29           CATOM    265  O   GLY A  16      68.896   9.659  34.434  1.00 16.91           OATOM    266  N   SER A  17      68.64~  11.755  33.499  1.00 12.53           NATOM    267  CA  SER A  17      69.154  12.460  34.650  1.00 21.93           CATOM    268  C   SER A  17      68.209  12.214  35.818  1.00 13.35           CATOM    269  O   SER A  17      68.677  11.957  36.915  1.00 24.19           OATOM    270  CB  SER A  17      69.378  13.942  34.333  1.00 15.52           CATOM    271  OG  SER A  17      68.153  14.619  34.372  1.00 22.95           OATOM    272  N   ALA A  18      66.896  12.143  35.590  1.00 17 52           NATOM    273  CA  ALA A  18      65.991  11.828  36.729  1.00 13.14           CATOM    274  C   ALA A  18      66.220  10.393  37.307  1.00 19.29           CATOM    275  O   ALA A  18      66.149  10.150  38.522  1.00 16.94           OATOM    276  CB  ALA A  18      64.460  12.046  36.334  1.00 14.33           CATOM    277  N   ILE A  19      66.484   9.432  36.430  1.00 20.80           NATOM    278  CA  ILE A  19      66.705   8.078  36.900  1.00 18.08           CATOM    279  C   ILE A  19      67.975   8.090  37.730  1.00 16.09           CATOM    280  O   ILE A  19      68.018   7.530  38.820  1.00 20.73           OATOM    281  CB  ILE A  19      66.804   7.079  35.710  1.00 17.58           CATOM    282  CG1 ILE A  19      65.444   6.812  35.162  1.00 10.09           CATOM    283  CG2 ILE A  19      67.309   5.666  36.133  1.00 21.60           CATOM    284  CD1 ILE A  19      65.528   6.361  33.741  1.00 19.05           CATOM    285  N   ARG A  20      68.984   8.771  37.198  1.00 18.13           NATOM    286  CA  ARG A  20      70.286   8.897  37.836  1.00 20.25           CATOM    287  C   ARG A  20      70.231   9.491  39.242  1.00 30.62           CATOM    288  O   ARG A  20      70.957   9.091  40.129  1.00 33.00           OATOM    289  CB  ARG A  20      71.201   9.743  36.957  1.00 11.71           CATOM    290  CG  ARG A  20      72.610   9.781  37.449  1.00 23.79           CATOM    291  CD  ARG A  20      72.881  11.107  38.060  1.00 36.76           CATOM    292  NE  ARG A  20      74.297  11.443  38.062  1.00 48.34           NATOM    293  CZ  ARG A  20      74.990  11.841  36.988  1.00100.00           CATOM    294  NH1 ARG A  20      74.393  11.931  35.808  1.00100.00           NATOM    295  NH2 ARG A  20      76.289  12.139  37.076  1.00100.00           NATOM    296  N   ARG A  21      69.368  10.461  39.439  1.00 22.10           NATOM    297  CA  ARG A  21      69.216  11.052  40.750  1.00 17.45           CATOM    298  C   ARG A  21      68.721  10.007  41.730  1.00 26.71           CATOM    299  O   ARG A  21      69.147  10.001  42.885  1.00 30.27           OATOM    300  CB  ARG A  21      68.142  12.144  40.708  1.00 17.93           CATOM    301  CG  ARG A  21      68.682  13.522  40.321  1.00 27.57           CATOM    302  CD  ARG A  21      67.586  14.599  40.130  1.00 23.02           CATOM    303  NE  ARG A  21      67.619  15.000  38.743  1.00 55.12           NATOM    304  CZ  ARG A  21      66.538  15.103  37.995  1.00 10.55           CATOM    305  NH1 ARG A  21      65.343  14.974  38.552  1.00 29.80           NATOM    306  NH2 ARG A  21      66.665  15.435  36.715  1.00 61.45           NATOM    307  N   GLN A  22      67.713   9.223  41.345  1.00 27.48           NATOM    308  CA  GLN A  22      67.167   8.257  42.313  1.00 24.79           CATOM    309  C   GLN A  22      68.137   7.127  42.547  1.00 31.37           CATOM    310  O   GLN A  22      68.394   6.724  43.685  1.00 27.47           OATOM    311  CB  GLN A  22      65.818   7.706  41.894  1.00 17.11           CATOM    312  CG  GLN A  22      64.921   8.745  41.243  1.00 66.14           CATOM    313  CD  GLN A  22      63.425   8.456  41.397  1.00 41.27           CATOM    314  OE1 GLN A  22      63.002   7.329  41.762  1.00 29.34           OATOM    315  NE2 GLN A  22      62.610   9.464  41.046  1.00 20.12           NATOM    316  N   LEU A  23      68.697   6.652  41.448  1.00 27.99           NATOM    317  CA  LEU A  23      69.649   5.575  41.500  1.00 24.48           CATOM    318  C   LEU A  23      70.828   5.971  42.334  1.00 28.87           CATOM    319  O   LEU A  23      71.288   5.218  43.165  1.00 30.79           OATOM    320  CB  LEU A  23      70.036   5.107  40.089  1.00 22.72           CATOM    321  CG  LEU A  23      68.966   4.072  39.658  1.00 26.16           CATOM    322  CD1 LEU A  23      69.271   3.083  38.481  1.00 24.80           CATOM    323  CD2 LEU A  23      68.427   3.284  40.835  1.00 22.91           CATOM    324  N   GLU A  24      71.279   7.192  42.153  1.00 28.77           NATOM    325  CA  GLU A  24      72.419   7.675  42.909  1.00 33.79           CATOM    326  C   GLU A  24      72.363   7.388  44.412  1.00 35.94           CATOM    327  O   GLU A  24      73.381   7.140  45.031  1.00 39.07           OATOM    328  CB  GLU A  24      72.647   9.165  42.653  1.00 36.21           CATOM    329  CG  GLU A  24      74.068   9.482  42.243  1.00 42.54           CATOM    330  CD  GLU A  24      74.158  10.689  41.333  1.00 89.51           CATOM    331  OE1 GLU A  24      73.386  11.663  41.549  1.00 43.21           OATOM    332  OE2 GLU A  24      74.994  10.646  40.398  1.00 66.28           OATOM    333  N   GLN A  25      71.182   7.422  45.000  1.00 45.70           NATOM    334  CA  GLN A  25      71.039   7.152  46.432  1.00 47.57           CATOM    335  C   GLN A  25      70.887   5.669  46.740  1.00 67.34           CATOM    336  O   GLN A  25      70.285   5.286  47.726  1.00 74.06           OATOM    337  CB  GLN A  25      69.783   7.842  46.905  1.00 51.85           CATOM    338  CG  GLN A  25      69.500   9.084  46.109  1.00 44.91           CATOM    339  CD  GLN A  25      68.419   9.913  46.742  1.00100.00           CATOM    340  OE1 GLN A  25      68.271   9.947  47.972  1.00100.00           OATOM    341  NE2 GLN A  25      67.624  10.602  45.911  1 00100.00           NATOM    342  N   ARG A  26      71.322   4.831  45.825  1.00 75.37           NATOM    343  CA  ARG A  26      71.182   3.407  46.026  1.00 74.87           CATOM    344  C   ARG A  26      72.568   2.791  46.147  1.00 74.08           CATOM    345  O   ARG A  26      73.440   2.997  45.289  1.00 77.00           OATOM    346  CB  ARG A  26      70.390   2.790  44.885  1.00 52.44           CATOM    347  CG  ARG A  26      68.916   2.927  45.070  1.00 43.51           CATOM    348  CD  ARG A  26      68.428   1.752  45.864  1.00 40.70           CATOM    349  NE  ARG A  26      67.200   1.176  45.338  1.00 42.33           NATOM    350  CZ  ARG A  26      67.126   0.508  44.196  1.00 32.07           CATOM    351  NH1 ARG A  26      68.215   0.324  43.486  1.00 44.02           NATOM    352  NH2 ARG A  26      65.968   0.017  43.771  1.00 77.32           NATOM    353  N   GLY A  27      72.778   2.114  47.266  1.00 46.30           NATOM    354  CA  GLY A  27      74.060   1.531  47.549  1.00 46.82           CATOM    355  C   GLY A  27      74.140   0.165  46.923  1.00 55.45           CATOM    356  O   GLY A  27      75.204  -0.453  46.877  1.00 64.43           OATOM    357  N   ASP A  28      73.017  -0.315  46.428  1.00 40.98           NATOM    358  CA  ASP A  28      73.016  -1.647  45.861  1.00 40.35           CATOM    359  C   ASP A  28      73.266  -1.536  44.400  1.00 39.55           CATOM    360  O   ASP A  28      73.109  -2.518  43.654  1.00 48.80           OATOM    361  CB  ASP A  28      71.680  -2.335  46.127  1.00 47.80           CATOM    362  CG  ASP A  28      70.503  -1.373  46.064  1.00 35.34           CATOM    363  OD1 ASP A  28      70.705  -0.140  46.095  1.00 39.23           OATOM    364  OD2 ASP A  28      69.383  -1.870  45.872  1.00 69.86           OATOM    365  N   VAL A  29      73.651  -0.329  43.996  1.00 31.03           NATOM    366  CA  VAL A  29      73.881  -0.050  42.591  1.00 28.44           CATOM    367  C   VAL A  29      75.166   0.676  42.281  1.00 28.00           CATOM    368  O   VAL A  29      75.505   1.699  42.892  1.00 34.83           OATOM    369  CB  VAL A  29      72.696   0.760  42.000  1.00 30.68           CATOM    370  CG1 VAL A  29      72.935   1.088  40.549  1.00 23.65          CATOM    371  CG2 VAL A  29      71.416  -0.028  42.156  1.00 27.95          CATOM    372  N   GLU A  30      75.824   0.219  41.230  1.00 30.76          NATOM    373  CA  GLU A  30      76.995   0.924  40.736  1.00 28.38          CATOM    374  C   GLU A  30      76.678   1.471  39.332  1.00 31.03          CATOM    375  O   GLU A  30      76.368   0.720  38.397  1.00 26.64          OATOM    376  CB  GLU A  30      78.199   0.006  40.722  1.00 31.84          CATOM    377  CG  GLU A  30      79.355   0.539  41.533  1.00 89.26          CATOM    378  CD  GLU A  30      80.667   0.264  40.858  1.00100.00          CATOM    379  OE1 GLU A  30      81.082  -0.922  40.872  1.00 88.94          OATOM    380  OE2 GLU A  30      81.202   1.206  40.219  1.00100.00          OATOM    381  N   LEU A  31      76.665   2.789  39.207  1.00 22.24          NATOM    382  CA  LEU A  31      76.269   3.391  37.945  1.00 29.37          CATOM    383  C   LEU A  31      77.404   3.507  36.941  1.00 25.79          CATOM    384  O   LEU A  31      78.485   3.969  37.256  1.00 29.41          OATOM    385  CB  LEU A  31      75.632   4.760  38.191  1.00 30.20          CATOM    386  CG  LEU A  31      74.329   4.763  38.994  1.00 29.37          CATOM    387  CD1 LEU A  31      73.841   6.143  39.240  1.00 23.43          CATOM    388  CD2 LEU A  31      73.275   3.962  38.281  1.00 23.04          NATOM    389  N   VAL A  32      77.146   3.100  35.711  1.00 21.94          NATOM    390  CA  VAL A  32      78.143   3.265  34.685  1.00 25.48          CATOM    391  C   VAL A  32      77.535   4.242  33.669  1.00 38.76          CATOM    392  O   VAL A  32      76.429   3.999  33.180  1.00 29.70          OATOM    393  CB  VAL A  32      78.517   1.902  34.055  1.00 34.25          CATOM    394  CG1 VAL A  32      79.587   2.079  32.970  1.00 30.56          CATOM    395  CG2 VAL A  32      79.003   0.950  35.139  1.00 25.27          CATOM    396  N   LEU A  33      78.219   5.375  33.457  1.00 30.19          NATOM    397  CA  LEU A  33      77.732   6.463  32.621  1.00 22.71          CATOM    398  C   LEU A  33      78.727   6.979  31.645  1.00 29.55          CATOM    399  O   LEU A  33      79.896   7.152  31.988  1.00 30.09          OATOM    400  CB  LEU A  33      77.423   7.635  33.514  1.00 19.75          CATOM    401  CG  LEU A  33      76.729   7.200  34.779  1.00 19.38          CATOM    402  CD1 LEU A  33      76.814   8.344  35.762  1.00 27.24          CATOM    403  CD2 LEU A  33      75.271   6.913  34.444  1.00 22.07          CATOM    404  N   ARG A  34      78.239   7.421  30.496  1.00 15.09          NATOM    405  CA  ARG A  34      79.154   8.008  29.541  1.00 26.04          CATOM    406  C   ARG A  34      78.469   9.173  28.916  1.00 36.57          CATOM    407  O   ARG A  34      77.288   9.130  28.651  1.00 38.59          OATOM    408  GB  ARG A  34      79.486   7.048  28.398  1.00 22.89          CATOM    409  CG  ARG A  34      80.579   6.081  28.706  1.00 23.29          CATOM    410  CD  ARG A  34      81.370   6.575  29.860  1.00 52.06          CATOM    411  NE  ARG A  34      81.783   5.458  30.711  1.00 80.25          NATOM    412  CZ  ARG A  34      82.646   4.530  30.323  1.00 41.94          CATOM    413  NH1 ARG A  34      83.173   4.596  29.104  1.00 53.02          NATOM    414  NH2 ARG A  34      82.983   3.547  31.148  1.00 25.56          NATOM    415  N   THR A  35      79.248  10.156  28.539  1.00 31.58            NATOM    416  CA  THR A  35      78.703  11.282  27.833  1.00 29.33            CATOM    417  C   THR A  35      78.719  10.951  26.340  1.00 32.53            CATOM    418  O   THR A  35      79.350   9.944  25.962  1.00 28.08            OATOM    419  CB  THR A  35      79.527  12.527  28.145  1.00 37.49            CATOM    420  OG1 THR A  35      80.844  12.429  27.560  1.00 31.91            OATOM    421  CG2 THR A  35      79.627  12.642  29.651  1.00 19.38            CATOM    422  N   ARG A  36      78.032  11.780  25.529  1.00 30.02            NATOM    423  CA  ARG A  36      78.002  11.639  24.056  1.00 29.37            CATOM    424  C   ARG A  36      79.406  11.765  23.503  1.00 31.46            CATOM    425  O   ARG A  36      79.772  11.012  22.591  1.00 36.56            OATOM    426  CB  ARG A  36      77.054  12.650  23.354  1.00 37.34            CATOM    427  CG  ARG A  36      76.937  12.465  21.846-99.00 49.47            CATOM    428  CD  ARG A  36      76.020  13.515  21.232-99.00 63.09            CATOM    429  NE  ARG A  36      75.528  13.124  19.915-99.00 75.23            NATOM    430  CZ  ARG A  36      74.381  13.549  19.391-99.00 91.44            CATOM    431  NH1 ARG A  36      73.605  14.375  20.079-99.00 79.32            NATOM    432  NH2 ARG A  36      74.009  13.144  18.185-99.00 78.73            NATOM    433  N   ASP A  37      80.217  12.677  24.063  1.00 41.30            NATOM    434  CA  ASP A  37      81.606  12.710  23.601  1.00 44.91            CATOM    435  C   ASP A  37      82.410  11.481  24.043  1.00 24.99            CATOM    436  O   ASP A  37      83.211  10.978  23.261  1.00 42.22            OATOM    437  CB  ASP A  37      82.347  14.048  23.718-99.00 47.07            CATOM    438  CG  ASP A  37      81.881  14.887  24.876-99.00 62.99            CATOM    439  OD1 ASP A  37      80.679  14.839  25.204-99.00 64.45            OATOM    440  OD2 ASP A  37      82.711  15.638  25.429-99.00 69.84            OATOM    441  N   GLU A  38      82.129  10.950  25.235  1.00 19.39            NATOM    442  CA  GLU A  38      82.790   9.717  25.682  1.00 27.84            CATOM    443  C   GLU A  38      82.203   8.527  24.901  1.00 37.14            CATOM    444  O   GLU A  38      82.873   7.511  24.699  1.00 35.04            OATOM    445  CB  GLU A  38      82.691   9.435  27.207  1.00 25.18            CATOM    446  CG  GLU A  38      83.116  10.549  28.183  1.00 37.45            CATOM    447  CD  GLU A  38      82.807  10.212  29.655  1.00 21.13            CATOM    448  OE1 GLU A  38      81.623   9.997  30.014  1.00 55.97            OATOM    449  OE2 GLU A  38      83.757   9.978  30.419  1.00 98.78            OATOM    450  N   LEU A  39      80.948   8.610  24.478  1.00 25.52            NATOM    451  CA  LEU A  39      80.440   7.483  23.739  1.00 18.17            CATOM    452  C   LEU A  39      79.291   7.764  22.825  1.00 20.34            CATOM    453  O   LEU A  39      78.152   7.810  23.259  1.00 26.35            OATOM    454  CB  LEU A  39      80.123   6.313  24.657  1.00 14.56            CATOM    455  CG  LEU A  39      79.410   5.075  24.058  1.00 19.52            CATOM    456  CD1 LEU A  39      80.205   4.392  22.994  1.00 18.84            CATOM    457  CD2 LEU A  39      78.890   4.051  25.084  1.00 17.41            CATOM    458  N   ASN A  40      79.598   7.880  21.543  1.00 16.73            NATOM    459  CA  ASN A  40      78.548   7.971  20.540  1.00 21.55            CATOM    460  C   ASN A  40      77.798   6.649  20.308  1.00 24 53           CATOM    461  O   ASN A  40      78.328   5.720  19.688  1.00 19.96           OATOM    462  CB  ASN A  40      79.130   8.367  19.216  1.00 18.45           CATOM    463  CG  ASN A  40      78.054   8.727  18.225  1.00 42.19           CATOM    464  OD1 ASN A  40      78.327   9.093  17.080  1.00 38.89           OATOM    465  ND2 ASN A  40      76.827   8.730  18.697  1.00 23.71           NATOM    466  N   LEU A  41      76.543   6.622  20.754  1.00 21.08           NATOM    467  CA  LEU A  41      75.649   5.465  20.650  1.00 15.03           CATOM    468  C   LEU A  41      75.225   5.068  19.213  1.00 18.22           CATOM    469  O   LEU A  41      74.681   3.971  18.980  1.00 15.72           OATOM    470  CB  LEU A  41      74.426   5.705  21.532  1.00 15.85           CATOM    471  CG  LEU A  41      74.822   6.029  22.974  1.00 21.90           CATOM    472  CD1 LEU A  41      73.604   6.413  23.749  1.00 20.59           CATOM    473  CD2 LEU A  41      75.481   4.796  23.609  1.00 17.97           CATOM    474  N   LEU A  42      75.542   5.916  18.238  1.00 12.45           NATOM    475  CA  LEU A  42      75.256   5.607  16.831  1.00 15.99           CATOM    476  C   LEU A  42      76.290   4.680  16.280  1.00 26.18           CATOM    477  O   LEU A  42      76.066   4.039  15.257  1.00 22.41           OATOM    478  CB  LEU A  42      75.282   6.873  15.984  1.00 17.85           CATOM    479  CG  LEU A  42      74.180   7.854  16.399  1.00 30.70           CATOM    480  CD1 LEU A  42      74.318   9.184  15.704  1.00 24.31           CATOM    481  CD2 LEU A  42      72.764   7.241  16.208  1.00 31.13           CATOM    482  N   ASP A  43      77.462   4.705  16.911  1.00 26.87           NATOM    483  CA  ASP A  43      78.579   3.875  16.486  1.00 19.29           CATOM    484  C   ASP A  43      78.583   2.519  17.163  1.00 13.33           CATOM    485  O   ASP A  43      79.051   2.348  18.297  1.00 18.75           OATOM    486  CB  ASP A  43      79.870   4.580  16.776  1.00 31.06           CATOM    487  CG  ASP A  43      81.083   3.758  16.380  1.00 30.68           CATOM    488  OD1 ASP A  43      80.971   2.551  16.082  1.00 32.36           OATOM    489  OD2 ASP A  43      82.187   4.308  16.499  1.00 37.83           OATOM    490  N   SER A  44      78.139   1.544  16.377  1.00 16.89           NATOM    491  CA  SER A  44      77.978   0.173  16.789  1.00 17.67           CATOM    492  C   SER A  44      79.237  -0.463  17.392  1.00 20.40           CATOM    493  O   SER A  44      79.206  -1.126  18.444  1.00 26.27           OATOM    494  CB  SER A  44      77.504  -0.617  15.581  1.00 13.85           CATOM    495  OG  SER A  44      76.800  -1.740  16.063  1.00 43.83           OATOM    496  N   ARG A  45      80.335  -0.301  16.682  1.00 15.63           NATOM    497  CA  ARG A  45      81.616  -0.788  17.154  1.00 19.94           CATOM    498  C   ARG A  45      81.910  -0.225  18.521  1.00 29.48           CATOM    499  O   ARG A  45      82.244  -0.937  19.457  1.00 27.65           OATOM    500  CB  ARG A  45      82.684  -0.261  16.203  1.00 27.46           CATOM    501  CG  ARG A  45      83.463  -1.338  15.495  1.00 92.03           CATOM    502  CD  ARG A  45      84.854  -1.418  16.077  1.00100.00           CATOM    503  NE  ARG A  45      85.636  -2.533  15.527  1.00100.00           NATOM    504  CZ  ARG A  45      86.092  -3.570  16.236  1.00100.00           CATOM    505  NH1 ARG A  45      85.791  -3.695  17.547  1.00100.00           NATOM    506  NH2 ARG A  45      86.773  -4.544  15.642  1.00100.00           NATOM    507  N   ALA A  46      81.772   1.090  18.629  1.00 31.04           NATOM    508  CA  ALA A  46      82.045   1.743  19.881  1.00 24.72           CATOM    509  C   ALA A  46      81.111   1.176  20.899  1.00 17.73           CATOM    510  O   ALA A  46      81.512   0.825  22.027  1.00 22.73           OATOM    511  CB  ALA A  46      81.839   3.221  19.751  1.00 27.16           CATOM    512  N   VAL A  47      79.835   1.119  20.531  1.00 17.54           NATOM    513  CA  VAL A  47      78.878   0.608  21.508  1.00 21.41           CATOM    514  C   VAL A  47      79.262  -0.812  21.914  1.00 30.25           CATOM    515  O   VAL A  47      79.192  -1.202  23.097  1.00 15.85           OATOM    516  CB  VAL A  47      77.470   0.668  20.989  1.00 18.59           CATOM    517  CG1 VAL A  47      76.503   0.042  22.012  1.00 16.88           CATOM    518  CG2 VAL A  47      77.115   2.096  20.756  1.00 16.28           CATOM    519  N   HIS A  48      79.692  -1.585  20.920  1.00 21.00           NATOM    520  CA  HIS A  48      80.028  -2.969  21.192  1.00 20.17           CATOM    521  C   HIS A  48      81.268  -3.079  22.117  1.00 32.98           CATOM    522  O   HIS A  48      81.289  -3.850  23.102  1.00 28.20           OATOM    523  CB  HIS A  48      80.063  -3.801  19.855  1.00 14.93           CATOM    524  CG  HIS A  48      78.686  -4.172  19.338  1.00 26.67           CATOM    525  ND1 HIS A  48      78.085  -5.394  19.600  1.00 28.83           NATOM    526  CD2 HIS A  48      77.758  -3.448  18.659  1.00 25.56           CATOM    527  CE1 HIS A  48      76.887  -5.430  19.043  1.00 20.08           CATOM    528  NE2 HIS A  48      76.660  -4.260  18.475  1.00 25.22           NATOM    529  N   ASP A  49      82.217  -2.170  21.902  1.00 22.62           NATOM    530  CA  ASP A  49      83.455  -2.169  22.674  1.00 24.23           CATOM    531  C   ASP A  49      83.171  -1.899  24.122  1.00 38.72           CATOM    532  O   ASP A  49      83.708  -2.551  25.027  1.00 35.44           OATOM    533  CB  ASP A  49      84.396  -1.112  22.127  1.00 30.29           CATOM    534  CG  ASP A  49      84.991  -1.503  20.775  1.00 52.45           CATOM    535  OD1 ASP A  49      85.007  -2.726  20.449  1.00 42.67           OATOM    536  OD2 ASP A  49      85.416  -0.587  20.029  1.00 73.76           OATOM    537  N   PHE A  50      82.294  -0.929  24.324  1.00 32.19           NATOM    538  CA  PHE A  50      81.902  -0.550  25.649  1.00 29.76           CATOM    539  C   PHE A  50      81.299  -1.765  26.359  1.00 30.31           CATOM    540  O   PHE A  50      81.715  -2.124  27.449  1.00 29.22           OATOM    541  CB  PHE A  50      80.892   0.610  25.576  1.00 23.82           CATOM    542  CG  PHE A  50      80.137   0.843  26.859  1.00 19.13           CATOM    543  CD1 PHE A  50      80.740   1.515  27.931  1.00 20.14           CATOM    544  CD2 PHE A  50      78.835   0.360  27.018  1.00 13.99           CATOM    545  CE1 PHE A  50      80.034   1.742  29.129  1.00 25.81           CATOM    546  CE2 PHE A  50      78.114   0.553  28.212  1.00 22.84           CATOM    547  CZ  PHE A  50      78.698   1.276  29.259  1.00 23.40           CATOM    548  N   PHE A  51      80.280  -2.367  25.768  1.00 21.75           NATOM    549  CA  PHE A  51      79.655  -3.451  26.457  1.00 22.61           CATOM    550  C   PHE A  S1      80.646  -4.603  26.612  1.00 34.01           CATOM    551  O   PHE A  51      80.550  -5.401  27.590  1.00 25.28           OATOM    552  CB  PHE A  51      78.389  -3.898  25.751  1.00 22.63           CATOM    553  CG  PHE A  51      77.158  -3.140  26.170  1.00 27.58           CATOM    554  CD1 PHE A  51      76.426  -3.525  27.280  1.00 21.78           CATOM    555  CD2 PHE A  51      76.663  -2.100  25.380  1.00 39.55           CATOM    556  CE1 PHE A  51      75.267  -2.796  27.662  1.00 28.34           CATOM    557  CE2 PHE A  51      75.492  -1.403  25.734  1.00 14.47           CATOM    558  CZ  PHE A  51      74.797  -1.744  26.878  1.00 14.55           CATOM    559  N   ALA A  52      81.576  -4.706  25.659  1.00 26.43           NATOM    560  CA  ALA A  52      82.587  -5.793  25.714  1.00 29.44           CATOM    561  C   ALA A  52      83.687  -5.560  26.768  1.00 43.76           CATOM    562  O   ALA A  52      84.502  -6.446  27.022  1.00 40.33           OATOM    563  CB  ALA A  52      83.228  -6.049  24.344  1.00 24.25           CATOM    564  N   SER A  53      83.702  -4.382  27.385  1.00 31.96           NATOM    565  CA  SER A  53      84.705  -4.090  28.377  1.00 21.06           CATOM    566  C   SER A  53      84.196  -3.625  29.709  1.00 26.41           CATOM    567  O   SER A  53      84.985  -3.492  30.611  1.00 36.12           0ATOM    568  CB  SER A  53      85.709  -3.088  27.843  1.00 14.22           CATOM    569  OG  SER A  53      85.140  -1.807  27.790  1.00 56.90           OATOM    570  N   GLU A  54      82.892  -3.431  29.874  1.00 22.38           NATOM    571  CA  GLU A  54      82.380  -2.893  31.139  1.00 17.27           CATOM    572  C   GLU A  54      81.584  -3.735  32.118  1.00 26.32           CATOM    573  O   GLU A  54      81.229  -3.281  33.191  1.00 37.43           OATOM    574  CB  GLU A  54      81.677  -1.563  30.906  1.00 27.30           CATOM    575  CG  GLU A  54      82.573  -0.543  30.262  1.00 44.77           CATOM    576  CD  GLU A  54      83.669  -0.142  31.194  1.00 86.31           CATOM    577  OE1 GLU A 54       83.392  -0.232  32.428  1.00 50.11           OATOM    578  OE2 GLU A  54      84.785   0.198  30.692  1.00 50.99           OATOM    579  N   ARG A  55      81.268  -4.971  31.804  1.00 29.63           NATOM    580  CA  ARG A  55      80.636  -5.748  32.854  1.00 33.32           CATOM    581  C   ARG A  55      79.347  -5.149  33.378  1.00 38.45           CATOM    582  O   ARG A  55      79.214  -4.897  34.576  1.00 40.18           OATOM    583  CB  ARG A  55      81.621  -5.875  34.045  1.00 57.61           CATOM    584  CG  ARG A  55      82.666  -7.028  33.960  1.00100.00           CATOM    585  CD  ARG A  55      82.805  -7.805  35.305  1.00100.00           CATOM    586  NE  ARG A  55      82.838  -9.270  35.146  1.00100.00           NATOM    587  CZ  ARG A  55      83.206 -10.129  36.102  1.00100.00           CATOM    588  NH1 ARG A  55      83.583  -9.681  37.301  1.00100.00           NATOM    589  NH2 ARG A  55      83.208 -11.440  35.855  1.00100.00           NATOM    590  N   ILE A  56      78.367  -5.029  32.491  1.00 42.25           NATOM    591  CA  ILE A  56      77.064  -4.434  32.794  1.00 25.49           CATOM    592  C   ILE A  56      75.982  -5.474  33.244  1.00 20.18           CATOM    593  O   ILE A  56      75.897  -6.579  32.704  1.00 24.74           OATOM    594  CB  ILE A  56      76.672  -3.512  31.531  1.00 26.89           CATOM    595  CG1 ILE A  56      77.643  -2.301  31.442  1.00 18.30           CATOM    596  CG2 ILE A  56      75.214  -3.016  31.549  1.00 19.84           CATOM    597  CD1 ILE A  56      77.998  -1.936  30.026  1.00 60.42           CATOM    598  N   ASP A  57      75.166  -5.133  34.237  1.00 16.84           NATOM    599  CA  ASP A  57      74.040  -5.999  34.630  1.00 16.33           CATOM    600  C   ASP A  57      72.676  -5.451  34.123  1.00 28.40           CATOM    601  O   ASP A  57      71.836  -6.198  33.657  1.00 25.50           OATOM    602  CB  ASP A  57      74.009  -6.194  36.164  1.00 16.94           CATOM    603  CG  ASP A  57      75.369  -6.720  36.703  1.00 34.27           CATOM    604  OD1 ASP A  57      75.875  -7.729  36.141  1.00 31.76           OATOM    605  OD2 ASP A  57      76.040  -6.007  37.499  1.00 28.36           OATOM    606  N   GLN A  58      72.443  -4.152  34.220  1.00 28.91           NATOM    607  CA  GLN A  58      71.183  -3.590  33.755  1.00 25.68           CATOM    608  C   GLN A  58      71.425  -2.364  32.881  1.00 23.21           CATOM    609  O   GLN A  58      72.403  -1.620  33.067  1.00 18.16           OATOM    610  CB  GLN A  58      70.342  -3.151  34.946  1.00 33.14           CATOM    611  CG  GLN A  58      69.798  -4.241  35.807  1.00 30.00           CATOM    612  CD  GLN A  58      69.226  -3.712  37.105  1.00 27.18           CATOM    613  OE1 GLN A  58      68.722  -2.601  37.161  1.00 31.20           OATOM    614  NE2 GLN A  58      69.455  -4.436  38.186  1.00 16.89           NATOM    615  N   VAL A  59      70.496  -2.138  31.961  1.00 18.35           NATOM    616  CA  VAL A  59      70.562  -0.998  31.045  1.00 15.59           CATOM    617  C   VAL A  59      69.238  -0.240  31.039  1.00 26.28           CATOM    618  O   VAL A  59      68.178  -0.820  30.762  1.00 19.51           OATOM    619  CB  VAL A  59      70.707  -1.456  29.601  1.00 15.32           CATOM    620  CG1 VAL A  59      70.477  -0.274  28.649  1.00 11.93           CATOM    621  CG2 VAL A  59      72.080  -2.111  29.364  1.00 15.83           CATOM    622  N   TYR A  60      69.306   1.064  31.293  1.00 21.71           NATOM    623  CA  TYR A  60      68.113   1.927  31.197  1.00 21.40           CATOM    624  C   TYR A  60      68.289   2.756  29.928  1.00 18.69           CATOM    625  O   TYR A  60      69.250   3.532  29.796  1.00 15.51           OATOM    626  CB  TYR A  60      68.021   2.817  32.413  1.00 17.24           CATOM    627  CG  TYR A  60      67.493   2.131  33.658  1.00 19.71           CATOM    628  CD1 TYR A  60      68.345   1.583  34.586  1.00 21.14           CATOM    629  CD2 TYR A  60      66.154   2.223  33.991  1.00 20.16           CATOM    630  CE1 TYR A  60      67.835   1.080  35.794  1.00 19.11           CATOM    631  CE2 TYR A  60      65.648   1.698  35.163  1.00 10.77           CATOM    632  CZ  TYR A  60      66.476   1.094  36.054  1.00 20.07           CATOM    633  OH  TYR A  60      65.921   0.585  37.248  1.00 16.04           OATOM    634  N   LEU A  61      67.491   2.452  28.916  1.00 17.46           NATOM    635  CA  LEU A  61      67.685   3.053  27.585  1.00 20.17           CATOM    636  C   LEU A  61      67.003   4.412  27.409  1.00 23.36           CATOM    637  O   LEU A  61      65.925   4.526  26.799  1.00 14.86           OATOM    638  CB  LEU A  61      67.267   2.060  26.485  1.00 14.78           CATOM    639  CG  LEU A  61      68.117   2.142  25.208  1.00 15.52           CATOM    640  CD1 LEU A  61      67.815   1.010  24.109  1.00  7.75           CATOM    641  CD2 LEU A  61      68.087   3.541  24.580  1.00 15.20           CATOM    642  N   ALA A  62      67.656   5.434  27.956  1.00 20.35           NATOM    643  CA  ALA A  62      67.120   6.784  27.963  1.00 18.55           CATOM    644  C   ALA A  62      67.779   7.739  26.949  1.00 18.57           CATOM    645  O   ALA A  62      67.455   8.924  26.920  1.00 24.31           OATOM    646  CB  ALA A  62      67.071   7.377  29.439  1.00 11.69           CATOM    647  N   ALA A  63      68.681   7.231  26.101  1.00 14.09           NATOM    648  CA  ALA A  63      69.249   8.095  25.052  1.00 12.84           CATOM    649  C   ALA A  63      68.310   8.005  23.877  1.00 27.00           CATOM    650  O   ALA A  63      67.845   6.916  23.511  1.00 24.51           OATOM    651  CB  ALA A  63      70.665   7.660  24.634  1.00  4.89           CATOM    652  N   ALA A  64      68.076   9.148  23.262  1.00 21.05           NATOM    653  CA  ALA A  64      67.202   9.286  22.086  1.00 13.50           CATOM    654  C   ALA A  64      67.435  10.664  21.416  1.00 28.08           CATOM    655  O   ALA A  64      67.987  11.600  22.021  1.00 26.63           OATOM    656  CB  ALA A  64      65.642   9.171  22.518  1.00  7.63           CATOM    657  N   LYS A  65      66.953  10.781  20.182  1.00 23.98           NATOM    658  CA  LYS A  65      66.966  12.012  19.409  1.00 20.47           CATOM    659  C   LYS A  65      65.488  12.443  19.551  1.00 24.37           CATOM    660  O   LYS A  65      64.594  11.807  18.976  1.00 20.29           OATOM    661  CB  LYS A  65      67.317  11.658  17.951  1.00 25.59           CATOM    662  CG  LYS A  65      66.808  12.630  16.923  1.00 27.54           CATOM    663  CD  LYS A  65      67.518  13.926  17.169  1.00 21.08           CATOM    664  CE  LYS A  65      67.316  14.905  16.029  1.00 55.15           CATOM    665  NZ  LYS A  65      67.876  16.263  16.392  1.00 81.63           NATOM    666  N   VAL A  66      65.228  13.362  20.485  1.00 22.47           NATOM    667  CA  VAL A  66      63.873  13.850  20.755  1.00 18.99           CATOM    668  C   VAL A  66      63.711  15.343  20.394  1.00 31.44           CATOM    669  O   VAL A  66      64.665  16.107  20.460  1.00 34.61           OATOM    670  CB  VAL A  66      63.440  13.623  22.204  1.00 16.66           CATOM    671  CG1 VAL A  66      64.269  12.623  22.869  1.00 15.01           CATOM    672  CG2 VAL A  66      63.379  14.904  22.950  1.00 19.21           CATOM    673  N   GLY A  67      62.514  15.755  19.994  1.00 18.03           NATOM    674  CA  GLY A  67      62.298  17.149  19.614  1.00 14.90           CATOM    675  C   GLY A  67      60.792  17.518  19.585  1.00 32.35           CATOM    676  O   GLY A  67      59.922  16.666  19.888  1.00 18.88           OATOM    677  N   GLY A  68      60.503  18.787  19.256  1.00 23.21           NATOM    678  CA  GLY A  68      59.132  19.288  19.183  1.00 23.83           CATOM    679  C   GLY A  68      58.540  19.137  17.771  1.00 19.31           CATOM    680  O   GLY A  68      59.165  18.550  16.870  1.00 30.64           OATOM    681  N   ILE A  69      57.343  19.684  17.588  1.00 15.20           NATOM    682  CA  ILE A  69      56.595  19.632  16.317  1.00 16.80           CATOM    683  C   ILE A  69      57.387  20.153  15.112  1.00 19.33           CATOM    684  O   ILE A  69      57.425  19.519  14.061  1.00 14.66           OATOM    685  CB  ILE A  69      55.257  20.432  16.480  1.00 30.11           CATOM    686  CG1 ILE A  69      54.271  19.683  17.385  1.00 24.27           CATOM    687  CG2 ILE A  69      54.610  20.749  15.181  1.00 47.53           CATOM    688  CP1 ILE A  69      53.259  20.608  18.056  1.00 85.71           CATOM    689  N   VAL A  70      58.010  21.327  15.269  1.00 23.03           NATOM    690  CA  VAL A  70      58.797  21.913  14.183  1.00 19.34           CATOM    691  C   VAL A  70      59.983  21.011  13.840  1.00 24.42           CATOM    692  O   VAL A  70      60.335  20.829  12.662  1.00 24.14           OATOM    693  CB  VAL A  70      59.304  23.404  14.467  1.00 21.37           CATOM    694  CG1 VAL A  70      60.137  23.907  13.281  1.00 17.79           CATOM    695  CG2 VAL A  70      58.136  24.410  14.678  1.00 15.74           CATOM    696  N   ALA A  71      60.621  20.450  14.861  1.00 19.68           NATOM    697  CA  ALA A  71      61.782  19.617  14.572  1.00 16.57           CATOM    698  C   ALA A  71      61.427  18.289  13.910  1.00 23.36           CATOM    699  O   ALA A  71      61.980  17.923  12.849  1.00 21.84           OATOM    700  CB  ALA A  71      62.685  19.439  15.805  1.00  9.36           CATOM    701  N   ASN A  72      60.463  17.598  14.511  1.00 16.80           NATOM    702  CA  ASN A  72      59.998  16.357  13.923  1.00 18.84           CATOM    703  C   ASN A  72      59.608  16.539  12.440  1.00 23.87           CATOM    704  O   ASN A  72      59.919  15.696  11.593  1.00 21.52           OATOM    705  CB  ASN A  72      58.835  15.806  14.738  1.00  8.60           CATOM    706  CG  ASN A  72      59.309  15.013  15.911  1.00 23.75           CATOM    707  OD1 ASN A  72      59.558  13.809  15.810  1.00 23.98           OATOM    708  ND2 ASN A  72      59.572  15.701  16.996  1.00  9.96           NATOM    709  N   ASN A  73      58.931  17.647  12.138  1.00 23.07           NATOM    710  CA  ASN A  73      58.521  17.971  10.761  1.00 26.05           CATOM    711  C   ASN A  73      59.665  18.454   9.817  1.00 26.95           CATOM    712  O   ASN A  73      59.613  18.276   8.569  1.00 22.13           OATOM    713  CB  ASN A  73      57.383  19.001  10.800  1.00 14.86           CATOM    714  CG  ASN A  73      56.015  18.349  10.987  1.00 19.88           CATOM    715  OD1 ASN A  73      55.620  17.468  10.217  1.00 27.02           OATOM    716  ND2 ASN A  73      55.322  18.732  12.051  1.00 20.78           NATOM    717  N   THR A  74      60.710  19.029  10.419  1.00 18.69           NATOM    718  CA  THR A  74      61.845  19.540   9.657  1.00 10.07           CATOM    719  C   THR A  74      62.968  18.548   9.375  1.00 21.00           CATOM    720  O   THR A  74      63.537  18.561   8.289  1.00 11.75           OATOM    721  CB  THR A  74      62.411  20.746  10.306  1.00 29.10           CATOM    722  OG1 THR A  74      61.370  21.714  10.457  1.00 23.24           OATOM    723  CG2 THR A  74      63.541  21.299   9.452  1.00 21.63           CATOM    724  N   TYR A  75      63.230  17.636  10.310  1.00 17.10           NATOM    725  CA  TYR A  75      64.267  16.620  10.112  1.00  9.07           CATOM    726  C   TYR A  75      63.733  15.203  10.318  1.00  6.17           CATOM    727  O   TYR A  75      64.143  14.542  11.267  1.00 15.58           OATOM    728  CB  TYR A  75      65.302  16.825  11.188  1.00 11.89           CATOM4   729  CG  TYR A  75      65.779  18.234  11.252  1.00 27.12           CATOM    730  CD1 TYR A  75      66.712  18.696  10.321  1.00 28.46           CATOM    731  CD2 TYR A  75      65.234  19.151  12.173  1.00 24.83           CATOM    732  CE1 TYR A  75      67.117  20.045  10.305  1.00 28.34           CATOM    733  CE2 TYR A  75      65.652  20.523  12.180  1.00 21.00           CATOM    734  CZ  TYR A  75      66.593  20.940  11.234  1.00 45.42           CATOM    735  OH  TYR A  75      67.066  22.230  11.215  1.00 35.37           OATOM    736  N   PRO A  76      62.759  14.775   9.532  1.00 13.30           NATOM    737  CA  PRO A  76      62.185  13.438   9.742  1.00 14.64           CATOM    738  C   PRO A  76      63.209  12.264   9.618  1.00 14.40           CATOM    739  O   PRO A  76      63.157  11.335  10.409  1.00 20.54           OATOM    740  CB  PRO A  76      61.055  13.366   8.709  1.00  7.83           CATOM    741  CG  PRO A  76      61.447  14.388   7.617  1.00 12.61           CATOM    742  CD  PRO A  76      62.068  15.504   8.455  1.00 11.18           CATOM    743  N   ALA A  77      64.163  12.339   8.681  1.00 15.25           NATOM    744  CA  ALA A  77      65.206  11.312   8.538  1.00  6.79           CATOM    745  C   ALA A  77      66.053  11.166   9.820  1.00 17.22           CATOM    746  O   ALA A  77      66.306  10.069  10.292  1.00 18.74           OATOM    747  CB  ALA A  77      66.097  11.601   7.330  1.00  9.04           CATOM    748  N   ASP A  78      66.466  12.267  10.424  1.00 10.92           NATOM    749  CA  ASP A  78      67.256  12.191  11.659  1.00 11.87           CATOM    750  C   ASP A  78      66.572  11.486  12.827  1.00 16.09           CATOM    751  O   ASP A  78      67.212  10.741  13.601  1.00 18.07           OATOM    752  CB  ASP A  78      67.578  13.609  12.088  1.00 19.16           CATOM    753  CG  ASP A  78      68.424  14.325  11.068  1.00 26.82           CATOM    754  OD1 ASP A  78      68.836  13.694  10.044  1.00 33.93           OATOM    755  OD2 ASP A  78      68.673  15.514  11.316  1.00 32.06           OATOM    756  N   PHE A  79      65.279  11.771  12.975  1.00 14.70           NATOM    757  CA  PHE A  79      64.471  11.192  14.044  1.00 20.69           CATOM    758  C   PHE A  79      64.224   9.707  13.876  1.00 20.22           CATOM    759  O   PHE A  79      64.269   8.987  14.862  1.00 22.37           OATOM    760  CB  PHE A  79      63.144  11.933  14.219  1.00 27.38           CATOM    761  CG  PHE A  79      63.264  13.218  14.990  1.00 28.59           CATOM    762  CD1 PHE A  79      63.137  13.230  16.386  1.00 27.49           CATOM    763  CD2 PHE A  79      63.509  14.415  14.325  1.00 28.20           CATOM    764  CE1 PHE A  79      63.281  14.413  17.109  1.00 21.76           CATOM    765  CE2 PHE A  79      63.625  15.593  15.037  1.00 31.48           CATOM    766  CZ  PHE A  79      63.509  15.582  16.439  1.00 26.31           CATOM    767  N   ILE A  80      63.942   9.249  12.650  1.00 10.79           NATOM    768  CA  ILE A  80      63.828   7.795  12.410  1.00 18.12           CATOM    769  C   ILE A  80      65.197   7.052  12.432  1.00 10.97           CATOM    770  O   ILE A  80      65.406   6.090  13.195  1.00  8.92           OATOM    771  CB  ILE A  80      62.944   7.408  11.148  1.00 17.41           CATOM    772  CG1 ILE A  80      62.651   5.886  11.105  1.00 10.16           CATOM    773  CG2 ILE A  80      63.583   7.888   9.901  1.00 17.46           CATOM    774  CD1 ILE A  80      61.722   5.410   9.980  1.00  7.30           CATOM    775  N   TYR A  81      66.151   7.539  11.658  1.00 11.18           NATOM    776  CA  TYR A  81      67.488   6.902  11.630  1.00 15.06           CATOM    777  C   TYR A  81      68.237   6.782  12.959  1.00 16.83           CATOM    778  O   TYR A  81      68.714   5.702  13.383  1.00 16.74           OATOM    779  CB  TYR A  81      68.384   7.599  10.616  1.00  9.43           CATOM    780  CG  TYR A  81      69.749   6.966  10.541  1.00 22.54           CATOM    781  CD1 TYR A  81      69.963   5.824   9.747  1.00 22.37           CATOM    782  CD2 TYR A  81      70.818   7.466  11.299  1.00 18.07           CATOM    783  CE1 TYR A  81      71.202   5.163   9.746  1.00 15.02           CATOM    784  CE2 TYR A  81      72.080   6.893  11.201  1.00 17.37           CATOM    785  CZ  TYR A  81      72.255   5.698  10.472  1.00 24.27           CATOM    786  OH  TYR A  81      73.491   5.063  10.409  1.00 19.57           OATOM    787  N   GLN A  82      68.385   7.918  13.612  1.00 11.39           NATOM    788  CA  GLN A  82      69.193   7.930  14.810  1.00 12.23           CATOM    789  C   GLN A  82      68.544   7.089  15.834  1.00 14.18           CATOM    790  O   GLN A  82      69.180   6.415  16.631  1.00 11.35           OATOM    791  CB  GLN A  82      69.280   9.354  15.291  1.00 18.73           CATOM    792  CG  GLN A  82      69.986  10.209  14.250  1.00 13.54           CATOM    793  CD  GLN A  82      70.285  11.617  14.736  1.00 26.00           CATOM    794  OE1 GLN A  82      70.410  11.850  15.927  1.00 22.99           OATOM    795  NE2 GLN A  82      70.404  12.561  13.808  1.00 16.59           NATOM    796  N   ASN A  83      67.235   7.181  15.869  1.00 11.35           NATOM    797  CA  ASN A  83      66.549   6.408  16.860  1.00 13.71           CATOM    798  C   ASN A  83      66.623   4.902  16.557  1.00 21.43           CATOM    799  O   ASN A  83      66.831   4.101  17.463  1.00 12.10           OATOM    800  CB  ASN A  83      65.132   6.945  17.074  1.00 13.51           CATOM    801  CG  ASN A  83      65.131   8.245  17.871  1.00 28.91           CATOM    802  OD1 ASN A  83      65.628   8.263  18.990  1.00 22.28           OATOM    803  ND2 ASN A  83      64.756   9.354  17.237  1.00 20.17           NATOM    804  N   MET A  84      66.592   4.517  15.290  1.00 15.63           NATOM    805  CA  MET A  84      66.704   3.101  15.007  1.00 15.66           CATOM    806  C   MET A  84      68.054   2.588  15.348  1.00 14.66           CATOM    807  O   MET A  84      68.148   1.514  15.902  1.00 11.45           OATOM    808  CB  MET A  84      66.418   2.815  13.563  1.00 17.59           CATOM    809  CG  MET A  84      64.911   2.894  13.220  1.00 14.40           CATOM    810  SD  MET A  84      64.638   2.811  11.387  1.00 15.99           SATOM    811  CE  MET A  84      65.164   1.105  10.952  1.00  8.90           CATOM    812  N   MET A  85      69.098   3.338  15.024  1.00 11.20           NATOM    813  CA  MET A  85      70.468   2.879  15.321  1.00 11.67           CATOM    814  C   MET A  85      70.779   2.831  16.774  1.00 13.04           CATOM    815  O   MET A  85      71.359   1.893  17.265  1.00 15.26           OATOM    816  CB  MET A  85      71.525   3.798  14.693  1.00 15.07           CATOM    817  CG  MET A  85      71.530   3.726  13.173  1.00 32.01           CATOM    818  SD  MET A  85      71.918   2.027  12.487  1.00 37.79           SATOM    819  CE  MET A  85      73.379   1.801  13.320  1.00 15.94           CATOM    820  N   ILE A  86      70.471   3.892  17.481  1.00 13.92           NATOM    821  CA  ILE A  86      70.760   3.893  18.912  1.00 12.58           CATOM    822  C   ILE A  86      70.159   2.662  19.591  1.00 21.61           CATOM    823  O   ILE A  86      70.813   1.981  20.362  1.00 18.68           OATOM    824  CB  ILE A  86      70.225   5.189  19.606  1.00 11.84           CATOM    825  CG1 ILE A  86      70.978   6.429  19.119  1.00 19.78           CATOM    826  CG2 ILE A  86      70.435   5.132  21.112  1.00  6.59           CATOM    827  CD1 ILE A  86      70.505   7.694  19.772  1.00 20.37           CATOM    828  N   GLU A  87      68.893   2.383  19.316  1.00 18.78           NATOM    829  CA  GLU A  87      68.263   1.237  19.930  1.00 14.00           CATOM    830  C   GLU A  87      68.797  -0.116  19.454  1.00 15.93           CATOM    831  O   GLU A  87      69.017  -0.991  20.268  1.00 11.04           OATOM    832  CB  GLU A  87      66.734   1.324  19.900  1.00 14.89           CATOM    833  CG  GLU A  87      66.085   1.327  18.538  1.00 28.96           CATOM    834  CD  GLU A  87      64.635   1.922  18.544  1.00 11.12           CATOM    835  OE1 GLU A  87      64.307   2.801  19.376  1.00 25.46           OATOM    836  OE2 GLU A  87      63.845   1.547  17.663  1.00 29.87           OATOM    837  N   SER A  88      69.054  -0.259  18.155  1.00 16.18           NATOM    838  CA  SER A  88      69.650  -1.482  17.569  1.00 19.52           CATOM    839  C   SER A  88      71.029  -1.792  18.160  1.00 22.54           CATOM    840  O   SER A  88      71.313  -2.929  18.592  1.00 13.80           OATOM    841  CB  SER A  88      69.815  -1.326  16.023  1.00 14.61           CATOM    842  OG  SER A  88      68.551  -1.201  15.355  1.00 15.41           OATOM    843  N   ASN A  89      71.884  -0.773  18.143  1.00 22.63           NATOM    844  CA  ASN A  89      73.227  -0.869  18.693  1.00 27.23           CATOM    845  C   ASN A  89      73.195  -1.363  20.134  1.00 21.34           CATOM    846  O   ASN A  89      73.795  -2.384  20.476  1.00 23.68           OATOM    847  CB  ASN A  89      73.980   0.487  18.597  1.00 13.71           CATOM    848  CG  ASN A  89      74.440   0.825  17.168  1.00 20.40           CATOM    849  OD1 ASN A  89      74.305  -0.006  16.255  1.00 14.93           OATOM    850  ND2 ASN A  89      74.937   2.067  16.960  1.00 13.32           NATOM    851  N   ILE A  90      72.488  -0.646  20.979  1.00 16.55           NATOM    852  CA  ILE A  90      72.437  -1.014  22.398  1.00 21.51           CATOM    853  C   ILE A  90      71.876  -2.421  22.729  1.00 26.50           CATOM    854  O   ILE A  90      72.384  -3.159  23.590  1.00 19.71           OATOM    855  CB  ILE A  90      71.670   0.070  23.233  1.00 13.32           CATOM    856  CG1 ILE A  90      72.539   1.299  23.401  1.00 11.05           CATOM    857  CG2 ILE A  90      71.371  -0.445  24.637  1.00  7.54           CATOM    858  CD1 ILE A  90      71.749   2.597  23.668  1.00 20.71           CATOM    859  N   ILE A  91      70.755  -2.733  22.114  1.00 14.98           NATOM    860  CA  ILE A  91      70.047  -3.953  22.442  1.00 21.33           CATOM    861  C   ILE A  91      70.927  -5.098  21.994  1.00 26.27           CATOM    862  O   ILE A  91      71.211  -6.011  22.751  1.00 26.56           OATOM    863  CB  ILE A  91      68.556  -3.930  21.814  1.00 20.39           CATOM    864  CG1 ILE A  91      67.692  -2.886  22.552  1.00 13.51           CATOM    865  CG2 ILE A  91      67.841  -5.316  21.845  1.00 11.31           CATOM    866  CD1 ILE A  91      66.320  -2.648  21.907  1.00 16.23           CATOM    867  N   HIS A  92      71.446  -4.983  20.785  1.00 24.12           NATOM    868  CA  HIS A  92      72.293  -6.015  20.243  1.00 26.71           CATOM    869  C   HIS A  92      73.609  -6.251  21.071  1.00 29.30           CATOM    870  O   HIS A  92      73.983  -7.366  21.443  1.00 18.58           OATOM    871  CB  HIS A  92      72.561  -5.682  18.775  1.00 22.23           CATOM    872  CG  HIS A  92      73.366  -6.720  18.077  1.00 26.32           CATOM    873  ND1 HIS A  92      72.798  -7.711  17.307  1.00 27.19           NATOM    874  CD2 HIS A  92      74.699  -6.978  18.106  1.00 21.95           CATOM    875  CE1 MIS A  92      73.755  -8.487  16.826  1.00 23.66           CATOM    876  NE2 HIS A  92      74.918  -8.062  17.296  1.00 17.36           NATOM    877  N   ALA A  93      74.328  -5.187  21.333  1.00 15.66           NATOM    878  CA  ALA A  93      75.530  -5.301  22.110  1.00 11.88           CATOM    879  C   ALA A  93      75.222  -5.900  23.512  1.00 28.78           CATOM    880  O   ALA A  93      75.912  -6.790  24.037  1.00 25.23           OATOM    881  CB  ALA A  93      76.139  -3.959  22.221  1.00  6.30           CATOM    882  N   ALA A  94      74.142  -5.442  24.113  1.00 18.82           NATOM    883  CA  ALA A  94      73.777  -5.971  25.399  1.00 15.61           CATOM    884  C   ALA A  94      73.593  -7.503  25.301  1.00 28.39           CATOM    885  O   ALA A  94      74.133  -8.263  26.099  1.00 21.67           OATOM    886  CB  ALA A  94      72.449  -5.279  25.911  1.00 18.46           CATOM    887  N   HIS A  95      72.814  -7.966  24.329  1.00 26.35           NATOM    888  CA  HIS A  95      72.551  -9.396  24.271  1.00 24.89           CATOM    889  C   HIS A  95      73.845 -10.176  24.140  1.00 22.81           CATOM    890  O   HIS A  95      74.077 -11.136  24.865  1.00 21.44           OATOM    891  CB  HIS A  95      71.571  -9.778  23.129  1.00 22.39           CATOM    892  CG  HIS A  95      71.554 -11.250  22.831  1.00 28.73           CATOM    893  ND1 HIS A  95      70.979 -12.182  23.682  1.00 22.83           NATOM    894  CD2 HIS A  95      72.159 -11.964  21.845  1.00 25.22           CATOM    895  CE1 HIS A  95      71.171 -13.397  23.196  1.00 22.72           CATOM    896  NE2 HIS A  95      71.911 -13.296  22.101  1.00 24.80           NATOM    897  N   GLN A  96      74.709  -9.658  23.281  1.00 19.97           NATOM    898  CA  GLN A  96      75.960 -10.299  22.917  1.00 22.27           CATOM    899  C   GLN A  96      76.877 -10.353  24.086  1.00 26.58           CATOM    900  O   GLN A  96      77.836 -11.093  24.088  1.00 24.17           OATOM    901  CB  GLN A  96      76.642  -9.492  21.818  1.00 23.38           CATOM    902  CG  GLN A  96      77.043 -10.299  20.596  1.00 61.06           CATOM    903  CD  GLN A  96      78.033  -9.557  19.675  1.00 75.83           CATOM    904  OE1 GLN A  96      78.999  -8.941  20.131  1.00 56.89           OATOM    905  NE2 GLN A  96      77.815  -9.668  18.366  1.00100.00           NATOM    906  N   ASN A  97      76.652  -9.500  25.060  1.00 22.15           NATOM    907  CA  ASN A  97      77.537  -9.536  26.208  1.00 14.74           CATOM    908  C   ASN A  97      76.732 -10.022  27.387  1.00 29.78           CATOM    909  O   ASN A  97      77.049  -9.762  28.564  1.00 27.09           OATOM    910  CB  ASN A  97      78.241  -8.201  26.462  1.00 12.93           CATOM    911  CG  ASN A  97      79.260  -7.897  25.407  1.00 24.91           CATOM    912  OD1 ASN A  97      80.331  -8.518  25.375  1.00 57.17           OATOM    913  ND2 ASN A  97      78.839  -7.135  24.392  1.00 34.88           NATOM    914  N   ASP A  98      75.666 -10.732  27.055  1.00 27.98           NATOM    915  CA  ASP A  98      74.907 -11.361  28.089  1.00 29.25           CATOM    916  C   ASP A  98      74.400 -10.379  29.164  1.00 37.53           CATOM    917  O   ASP A  98      74.505 -10.634  30.367  1.00 36.42           OATOM    918  CB  ASP A  98      75.791 -12.450  28.700  1.00 36.37           CATOM    919  CG  ASP A  98      75.016 -13.712  29.053  1.00 88.62           CATOM    920  OD1 ASP A  98      73.775 -13.749  28.877  1.00 82.53           OATOM    921  OD2 ASP A  98      75.656 -14.670  29.542  1.00100.00           OATOM    922  N   VAL A  99      73.879  -9.235  28.730  1.00 27.13           NATOM    923  CA  VAL A  99      73.157  -8.351  29.635  1.00 21.57           CATOM    924  C   VAL A  99      71.706  -8.868  29.530  1.00 16.15           CATOM    925  O   VAL A  99      71.159  -9.088  28.422  1.00 19.47           OATOM    926  CB  VAL A  99      73.264  -6.900  29.206  1.00 24.18           CATOM    927  CG1 VAL A  99      72.517  -6.015  30.198  1.00 14.58           CATOM    928  CG2 VAL A  99      74.720  -6.515  29.225  1.00 30.10           CATOM    929  N   ASN A 100      71.149  -9.262  30.662  1.00 17.39           NATOM    930  CA  ASN A 100      69.852  -9.925  30.613  1.00 25.77           CATOM    931  C   ASN A 100      68.648  -9.034  30.910  1.00 24.95           CATOM    932  O   ASN A 100      67.498  -9.377  30.582  1.00 20.88           OATOM    933  CB  ASN A 100      69.846 -11.157  31.527  1.00 14.98           CATOM    934  CG  ASN A 100      68.724 -12.112  31.180  1.00 20.38           CATOM    935  OD1 ASN A 100      68.737 -12.709  30.100  1.00 29.59           OATOM    936  ND2 ASN A 100      67.716 -12.240  32.076  1.00 16.35           NATOM    937  N   LYS A 101      68.941  -7.923  31.584  1.00 17.91           NATOM    938  CA  LYS A 101      67.970  -6.916  31.994  1.00 25.43           CATOM    939  C   LYS A 101      68.107  -5.510  31.323  1.00 25.29           CATOM    940  O   LYS A 101      69.151  -4.850  31.377  1.00 19.88           OATOM    941  CB  LYS A 101      67.996  -6.807  33.521  1.00 29.28           CATOM    942  CG  LYS A 101      67.464  -8.054  34.205  1.00  9.31           CATOM    943  CD  LYS A 101      67.218  -7.719  35.668  1.00 38.93           CATOM    944  CE  LYS A 101      66.206  -6.569  35.885  1.00 13.38           CATOM    945  NZ  LYS A 101      64.750  -7.006  35.825  1.00 15.26           NATOM    946  N   LEU A 102      67.013  -5.043  30.732  1.00 22.22           NATOM    947  CA  LEU A 102      67.003  -3.744  30.092  1.00 15.40           CATOM    948  C   LEU A 102      65.612  -3.115  30.156  1.00 18.55           CATOM    949  O   LEU A 102      64.590  -3.811  30.102  1.00 18.92           OATOM    950  CB  LEU A 102      67.465  -3.898  28.636  1.00 11.23           CATOM    951  CG  LEU A 102      67.553  -2.711  27.651  1.00 15.51           CATOM    952  CD1 LEU A 102      68.628  -2.985  26.559  1.00  9.65           CATOM    953  CD2 LEU A 102      66.162  -2.407  26.995  1.00 13.10           CATOM    954  N   LEU A 103      65.595  -1.798  30.318  1.00 17.05           NATOM    955  CA  LEU A 103      64.356  -1.036  30.265  1.00 16.23           CATOM    956  C   LEU A 103      64.346  -0.072  29.046  1.00 19.65           CATOM    957  O   LEU A 103      65.215   0.789  28.875  1.00 19.68           OATOM    958  CB  LEU A 103      64.099  -0.289  31.562  1.00 12.28           CATOM    959  CG  LEU A 103      62.686   0.259  31.594  1.00 14.13           CATOM    960  CD1 LEU A 103      61.645  -0.822  31.902  1.00 10.31           CATOM    961  CD2 LEU A 103      62.646   1.360  32.601  1.00 12.30           CATOM    962  N   PHE A 104      63.417  -0.333  28.140  1.00 16.41           NATOM    963  CA  PHE A 104      63.215   0.486  26.956  1.00 18.32           CATOM    964  C   PHE A 104      62.126   1.546  27.249  1.00 21.85           CATOM    965  O   PHE A 104      61.168   1.271  27.992  1.00 18.36           OATOM    966  CB  PHE A 104      62.796  -0.386  25.793  1.00  9.86           CATOM    967  CG  PHE A 104      62.732   0.348  24.508  1.00 16.81           CATOM    968  CD1 PAE A 104      63.894   0.714  23.840  1.00 25.04           CATOM    969  CD2 PHE A 104      61.511   0.795  24.005  1.00 22.59           CATOM    970  CE1 PHE A 104      63.836   1.448  22.619  1.00 31.26           CATOM    971  CE2 PHE A 104      61.449   1.535  22.814  1.00 15.59           CATOM    972  CZ  PHE A 104      62.625   1.895  22.139  1.00 11.67           CATOM    973  N   LEU A 105      62.341   2.762  26.734  1.00 20.33           NATOM    974  CA  LEU A 105      61.416   3.897  26.904  1.00 18.10           CATOM    975  C   LEU A 105      60.711   4.237  25.634  1.00 17.04           CATOM    976  O   LEU A 105      61.315   4.680  24.665  1.00 18.83           OATOM    977  CB  LEU A 105      62.178   5.146  27.214  1.00 17.49           CATOM    979  CG  LEU A 105      62.434   5.544  28.644  1.00 27.17           CATOM    979  CD1 LEU A 105      62.630   4.349  29.574  1.00 19.16           CATOM    980  CD2 LEU A 105      63.688   6.347  28.529  1.00 23.59           CATOM    981  N   GLY A 106      59.407   4.153  25.652  1.00 20.66           NATOM    982  CA  GLY A 106      58.679   4.536  24.455  1.00 21.03           CATOM    983  C   GLY A 106      58.080   5.935  24.597  1.00 17.32           CATOM    984  O   GLY A 106      58.690   6.858  25.113  1.00 26.89           OATOM    985  N   SER A 107      56.831   6.047  24.219  1.00 22.05           NATOM    986  CA  SER A 107      56.177   7.317  24.288  1.00 22.12           CATOM    987  C   SER A 107      54.686   7.212  23.923  1.00 19.06           CATOM    988  O   SER A 107      54.314   6.545  22.963  1.00 27.42           OATOM    989  CB  SER A 107      56.882   8.232  23.300  1.00 20.99           CATOM    990  OG  SER A 107      55.947   9.133  22.776  1.00 42.85           OATOM    991  N   SER A 108      53.826   7.890  24.671  1.00 27.42           NATOM    992  CA  SER A 108      52.382   7.947  24.339  1.00 26.43           CATOM    993  C   SER A 108      52.144   8.259  22.842  1.00 30.97           CATOM    994  O   SER A 108      51.242   7.709  22.217  1.00 33.46           OATOM    995  CB  SER A 108      51.710   9.072  25.144  1.00 19.87           CATOM    996  OG  SER A 108      52.495  10.266  25.071  1.00 70.88           OATOM    997  N   CYS A 109      52.927   9.180  22.278  1.00 24.73           NATOM    998  CA  CYS A 109      52.728   9.549  20.880  1.00 25.61           CATOM    999  C   CYS A 109      52.970   8.482  19.815  1.00 21.29           CATOM   1000  O   CYS A 109      52.967   8.737  18.623  1.00 31.31           OATOM   1001  CB  CYS A 109      53.369  10.899  20.544  1.00 39.55           CATOM   1002  SG  CYS A 109      55.153  11.077  20.847  1.00 49.24           SATOM   1003  N   ILE A 110      53.101   7.264  20.258  1.00 18.31           NATOM   1004  CA  ILE A 110      53.329   6.150  19.379  1.00 28.10           CATOM   1005  C   ILE A 110      51 977   5.489  19.082  1.00 15.38           CATOM   1006  O   ILE A 110      51.895   4.592  18.268  1.00 16.52           OATOM   1007  CB  ILE A 110      54.154   5.153  20.206  1.00 40.45           CATOM   1008  CG1 ILE A 110      55.604   5.510  20.136  1.00 39.02           CATOM   1009  CG2 ILE A 110      53.879   3.715  19.875  1.00 61.33           CATOM   1010  CD1 ILE A 110      56.429   4.338  20.549  1.00 82.74           CATOM   1011  N   TYR A 111      50.951   5.842  19.854  1.00 14.91           NATOM   1012  CA  TYR A 111      49.630   5.227  19.678  1.00 13.96           CATOM   1013  C   TYR A 111      48.956   5.831  18.459  1.00 20.40           CATOM   1014  O   TYR A 111      49.302   6.933  18.056  1.00 11.71           OATOM   1015  CB  TYR A 111      48.763   5.468  20.921  1.00  9.63           CATOM   1016  CG  TYR A 111      49.117   4.550  22.065  1.00 14.94           CATOM   1017  CD1 TYR A 111      48.985   3.159  21.938  1.00  9.73           CATOM   1018  CD2 TYR A 111      49.755   5.038  23.216  1.00 14.96           CATOM   1019  CE1 TYR A 111      49.344   2.273  23.014  1.00  6.53           CATOM   1020  CE2 TYR A 111      50.146   4.155  24.272  1.00 13.66           CATOM   1021  CZ  TYR A 111      49.873   2.787  24.171  1.00 17.86           CATOM   1022  OH  TYR A 111      50.266   1.927  25.157  1.00 11.37           OATOM   1023  N   PRO A 112      47.974   5.145  17.872  1.00 22.56           NATOM   1024  CA  PRO A 112      47.279   5.743  16.721  1.00 23.44           CATOM   1025  C   PRO A 112      46.589   7.111  16.988  1.00 17.82           CATOM   1026  O   PRO A 112      46.197   7.453  18.115  1.00 19.72           OATOM   1027  CB  PRO A 112      46.290   4.644  16.252  1.00 15.69           CATOM   1028  CG  PRO A 112      46.895   3.343  16.769  1.00 22.83           CATOM   1029  CD  PRO A 112      47.593   3.733  18.086  1.00 16.10           CATOM   1030  N   LYS A 113      46.418   7.866  15.915  1.00 19.48           NATOM   1031  CA  LYS A 113      45.793   9.167  15.994  1.00 23.50           CATOM   1032  C   LYS A 113      44.396   9.077  16.655  1.00 34.28           CATOM   1033  O   LYS A 113      44.046   9.887  17.524  1.00 46.14           OATOM   1034  CB  LYS A 113      45.675   9.735  14.593  1.00 30.04           CATOM   1035  CG  LYS A 113      46.219  11.124  14.477  1.00 43.78           CATOM   1036  CD  LYS A 113      45.381  11.941  13.515  1.00100.00           CATOM   1037  CE  LYS A 113      44.361  12.836  14.250  1.00100.00           CATOM   1038  NZ  LYS A 113      43.480  13.625  13.304  1.00100.00           NATOM   1039  N   LEU A 114      43.591   8.103  16.250  1.00 26.33           NATOM   1040  CA  LEU A 114      42.267   7.957  16.833  1.00 20.65           CATOM   1041  C   LEU A 114      42.083   6.792  17.760  1.00 18.44           CATOM   1042  O   LEU A 114      41.002   6.278  17.918  1.00 34.04           OATOM   1043  CB  LEU A 114      41.194   8.002  15.780  1.00 24.37           CATOM   1044  CG  LEU A 114      41.587   9.122  14.830  1.00 40.86           CATOM   1045  CD1 LEU A 114      40.991   8.797  13.504  1.00 49.29           CATOM   1046  CD2 LEU A 114      41.139  10.512  15.300  1.00 26.85           CATOM   1047  N   ALA A 115      43.103   6.473  18.527  1.00 29.00           NATOM   1048  CA  ALA A 115      42.920   5.446  19.528  1.00 25.66           CATOM   1049  C   ALA A 115      41.722   5.727  20.454  1.00 28.76           CATOM   1050  O   ALA A 115      41.364   6.855  20.682  1.00 24.12           OATOM   1051  CB  ALA A 115      44.177   5.272  20.326  1.00 16.86           CATOM   1052  N   LYS A 116      41.137   4.675  20.998  1.00 30.21           NATOM   1053  CA  LYS A 116      40.036   4.792  21.928  1.00 25.85           CATOM   1054  C   LYS A 116      40.668   5.248  23.195  1.00 14.18           CATOM   1055  O   LYS A 116      41.750   4.781  23.535  1.00 23.51           OATOM   1056  CB  LYS A 116      39.369   3.415  22.116  1.00 22.05           CATOM   1057  CG  LYS A 116      39.053   3.032  23.524  1.00 55.38           CATOM   1058  CD  LYS A 116      37.963   1.955  23.549  1.00100.00           CATOM   1059  CE  LYS A 116      37.120   1.953  24.835  1.00100.00           CATOM   1060  NZ  LYS A 116      35.767   1.310  24.630  1.00100.00           NATOM   1061  N   GLN A 117      40.021   6.208  23.856  1.00 18.23           NATOM   1062  CA  GLN A 117      40.456   6.757  25.180  1.00 21.01           CATOM   1063  C   GLN A 117      39.695   6.178  26.383  1.00 30.96           CATOM   1064  O   GLN A 117      38.483   6.009  26.345  1.00 27.66           OATOM   1065  CB  GLN A 117      40.215   8.263  25.179  1.00 11.32           CATOM   1066  CG  GLN A 117      40.849   8.912  23.948  1.00 12.12           CATOM   1067  CD  GLN A 117      42.404   8.823  23.954  1.00 24.10           CATOM   1068  OE1 GLN A 117      43.041   8.628  22.896  1.00 47.88           OATOM   1069  NE2 GLN A 117      43.001   8.953  25.131  1.00 14.24           NATOM   1070  N   PRO A 118      40.374   5.992  27.499  1.00 30.02           NATOM   1071  CA  PRO A 118      41.826   6.194  27.655  1.00 26.44           CATOM   1072  C   PRO A 118      42.450   5.050  26.899  1.00 24.37           CATOM   1073  O   PRO A 118      41.792   4.027  26.726  1.00 25.34           OATOM   1074  CB  PRO A 118      42.055   5.994  29.167  1.00 23.89           CATOM   1075  CG  PRO A 118      40.847   5.240  29.654  1.00 23.20           CATOM   1076  CD  PRO A 118      39.695   5.519  28.709  1.00 15.79           CATOM   1077  N   MET A 119      43.684   5.228  26.432  1.00 16.00           NATOM   1078  CA  MET A 119      44.372   4.215  25.644  1.00 10.80           CATOM   1079  C   MET A 119      45.062   3.083  26.444  1.00 23.61           CATOM   1080  O   MET A 119      46.013   3.281  27.209  1.00 18.02           OATOM   1081  CB  MET A 119      45.384   4.894  24.791  1.00 13.52           CATOM   1082  CG  MET A 119      44.801   6.014  23.989  1.00 18.52           CATOM   1083  SD  MET A 119      46.157   7.054  23.271  1.00 26.27           SATOM   1084  CE  MET A 119      46.264   6.524  21.845  1.00 33.79           CATOM   1085  N   ALA A 120      44.559   1.875  26.271  1.00 26.64           N           NATOM   1086  CA  ALA A 120      45.177   0.712  26.884  1.00 29.17           CATOM   1087  C   ALA A 120      46.356   0.308  25.984  1.00 23.21           CATOM   1088  O   ALA A 120      46.439   0.759  24.833  1.00 20.19           OATOM   1089  CB  ALA A 120      44.169  -0.419  26.944  1.00 26.02           CATOM   1090  N   GLU A 121      47.238  -0.553  26.507  1.00 12.30           NATOM   1091  CA  GLU A 121      48.427  -1.009  25.788  1.00  9.45           CATOM   1092  C   GLU A 121      48.070  -1.697  24.450  1.00 11.68           CATOM   1093  O   GLU A 121      48.828  -1.670  23.450  1.00 14.84           OATOM   1094  CB  GLU A 121      49.321  -1.883  26.715  1.00 16.74           CATOM   1095  CG  GLU A 121      50.132  -1.122  27.763  1.00 18.14           CATOM   1096  CD  GLU A 121      49.458  -1.000  29.137  1.00 13.00           CATOM   1097  OE1 GLU A 121      48.252  -1.294  29.276  1.00 20.79           OATOM   1098  OE2 GLU A 121      50.123  -0.521  30.080  1.00 17.86           OATOM   1099  N   SER A 122      46.887  -2.273  24.409  1.00 11.79           NATOM   1100  CA  SER A 122      46.427  -2.977  23.218  1.00 12.16           CATOM   1101  O   SER A 122      46.030  -2.058  22.100  1.00 11.70           CATOM   1102  O   SER A 122      45.717  -2.529  21.010  1.00 13.91           OATOM   1103  CB  SER A 122      45.186  -3.781  23.568  1.00 21.50           CATOM   1104  OG  SER A 122      44.143  -2.908  23.976  1.00 28.52           OATOM   1105  N   GLU A 123      46.041  -0.754  22.341  1.00 14.65           NATOM   1106  CA  GLU A 123      45.783   0.202  21.243  1 00 17.15           CATOM   1107  C   GLU A 123      46.959   0.313  20.240  1.00 11.48           CATOM   1108  O   GLU A 123      46.821   0.844  19.141  1.00 11.19           OATOM   1109  CB  GLU A 123      45.481   1.600  21.805  1.00 21.66           CATOM   1110  CG  GLU A 123      44.127   1.694  22.523  1.00 24.68           CATOM   1111  CD  GLU A 123      42.984   1.374  21.585  1.00 35.56           CATOM   1112  OE1 GLU A 123      43.019   1.865  20.426  1.00 41.73           OATOM   1113  OE2 GLU A 123      42.158   0.497  21.940  1.00100.00           OATOM   1114  N   LEU A 124      48.134  -0.185  20.618  1.00 14.02           NATOM   1115  CA  LEU A 124      49.296  -0.082  19.740  1.00 15.32           CATOM   1116  C   LEU A 124      49.082  -0.754  18.458  1.00 17.76           CATOM   1117  O   LEU A 124      48.752  -1.917  18.445  1.00 18.91           OATOM   1118  CB  LEU A 124      50.564  -0.680  20.362  1.00 18.07           CATOM   1119  CG  LEU A 124      51.922  -0.222  19.803  1.00 21.52           CATOM   1120  CD1 LEU A 124      52.080   1.258  20.117  1.00 20.35           CATOM   1121  CD2 LEU A 124      53.042  -0.919  20.550  1.00 14.07           CATOM   1122  N   LEU A 125      49.514  -0.071  17.409  1.00 18.44           NATOM   1123  CA  LEU A 125      49.445  -0.564  16.052  1.00 19.92           CATOM   1124  C   LEU A 125      48.034  -0.754  15.509  1.00 25.56           CATOM   1125  O   LEU A 125      47.854  -1.188  14.364  1.00 18.26           OATOM   1126  CB  LEU A 125      50.355  -1.800  15.840  1.00 20.79           CATOM   1127  CG  LEU A 125      51.890  -1.511  15.778  1.00 17.21           CATOM   1128  CD1 LEU A 125      52.744  -2.649  16.316  1.00 19.95           CATOM   1129  CD2 LEU A 125      52.334  -1.219  14.338  1.00  5.81           CATOM   1130  N   GLN A 126      47.027  -0.327  16.276  1.00 21.97           NATOM   1131  CA  GLN A 126      45.652  -0.504  15.790  1.00 19.97           CATOM   1132  C   GLN A 126      45.213   0.447  14.724  1.00 28.31           CATOM   1133  O   GLN A 126      44.076   0.391  14.293  1.00 47.49           OATOM   1134  CB  GLN A 126      44.652  -0.404  16.911  1.00 19.87           CATOM   1135  CG  GLN A 126      44.949  -1.312  18.048  1.00 18.39           CATOM   1136  CD  GLN A 126      44.319  -2.626  17.835  1.00 66.80           CATOM   1137  OE1 GLN A 126      44.064  -3.376  18.792  1.00 40.75           OATOM   1138  NE2 GLN A 126      44.015  -2.952  16.565  1.00 71.74           NATOM   1139  N   GLY A 127      46.080   1.330  14.270  1.00 28.29           NATOM   1140  CA  GLY A 127      45.627   2.260  13.252  1.00 23.31           CATOM   1141  C   GLY A 127      46.662   3.315  12.953  1.00 22.90           CATOM   1142  O   GLY A 127      47.755   3.254  13.474  1.00 25.30           OATOM   1143  N   THR A 128      46.311   4.219  12.046  1.00 19.51           NATOM   1144  CA  THR A 128      47.149   5.314  11.588  1.00 22.12           CATOM   1145  C   THR A 128      47.705   6.219  12.695  1.00 22.60           CATOM   1146  O   THR A 128      47.061   6.461  13.731  1.00 18.58           OATOM   1147  CB  THR A 128      46.392   6.182  10.544  1.00 35.98           CATOM   1148  OG1 THR A 128      46.533   5.594   9.239  1.00 58.05           OATOM   1149  CG2 THR A 128      46.942   7.639  10.542  1.00 43.41           CATOM   1150  N   LEU A 129      48.907   6.715  12.425  1.00 18.32           NATOM   1151  CA  LEU A 129      49.674   7.534  13.356  1.00 16.76           CATOM   1152  C   LEU A 129      49.504   8.959  12.967  1.00  4.89           CATOM   1153  O   LEU A 129      49.232   9.260  11.814  1.00 16.14           OATOM   1154  CB  LEU A 129      51.205   7.191  13.261  1.00 17.91           CATOM   1155  CG  LEU A 129      51.769   5.804  13.752  1.00 18.21           CATOM   1156  CD1 LEU A 129      53.132   5.379  13.193  1.00 12.12           CATOM   1157  CD2 LEU A 129      51.683   5.532  15.251  1.00  3.89           CATOM   1158  N   GLU A 130      49.816   9.827  13.917  1.00 10.23           NATOM   1159  CA  GLU A 130      49.912  11.268  13.691  1.00 13.22           CATOM   1160  C   GLU A 130      51.128  11.544  12.775  1.00 23.44           CATOM   1161  O   GLU A 130      52.249  11.162  13.090  1.00 21.23           OATOM   1162  CB  GLU A 130      50.150  11.979  15.035  1.00 18.48           CATOM   1163  CG  GLU A 130      50.754  13.376  14.886  1.00 77.44           CATOM   1164  CD  GLU A 130      49.833  14.328  14.121  1.00100.00           CATOM   1165  OE1 GLU A 130      48.588  14.205  14.340  1.00 36.19           OATOM   1166  OE2 GLU A 130      50.347  15.161  13.295  1.00 21.03           OATOM   1167  N   PRO A 131      50.920  12.219  11.648  1.00 21.35           NATOM   1168  CA  PRO A 131      52.023  12.409  10.731  1.00 14.78           CATOM   1169  C   PRO A 131      53.201  13.132  11.265  1.00 14.98           CATOM   1170  O   PRO A 131      54.325  12.847  10.853  1.00 20.99           OATOM   1171  CB  PRO A 131      51.413  13.154   9.552  1.00 14.76           CATOM   1172  CG  PRO A 131      50.071  13.485   9.949  1.00 20.99           CATOM   1173  CD  PRO A 131      49.641  12.626  11.047  1.00 17.25           CATOM   1174  N   THR A 132      52.986  14.095  12.159  1.00 18.77           NATOM   1175  CA  THR A 132      54.131  14.838  12.689  1.00 16.44           CATOM   1176  C   THR A 132      55.102  13.951  13.408  1.00 21.91           CATOM   1177  O   THR A 132      56.317  14.088  13.234  1.00 24.17           OATOM   1178  CB  THR A 132      53.716  15.907  13.606  1.00 23.45           CATOM   1179  OG1 THR A 132      52.976  16.883  12.850  1.00 31.15           OATOM   1180  CG2 THR A 132      54.969  16.519  14.341  1.00  9.28           CATOM   1181  N   ASN A 133      54.551  12.970  14.122  1.00 28.59           NATOM   1182  CA  ASN A 133      55.359  12.007  14.875  1.00 26.38           CATOM   1183  C   ASN A 133      55.666  10.682  14.207  1.00 14.85           CATOM   1184  O   ASN A 133      56.446   9.884  14.755  1.00 18.67           OATOM   1185  CB  ASN A 133      54.661  11.699  16.168  1.00 23.70           CATOM   1186  CG  ASN A 133      54.480  12.894  16.968  1.00 50.55           CATOM   1187  OD1 ASN A 133      53.354  13.272  17.252  1.00 40.07           OATOM   1188  ND2 ASN A 133      55.568  13.638  17.163  1.00 40.36           NATOM   1189  N   GLU A 134      55.100  10.469  13.022  1.00  9.98           NATOM   1190  CA  GLU A 134      55.237   9.210  12.365  1.00  9.66           CATOM   1191  C   GLU A 134      56.648   8.530  12.274  1.00 13.86           CATOM   1192  O   GLU A 134      56.814   7.388  12.706  1.00 22.89           OATOM   1193  CB  GLU A 134      54.448   9.200  11.070  1.00 17.55           CATOM   1194  CG  GLU A 134      54.750   7.930  10.227  1.00 20.89           CATOM   1195  CD  GLU A 134      53.926   7.868   8.970  1.00 13.59           CATOM   1196  OE1 GLU A 134      52.678   7.738   9.085  1.00 35.28           OATOM   1197  OE2 GLU A 134      54.497   8.048   7.869  1.00 13.44           OATOM   1198  N   PRO A 135      57.680   9.222  11.789  1.00 15.72           NATOM   1199  CA  PRO A 135      59.014   8.600  11.699  1.00 18.91           CATOM   1200  C   PRO A 135      59.544   8.174  13.073  1.00 18.68           CATOM   1201  O   PRO A 135      60.072   7.069  13.271  1.00 15.69           OATOM   1202  CB  PRO A 135      59.896   9.755  11.169  1.00 13.84           CATOM   1203  CG  PRO A 135      59.036  10.514  10.350  1.00  9.78           CATOM   1204  CD  PRO A 135      57.594  10.395  10.908  1.00 14.43           CATOM   1205  N   TYR A 136      59.449   9.117  13.994  1.00  8.64           NATOM   1206  CA  TYR A 136      59.873   8.915  15.324  1.00 13.27           CATOM   1207  C   TYR A 136      59.056   7.728  15.907  1.00 16.84           CATOM   1208  O   TYR A 136      59.578   6.903  16.658  1.00 12.90           OATOM   1209  CB  TYR A 136      59.604  10.234  16.100  1.00 15.51           CATOM   1210  CG  TYR A 136      59.912  10.168  17.614  1.00 18.26           CATOM   1211  CD1 TYR A 136      61.200  10.062  18.072  1.00 20.53           CATOM   1212  CD2 TYR A 136      58.904  10.150  18.568  1.00 17.38           CATOM   1213  CE1 TYR A 136      61.484   9.959  19.440  1.00 30.44           CATOM   1214  CE2 TYR A 136      59.184  10.084  19.953  1.00  9.85           CATOM   1215  CZ  TYR A 136      60.476   9.949  20.377  1.00 20.65           CATOM   1216  OH  TYR A 136      60.792   9.873  21.734  1.00 24.41           OATOM   1217  N   ALA A 137      57.760   7.687  15.638  1.00  7.19           NATOM   1218  CA  ALA A 137      56.923   6.633  16.227  1.00 12.68           CATOM   1219  C   ALA A 137      57.345   5.265  15.737  1.00 15.21           CATOM   1220  O   ALA A 137      57.425   4.272  16.488  1.00 14.58           CATOM   1221  CB  ALA A 137      55.517   6.849  15.871  1.00 11.40           CATOM   1222  N   ILE A 138      57.567   5.213  14.447  1.00  8.93           NATOM   1223  CA  ILE A 138      57.954   3.971  13.831  1.00 11.77           CATOM   1224  C   ILE A 138      59.246   3.494  14.492  1.00 16.20           CATOM   1225  O   ILE A 138      59.307   2.377  14.970  1.00 13.79           OATOM   1226  CB  ILE A 138      58.064   4.172  12.316  1.00 17.85           CATOM   1227  CG1 ILE A 138      56.680   4.473  11.757  1.00 28.21           CATOM   1228  CG2 ILE A 138      58.674   2.986  11.602  1.00  9.81           CATOM   1229  CD1 ILE A 138      55.695   3.376  11.970  1.00 18.17           CATOM   1230  N   ALA A 139      60.243   4.361  14.625  1.00 11.54           NATOM   1231  CA  ALA A 139      61.494   3.937  15.288  1.00 13.22           CATOM   1232  C   ALA A 139      61.256   3.364  16.675  1.00 18.73           CATOM   1233  O   ALA A 139      61.791   2.318  17.031  1.00 20.44           OATOM   1234  CB  ALA A 139      62.434   5.073  15.390  1.00 13.62           CATOM   1235  N   LYS A 140      60.397   4.033  17.448  1.00 16.36           NATOM   1236  CA  LYS A 140      60.083   3.600  18.815  1.00 15.14           CATOM   1237  C   LYS A 140      59.392   2.262  18.824  1.00 15.18           CATOM   1238  O   LYS A 140      59.824   1.346  19.475  1.00 21.42           OATOM   1239  CB  LYS A 140      59.193   4.606  19.525  1.00 17.86           CATOM   1240  CG  LYS A 140      59.925   5.806  20.152  1.00 21.11           CATOM   1241  CD  LYS A 140      61.208   5.478  20.958  1.00 16.75           CATOM   1242  CE  LYS A 140      61.664   6.735  21.835  1.00 10.06           CATOM   1243  NZ  LYS A 140      62.688   6.496  22.921  1.00 14.40           NATOM   1244  N   ILE A 141      58.356   2.116  18.027  1.00 11.49           NATOM   1245  CA  ILE A 141      57.703   0.828  17.977  1.00 17.92           CATOM   1246  C   ILE A 141      58.729  -0.282  17.577  1.00 13.46           CATOM   1247  O   ILE A 141      58.730  -1.374  18.148  1.00 13.92           OATOM   1248  CB  ILE A 141      56.497   0.925  17.019  1.00 22.59           CATOM   1249  CG1 ILE A 141      55.466   1.906  17.557  1.00 17.61           CATOM   1250  CG2 ILE A 141      55.863  -0.411  16.700  1.00 10.49           CATOM   1251  CD1 ILE A 141      54.530   2.327  16.449  1.00 13.43           CATOM   1252  N   ALA A 142      59.637   0.028  16.650  1.00 10.29           NATOM   1253  CA  ALA A 142      60.657  -0.931  16.228  1.00  7.15           CATOM   1254  C   ALA A 142      61.456  -1.301  17.456  1.00 16.58           CATOM   1255  O   ALA A 142      61.839  -2.454  17.621  1.00 13.04           OATOM   1256  CB  ALA A 142      61.604  -0.288  15.130  1.00  4.44           CATOM   1257  N   GLY A 143      61.703  -0.307  18.316  1.00  9.56           NATOM   1258  CA  GLY A 143      62.448  -0.525  19.527  1.00  5.15           CATOM   1259  C   GLY A 143      61.770  -1.555  20.430  1.00 16.36           CATOM   1260  O   GLY A 143      62.392  -2.482  20.967  1.00 14.11           OATOM   1261  N   ILE A 144      60.476  -1.418  20.564  1.00 20.33           NATOM   1262  CA  ILE A 144      59.725  -2.314  21.407  1.00 15.35           CATOM   1263  C   ILE A 144      59.706  -3.732  20.859  1.00 19.84           CATOM   1264  O   ILE A 144      59.836  -4.700  21.608  1.00 17.93           OATOM   1265  CB  ILE A 144      58.317  -1.819  21.559  1.00 10.60           CATOM   1266  CG1 ILE A 144      58.311  -0.610  22.516  1.00  9.80           CATOM   1267  CG2 ILE A 144      57.410  -2.928  22.122  1.00  9.60           CATOM   1268  CD1 ILE A 144      57.022   0.076  22.517  1.00 18.32           CATOM   1269  N   LYS A 145      59.520  -3.841  19.556  1.00  7.20           NATOM   1270  CA  LYS A 145      59.459  -5.139  18.926  1.00  7.64           CATOM   1271  C   LYS A 145      60.840  -5.788  18.931  1.00 15.32           CATOM   1272  O   LYS A 145      60.923  -6.989  18.981  1.00 14.76           OATOM   1273  CB  LYS A 145      58.891  -5.001  17.516  1.00 11.25           CATOM   1274  CG  LYS A 145      57.414  -4.581  17.489  1.00 12.13           CATOM   1275  CD  LYS A 145      56.642  -5.434  18.495  1.00 25.23           CATOM   1276  CE  LYS A 145      55.189  -4.995  18.692  1.00 13.64           CATOM   1277  NZ  LYS A 145      54.441  -6.111  19.392  1.00 11.94           NATOM   1278  N   LEU A 146      61.934  -5.011  18.986  1.00 26.98           NATOM   1279  CA  LEU A 146      63.261  -5.642  19.167  1.00 19.72           CATOM   1280  C   LEU A 146      63.262  -6.316  20.542  1.00 18.20           CATOM   1281  O   LEU A 146      63.590  -7.511  20.703  1.00 19.86           OATOM   1282  CB  LEU A 146      64.398  -4.618  19.150  1.00 13.56           CATOM   1283  CG  LEU A 146      64.895  -4.258  17.759  1.00 21.84           CATOM   1284  CD1 LEU A 146      65.672  -2.945  17.817  1.00 17.94           CATOM   1285  CD2 LEU A 146      65.745  -5.397  17.102  1.00 16.10           CATOM   1286  N   CYS A 147      62.931  -5.523  21.548  1.00  7.91           NATOM   1287  CA  CYS A 147      62.875  -6.064  22.893  1.00  9.14           CATOM   1288  C   CYS A 147      62.072  -7.378  22.945  1.00 22.72           CATOM   1289  O   CYS A 147      62.568  -8.401  23.383  1.00 16.90           OATOM   1290  CB  CYS A 147      62.232  -5.058  23.809  1.00 12.63           CATOM   1291  SG  CYS A 147      63.411  -3.823  24.316  1.00 15.02           SATOM   1292  N   GLU A 148      60.823  -7.352  22.508  1.00 20.03           NATOM   1293  CA  GLU A 148      60.016  -8.555  22.567  1.00 16.09           CATOM   1294  C   GLU A 148      60.685  -9.715  21.802  1.00 22.61           CATOM   1295  O   GLU A 148      60.651 -10.888  22.226  1.00 12.05           OATOM   1296  CB  GLU A 148      58.597  -8.268  22.046  1.00 14.66           CATOM   1297  CG  GLU A 148      57.864  -7.189  22.840  1.00 11.45           CATOM   1298  CD  GLU A 148      56.471  -6.821  22.277  1.00 11.75           CATOM   1299  OE1 GLU A 148      56.117  -7.055  21.080  1.00 11.65           OATOM   1300  OE2 GLU A 148      55.728  -6.231  23.081  1.00 22.56           OATOM   1301  N   SER A 149      61.368  -9.377  20.715  1.00 15.57           NATOM   1302  CA  SER A 149      61.938 -10.428  19.887  1.00 10.21           CATOM   1303  C   SER A 149      63.040 -11.245  20.502  1.00 15.83           CATOM   1304  O   SER A 149      63.102 -12.458  20.291  1.00 12.72           OATOM   1305  CB  SER A 149      62.270  -9.936  18.488  1.00  9.44           CATOM   1306  OG  SER A 149      61.053  -9.650  17.782  1.00 15.91           OATOM   1307  N   TYR A 150      63.910 -10.546  21.224  1.00 18.44           NATOM   1308  CA  TYR A 150      65.065 -11.100  21.948  1.00 20.50           CATOM   1309  C   TYR A 150      64.514 -11.848  23.158  1.00 21.87           CATOM   1310  O   TYR A 150      64.939 -12.949  23.486  1.00 31.39           OATOM   1311  CB  TYR A 150      66.005  -9.950  22.425  1.00 13.71           CATOM   1312  CG  TYR A 150      66.994  -9.509  21.365  1.00 14.13           CATOM   1313  CD1 TYR A 150      66.611  -8.673  20.317  1.00 14.64           CATOM   1314  CD2 TYR A 150      68.288 -10.000  21.360  1.00 18.32           CATOM   1315  CE1 TYR A 150       67.487  -8.390  19.278  1.00 11.91           CATOM   1316  CE2 TYR A 150       69.198  -9.682  20.345  1.00 11.10           CATOM   1317  CZ  TYR A 150       68.804  -8.900  19.326  1.00 20.95           CATOM   1328  OH  TYR A 150       69.739  -8.685  18.333  1.00 27.73           OATOM   1319  N   ASN A 151       63.536 -11.249  23.801  1.00 14.83           NATOM   1320  CA  ASN A 151       62.903 -11.889  24.937  1.00 23.62           CATOM   1321  C   ASN A 151       62.417 -13.244  24.410  1.00 28.53           CATOM   1322  O   ASN A 151       62.630 -14.248  25.072  1.00 25.89           OATOM   1323  CB  ASN A 151       61.655 -11.113  25.439  1.00 20.95           CATOM   1324  CG  ASN A 151       61.988  -9.867  26.284  1.00 15.07           CATOM   1325  OD1 ASN A 151       61.126  -9.020  26.466  1.00 26.72           OATOM   1326  ND2 ASN A 151       63.231  -9.709  26.700  1.00  6.31           NATOM   1327  N   ARG A 152       61.731 -13.249  23.259  1.00 19.91           NATOM   1328  CA  ARG A 152       61.129 -14.465  22.687  1.00 17.62           CATOM   1329  C   ARG A 152       62.090 -15.523  22.188  1.00 21.34           CATOM   1330  O   ARG A 152       61.959 -16.687  22.542  1.00 15.44           OATOM   1331  CB  ARG A 152       60.086 -14.148  21.610  1.00 15.30           CATOM   1332  CG  ARG A 152       58.672 -13.754  22.157  1.00 17.22           CATOM   1333  CD  ARG A 152       57.652 -13.297  21.049  1.00  9.11           CATOM   1334  NE  ARG A 152       57.161 -14.419  20.241  1.00 21.05           NATOM   1335  CZ  ARG A 152       57.159 -14.447  18.912  1.00 28.61           CATOM   1336  NH1 ARG A 152       57.590 -13.387  18.221  1.00 21.98           NATOM   1337  NH2 ARG A 152       56.717 -15.528  18.262  1.00 26.11           NATOM   1338  N   GLN A 153       63.098 -15.104  21.434  1.00 16.54           NATOM   1339  CA  GLN A 153       64.044 -16.036  20.842  1.00  9.74           CATOM   1340  C   GLN A 153       65.082 -16.443  21.807  1.00 16.70           CATOM   1341  O   GLN A 153       65.529 -17.545  21.763  1.00 24.35           OATOM   1342  CB  GLN A 153       64.789 -15.372  19.714  1.00  8.99           CATOM   1343  CG  GLN A 153       65.935 -16.225  19.116  1.00  4.63           CATOM   1344  CD  GLN A 153       66.315 -15.637  17.762  1.00 14.17           CATOM   1345  OE1 GLN A 153       65.611 -14.763  17.254  1.00 12.53           OATOM   1346  NE2 GLN A 153       67.466 -16.024  17.228  1.00 13.38           NATOM   1347  N   TYR A 154       65.566 -15.518  22.608  1.00 14.35           NATOM   1348  CA  TYR A 154       66.677 -15.839  23.483  1.00 12.16           CATOM   1349  C   TYR A 154       66.323 -15.930  24.954  1.00 19.06           CATOM   1350  O   TYR A 154       67.185 -16.207  25.777  1.00 25.59           OATOM   1351  CB  TYR A 154       67.829 -14.816  23.326  1.00 16.89           CATOM   1352  CG  TYR A 154       68.418 -14.733  21.943  1.00 17.53           CATOM   1353  CD1 TYR A 154       69.259 -15.726  21.467  1.00 18.91           CATOM   1354  CD2 TYR A 154       68.080 -13.712  21.091  1.00 13.97           CATOM   1355  CE1 TYR A 154       69.782 -15.686  20.190  1.00 10.98           CATOM   1356  CE2 TYR A 154       68.621 -13.639  19.806  1.00 23.81           CATOM   1357  CZ  TYR A 154       69.488 -14.634  19.380  1.00 23.08           CATOM   1358  OH  TYR A 154       70.002 -14.619  18.118  1.00 23.87           OATOM   1359  N   GLY A 155       65.080 -15.686  25.313  1.00 12.08           NATOM   1360  CA  GLY A 155      64.747 -15.702  26.731  1.00 15.80            CATOM   1361  C   GLY A 155      65.323 -14.498  27.580  1.00 33.97            CATOM   1362  O   GLY A 125      65.491 -14.640  28.789  1.00 25.76            OATOM   1363  N   ARG A 156      65.564 -13.318  26.981  1.00 25.91            NATOM   1364  CA  ARG A 156      66.066 -12.146  27.734  1.00 14.13            CATOM   1365  C   ARG A 156      64.971 -11.486  28.581  1.00 16.23            CATOM   1366  O   ARG A 156      63.802 -11.919  28.583  1.00 22.61            OATOM   1367  CB  ARG A 156      66.601 -11.124  26.750  1.00 13.16            CATOM   1368  CG  ARG A 156      67.875 -11.570  26.099  1.00 15.18            CATOM   1369  CD  ARG A 156      68.930 -11.418  27.121  1.00 26.42            CATOM   1370  NE  ARG A 156      70.200 -11.912  26.633  1.00 21.25            NATOM   1371  CZ  ARG A 156      71.092 -12.555  27.386  1.00 42.25            CATOM   1372  NH1 ARG A 156      70.870 -12.795  28.679  1.00 20.02            NATOM   1373  NH2 ARG A 156      72.221 -12.966  26.843  1.00 20.88            NATOM   1374  N   ASP A 157      65.343 -10.446  29.321  1.00 16.00            NATOM   1375  CA  ASP A 157      64.370  -9.749  30.166  1.00 16.20            CATOM   1376  C   ASP A 157      64.444  -8.245  29.841  1.00 19.20            CATOM   1377  O   ASP A 157      64.865  -7.429  30.650  1.00 10.71            OATOM   1378  CB  ASP A 157      64.609 -10.061  31.652  1.00 16.50            CATOM   1379  CG  ASP A 157      63.489  -9.560  32.566  1.00 26.45            CATOM   1380  OD1 ASP A 157      62.433  -9.060  32.108  1.00 26.82            OATOM   1381  OD2 ASP A 157      63.673  -9.653  33.784  1.00 21.88            OATOM   1382  N   TYR A 158      64.038  -7.921  28.620  1.00 19.41            NATOM   1383  CA  TYR A 158      64.099  -6.564  28.083  1.00 18.96            CATOM   1384  C   TYR A 158      62.688  -5.977  28.127  1.00 22.62            CATOM   1385  O   TYR A 158      61.854  -6.296  27.282  1.00 10.12            OATOM   1386  CB  TYR A 158      64.562  -6.661  26.631  1.00 16.34            CATOM   1387  CG  TYR A 158      65.982  -7.166  26.484  1.00 12.04            CATOM   1388  CD1 TYR A 158      66.789  -7.415  27.621  1.00 13.76            CATOM   1389  CD2 TYR A 158      66.544  -7.349  25.218  1.00 16.35            CATOM   1390  CE1 TYR A 158      68.135  -7.786  27.482  1.00  8.18            CATOM   1391  CE2 TYR A 158      67.886  -7.732  25.060  1.00 13.73            CATOM   1392  CZ  TYR A 158      68.676  -7.942  26.186  1.00 24.45            CATOM   1393  OH  TYR A 158      69.993  -8.338  25.997  1.00 14.36            OATOM   1394  N   ARG A 159      62.423  -5.200  29.175  1.00 23.53            NATOM   1395  CA  ARG A 159      61.105  -4.603  29.483  1.00 21.15            CATOM   1396  C   ARG A 159      60.930  -3.172  28.878  1.00 23.55            CATOM   1397  O   ARG A 159      61.911  -2.566  28.424  1.00 18.12            OATOM   1398  CB  ARG A 159      60.891  -4.608  31.034  1.00 21.68            CATOM   1399  CG  ARG A 159      60.986  -6.029  31.722  1.00 16.41            CATOM   1400  CD  ARG A 159      61.135  -6.052  33.233  1.00 18.10            CATOM   1401  NE  ARG A 159      61.305  -7.402  33.772  1.00 19.25            NATOM   1402  CZ  ARG A 159      61.164  -7.720  35.058  1.00 36.67            CATOM   1403  NH1 ARG A 159      60.886  -6.776  35.962  1.00 15.32            NATOM   1404  NH2 ARG A 159      61.309  -8.986  35.448  1.00 11.79            NATOM   1405  N   SER A 160       59.689  -2.661  28.859  1.00 24.44           NATOM   1406  CA  SEP A 160       59.312  -1.393  28.200  1.00 21.59           CATOM   1407  C   SER A 160       58.242  -0.577  28.950  1.00 25.07           CATOM   1408  O   SER A 160       57.257  -1.127  29.454  1.00 17.02           OATOM   1409  CB  SER A 160       58.719  -1.747  26.797  1.00 13.05           CATOM   1410  OG  SER A 160       59.782  -1.897  25.885  1.00 37.57           OATOM   1411  N   VAL A 161       58.378   0.742  28.927  1.00 21.01           NATOM   1412  CA  VAL A 161       57.369   1.644  29.509  1.00  9.70           CATOM   1413  C   VAL A 161       57.068   2.747  28.504  1.00 16.77           CATOM   1414  O   VAL A 161       57.955   3.149  27.729  1.00 16.33           OATOM   1415  CB  VAL A 161       57.806   2.248  30.862  1.00 17.94           CATOM   1416  CG1 VAL A 161       57.873   1.185  31.984  1.00 16.16           CATOM   1417  CG2 VAL A 161       59.137   2.992  30.750  1.00 21.10           CATOM   1418  N   MET A 162       55.794   3.147  28.443  1.00 22.46           NATOM   1419  CA  MET A 162       55.296   4.185  27.513  1.00 19.23           CATOM   1420  C   MET A 162       54.880   5.312  28.397  1.00 25.19           CATOM   1421  O   MET A 162       53.788   5.269  28.961  1.00 18.35           OATOM   1422  CB  MET A 162       53.979   3.796  26.850  1.00 15.55           CATOM   1423  CG  MET A 162       54.013   2.630  25.949  1.00 37.79           CATOM   1424  SD  MET A 162       54.354   3.100  24.235  1.00 52.07           SATOM   1425  CE  MET A 162       56.193   3.134  24.410  1.00 36.30           CATOM   1426  N   PRO A 163       55.730   6.313  28.521  1.00 18.43           NATOM   1427  CA  PRO A 163       55.390   7.472  29.337  1.00 17.76           CATOM   1428  C   PRO A 163       54.300   8.384  28.667  1.00 21.23           CATOM   1429  O   PRO A 163       54.208   8.448  27.433  1.00 15.20           OATOM   1430  CB  PRO A 163       56.727   8.196  29.423  1.00 11.43           CATOM   1431  CG  PRO A 163       57.352   7.874  28.031  1.00 13.99           CATOM   1432  CD  PRO A 163       57.086   6.401  27.949  1.00 12.24           CATOM   1433  N   THR A 164       53.478   9.060  29.478  1.00 13.95           NATOM   1434  CA  THR A 164       52.581  10.121  28.963  1.00 25.82           CATOM   1435  C   THR A 164       53.406  11.441  28.781  1.00 19.67           CATOM   1436  O   THR A 164       54.633  11.393  28.868  1.00 13.97           OATOM   1437  CB  THR A 164       51.373  10.391  29.903  1.00 25.51           CATOM   1438  OG1 THR A 164       50.470  11.321  29.267  1.00 14.77           OATOM   1439  CG2 THR A 164       51.818  10.886  31.298  1.00  9.06           CATOM   1440  N   ASN A 165       52.751  12.589  28.556  1.00 14.99           NATOM   1441  CA  ASN A 165       53.448  13.901  28.481  1.00  7.83           CATOM   1442  C   ASN A 165       54.167  14.064  29.824  1.00 11.21           CATOM   1443  O   ASN A 165       53.554  13.929  30.894  1.00 17.66           OATOM   1444  CB  ASN A 165       52.434  15.061  28.416  1.00 14.48           CATOM   1445  CG  ASN A 165       51.492  14.941  27.262  1.00 23.70           CATOM   1446  OD1 ASN A 165       51.939  14.800  26.129  1.00 22.37           OATOM   1447  ND2 ASN A 165       50.173  14.925  27.539  1.00 27.22           NATOM   1448  N   LEU A 166       55.418  14.490  29.777  1.00  8.23           NATOM   1449  CA  LEU A 166       56.187  14.604  30.994  1.00 14.40           CATOM   1450  C   LEU A 166      56.629  16.017  31.120  1.00 25.05           CATOM   1451  O   LEU A 166      56.624  16.718  30.125  1.00 25.09           OATOM   1452  CB  LEU A 166      57.460  13.743  30.870  1.00 17.48           CATOM   1453  CG  LEU A 166      57.423  12.218  30.652  1.00 16.63           CATOM   1454  CD1 LEU A 166      58.837  11 639  31.000  1.00 22.52           CATOM   1455  CD2 LEU A 166      56.336  11.539  31.514  1.00  7.46           CATOM   1456  N   TYR A 167      57.146  16.391  32.300  1.00 19.78           NATOM   1457  CA  TYR A 167      57.678  17.760  32.511  1.00 18.58           CATOM   1458  C   TYR A 167      58.534  17.763  33.767  1.00 15.53           CATOM   1459  O   TYR A 167      58.474  16.852  34.575  1.00 16.71           OATOM   1460  CB  TYR A 167      56.509  18.778  32.665  1.00 18.33           CATOM   1461  CG  TYR A 167      55.671  18.561  33.931  1.00 14.23           CATOM   1462  CD1 TYR A 167      54.624  17.618  33.977  1.00 13.35           CATOM   1463  CD2 TYR A 167      55.984  19.258  35.106  1.00 16.52           CATOM   1464  CE1 TYR A 167      53.889  17.446  35.146  1.00 21.17           CATOM   1465  CE2 TYR A 167      55.302  19.084  36.264  1.00  8.26           CATOM   1466  CZ  TYR A 167      54.228  18.203  36.296  1.00 23.56           CATOM   1467  OH  TYR A 167      53.526  18.078  37.504  1.00 22.81           OATOM   1468  N   GLY A 168      59.334  18.797  33.952  1.00 16.59           NATOM   1469  CA  GLY A 168      60.158  18.817  35.152  1.00 18.21           CATOM   1470  C   GLY A 168      61.534  19.428  34.880  1.00 13.69           CATOM   1471  O   GLY A 168      61.746  20.028  33.837  1.00 16.52            OATOM   1472  N   PRO A 169      62.473  19.263  35.817  1.00 20.33            NATOM   1473  CA  PRO A 169      63.801  19.822  35.656  1.00 16.07           CATOM   1474  C   PRO A 169      64.430  19.353  34.387  1.00 27.18           CATOM   1475  O   PRO A 169      64.305  18.186  33.981  1.00 21.23           OATOM   1476  CB  PRO A 169      64.595  19.206  36.805  1.00 17.28           CATOM   1477  CG  PRO A 169      63.649  18.919  37.830  1.00 19.89           CATOM   1478  CD  PRO A 169      62.263  18.772  37.189  1.00 22.47           CATOM   1479  N   HIS A 170      65.226  20.235  33.829  1.00 19.48           NATOM   1480  CA  HIS A 170      65.952  19.877  32.638  1.00 25.56           CATOM   1481  C   HIS A 170      65.096  19.707  31.428  1.00 29.15           CATOM   1482  O   HIS A 170      65.553  19.091  30.479  1.00 29.71           OATOM   1483  CB  HIS A 170      66.783  18.600  32.845  1.00 28.94           CATOM   1484  CG  HIS A 170      67.703  18.671  34.034  1.00 33.88           CATOM   1485  ND1 HIS A 170      68.975  19.203  33.969  1.00 25.46           NATOM   1486  CD2 HIS A 170      67.518  18.298  35.326  1.00 34.77           CATOM   1487  CE1 HIS A 170      69.531  19.151  35.166  1.00 25.63           CATOM   1488  NE2 HIS A 170      68.673  18.603  36.008  1.00 31.72           NATOM   1489  N   ASP A 171      63.881  20.245  31.440  1.00 21.52           NATOM   1490  CA  ASP A 171      63.041  20.267  30.218  1.00 28.63           CATOM   1491  C   ASP A 171      63.630  21.459  29.359  1.00 41.94           CATOM   1492  O   ASP A 171      64.534  22.171  29.835  1.00 29.69           OATOM   1493  CB  ASP A 171      61.552  20.558  30.602  1.00 26.40           CATOM   1494  CG  ASP A 171      60.552  20.097  29.540  1.00 22.32           CATOM   1495  OD1 ASP A 171       60.890  20.067  28.325  1.00 32.03           OATOM   1496  OD2 ASP A 171       59.427  19.719  29.916  1.00 42.13           OATOM   1497  N   ASN A 172       63.141  21.712  28.137  1.00 42.08           NATOM   1498  CA  ASN A 172       63.616  22.893  27.388  1.00 35.95           CATOM   1499  C   ASN A 172       62.665  24.056  27.674  1.00 33.71           CATOM   1500  O   ASN A 172       61.586  24.102  27.104  1.00 32.69           OATOM   1501  CB  ASN A 172       63.632  22.667  25.869  1.00 41.60           CATOM   1502  CG  ASN A 172       63.807  23.987  25.086  1.00 39.09           CATOM   1503  OD1 ASN A 172       62.973  24.347  24.259  1.00 83.94           OATOM   1504  ND2 ASN A 172       64.855  24.740  25.418  1.00 65.07           NATOM   1505  N   PHE A 173       63.021  24.953  28.583  1.00 31.93           NATOM   1506  CA  PHE A 173       62.082  26.030  28.944  1.00 48.24           CATOM   1507  C   PHE A 173       61.989  27.260  28.045  1.00 69.01           CATOM   1508  O   PHE A 173       62.278  28.395  28.465  1.00 58.79           OATOM   1509  CB  PHE A 173       62.225  26.459  30.390  1.00 43.43           CATOM   1510  CG  PHE A 173       61.867  25.399  31.356  1.00 34.19           CATOM   1511  CD1 PHE A 173       62.810  24.488  31.751  1.00 24.68           CATOM   1512  CD2 PHE A 173       60.621  25.354  31.925  1.00 24.84           CATOM   1513  CE1 PHE A 173       62.524  23.548  32.682  1.00 23.64           CATOM   1514  CE2 PHE A 173       60.305  24.366  32.804  1.00 31.32           CATOM   1515  CZ  PHE A 173       61.263  23.457  33.192  1.00 24.30           CATOM   1516  N   HIS A 174       61.510  27.036  26.831  1.00 68.16           NATOM   1517  CA  HIS A 174       61.401  28.109  25.871  1.00 64.53           CATOM   1518  C   HIS A 174       59.973  28.221  25.400  1.00 71.58           CATOM   1519  O   MIS A 174       59.309  27.186  25.249  1.00 73.20           OATOM   1520  CB  HIS A 174       62.418  27.870  24.736  1.00 71.71           CATOM   1521  CG  HIS A 174       63.835  27.868  25.229  1.00 92.29           CATOM   1522  ND1 HIS A 174       64.921  27.539  24.440  1.00100.00           NATOM   1523  CD2 HIS A 174       64.338  28.133  26.463  1.00100.00           CATOM   1524  CE1 HIS A 174       66.032  27.628  25.160  1.00100.00           CATOM   1525  NE2 HIS A 174       65.705  27.981  26.393  1.00100.00           NATOM   1526  N   PRO A 175       59.469  29.461  25.262  1.00 65.71           NATOM   1527  CA  PRO A 175       58.109  29.658  24.770  1.00 55.72           CATOM   1528  C   PRO A 175       58.233  29.297  23.267  1.00 75.83           CATOM   1529  O   PRO A 175       57.224  29.226  22.554  1.00 69.59           OATOM   1530  CB  PRO A 175       57.866  31.142  25.026  1.00 49.14           CATOM   1531  CG  PRO A 175       59.258  31.790  24.901  1.00 42.23           CATOM   1532  CD  PRO A 175       60.286  30.695  25.109  1.00 49.59           CATOM   1533  N   SER A 176       59.480  28.954  22.879  1.00 85.09           NATOM   1534  CA  SER A 176       59.954  28.474  21.548  1.00 81.18           CATOM   1535  C   SER A 176       59.660  26.965  21.343  1.00 73.90           CATOM   1536  O   SER A 176       59.617  26.458  20.213  1.00 57.03           OATOM   1537  CB  SER A 176       61.493  28.666  21.447  1.00 71.32           CATOM   1538  OG  SER A 176       62.048  29.349  22.578  1.00 51.93           OATOM   1539  N   ASN A 177       59.520  26.276  22.480  1.00 66.23           NATOM   1540  CA  ASN A 177       59.274  24.847  22.619  1.00 56.41           CATOM   1541  C   ASN A 177       57.810  24.497  22.353  1.00 60.91           CATOM   1542  O   ASN A 177       56.914  25.215  22.811  1.00 55.58           OATOM   1543  CB  ASN A 177       59.619  24.469  24.065  1.00 50.45           CATOM   1544  CG  ASN A 177       59.562  22.970  24.319  1.00 66.57           CATOM   1545  OD1 ASN A 177       59.095  22.216  23.476  1.00100.00           OATOM   1546  ND2 ASN A 177       60.099  22.546  25.464  1.00 35.61           NATOM   1547  N   SER A 178       57.583  23.387  21.627  1.00 57.10           NATOM   1548  CA  SER A 178       56.234  22.853  21.279  1.00 50.50           CATOM   1549  C   SER A 178       55.557  22.159  22.491  1.00 76.24           CATOM   1550  O   SER A 178       54.575  21.400  22.304  1.00 99.63           OATOM   1551  CB  SER A 178       56.316  21.800  20.118  1.00 10.17           CATOM   1552  OG  SER A 178       57.397  22.112  19.217  1.00 71.69           OATOM   1553  N   HIS A 179       56.134  22.284  23.694  1.00 37.39           NATOM   1554  CA  HIS A 179       55.569  21.587  24.855  1.00 30.96           CATOM   1555  C   HIS A 179       54.961  22.616  25.767  1.00 21.93           CATOM   1556  O   HIS A 179       55.641  23.598  26.138  1.00 25.17           OATOM   1557  CB  HIS A 179       56.634  20.683  25.575  1.00 36.20           CATOM   1558  CG  HIS A 179       56.973  19.419  24.835  1.00 42.90           CATOM   1559  ND1 HIS A 179       56.973  19.335  23.457  1.00 49.52           NATOM   1560  CD2 HIS A 179       57.323  18.190  25.278  1.00 52.42           CATOM   1561  CE1 HIS A 179       57.283  18.109  23.084  1.00 44.78           CATOM   1562  NE2 HIS A 179       57.500  17.393  24.168  1.00 50.49           NATOM   1563  N   VAL A 180       53.661  22.454  26.038  1.00 19.14           NATOM   1564  CA  VAL A 180       52.886  23.449  26.789  1.00 29.03           CATOM   1565  C   VAL A 180       53.373  23.890  28.142  1.00 31.29           CATOM   1566  O   VAL A 180       53.348  25.075  28.447  1.00 19.55           OATOM   1567  CB  VAL A 180       51.403  23.115  26.914  1.00 35.47           CATOM   1568  CG1 VAL A 180       50.630  24.399  27.217  1.00 35.84           CATOM   1569  CG2 VAL A 180       50.923  22.550  25.663  1.00 36.11           CATOM   1570  N   ILE A 181       53.684  22.935  29.005  1.00 26.57           NATOM   1571  CA  ILE A 181       54.138  23.285  30.360  1.00 24.49           CATOM   1572  C   ILE A 181       55.371  24.213  30.361  1.00 16.51           CATOM   1573  O   ILE A 181       55.326  25.315  30.909  1.00 24.42           OATOM   1574  CB  ILE A 181       54.285  22.018  31.264  1.00 20.20           CATOM   1575  CG1 ILE A 181       52.878  21.428  31.528  1.00 18.22           CATOM   1576  CG2 ILE A 181       55.014  22.315  32.581  1.00 13.37           CATOM   1577  CD1 ILE A 181       52.867  20.086  32.286  1.00  8.03           CATOM   1578  N   PRO A 182       56.452  23.779  29.718  1.00 22.21           NATOM   1579  CA  PRO A 182       57.664  24.605  29.640  1.00 22.07           CATOM   1580  C   PRO A 182       57.379  25.852  28.828  1.00 24.18           CATOM   1581  O   PRO A 182       57.811  26.949  29.210  1.00 18.35           OATOM   1582  CB  PRO A 182       58.682  23.725  28.890  1.00 24.97           CATOM   1583  CG  PRO A 182       57.925  22.473  28.471  1.00 25.77           CATOM   1584  CD  PRO A 182       56.727  22.359  29.401  1.00 18.23           CATOM   1585  N   ALA A 183       56.628  25.707  27.729  1.00 21.45           NATOM   1586  CA  ALA A 183       56.261  26.896  26.943  1.00 21.66           CATOM   1587  C   ALA A 183       55.464  27.900  27.811  1.00 26.10           CATOM   1588  O   ALA A 183       55.773  29.091  27.856  1.00 19.50           OATOM   1589  CB  ALA A 183       55.473  26.513  25.703  1.00 13.26           CATOM   1590  N   LEU A 184       54.472  27.389  28.543  1.00 23.34           NATOM   1591  CA  LEU A 184       53.642  28.215  29.401  1.00 19.05           CATOM    1592  C  LEU A 184       54.312  28.693  30.655  1.00 21.91           CATOM   1593  O   LEU A 184       54.017  29.771  31.158  1.00 19.71           OATOM   1594  CB  LEU A 184       52.309  27.553  29.715  1.00 14.41           CATOM   1595  CG  LEU A 184       51.342  27.595  28.525  1.00 23.42           CATOM   1596  CD1 LEU A 184       49.918  27.244  28.928  1.00 31.06           CATOM   1597  CD2 LEU A 184       51.380  28.896  27.690  1.00 21.73           CATOM   1598  N   LEU A 185       55.178  27.879  31.213  1.00 18.39           NATOM   1599  CA  LEU A 185       55.833  28.332  32.417  1.00 16.39           CATOM   1600  C   LEU A 185       56.669  29.528  31.985  1.00 23.67           CATOM   1601  O   LEU A 185       56.681  30.590  32.644  1.00 29.38           OATOM   1602  CB  LEU A 185       56.723  27.233  33.015  1.00 15.05           CATOM   1603  CG  LEU A 185       56.021  26.348  34.041  1.00 15.56           CATOM   1604  CD1 LEU A 185       56.819  25.022  34.301  1.00 21.06           CATOM   1605  CD2 LEU A 185       55.722  27.113  35.321  1.00 11.02           CATOM   1606  N   ARG A 186       57.337  29.397  30.852  1.00 17.09           NATOM   1607  CA  ARG A 186       58.137  30.523  30.429  1.00 18.82           CATOM   1608  C   ARG A 186       57.308  31.752  30.069  1.00 29.00           CATOM   1609  O   ARG A 186       57.629  32.880  30.476  1.00 23.91           OATOM   1610  CB  ARG A 186       59.026  30.146  29.281  1.00 22.06           CATOM   1611  CG  ARG A 186       59.653  31.365  28.652  1.00 38.46           CATOM   1612  CD  ARG A 186       60.825  31.804  29.462  1.00 83.66           CATOM   1613  NE  ARG A 186       62.012  31.861  28.631  1.00 70.77           NATOM   1614  CZ  ARG A 186       63.058  32.622  28.904  1.00 91.68           CATOM   1615  NH1 ARG A 186       63.053  33.386  29.995  1.00 56.56           NATOM   1616  NH2 ARG A 186       64.098  32.639  28.082  1.00100.00           NATOM   1617  N   ARG A 187       56.234  31.544  29.310  1.00 20.96           NATOM   1618  CA  ARG A 187       55.361  32.662  28.941  1.00 19.32           CATOM   1619  C   ARG A 187       54.765  33.453  30.142  1.00 28.41           CATOM   1620  O   ARG A 187       54.823  34.700  30.193  1.00 17.23           OATOM   1621  CB  ARG A 187       54.270  32.223  27.957  1.00 17.05           CATOM   1622  CG  ARG A 187       54.813  31.546  26.720  1.00 61.42           CATOM   1623  CD  ARG A 187       53.696  31.244  25.757  1.00 44.57           CATOM   1624  NE  ARG A 187       53.033  32.472  25.354  1.00 29.47           NATOM   1625  CZ  ARG A 187       51.831  32.534  24.790  1.00 17.82           CATOM   1626  NH1 ARG A 187       51.136  31.427  24.544  1.00 24.95           NATOM   1627  NH2 ARG A 187       51.341  33.716  24.447  1.00 37.77           NATOM   1628  N   PHE A 188       54.192  32.734  31.101  1.00 23.48           NATOM   1629  CA  PHE A 188       53.604  33.399  32.259  1.00 21.24           CATOM   1630  C   PHE A 188      54.638  34.080  33.095  1.00 21.39           CATOM   1631  O   PHE A 188      54.394  35.126  33.626  1.00 23.90           OATOM   1632  CB  PHE A 188      52.723  32.466  33.077  1.00 19.95           CATOM   1633  CG  PHE A 188      51.389  32.215  32.435  1.00 22.28           CATOM   1634  CD1 PHE A 188      50.440  33.229  32.375  1.00 19.42           CATOM   1635  CD2 PHE A 188      51.144  31.038  31.734  1.00 23.82           CATOM   1636  CE1 PHE A 188      49.191  33.026  31.742  1.00 24.77           CATOM   1637  CE2 PHE A 188      49.936  30.826  31.057  1.00 20.17           CATOM   1638  CZ  PHE A 188      48.945  31.815  31.068  1.00 23.14           CATOM   1639  N   HIS A 189      55.831  33.513  33.118  1.00 24.15           NATOM   1640  CA  HIS A 189      56.933  34.122  33.837  1.00 28.79           CATOM   1641  C   HIS A 189      57.303  35.506  33.315  1.00 28.58           CATOM   1642  O   HIS A 189      57.480  36.463  34.083  1.00 20.07           OATOM   1643  CB  HIS A 189      58.148  33.268  33.641  1.00 31.38           CATOM   1644  CG  HIS A 189      59.364  33.844  34.290  1.00 29.98           CATOM   1645  ND1 HIS A 189      59.548  33.833  35.658  1.00 31.00           NATOM   1646  CD2 HIS A 189      60.449  34.464  33.766  1.00 21.79           CATOM   1647  CE1 HIS A 189      60.722  34.371  35.945  1.00 24.04           CATOM   1648  NE2 HIS A 189      61.257  34.815  34.821  1.00 19.53           NATOM   1649  N   GLU A 190      57.539  35.561  32.006  1.00 28.43           NATOM   1650  CA  GLU A 190      57.876  36.816  31.324  1.00 27.72           CATOM   1651  C   GLU A 190      56.725  37.829  31.437  1.00 32.56           CATOM   1652  O   GLU A 190      56.949  38.995  31.717  1.00 27.06           OATOM   1653  CB  GLU A 190      58.122  36.529  29.849  1.00 28.55           CATOM   1654  CG  GLU A 190      59.150  35.461  29.614  1.00 35.29           CATOM   1655  CD  GLU A 190      60.553  35.941  29.892  1.00 99.81           CATOM   1656  OE1 GLU A 190      60.913  36.037  31.085  1.00 86.56           OATOM   1657  OE2 GLU A 190      61.293  36.167  28.910  1.00100.00           OATOM   1658  N   ALA A 191      55.493  37.391  31.196  1.00 32.67           NATOM   1659  CA  ALA A 191      54.349  38.286  31.311  1.00 25.30           CATOM   1660  C   ALA A 191      54.287  38.795  32.742  1.00 36.20           CATOM   1661  O   ALA A 191      53.920  39.924  33.014  1.00 27.52           OATOM   1662  CB  ALA A 191      53.055  37.563  31.000  1.00 16.48           CATOM   1663  N   THR A 192      54.549  37.927  33.693  1.00 29.39           NATOM   1664  CA  THR A 192      54.395  38.386  35.041  1.00 19.08           CATOM   1665  C   THR A 192      55.420  39.494  35.298  1.00 44.78           CATOM   1666  O   THR A 192      55.094  40.550  35.839  1.00 40.58           OATOM   1667  CB  THR A 192      54.515  37.235  35.983  1.00 18.99           CATOM   1668  OG1 THR A 192      53.410  36.348  35.755  1.00 34.36           OATOM   1669  CG2 THR A 192      54.461  37.738  37.425  1.00 21.15           CATOM   1670  N   ALA A 193      56.617  39.312  34.757  1.00 48.58           NATOM   1671  CA  ALA A 193      57.705  40.286  34.905  1.00 50.59           CATOM   1672  C   ALA A 193      57.496  41.613  34.145  1.00 54.42           CATOM   1673  O   ALA A 193      57.952  42.698  34.553  1.00 48.28           OATOM   1674  CB  ALA A 193      59.047  39.640  34.496  1.00 51.78           CATOM   1675  N   GLN A 194      56.810  41.530  33.022  1.00 43.16           NATOM   1676  CA  GLN A 194      56.586  42.722  32.242  1.00 38.03           CATOM   1677  C   GLN A 194      55.264  43.389  32.576  1.00 40.85           CATOM   1678  O   GLN A 194      54.830  44.284  31.845  1.00 51.20           OATOM   1679  CB  GLN A 194      56.599  42.358  30.750  1.00 35.96           CATOM   1680  CG  GLN A 194      57.910  41.692  30.290  1.00100.00           CATOM   1681  CD  GLN A 194      57.715  40.661  29.158  1.00100.00           CATOM   1682  OE1 GIN A 194      56.619  40.546  28.579  1.00100.00           OATOM   1683  NE2 GLN A 194      58.782  39.904  28.848  1.00100.00           NATOM   1684  N   GLY A 195      54.583  42.949  33.630  1.00 32.29           NATOM   1685  CA  GLY A 195      53.236  43.464  33.864  1.00 36.26           CATOM   1686  C   GLY A 195      52.299  43.332  32.593  1.00 45.33           CATOM   1687  O   GLY A 195      51.515  44.242  32.346  1.00 45.16           OATOM   1688  N   GLY A 196      52.405  42.245  31.788  1.00 36.33           NATOM   1689  CA  GLY A 196      51.515  41.965  30.608  1.00 19.06           CATOM   1690  C   GLY A 196      50.037  41.956  31.117  1.00 22.49           CATOM   1691  O   GLY A 196      49.724  41.479  32.223  1.00 33.09           OATOM   1692  N   PRO A 197      49.144  42.657  30.431  1.00 29.22           NATOM   1693  CA  PRO A 197      47.790  42.732  30.953  1.00 25.29           CATOM   1694  C   PRO A 197      47.091  41.413  30.674  1.00 24.64           CATOM   1695  O   PRO A 197      46.192  40.991  31.411  1.00 24.75           OATOM   1696  CB  PRO A 197      47.162  43.911  30.176  1.00 26.31           CATOM   1697  CG  PRO A 197      48.188  44.407  29.252  1.00 26.56           CATOM   1698  CD  PRO A 197      49.307  43.454  29.203  1.00 30.25           CATOM   1699  N   ASP A 198      47.572  40.723  29.658  1.00 16.88           NATOM   1700  CA  ASP A 198      47.067  39.418  29.405  1.00 21.65           CATOM   1701  C   ASP A 198      48.046  38.522  28.677  1.00 31.28           CATOM   1702  O   ASP A 198      49.062  38.978  28.172  1.00 34.57           OATOM   1703  CB  ASP A 198      45.739  39.507  28.669  1.00 32.80           CATOM   1704  CG  ASP A 198      45.868  40.055  27.256  1.00 46.13           CATOM   1705  OD1 ASP A 198      46.982  40.230  26.725  1.00 57.45           OATOM   1706  OD2 ASP A 198      44.817  40.271  26.640  1.00 67.61           OATOM   1707  N   VAL A 199      47.713  37.234  28.614  1.00 38.67           NATOM   1708  CA  VAL A 199      48.499  36.226  27.901  1.00 27.79           CATOM   1709  C   VAL A 199      47.462  35.469  27.065  1.00 25.88           CATOM   1710  O   VAL A 199      46.460  35.023  27.598  1.00 24.22           OATOM   1711  CB  VAL A 199      49.163  35.229  28.905  1.00 24.37           CATOM   1712  CG1 VAL A 199      49.874  34.047  28.160  1.00 20.28           CATOM   1713  CG2 VAL A 199      50.121  35.942  29.835  1.00 22.25           CATOM   1714  N   VAL A 200      47.661  35.386  25.757  1.00 23.72           NATOM   1715  CA  VAL A 200      46.701  34.694  24.903  1.00 23.99           CATOM   1716  C   VAL A 200      47.167  33.286  24.499  1.00 22.85           CATOM   1717  O   VAL A 200      48.321  33.108  24.166  1.00 29.77           OATOM   1718  CB  VAL A 200      46.358  35.548  23.680  1.00 23.11           CATOM   1719  CG1 VAL A 200      45.561  34.737  22.598  1.00 16.25           CATOM   1720  CG2 VAL A 200      45.652  36.823  24.130  1.00 27.86           CATOM   1721  N   VAL A 201      46.296  32.278  24.632  1.00 27.39           NATOM   1722  CA  VAL A 201      46.588  30.893  24.265  1.00  9.63           CATOM   1723  C   VAL A 201      45.653  30.529  23.165  1.00 19.63           CATOM   1724  O   VAL A 201      44.452  30.755  23.312  1.00 17.61           OATOM   1725  CB  VAL A 201      46.306  29.952  25.426  1.00 19.95           CATOM   1726  CG1 VAL A 201      46.703  28.519  25.054  1.00 20.85           CATOM   1727  CG2 VAL A 201      47.086  30.439  26.661  1.00 16.73           CATOM   1728  N   TRP A 202      46.210  30.080  22.030  1.00 14.36           NATOM   1729  CA  TRP A 202      45.422  29.693  20.865  1.00 18.97           CATOM   1730  C   TRP A 202      44.495  28.572  21.313  1.00 36.22           CATOM   1731  O   TRP A 202      44.934  27.694  22.057  1.00 31.46           OATOM   1732  CB  TRP A 202      46.292  29.055  19.823  1.00 19.14           CATOM   1733  CG  TRP A 202      47.243  29.894  19.066  1.00 33.65           CATOM   1734  CD1 TRP A 202      48.391  29.463  18.429  1.00 35.28           CATOM   1735  CD2 TRP A 202      47.126  31.282  18.772  1.00 39.90           CATOM   1736  NE1 TRP A 202      48.941  30.481  17.693  1.00 37.86           NATOM   1737  CE2 TRP A 202      48.228  31.624  17.922  1.00 38.35           CATOM   1738  CE3 TRP A 202      46.206  32.281  19.138  1.00 39.39           CATOM   1739  CZ2 TRP A 202      48.380  32.884  17.367  1.00 36.15           CATOM   1740  CZ3 TRP A 202      46.356  33.542  18.578  1.00 39.60           CATOM   1741  CH2 TRP A 202      47.428  33.828  17.684  1.00 40.99           CATOM   1742  N   GLY A 203      43.245  28.564  20.842  1.00 25.59           NATOM   1743  CA  GLY A 203      42.332  27.483  21.169  1.00 13.09           CATOM   1744  C   GLY A 203      41.260  27.813  22.193  1.00 21.12           CATOM   1745  O   GLY A 203      41.340  28.815  22.886  1.00 22.86           OATOM   1746  N   SER A 204      40.270  26.919  22.262  1.00 16.88           NATOM   1747  CA  SER A 204      39.163  26.979  23.192  1.00 18.36           CATOM   1748  C   SER A 204      39.561  26.664  24.659  1.00 22.07           CATOM   1749  O   SER A 204      38.888  27.096  25.604  1.00 34.39           OATOM   1750  CB  SER A 204      38.053  25.998  22.740  1.00  9.99           CATOM   1751  OG  SER A 204      38.237  24.695  23.291  1.00 16.37           OATOM   1752  N   GLY A 205      40.562  25.813  24.854  1.00 12.42           NATOM   1753  CA  GLY A 205      40.963  25.411  26.208  1.00 11.64           CATOM   1754  C   GLY A 205      40.208  24.178  26.711  1.00 19.49           CATOM   1755  O   GLY A 205      40.422  23.723  27.838  1.00 13.59           OATOM   1756  N   THR A 206      39.292  23.683  25.881  1.00 15.38           NATOM   1757  CA  THR A 206      38.432  22.594  26.281  1.00 10.80           CATOM   1758  C   THR A 206      39.056  21.221  26.154  1.00 26.39           CATOM   1759  O   THR A 206      38.564  20.267  26.737  1.00 23.28           OATOM   1760  CB  THR A 206      37.124  22.562  25.460  1.00 12.86           CATOM   1761  OG1 THR A 206      37.438  22.395  24.082  1.00 13.12           OATOM   1762  CG2 THR A 206      36.348  23.840  25.620  1.00 10.62           CATOM   1763  N   PRO A 207      40.101  21.083  25.354  1.00 21.10           NATOM   1764  CA  PRO A 207      40.658  19.743  25.175  1.00 18.15           CATOM   1765  C   PRO A 207       41.316  19.181  26.423  1.00 21.75           CATOM   1766  O   PRO A 207       41.951  19.925  27.215  1.00 20.65           OATOM   1767  CB  PRO A 207       41.638  19.909  24.013  1.00 17.51           CATOM   1768  CG  PRO A 207       41.146  21.213  23.307  1.00 21.45           CATOM   1769  CD  PRO A 207       40.698  22.062  24.431  1.00 23.44           CATOM   1770  N   MET A 208       41.112  17.876  26.624  1.00 15.60           NATOM   1771  CA  MET A 208       41.694  17.167  27.775  1.00 22.94           CATOM   1772  C   MET A 208       43.058  16.427  27.579  1.00 21.90           CATOM   1773  O   MET A 208       43.248  15.677  26.633  1.00 23.16           OATOM   1774  CB  MET A 208       40.645  16.273  28.386  1.00 32.86           CATOM   1775  CG  MET A 208       39.630  17.057  29.223  1.00 46.17           CATOM   1776  SD  MET A 208       38.301  15.990  29.826  1.00 57.85           SATOM   1777  CE  MET A 208       37.999  15.028  28.343  1.00 58.23           CATOM   1778  N   ARG A 209       44.022  16.681  28.456  1.00 17.75           NATOM   1779  CA  ARG A 209       45.318  16.042  28.324  1.00 19.88           CATOM   1780  C   ARG A 209       45.871  15.534  29.639  1.00 16.92           CATOM   1781  O   ARG A 209       45.433  15.946  30.697  1.00 16.58           OATOM   1782  CB  ARG A 209       46.340  16.963  27.658  1.00 21.07           CATOM   1783  CG  ARG A 209       45.980  17.478  26.275  1.00 22.57           CATOM   1784  CD  ARG A 209       45.833  16.357  25.282  1.00 28.26           CATOM   1785  NE  ARG A 209       45.586  16.819  23.906  1.00 23.15           NATOM   1786  CZ  ARG A 209       44.420  16.742  23.267  1.00 34.52           CATOM   1787  NH1 ARG A 209       43.336  16.267  23.890  1.00 18.03           NATOM   1788  NH2 ARG A 209       44.339  17.175  22.012  1.00 29.78           NATOM   1789  N   GLU A 210       46.878  14.675  29.547  1.00 20.87           NATOM   1790  CA  GLU A 210       47.530  14.079  30.720  1.00 17.37           CATOM   1791  C   GLU A 210       49.031  14.490  30.851  1.00 20.96           CATOM   1792  O   GLU A 210       49.748  14.622  29.841  1.00 22.44           OATOM   1793  CB  GLU A 210       47.400  12.562  30.571  1.00 16.26           CATOM   1794  CG  GLU A 210       47.807  11.785  31.809  1.00 19.91           CATOM   1795  CD  GLU A 210       48.057  10.304  31.531  1.00 27.81           CATOM   1796  OE1 GLU A 210       48.111   9.919  30.343  1.00 17.29           OATOM   1797  OR2 GLU A 210       48.268   9.540  32.494  1.00 21.63           OATOM   1798  N   PHE A 211       49.504  14.712  32.084  1.00 14.02           NATOM   1799  CA  PHE A 211       50.887  15.159  32.353  1.00 17.48           CATOM   1800  C   PHE A 211       51.458  14.414  33.531  1.00 33.62           CATOM   1801  O   PHE A 211       50.716  14.031  34.443  1.00 27.96           OATOM   1802  CB  PHE A 211       50.933  16.677  32.644  1.00 17.78           CATOM   1803  CG  PHE A 211       50.303  17.490  31.541  1.00 21.49           CATOM   1804  CD1 PHE A 211       51.009  17.676  30.320  1.00 17.36           CATOM   1805  CD2 PHE A 211       48.933  17.844  31.618  1.00 15.09           CATOM   1806  CE1 PHE A 211       50.399  18.334  29.237  1.00 16.37           CATOM   1807  CE2 PHE A 211       48.288  18.491  30.533  1.00  9.61           CATOM   1808  CZ  PHE A 211       49.053  18.756  29.344  1.00 12.71           CATOM   1809  N   LEU A 212       52.761  14.161  33.495  1.00 23.76           NATOM   1810  CA  LEU A 212      53.405  13.448  34.603  1.00 21.24           CATOM   1811  C   LEU A 212      54.772  14.053  34.898  1.00 14.00           CATOM   1812  O   LEU A 212      55.519  14.398  33.985  1.00 13.99           OATOM   1813  CB  LEU A 212      53.548  11.954  34.294  1.00 21.52           CATOM   1814  CG  LEU A 212      54.033  11.039  35.406  1.00 21.09           CATOM   1815  CD1 LEU A 212      52.866  10.634  36.280  1.00 20.84           CATOM   1816  CD2 LEU A 212      54.768   9.829  34.832  1.00 13.18           CATOM   1817  N   HIS A 213      55.023  14.302  36.175  1.00  9.60           NATOM   1818  CA  HIS A 213      56.290  14.864  36.555  1.00 13.66           CATOM   1819  C   HIS A 213      57.380  13.828  36.293  1.00 20.37           CATOM   1820  O   MIS A 213      57.238  12.614  36.542  1.00 16.08           OATOM   1821  CB  HIS A 213      56.280  15.250  38.002  1.00 18.72           CATOM   1822  CG  HIS A 213      57.491  16.017  38.408  1.00 21.22           CATOM   1823  ND1 HIS A 213      58.703  15.406  38.656  1.00 24.29           NATOM   1824  CD2 HIS A 213      57.716  17.353  38.499  1.00 23.67           CATOM   1825  CE1 HIS A 213      59.615  16.331  38.917  1.00 19.13           CATOM   1826  NE2 HIS A 213      59.041  17.523  38.847  1.00 21.99           NATOM   1827  N   VAL A 214      58.459  14.295  35.698  1.00 21.07           NATOM   1828  CA  VAL A 214      59.532  13.383  35.361  1.00 19.23           CATOM   1829  C   VAL A 214      60.067  12.523  36.551  1.00 27.20           CATOM   1830  O   VAL A 214      60.604  11.444  36.359  1.00 22.23           OATOM   1831  CB  VAL A 214      60.625  14.125  34.566  1.00 11.84           CATOM   1832  CG1 VAL A 214      61.390  15.199  35.485  1.00  8.52           CATOM   1833  CG2 VAL A 214      61.560  13.097  33.902  1.00 12.39           CATOM   1834  N   ASP A 215      59.893  12.984  37.790  1.00 25.29           NATOM   1835  CA  ASP A 215      60.406  12.228  38.936  1.00 18.19           CATOM   1836  C   ASP A 215      59.530  11.023  39.230  1.00 13.85           CATOM   1837  O   ASP A 215      59.988   9.981  39.666  1.00 17.44           OATOM   1838  CB  ASP A 215      60.575  13.129  40.155  1.00 16.27           CATOM   1839  CG  ASP A 215      61.859  13.979  40.068  1.00 30.73           CATOM   1840  OD1 ASP A 215      62.782  13.614  39.308  1.00 23.02           OATOM   1841  OD2 ASP A 215      61.957  15.029  40.730  1.00 26.00           OATOM   1842  N   ASP A 216      58.276  11.136  38.863  1.00 20.08           NATOM   1843  CA  ASP A 216      57.378  10.017  39.016  1.00 18.78           CATOM   1844  C   ASP A 216      57.761   9.083  37.894  1.00 23.56           CATOM   1845  O   ASP A 216      57.715   7.880  38.026  1.00 20.79           OATOM   1846  CB  ASP A 216      55.912  10.457  38.821  1.00 17.18           CATOM   1847  CG  ASP A 216      55.193  10.757  40.162  1.00 38.03           CATOM   1848  OD1 ASP A 216      55.503  10.119  41.223  1.00 26.02           OATOM   1849  OD2 ASP A 216      54.249  11.587  40.124  1.00 25.41           OATOM   1850  N   MET A 217      58.092   9.653  36.755  1.00 18.11           NATOM   1851  CA  MET A 217      58.394   8.785  35.636  1.00 22.41           CATOM   1852  C   MET A 217      59.572   7.942  35.992  1.00 27.54           CATOM   1853  O   MET A 217      59.579   6.752  35.710  1.00 20.86           OATOM   1854  CB  MET A 217      58.637   9.592  34.345  1.00 21.24           CATOM   1855  CG  MET A 217      59.478   8.918  33.287  1.00 16.37           CATOM   1856  SD  MET A 217      58.962   7.412  32.473  1.00 30.51           SATOM   1857  CE  MET A 217      57.465   7.608  32.391  1.00 19.57           CATOM   1858  N   ALA A 218      60.561   8.562  36.623  1.00 19.09           NATOM   1859  CA  ALA A 218      61.774   7.841  37.002  1.00 13.65           CATOM   1860  C   ALA A 218      61.436   6.778  38.028  1.00 22.61           CATOM   1861  O   ALA A 218      61.934   5.670  37.967  1.00 19.36           OATOM   1862  CB  ALA A 218      62.809   8.780  37.579  1.00 12.23           CATOM   1863  N   ALA A 219      60.605   7.109  39.000  1.00 19.34           NATOM   1864  CA  ALA A 219      60.310   6.105  40.023  1.00 18.01           CATOM   1865  C   ALA A 219      59.630   4.901  39.413  1.00 23.57           CATOM   1866  O   ALA A 219      59.781   3.777  39.898  1.00 22.71           OATOM   1867  CB  ALA A 219      59.387   6.678  41.083  1.00 10.11           CATOM   1868  N   ALA A 220      58.753   5.174  38.454  1.00 18.99           NATOM   1869  CA  ALA A 220      57.905   4.158  37.855  1.00 14.12           CATOM   1870  C   ALA A 220      58.753   3.213  37.034  1.00 25.33           CATOM   1871  O   ALA A 220      58.584   2.006  37.114  1.00 20.63           OATOM   1872  CB  ALA A 220      56.796   4.798  37.023  1.00  8.53           CATOM   1873  N   SER A 221      59.770   3.772  36.379  1.00 23.92           NATOM   1874  CA  SER A 221      60.702   3.011  35.556  1.00 18.38           CATOM   1875  C   SER A 221      61.537   1.989  36.353  1.00 20.90           CATOM   1876  O   SER A 221      61.683   0.799  35.983  1.00 19.84           OATOM   1877  CB  SER A 221      61.604   3.985  34.804  1.00 10.67           CATOM   1878  OG  SER A 221      60.847   4.744  33.867  1.00 15.61           OATOM   1879  N   ILE A 222      62.083   2.476  37.463  1.00 18.12           NATOM   1880  CA  ILE A 222      62.866   1.644  38.381  1.00 21.56           CATOM   1881  C   ILE A 222      62.020   0.554  39.068  1.00 29.10           CATOM   1882  O   ILE A 222      62.504  -0.566  39.307  1.00 19.03           OATOM   1883  CB  ILE A 222      63.467   2.516  39.432  1.00 24.56           CATOM   1884  CG1 ILE A 222      64.465   3.473  38.765  1.00 32.13           CATOM   1885  CG2 ILE A 222      64.129   1.671  40.500  1.00 28.26           CATOM   1886  CD1 ILE A 222      64.973   4.585  39.649  1.00 15.61           CATOM   1887  N   HIS A 223      60.772   0.907  39.384  1.00 19.34           NATOM   1888  CA  HIS A 223      59.829  -0.031  39.996  1.00 20.46           CATOM   1889  C   HIS A 223      59.599  -1.097  38.964  1.00 24.82           CATOM   1890  O   HIS A 223      59.723  -2.283  39.270  1.00 24.66           OATOM   1891  CB  HIS A 223      58.465   0.637  40.359  1.00 19.53           CATOM   1892  CG  HIS A 223      57.373  -0.333  40.759  1.00 28.64           CATOM   1893  ND1 HIS A 223      57.021  -0.564  42.082  1.00 24.16           NATOM   1894  CD2 HIS A 223      56.497  -1.062  40.004  1.00 30.39           CATOM   1895  CE1 HIS A 223      55.983  -1.399  42.112  1.00 30.39           CATOM   1896  NE2 HIS A 223      55.652  -1.727  40.869  1.00 28.13           NATOM   1897  N   VAL A 224      59.354  -0.684  37.725  1.00 22.06           NATOM   1898  CA  VAL A 224      59.111  -1.657  36.652  1.00 19.15           CATOM   1899  C   VAL A 224      60.350  -2.490  36.333  1.00 25.89           CATOM   1900  O   VAL A 224       60.282  -3.709  36.250  1.00 22.37          OATOM   1901  CB  VAL A 224       58.559  -1.022  35.377  1.00 22.59          CATOM   1902  CG1 VAL A 224       58.512  -2.050  34.231  1.00 22.61          CATOM   1903  CG2 VAL A 224       57.161  -0.491  35.650  1.00 23.44          CATOM   1904  N   MET A 225       61.499  -1.838  36.255  1.00 27.83          NATOM   1905  CA  MET A 225       62.710  -2.577  36.004  1.00 23.69          CATOM   1906  C   MET A 225       62.896  -3.678  37.071  1.00 31.95          CATOM   1907  O   MET A 225       63.290  -4.805  36.785  1.00 24.33          OATOM   1908  CB  MET A 225       63.902  -1.604  36.056  1.00 21.34          CATOM   1909  CG  MET A 225       65.295  -2.296  35.999  1.00 17.83          CATOM   1910  SD  MET A 225       65.750  -2.958  34.306  1.00 23.33          SATOM   1911  CE  MET A 225       67.080  -1.896  33.785  1.00 16.46          CATOM   1912  N   GLU A 226       62.644  -3.319  38.316  1.00 19.54          NATOM   1913  CA  GLU A 226       62.988  -4.161  39.428  1.00 21.58          CATOM   1914  C   GLU A 226       61.999  -5.200  39.918  1.00 30.77          CATOM   1915  O   GLU A 226       62.308  -6.012  40.780  1.00 29.39          OATOM   1916  CB  GLU A 226       63.613  -3.323  40.547  1.00 20.47          CATOM   1917  CG  GLU A 226       64.937  -2.673  40.122  1.00 23.03          CATOM   1918  CD  GLU A 226       65.504  -1.809  41.208  1.00 32.62          CATOM   1919  OE1 GLU A 226       64.721  -1.455  42.122  1.00 26.12          OATOM   1920  OE2 GLU A 226       66.711  -1.479  41.152  1.00 17.67          OATOM   1921  N   LEU A 227       60.837  -5.248  39.295  1.00 34.11          NATOM   1922  CA  LEU A 227       59.883  -6.296  39.642  1.00 35.26          CATOM   1923  C   LEU A 227       60.537  -7.644  39.320  1.00 27.91          CATOM   1924  O   LEU A 227       61.291  -7.766  38.340  1.00 19.89          OATOM   1925  CB  LEU A 227       58.693  -6.236  38.678  1.00 36.48          CATOM   1926  CG  LEU A 227       57.381  -5.569  38.955  1.00 40.30          CATOM   1927  CD1 LEU A 227       57.697  -4.194  39.382  1.00 42.04          CATOM   1928  CD2 LEU A 227       56.610  -5.577  37.647  1.00 46.21          CATOM   1929  N   ALA A 228       60.026  -8.688  39.955  1.00 27.15          NATOM   1930  CA  ALA A 228       60.425 -10.051  39.616  1.00 25.26          CATOM   1931  C   ALA A 228       59.801 -10.435  38.279  1.00 27.93          CATOM   1932  O   ALA A 228       58.624 -10.093  37.934  1.00 31.26          OATOM   1933  CB  ALA A 228       60.003 -11.052  40.703  1.00 22.05          CATOM   1934  N   HIS A 229       60.624 -11.160  37.539  1.00 27.05          NATOM   1935  CA  HIS A 229       60.275 -11.605  36.222  1.00 24.42          CATOM   1936  C   HIS A 229       58.905 -12.260  36.184  1.00 21.74          CATOM   1937  O   HIS A 229       58.015 -11.851  35.398  1.00 22.22          OATOM   1938  CB  HIS A 229       61.351 -12.520  35.698  1.00 17.71          CATOM   1939  CG  HIS A 229       61.284 -12.701  34.220  1.00 27.24          CATOM   1940  ND1 HIS A 229       61.060 -11.650  33.350  1.00 34.38          NATOM   1941  CD2 HIS A 229       61.292 -13.821  33.465  1.00 31.45          CATOM   1942  CE1 HIS A 229       60.992 -12.113  32.115  1.00 30.50          CATOM   1943  NE2 HIS A 229       61.124 -13.427  32.159  1.00 35.23          NATOM   1944  N   GLU A 230       58.681 -13.161  37.140  1.00 20.24          NATOM   1945  CA  GLU A 230      57.425 -13.895  37.209  1.00 29.41           CATOM   1946  C   GLU A 230      56.181 -13.051  37.341  1.00 22.20           CATOM   1947  O   GLU A 230      55.159 -13.359  36.679  1.00 17.78           OATOM   1948  CB  GLU A 230      57.464 -14.997  38.274  1.00 38.51           CATOM   1949  CG  GLU A 230      58.085 -14.582  39.567  1.00 63.09           CATOM   1950  CD  GLU A 230      57.036 -14.473  40.661  1.00100.00           CATOM   1951  OE1 GLU A 230      55.859 -14.872  40.400  1.00100.00           OATOM   1952  OE2 GLU A 230      57.409 -14.003  41.768  1.00 81.48           OATOM   1953  N   VAL A 231      56.272 -12.004  38.182  1.00 16.53           NATOM   1954  CA  VAL A 231      55.202 -11.029  38.356  1.00 20.23           CATOM   1955  C   VAL A 231      55.009 -10.164  37.102  1.00 24.45           CATOM   1956  O   VAL A 231      53.864  -9.834  36.705  1.00 21.00           OATOM   1957  CB  VAL A 231      55.541 -10.057  39.426  1.00 28.61           CATOM   1958  CG1 VAL A 231      54.362  -9.098  39.610  1.00 29.78           CATOM   1959  CG2 VAL A 231      55.881 -10.757  40.677  1.00 28.96           CATOM   1960  N   TRP A 232      56.133  -9.798  36.486  1.00 17.17           NATOM   1961  CA  TRP A 232      56.052  -9.044  35.262  1.00 21.52           CATOM   1962  C   TRP A 232      55.388  -9.844  34.156  1.00 20.53           CATOM   1963  O   TRP A 232      54.588  -9.306  33.380  1.00 24.31           OATOM   1964  CB  TRP A 232      57.438  -8.644  34.801  1.00 29.88           CATOM   1965  CG  TRP A 232      57.430  -7.843  33.500  1.00 27.65           CATOM   1966  CD1 TRP A 232      57.184  -6.464  33.356  1.00 25.42           CATOM   1967  CD2 TRP A 232      57.714  -8.336  32.169  1.00 27.75           CATOM   1968  NE1 TRP A 232      57.325  -6.095  32.033  1.00 22.53           NATOM   1969  CE2 TRP A 232      57.655  -7.203  31.279  1.00 25.11           CATOM   1970  CE3 TRP A 232      58.037  -9.603  31.640  1.00 22.72           CATOM   1971  CZ2 TRP A 232      57.917  -7.316  29.879  1.00 17.23           CATOM   1972  CZ3 TRP A 232      58.238  -9.720  30.223  1.00 25.97           CATOM   1973  CH2 TRP A 232      58.154  -8.581  29.368  1.00 22.07           CATOM   1974  N   LEU A 233      55.749 -11.121  34.018  1.00 23.80           NATOM   1975  CA  LEU A 233      55.141 -11.949  32.937  1.00 24.78           CATOM   1976  C   LEU A 233      53.652 -12.118  33.122  1.00 24.51           CATOM   1977  O   LEU A 233      52.865 -12.075  32.163  1.00 28.50           OATOM   1978  CB  LEU A 233      55.765 -13.348  32.820  1.00 26.20           CATOM   1979  CG  LEU A 233      57.250 -13.505  32.503  1.00 19.39           CATOM   1980  CD1 LEU A 233      57.745 -14.850  33.023  1.00 19.90           CATOM   1981  CD2 LEU A 233      57.561 -13.287  31.017  1.00 16.01           CATOM   1982  N   GLU A 234      53.298 -12.343  34.372  1.00 25.45           NATOM   1983  CA  GLU A 234      51.929 -12.523  34.822  1.00 30.04           CATOM   1984  C   GLU A 234      51.128 -11.319  34.367  1.00 35.69           CATOM   1985  O   GLU A 234      49.926 -11.390  34.052  1.00 28.25           OATOM   1986  CB  GLU A 234      52.007 -12.468  36.344  1.00 37.30           CATOM   1987  CG  GLU A 234      50.908 -13.133  37.118  1.00 45.39           CATOM   1988  CD  GLU A 234      51.112 -12.881  38.601  1.00100.00           CATOM   1989  OE1 GLU A 234      52.240 -13.137  39.104  1.00 99.09           OATOM   1990  OE2 GLU A 234      50.211 -12.257  39.211  1.00100.00           OATOM   1991  N   ASN A 235      51.802 -10.184  34.364  1.00 25.04           NATOM   1992  CA  ASN A 235      51.109  -8.986  33.992  1.00 26.17           CATOM   1993  C   ASN A 235      51.280  -8.494  32.571  1.00 30.46           CATOM   1994  O   ASN A 235      50.824  -7.393  32.259  1.00 22.90           OATOM   1995  CB  ASN A 235      51.427  -7.895  34.981  1.00 29.23           CATOM   1996  CG  ASN A 235      50.878  -8.197  36.342  1.00 39.27           CATOM   1997  OD1 ASN A 235      49.722  -7.882  36.628  1.00 29.06           OATOM   1998  ND2 ASN A 235      51.653  -8.934  37.140  1.00 40.22           NATOM   1999  N   THR A 236      51.935  -9.268  31.708  1.00 20.97           NATOM   2000  CA  THR A 236      52.108  -8.795  30.344  1.00 22.30           CATOM   2001  C   THR A 236      51.867  -9.943  29.419  1.00 29.74           CATOM   2002  O   THR A 236      51.551 -11.033  29.895  1.00 21.23           OATOM   2003  CB  THR A 236      53.545  -8.306  30.161  1.00 22.73           CATOM   2004  OG1 THR A 236      54.422  -9.325  30.636  1.00 21.23           OATOM   2005  CG2 THR A 236      53.801  -7.048  31.041  1.00 19.69           CATOM   2006  N   GLN A 237      52.003  -9.699  28.109  1.00 22.23           NATOM   2007  CA  GLN A 237      52.097 -10.783  27.122  1.00 16.69           CATOM   2008  C   GLN A 237      53.335 -10.507  26.331  1.00 21.02           CATOM   2009  O   GLN A 237      53.729  -9.362  26.204  1.00 22.19           OATOM   2010  CB  GLN A 237      50.913 -10.999  26.189  1.00  8.23           CATOM   2011  CG  GLN A 237      49.639 -11.096  26.904  1.00 21.04           CATOM   2012  CD  GLN A 237      48.907  -9.862  26.606  1.00 62.07           CATOM   2013  OE1 GLN A 237      48.437  -9.712  25.460  1.00 59.32           OATOM   2014  NE2 GLN A 237      49.220  -8.847  27.388  1.00 37.82           NATOM   2015  N   PRO A 238      54.002 -11.579  25.917  1.00 28.76           NATOM   2016  CA  PRO A 238      55.275 -11.438  25.246  1.00 30.28           CATOM   2017  C   PRO A 238      55.194 -10.643  23.958  1.00 29.08           CATOM   2018  O   PRO A 238      56.181 -10.029  23.600  1.00 19.95           OATOM   2019  CB  PRO A 238      55.733 -12.879  25.011  1.00 22.54           CATOM   2020  CG  PRO A 238      54.898 -13.710  25.886  1.00 16.92           CATOM   2021  CD  PRO A 238      53.626 -12.998  26.068  1.00 11.75           CATOM   2022  N   MET A 239      54.041 -10.635  23.286  1.00 17.26           NATOM   2023  CA  MET A 239      53.924  -9.807  22.104  1.00 17.85           CATOM   2024  C   MET A 239      53.109  -8.509  22.362  1.00 18.63           CATOM   2025  O   MET A 239      52.792  -7.741  21.419  1.00 16.82           OATOM   2026  CB  MET A 239      53.460 -10.588  20.881  1.00 15.22           CATOM   2027  CG  MET A 239      54.536 -11.534  20.261  1.00 12.90           CATOM   2028  SD  MET A 239      53.994 -12.534  18.808  1.00 17.49           SATOM   2029  CE  MET A 239      54.350 -11.357  17.422  1.00 13.12           CATOM   2030  N   LEU A 240      52.847  -8.252  23.646  1.00 18.55           NATOM   2031  CA  LEU A 240      52.159  -7.037  24.131  1.00 16.68           CATOM   2032  C   LEU A 240      52.774  -6.733  25.493  1.00 11.82           CATOM   2033  O   LEU A 240      52.124  -6.803  26.549  1.00 13.84           OATOM   2034  CB  LEU A 240      50.645  -7.249  24.240  1.00 16.91           CATOM   2035  CG  LEU A 240      49.646  -6.120  23.852  1.00 22.29           CATOM   2036  CD1 LEU A 240      48.968  -5.488  25.033  1.00 25.51           CATOM   2037  CD2 LEU A 240      50.070  -5.059  22.815  1.00 28.07           CATOM   2038  N   SER A 241      54.076  -6.467  25.456  1.00 13.09           NATOM   2039  CA  SER A 241      54.842  -6.315  26.682  1.00 24.20           CATOM   2040  C   SER A 241      54.947  -4.938  27.377  1.00 30 52           CATOM   2041  O   SER A 241      55.363  -4.854  28.547  1.00 17.02           OATOM   2042  CB  SER A 241      56.247  -6.900  26.495  1.00 14.04           CATOM   2043  OG  SER A 241      57.062  -6.144  25.598  1.00 13.95           OATOM   2044  N   HIS A 242      54.661  -3.861  26.659  1.00 17.87           NATOM   2045  CA  HIS A 242      54.894  -2.548  27.221  1.00 13.55           CATOM   2046  C   HIS A 242      53.990  -2.254  28.373  1.00 13.70           CATOM   2047  O   HIS A 242      52.974  -2.885  28.539  1.00 13.29           OATOM   2048  CB  HIS A 242      54.826  -1.430  26.130  1.00 16.05           CATOM   2049  CG  HIS A 242      53.595  -1.504  25.272  1.00 18.88           CATOM   2050  ND1 HIS A 242      52.591  -0.553  25.326  1.00 23.24           NATOM   2051  CD2 HIS A 242      53.165  -2.461  24.413  1.00 13.19           CATOM   2052  CE1 HIS A 242      51.629  -0.887  24.483  1.00 17.44           CATOM   2053  NE2 HIS A 242      51.962  -2.031  23.901  1.00 19.54           NATOM   2054  N   ILE A 243      54.310  -1.203  29.095  1.00 15.84           NATOM   2055  CA  ILE A 243      53.492  -0.809  30.192  1.00 19.10           CATOM   2056  C   ILE A 243      53.336   0.714  30.191  1.00 23.23           CATOM   2057  O   ILE A 243      54.312   1.406  30.385  1.00 12.10           OATOM   2058  CB  ILE A 243      54.166  -1.273  31.482  1.00 24.62           CATOM   2059  CG1 ILE A 243      54.014  -2.783  31.576  1.00 25.60           CATOM   2060  CG2 ILE A 243      53.497  -0.665  32.735  1.00 17.37           CATOM   2061  CD1 ILE A 243      54.725  -3.365  32.714  1.00 14.82           CATOM   2062  N   ASN A 244      52.112   1.217 .30.013  1.00 16.43           NATOM   2063  CA  ASN A 244      51.824   2.689  30.038  1.00 18.99           CATOM   2064  C   ASN A 244      52.252   3.292  31.348  1.00 18.83           CATOM   2065  O   ASN A 244      51.965   2.727  32.405  1.00 19.58           OATOM   2066  CB  ASN A 244      50.304   2.987  29.910  1.00 15.67           CATOM   2067  CG  ASN A 244      49.768   2.702  28.517  1.00 14.57           CATOM   2068  OD1 ASN A 244      50.546   2.583  27.580  1.00 13.64           OATOM   2069  ND2 ASN A 244      48.443   2.491  28.393  1.00 10.16           NATOM   2070  N   VAL A 245      52.800   4.499  31.326  1.00 13.50           NATOM   2071  CA  VAL A 245      53.159   5.134  32.602  1.00 13.49           CATOM   2072  C   VAL A 245      52.528   6.566  32.644  1.00 16.25           CATOM   2073  O   VAL A 245      52.786   7.405  31.770  1.00 15.20           OATOM   2074  CB  VAL A 245      54.754   5.163  32.810  1.00 21.07           CATOM   2075  CG1 VAL A 245      55.154   6.085  33.937  1.00 15.08           CATOM   2076  CG2 VAL A 245      55.280   3.817  33.143  1.00 15.82           CATOM   2077  N   GLY A 246      51.696   6.843  33.649  1.00 14.03           NATOM   2078  CA  GLY A 246      51.027   8.136  33.707  1.00 16.87           CATOM   2079  C   GLY A 246      50.146   8.203  34.939  1.00 26.95           CATOM   2080  O   GLY A 246      50.323   7.401  35.850  1.00 23.04           OATOM   2081  N   THR A 247      49.207   9.161  34.963  1.00 21.44           NATOM   2082  CA  THR A 247      48.232   9.276  36.063  1.00 21.39           CATOM   2083  C   THR A 247      46.868   8.677  35.673  1.00 24.08           CATOM   2084  O   THR A 247      46.069   8.306  36.508  1.00 21 03           OATOM   2085  CB  THR A 247      47.988  10.730  36.404  1.00 22.24           CATOM   2086  OG1 THR A 247      47.409  11.389  35.265  1.00 18.62           OATOM   2087  CG2 THR A 247      49.275  11.378  36.724  1.00 18.99           CATOM   2088  N   GLY A 248      46.583   8.651  34.384  1.00 24.95           NATOM   2089  CA  GLY A 248      45.319   8.143  33.924  1.00 22.61           CATOM   2090  C   GLY A 248      44.223   9.160  34.226  1.00 21.42           CATOM   2091  O   GLY A 248      43.059   8.866  34.137  1.00 25.70           OATOM   2092  N   VAL A 249      44.615  10.386  34.521  1.00 30.72           NATOM   2093  CA  VAL A 249      43.673  11.464  34.827  1.00 26.09           CATOM   2094  C   VAL A 249      43.747  12.596  33.786  1.00 32.70           CATOM   2095  O   VAL A 249      44.853  13.006  33.387  1.00 26.92           OATOM   2096  CB  VAL A 249      44.020  12.085  36.214  1.00 38.59           CATOM   2097  CG1 VAL A 249      43.225  13.324  36.470  1.00 36.11           CATOM   2098  CG2 VAL A 249      43.782  11.083  37.306  1.00 41.30           CATOM   2099  N   ASP A 250      42.581  13.125  33.397  1.00 27.95           NATOM   2100  CA  ASP A 250      42.488  14.232  32.439  1.00 20.64           CATOM   2101  C   ASP A 250      42.611  15.581  33.155  1.00 27.63           CATOM   2102  O   ASP A 250      42.188  15.783  34.308  1.00 26.23           OATOM   2103  CB  ASP A 250      41.075  14.302  31.827  1.00 23.89           CATOM   2104  CG  ASP A 250      40.768  13.180  30.850  1.00 39.52           CATOM   2105  OD1 ASP A 250      41.283  13.184  29.688  1.00 39.96           OATOM   2106  OD2 ASP A 250      39.767  12.501  31.153  1.00 45.34           OATOM   2107  N   CYS A 251      43.029  16.566  32.388  1.00 20.12           NATOM   2108  CA  CYS A 251      42.962  17.906  32.851  1.00 27.20           CATOM   2109  C   CYS A 251      42.918  18.779  31.577  1.00 26.47           CATOM   2110  O   CYS A 251      43.699  18.560  30.633  1.00 19.45           OATOM   2111  CB  CYS A 251      44.148  18.157  33.778  1.00 34.86           CATOM   2112  SG  CYS A 251      45.129  19.619  33.453  1.00 29.47           SATOM   2113  N   THR A 252      41.932  19.673  31.494  1.00 14.85           NATOM   2114  CA  THR A 252      41.834  20.588  30.335  1.00 21.21           CATOM   2115  C   THR A 252      42.999  21.592  30.236  1.00 20.53           CATOM   2116  O   THR A 252      43.657  21.926  31.249  1.00 15.24           OATOM   2117  CB  THR A 252      40.506  21.407  30.329  1.00 32.08           CATOM   2118  OG1 THR A 252      40.460  22.304  31.447  1.00 19.26           OATOM   2119  CG2 THR A 252      39.309  20.495  30.372  1.00 13.91           CATOM   2120  N   ILE A 253      43.228  22.095  29.024  1.00 14.81           NATOM   2121  CA  ILE A 253      44.264  23.118  28.812  1.00 16.90           CATOM   2122  C   ILE A 253      43.934  24.383  29.627  1.00 23.41           CATOM   2123  O   ILE A 253      44.834  25.012  30.247  1.00 15.27           OATOM   2124  CB  ILE A 253      44.404  23.452  27.302  1.00 24.05           CATOM   2125  CG1 ILE A 253      44.862  22.200  26.561  1.00 27.33           CATOM   2126  CG2 ILE A 253      45.473  24.479  27.077  1.00  9.22           CATOM   2127  CD1 ILE A 253      45.662  21.276  27.452  1.00 49.56           CATOM   2128  N   ARG A 254      42.637  24.709  29.707  1.00 19.56           NATOM   2129  CA  ARG A 254      42.228  25.865  30.522  1.00 19.41           CATOM   2130  C   ARG A 254      42.712  25.713  31.970  1.00 18.10           CATOM   2131  O   ARG A 254      43.311  26.616  32.515  1.00 13.89           OATOM   2132  CB  ARG A 254      40.704  26.101  30.480  1.00 15.98           CATOM   2133  CG  ARG A 254      40.282  27.378  31.255  1.00  9.96           CATOM   2134  CD  ARG A 254      38.809  27.702  31.218  1.00 24.79           CATOM   2135  NE  ARG A 254      38.498  28.414  29.997  1.00 29.42           NATOM   2136  CZ  ARG A 254      38.693  29.723  29.794  1.00 59.85           CATOM   2137  NH1 ARG A 254      39.194  30.527  30.732  1.00 42.58           NATOM   2138  NH2 ARG A 254      38.377  30.245  28.620  1.00 18.44           NATOM   2139  N   ASP A 255      42.406  24.564  32.586  1.00 20.22           NATOM   2140  CA  ASP A 255      42.795  24.205  33.974  1.00 16.48           CATOM   2141  C   ASP A 255      44.321  24.372  34.069  1.00 22.43           CATOM   2142  O   ASP A 255      44.868  24.897  35.060  1.00 18.53           OATOM   2143  CB  ASP A 255      42.478  22.686  34.157  1.00 19.17           CATOM   2144  CG  ASP A 255      42.144  22.246  35.610  1.00 47.08           CATOM   2145  OD1 ASP A 255      41.780  23.090  36.429  1.00 49.66           OATOM   2146  OD2 ASP A 255      42.020  21.016  35.880  1.00 48.12           OATOM   2147  N   LEU A 256      45.014  23.809  33.078  1.00 15.98           NATOM   2148  CA  LEU A 256      46.465  23.844  33.069  1.00 21.76           CATOM   2149  C   LEU A 256      47.020  25.275  33.076  1.00 16.79           CATOM   2150  O   LEU A 256      47.825  25.697  33.946  1.00 15.24           OATOM   2151  CB  LEU A 256      46.967  23.056  31.859  1.00 23.33           CATOM   2152  CG  LEU A 256      48.491  23.100  31.765  1.00 26.80           CATOM   2153  CD1 LEU A 256      49.171  22.334  32.984  1.00 17.13           CATOM   2154  CD2 LEU A 256      49.040  22.724  30.346  1.00 15.42           CATOM   2155  N   ALA A 257      46.520  26.048  32.140  1.00 13.77           NATOM   2156  CA  ALA A 257      46.938  27.436  32.025  1.00 12.70           CATOM   2157  C   ALA A 257      46.656  28.237  33.267  1.00 10.73           CATOM   2158  O   ALA A 257      47.451  29.073  33.672  1.00 20.33           OATOM   2159  CB  ALA A 257      46.208  28.073  30.834  1.00 13.34           CATOM   2160  N   GLN A 258      45.470  28.080  33.835  1.00 12.40           NATOM   2161  CA  GLN A 258      45.102  28.911  34.981  1.00  8.39           CATOM   2162  C   GLN A 258      45.879  28.480  36.166  1.00 13.48           CATOM   2163  O   GLN A 258      46.178  29.281  37.029  1.00 22.96           OATOM   2164  CB  GLN A 258      43.614  28.761  35.305  1.00 16.12           CATOM   2165  CG  GLN A 258      42.674  29.096  34.130  1.00 30.19           CATOM   2166  CD  GLN A 258      42.574  30.585  33.781  1.00 37.29           CATOM   2167  OE1 GLN A 258      42.911  31.471  34.610  1.00 21.24           OATOM   2168  NE2 GLN A 258      42.021  30.876  32.572  1.00 15.94           NATOM   2169  N   THR A 259      46.179  27.182  36.232  1.00 16.21           NATOM   2170  CA  THR A 259      46.982  26.678  37.336  1.00 16.85           CATOM   2171  C   THR A 259      48.410  27.186  37.233  1.00 20.56           CATOM   2172  O   THR A 259      49.002  27.621  38.214  1.00 21.44           OATOM   2173  CB  THR A 259      47.066  25.192  37.361  1.00 27.56           CATOM   2174  OG1 THR A 259      45.752  24.620  37.509  1.00 20.92           OATOM   2175  CG2 THR A 259      47.936  24.796  38.545  1.00 12.85           CATOM   2176  N   ILE A 260      48.952  27.170  36.028  1.00 19.96           NATOM   2177  CA  ILE A 260      50.292  27.704  35.839  1.00 23.01           CATOM   2178  C   ILE A 260      50.313  29.180  36.225  1.00 31.73           CATOM   2179  O   ILE A 260      51.211  29.627  36.993  1.00 25.90           OATOM   2180  CB  ILE A 260      50.835  27.456  34.390  1.00 22.46           CATOM   2181  CG1 ILE A 260      51.153  25.940  34.232  1.00 24.12           CATOM   2182  CG2 ILE A 260      52.099  28.361  34.106  1.00 13.47           CATOM   2183  CD1 ILE A 260      51.501  25.443  32.810  1.00 12.58           CATOM   2184  N   ALA A 261      49.280  29.910  35.764  1.00 15.35           NATOM   2185  CA  ALA A 261      49.177  31.355  36.048  1.00 16.00           CATOM   2186  C   ALA A 261      49.316  31.604  37.550  1.00 20.58           CATOM   2187  O   ALA A 261      50.104  32.443  37.987  1.00 16.09           OATOM   2188  CB  ALA A 261      47.832  31.958  35.487  1.00 13.65           CATOM   2189  N   LYS A 262      48.551  30.843  38.323  1.00 11.50           NATOM   2190  CA  LYS A 262      48.578  30.905  39.770  1.00 10.13           CATOM   2191  C   LYS A 262      49.968  30.460  40.296  1.00 28.08           CATOM   2192  O   LYS A 262      50.503  31.084  41.205  1.00 29.37           OATOM   2193  CB  LYS A 262      47.453  30.032  40.335  1.00 12.50           CATOM   2194  CG  LYS A 262      47.332  29.962  41.888  1.00 16.51           CATOM   2195  CD  LYS A 262      46.092  29.092  42.371  1.00 46.61           CATOM   2196  CE  LYS A 262      46.344  27.555  42.661  1.00 99.70           CATOM   2197  NZ  LYS A 262      45.157  26.703  43.200  1.00 36.59           NATOM   2198  N   VAL A 263      50.589  29.443  39.705  1.00 17.44           NATOM   2199  CA  VAL A 263      51.915  29.039  40.171  1.00 18.72           CATOM   2200  C   VAL A 263      52.997  30.170  39.997  1.00 32.12           CATOM   2201  O   VAL A 263      53.871  30.412  40.834  1.00 21.18           OATOM   2202  CB  VAL A 263      52.389  27.709  39.476  1.00 16.35           CATOM   2203  CG1 VAL A 263      53.920  27.518  39.647  1.00 11.83           CATOM   2204  CG2 VAL A 263      51.646  26.522  40.093  1.00 14.99           CATOM   2205  N   VAL A 264      52.913  30.899  38.909  1.00 21.75           NATOM   2206  CA  VAL A 264      53.917  31.877  38.653  1.00 19.81           CATOM   2207  C   VAL A 264      53.719  33.208  39.377  1.00 35.79           CATOM   2208  O   VAL A 264      54.632  34.032  39.482  1.00 28.99           OATOM   2209  CB  VAL A 264      54.059  32.014  37.175  1.00 24.27           CATOM   2210  CG1 VAL A 264      54.728  33.269  36.822  1.00 33.58           CATOM   2211  CG2 VAL A 264      54.840  30.808  36.674  1.00 23.01           CATOM   2212  N   GLY A 265      52.550  33.378  39.969  1.00 25.30           NATOM   2213  CA  GLY A 265      52.241  34.620  40.636  1.00 24.14           CATOM   2214  C   GLY A 265      51.730  35.694  39.632  1.00 35.03           CATOM   2215  O   GLY A 265      51.773  36.911  39.962  1.00 33.71           OATOM   2216  N   TYR A 266      51.294  35.257  38.428  1.00 26.25           NATOM   2217  CA  TYR A 266      50.698  36.151  37.373  1.00 26.55           CATOM   2218  C   TYR A 266      49.364  36.745  37.818  1.00 31.01           CATOM   2219  O   TYR A 266      48.532  36.067  38.455  1.00 27.99           OATOM   2220  CB  TYR A 266      50.501  35.463  36.008  1.00 24.31           CATOM   2221  CG  TYR A 266      49.994  36.381  34.884  1.00 28.64           CATOM   2222  CD1 TYR A 266      50.670  37.582  34.542  1.00 35.05           CATOM   2223  CD2 TYR A 266      48.860  36.038  34.118  1.00 22.60           CATOM   2224  CE1 TYR A 266      50.212  38.434  33.472  1.00 20.73           CATOM   2225  CE2 TYR A 266      48.428  36.859  33.012  1.00 20.91           CATOM   2226  CZ  TYR A 266      49.088  38.062  32.735  1.00 23.85           CATOM   2227  OH  TYR A 266      48.622  38.851  31.710  1.00 33.40           OATOM   2228  N   LYS A 267      49.217  38.043  37.604  1.00 25.72           NATOM   2229  CA  LYS A 267      47.988  38.697  38.009  1.00 30.77           CATOM   2230  C   LYS A 267      47.217  39.280  36.798  1.00 28.85           CATOM   2231  O   LYS A 267      46.179  39.894  36.949  1.00 31.17           OATOM   2232  CB  LYS A 267      48.279  39.741  39.092  1.00 27.13           CATOM   2233  CG  LYS A 267      48.728  39.128  40.403  1.00 23.18           CATOM   2234  CD  LYS A 267      48.420  40.096  41.562  1.00 30.98           CATOM   2235  CE  LYS A 267      47.933  39.358  42.820  1.00 48.52           CATOM   2236  NZ  LYS A 267      47.005  38.208  42.505  1.00100.00           NATOM   2237  N   GLY A 268      47.716  39.054  35.594  1.00 22.67           NATOM   2238  CA  GLY A 268      47.019  39.518  34.394  1.00 21.38           CATOM   2239  C   GLY A 268      45.856  38.568  34.085  1.00 31.03           CATOM   2240  O   GLY A 268      45.455  37.728  34.911  1.00 19.71           OATOM   2241  N   ARG A 269      45.387  38.645  32.849  1.00 30.40           NATOM   2242  CA  ARG A 269      44.263  37.846  32.399  1.00 26.47           CATOM   2243  C   ARG A 269      44.680  36.705  31.489  1.00 22.35           CATOM   2244  O   ARG A 269      45.378  36.926  30.524  1.00 22.75           OATOM   2245  CB  ARG A 269      43.297  38.753  31.626  1.00 22.65           CATOM   2246  CG  ARG A 269      42.201  39.390  32.463  1.00 24.21           CATOM   2247  CD  ARG A 269      40.936  39.465  31.568  1.00 83.45           CATOM   2248  NE  ARG A 269      40.113  40.676  31.762  1.00100.00           NATOM   2249  CZ  ARG A 269      38.808  40.751  31.431  1.00100.00           CATOM   2250  NH1 ARG A 269      38.201  39.691  30.921  1.00 99.93           NATOM   2251  NH2 ARG A 269      38.094  41.865  31.663  1.00100.00           NATOM   2252  N   VAL A 270      44.195  35.494  31.758  1.00 19.87           NATOM   2253  CA  VAL A 270      44.468  34.389  30.856  1.00 24.82           CATOM   2254  C   VAL A 270      43.319  34.456  29.824  1.00 22.51           CATOM   2255  O   VAL A 270      42.145  34.501  30.181  1.00 25.79           OATOM   2256  CB  VAL A 270      44.436  32.979  31.571  1.00 24.03           CATOM   2257  CG1 VAL A 270      44.576  31.861  30.533  1.00 20.72           CATOM   2258  CG2 VAL A 270      45.506  32.849  32.639  1.00 11.27           CATOM   2259  N   VAL A 271      43.660  34.409  28.554  1.0025.18            NATOM   2260  CA  VAL A 271      42.666  34.492  27.487  1.00 28.32           CATOM   2261  C   VAL A 271      42.819  33.370  26.442  1.00 24.89           CATOM   2262  O   VAL A 271      43.923  33.115  25.980  1.00 21.98           OATOM   2263  CB  VAL A 271      42.901  35.813  26.736  1.00 29.25           CATOM   2264  CG1 VAL A 271      42.256  35.773  25.370  1.00 31.91           CATOM   2265  CG2 VAL A 271      42.421  36.989  27.565  1.00 18.72           CATOM   2266  N   PHE A 272      41.716  32.758  26.019  1.00 26.14           NATOM   2267  CA  PHE A 272      41.752  31.747  24.963  1.00 24.34           CATOM   2268  C   PHE A 272      41.236  32.266  23.623  1.00 28.95           CATOM   2269  O   PHE A 272      40.155  32.826  23.582  1.00 22.01           OATOM   2270  CB  PHE A 272      40.960  30.506  25.391  1.00 20.97           CATOM   2271  CG  PHE A 272      41.764  29.570  26.243  1.00 21.77           CATOM   2272  CD1 PHE A 272      41.940  29.842  27.610  1.00 14.60           CATOM   2273  CD2 PHE A 272      42.504  28.550  25.656  1.00 22.19           CATOM   2274  CE1 PHE A 272      42.763  29.041  28.434  1.00 17.89           CATOM   2275  CE2 PHE A 272      43.336  27.726  26.454  1.00 27.64           CATOM   2276  CZ  PHE A 272      43.478  27.979  27.851  1.00 25.14           CATOM   2277  N   ASP A 273      42.012  32.114  22.542  1.00 29.45           NATOM   2278  CA  ASP A 273      41.557  32.536  21.214  1.00 22.33           CATOM   2279  C   ASP A 273      40.896  31.365  20.493  1.00 25.67           CATOM   2280  O   ASP A 273      41.539  30.570  19.793  1.00 17.81           OATOM   2281  CB  ASP A 273      42.672  33.114  20.343  1.00 21.45           CATOM   2282  CG  ASP A 273      42.131  33.626  18.990  1.00 26.89           CATOM   2283  OD1 ASP A 273      40.975  33.249  18.598  1.00 27.76           OATOM   2284  OD2 ASP A 273      42.838  34.421  18.327  1.00 30.06           OATOM   2285  N   ALA A 274      39.589  31.284  20.649  1.00 15.59           NATOM   2286  CA  ALA A 274      38.932  30.128  20.128  1.00 23.75           CATOM   2287  C   ALA A 274      38.853  30.168  18.653  1.00 32.30           CATOM   2288  O   ALA A 274      38.284  29.256  18.029  1.00 29.37           OATOM   2289  CB  ALA A 274      37.567  29.905  20.777  1.00 18.87           CATOM   2290  N   SER A 275      39.372  31.243  18.081  1.00 21.10           NATOM   2291  CA  SER A 275      39.343  31.288  16.631  1.00 26.90           CATOM   2292  C   SER A 275      40.390  30.300  16.116  1.00 43.37           CATOM   2293  O   SER A 275      40.421  29.949  14.927  1.00 46.32           OATOM   2294  CB  SER A 275      39.547  32.683  16.074  1.00 15.19           CATOM   2295  OG  SER A 275      40.904  33.070  16.078  1.00 28.71           OATOm   2296  N   LYS A 276      41.192  29.780  17.037  1.00 22.98           NATOM   2297  CA  LYS A 276      42.178  28.791  16.638  1.00 23.28           CATOM   2298  C   LYS A 276      41.645  27.405  16.976  1.00 29.73           CATOM   2299  O   LYS A 276      40.992  27.206  18.010  1.00 25.10           OATOM   2300  CB  LYS A 276      43.544  29.051  17.275  1.00 19.19           CATOM   2301  CG  LYS A 276      43.957  30.496  17.218  1.00 32.11           CATOM   2302  CD  LYS A 276      44.062  30.852  15.798  1.00 22.43           CATOM   2303  CE  LYS A 276      44.930  32.067  15.570  1.00 23.18           CATOM   2304  NZ  LYS A 276      45.454  32.117  14.152  1.00 29.42           NATOM   2305  N   PRO A 277      41.892  26.476  16.055  1.00 36.04           NATOM   2306  CA  PRO A 277      41.446  25.087  16.170  1.00 35.93           CATOM   2307  C   PRO A 277      42.022  24.332  17.363  1.00 29.30           CATOM   2308  O   PRO A 277      43.103  24.650  17.885  1.00 30.54           OATOM   2309  CB  PRO A 277      41.975  24.453  14.878  1.00 39.65           CATOM   23.0  CG  PRO A 277      43.249  25.261  14.566  1.00 42.90           CATOM   2311  CD  PRO A 277      42.787  26.670  14.892  1.00 37.84           CATOM   2312  N   ASP A 278      41.273  23.339  17.809  1.00 22.35           NATOM   2313  CA  ASP A 278      41.745  22.501  18.903  1.00 22.16           CATOM   2314  C   ASP A 278      42.184  21.189  18.272  1.00 19.66           CATOM   2315  O   ASP A 278      41.905  20.917  17.117  1.00 23.49           OATOM   2316  CB  ASP A 278      40.636  22.241  19.971  1.00 15.09           CATOM   2317  CG  ASP A 278      40.216  23.503  20.702  1.00 22.86           CATOM   2318  OD1 ASP A 278      41.113  24.254  21.096  1.00 25.18           OATOM   2319  OD2 ASP A 278      38.999  23.787  20.812  1.00 39.55           OATOM   2320  N   GLY A 279      42.846  20.355  19.044  1.00 30.65           NATOM   2321  CA  GLY A 279      43.229  19.034  18.546  1.00 33.78           CATOM   2322  C   GLY A 279      42.115  18.099  18.944  1.00 38.10           CATOM   2323  O   GLY A 279      40.963  18.517  19.068  1.00 47.52           OATOM   2324  N   THR A 280      42.419  16.839  19.177  1.00 29.44           NATOM   2325  CA  THR A 280      41.328  15.990  19.587  1.00 26.68           CATOM   2326  C   THR A 280      40.889  16.439  20.972  1.00 23.52           CATOM   2327  O   THR A 280      41.670  17.067  21.713  1.00 23.62           OATOM   2328  CB  THR A 280      41.695  14.492  19.540  1.00 40.78           CATOM   2329  OG1 THR A 280      42.889  14.272  20.296  1.00 25.56           OATOM   2330  CG2 THR A 280      41.893  14.054  18.095  1.00 37.71           CATOM   2331  N   PRO A 281      39.672  16.063  21.346  1.00 25.54           NATOM   2332  CA  PRO A 281      39.129  16.454  22.628  1.00 25.72           CATOM   2333  C   PRO A 281      39.776  15.778  23.800  1.00 26.02           CATOM   2334  O   PRO A 281      39.752  16.314  24.915  1.00 22.68           OATOM   2335  CB  PRO A 281      37.650  15.990  22.559  1.00 28.89           CATOM   2336  CG  PRO A 281      37.417  15.540  21.201  1.00 29.39           CATOM   2337  CD  PRO A 281      38.761  15.138  20.646  1.00 26.82           CATOM   2338  N   ARG A 282      40.281  14.567  23.587  1.00 27.88           NATOM   2339  CA  ARG A 282      40.806  13.817  24.720  1.00 34.08           CATOM   2340  C   ARG A 282      41.977  12.918  24.384  1.00 27.62           CATOM   2341  O   ARG A 282      41.913  12.182  23.425  1.00 23.83           OATOM   2342  CB  ARG A 282      39.676  13.017  25.405  1.00 20.89           CATOM   2343  CG  ARG A 282      40.035  12.467  26.775  1.00 22.81           CATOM   2344  CD  ARG A 282      38.762  11.925  27.442  1.00 26.77           CATOM   2345  NE  ARG A 282      38.963  11.345  28.781  1.00 36.48           NATOM   2346  CZ  ARG A 282      38.518  10.139  29.164  1.00 37.74           CATOM   2347  NH1 ARG A 282      37.813   9.360  28.346  1.00 28.45           NATOM   2348  NH2 ARG A 282      38.754   9.700  30.384  1.00 27.25           NATOM   2349  N   LY5 A 283      43.016  12.963  25.223  1.00 28.91           NATOM   2350  CA  LYS A 283      44.217  12.171  25.051  1.00 24.32           CATOM   2351  C   LYS A 283      44.796  11.766  26.404  1.00 29.57           CATOM   2352  O   LYS A 283      45.262  12.626  27.138  1.00 33.16           OATOM   2353  CB  LYS A 283      45.226  13.008  24.287  1.00 21.93           CATOM   2354  CG  LYS A 283      46.111  12.251  23.316  1.00 32.38           CATOM   2355  CD  LYS A 283      46.526  13.171  22.143  1.00 95.77           CATOM   2356  CE  LYS A 283      45.710  12.937  20.836  1.00100.00           CATOM   2357  NZ  LYS A 283      46.418  13.332  19.535  1.00100.00           NATOM   2358  N   LEU A 284      44.747  10.467  26.734  1.00 23.37           NATOM   2359  CCA LEU A 284      45.327   9.905  27.997  1.00 16.08           CATOM   2360  C   LEU A 284      45.463   8.386  28.047  1.00 20.46           CATOM   2361  O   LEU A 284      44.679   7.655  27.446  1.00 25.45           OATOM   2362  CB  LEU A 284      44.641  10.387  29.284  1.00 16.30           CATOM   2363  CG  LEU A 284      43.334   9.700  29.714  1.00 25.97           CATOM   2364  CD1 LEU A 284      42.881  10.089  31.152  1.00 22.11           CATOM   2365  CD2 LEU A 284      42.203   9.953  28.693  1.00 23.92           CATOM   2366  N   LEU A 285      46.453   7.939  28.820  1.00 18.51           NATOM   2367  CA  LEU A 285      46.792   6.527  29.003  1.00 16.77           CATOM   2368  C   LEU A 285      45.880   5.865  30.006  1.00 30.75           CATOM   2369  O   LEU A 285      45.576   6.439  31.058  1.00 22.02           OATOM   2370  CB  LEU A 285      48.229   6.389  29.585  1.00 15.85           CATOM   2371  CG  LEU A 285      49.307   6.970  28.672  1.00 21.51           CATOM   2372  CD1 LEU A 285      50.703   6.705  29.122  1.00 15.15           CATOM   2373  CD2 LEU A 285      49.051   6.368  27.330  1.00 16.94           CATOM   2374  N   ASP A 286      45.565   4.599  29.734  1.00 26.62           NATOM   2375  CA  ASP A 286      44.945   3.726  30.698  1.00 10.90           CATOM   2376  C   ASP A 286      46.128   3.055  31.498  1.00 20.54           CATOM   2377  O   ASP A 286      46.991   2.372  30.938  1.00 23.38           OATOM   2378  CB  ASP A 286      44.073   2.702  29.970  1.00 14.65           CATOM   2379  CG  ASP A 286      43.409   1.699  30.943  1.00 24.60           CATOM   2380  OD1 ASP A 286      43.932   1.437  32.083  1.00 24.60           OATCM   2381  OD2 ASP A 286      42.316   1.231  30.583  1.00 26.03           OATOM   2382  N   VAL A 287      46.230   3.317  32.791  1.00 15.44           NATOM   2383  CA  VAL A 287      47.354   2.816  33.556  1.00 15.58           CATOM   2384  C   VAL A 287      46.973   1.695  34.521  1.00 16.48           CATOM   2385  O   VAL A 287      47.613   1.473  35.572  1.00 16.63           OATOM   2386  CB  VAL A 287      48.101   4.006  34.260  1.00 29.84           CATOM   2387  CG1 VAL A 287      48.534   5.085  33.224  1.00 18.39           CATOM   2388  CG2 VAL A 287      47.173   4.670  35.258  1.00 37.79           CATOM   2389  N   THR A 288      45.904   0.992  34.152  1.00 22.27           NATOM   2390  CA  THR A 288      45.428  -0.152  34.956  1.00 19.34           CATOM   2391  C   THR A 288      46.561  -1.177  35.227  1.00 27.47           CATOM   2392  O   THR A 288      46.778  -1.586  36.365  1.00 24.87           OATOM   2393  CB  THR A 288      44.288  -0.909  34.244  1.00 22.86           CATOM   2394  OG1 THR A 288      43.120  -0.096  34.106  1.00 24.84           OATOM   2395  CG2 THR A 288      43.916  -2.113  35.024  1.00 25.08          CATOM   2396  N   ARG A 289      47.290  -1.585  34.179  1.00 26.08          NATOM   2397  CA  ARG A 289      48.428  -2.506  34.319  1.00 16.92          CATOM   2398  C   ARG A 289      49.405  -2.037  35.408  1.00 22.96          CATOM   2399  O   ARG A 289      49.847  -2.790  36.275  1.00 23.03          OATOM   2400  CB  ARG A 289      49.208  -2.607  32.976  1.00 12.43          CATOM   2401  CG  ARG A 289      48.934  -3.804  32.103  1.00 29.39          CATOM   2402  CD  ARG A 289      50.016  -4.102  31.037  1.00 25.88          CATOM   2403  NE  ARG A 289      49.441  -4.996  30.020  1.00 17.26          NATOM   2404  CZ  ARG A 289      50.053  -5.459  28.930  1.00 38.82          CATOM   2405  NH1 ARG A 289      51.306  -5.153  28.660  1.00 13.51          NATOM   2406  NH2 ARG A 289      49.400  -6.262  28.096  1.00 37.68          NATOM   2407  N   LEU A 290      49.815  -0.786  35.306  1.00 26.60          NATOM   2408  CA  LEU A 290      50.809  -0.254  36.219  1.00 25.42          CATOM   2409  C   LEU A 290      50.324  -0.376  37.656  1.00 24.17          CATOM   2410  O   LEU A 290      51.072  -0.759  38.574  1.00 19.94          OATOM   2411  CB  LEU A 290      51.000   1.219  35.876  1.00 24.66          CATOM   2412  CG  LEU A 290      52.281   2.019  36.066  1.00 24.67          CATOM   2413  CD1 LEU A 290      51.992   3.479  36.504  1.00 29.25          CATOM   2414  CD2 LEU A 290      53.450   1.335  36.788  1.00 15.82          CATOM   2415  N   HIS A 291      49.093   0.075  37.868  1.00 30.10          NATOM   2416  CA  HIS A 291      48.513   0.074  39.212  1.00 34.17          CATOM   2417  C   HIS A 291      48.411  -1.367  39.730  1.00 43.41          CATOM   2418  O   HIS A 291      48.621  -1.654  40.929  1.00 38.81          OATOM   2419  CB  HIS A 291      47.113   0.674  39.143  1.00 28.01          CATOM   2420  CG  HIS A 291      47.097   2.153  38.984  1.00 29.68          CATOM   2421  ND1 HIS A 291      48.242   2.921  39.015  1.00 35.63          NATOM   2422  CD2 HIS A 291      46.068   3.024  38.855  1.00 31.18          CATOM   2423  CE1 HIS A 291      47.926   4.197  38.845  1.00 24.20          CATOM   2424  NE2 HIS A 291      46.612   4.289  38.747  1.00 21.92          NATOM   2425  N   GLN A 292      48.048  -2.260  38.821  1.00 30.71          NATOM   2426  CA  GLN A 292      47.950  -3.654  39.181  1.00 34.82          CATOM   2427  C   GLN A 292      49.287  -4.197  39.622  1.00 36.93          CATOM   2428  O   GLN A 292      49.323  -5.040  40.510  1.00 27.56          OATOM   2429  CB  GLN A 292      47.322  -4.487  38.069  1.00 28.23          CATOM   2430  CG  GLN A 292      45.798  -4.405  38.171  1.00 81.15          CATOM   2431  CD  GLN A 292      45.023  -4.954  36.963  1.00100.00          CATOM   2432  OE1 GLN A 292      45.597  -5.410  35.951  1.00 99.65          OATOM   2433  NE2 GLN A 292      43.687  -4.895  37.073  1.00 40.86          NATOM   2434  N   LEU A 293      50.375  -3.658  39.058  1.00 31.75          NATOM   2435  CA  LEU A 293      51.750  -4.072  39.383  1.00 22.67          CATOM   2436  C   LEU A 293      52.238  -3.323  40.613  1.00 28.64          CATOM   2437  O   LEU A 293      53.420  -3.377  41.017  1.00 22.27          OATOM   2438  CB  LEU A 293      52.665  -3.769  38.205  1.00 25.57          CATOM   2439  CG  LEU A 293      52.497  -4.703  37.016  1.00 35.11          CATOM   2440  CD1 LEU A 293      53.306  -4.170  35.836  1.00 28.25           CATOM   2441  CD2 LEU A 293      52.965  -6.110  37.439  1.00 47.81           CATOM   2442  N   GLY A 294      51.316  -2.510  41.111  1.00 33.08           NATOM   2443  CA  GLY A 294      51.488  -1.793  42.347  1.00 24.90           CATOM   2444  C   GLY A 294      52.272  -0.512  42.326  1.00 29.31           CATOM   2445  O   GLY A 294      53.070  -0.249  43.223  1.00 25.25           OATOM   2446  N   TRP A 295      52.000   0.347  41.368  1.00 27.83           NATOM   2447  CA  TRP A 295      52.687   1.623  41.385  1.00 19.45           CATOM   2448  C   TRP A 295      51.684   2.731  41.081  1.00 25.79           CATOM   2449  O   TRP A 295      50.765   2.527  40.297  1.00 20.43           OATOM   2450  CB  TRP A 295      53.961   1.614  40.524  1.00 12.85           CATOM   2451  CG  TRP A 295      54.750   2.911  40.618  1.00 23.04           CATOM   2452  CD1 TRP A 295      55.897   3.161  41.368  1.00 23.68           CATOM   2453  CD2 TRP A 295      54.415   4.159  39.979  1.00 20.72           CATOM   2454  NE1 TRP A 295      56.258   4.493  41.244  1.00 18.67           NATOM   2455  CE2 TRP A 295      55.389   5.113  40.373  1.00 20.95           CATOM   2456  CE3 TRP A 295      53.406   4.550  39.102  1.00 21.47           CATOM   2457  CZ2 TRP A 295      55.338   6.439  39.958  1.00 17.58           CATOM   2458  CZ3 TRP A 295      53.403   5.873  38.632  1.00 21.57           CATOM   2459  CH2 TRP A 295      54.368   6.787  39.058  1.00 19.45           CATOM   2460  N   TYR A 296      51.709   3.797  41.884  1.00 25.17           NATOM   2461  CA  TYR A 296      50.720   4.883  41.731  1.00 24.90           CATOM   2462  C   TYR A 296      51.517   6.178  41.857  1.00 30.85           CATOM   2463  O   TYR A 296      52.363   6.272  42.745  1.00 21.27           OATOM   2464  CB  TYR A 296      49.654   4.813  42.840  1.00 25.18           CATOM   2465  CG  TYR A 296      48.685   3.651  42.744  1.00 23.04           CATOM   2466  CD1 TYR A 296      49.078   2.343  43.088  1.00 31.62           CATOM   2467  CD2 TYR A 296      47.380   3.853  42.289  1.00 26.02           CATOM   2468  CE1 TYR A 296      48.203   1.268  42.935  1.00 24.42           CATOM   2469  CE2 TYR A 296      46.493   2.770  42.127  1.00 24.81           CATOM   2470  CZ  TYR A 296      46.902   1.483  42.464  1.00 39.41           CATOM   2471  OH  TYR A 296      45.984   0.434  42.337  1.00 66.19           OATOM   2472  N   HIS A 297      51.324   7.123  40.924  1.00 20.95           NATOM   2473  CA  MIS A 297      52.130   8.343  40.938  1.00 26.86           CATOM   2474  C   HIS A 297      51.947   9.175  42.210  1.00 35.01           CATOM   2475  O   HIS A 297      50.885   9.132  42.874  1.00 26.92           OATOM   2476  CB  HIS A 297      51.819   9.192  39.733  1.00 25.77           CATOM   2477  CG  HIS A 297      50.489   9.842  39.803  1.00 31.16           CATOM   2478  ND1 HIS A 297      49.314   9.145  39.633  1.00 34.21           NATOM   2479  CD2 HIS A 297      50.135  11.094  40.167  1.00 25.83           CATOM   2480  CE1 HIS A 297      48.290   9.972  39.776  1.00 24.14           CATOM   2481  NE2 HIS A 297      48.761  11.164  40.087  1.00 23.35           NATOM   2482  N   GLU A 298      52.983   9.926  42.554  1.00 24.98           NATOM   2483  CA  GLU A 298      52.957  10.683  43.798  1.00 27.65           CATOM   2484  C   GLU A 298      52.831  12.187  43.741  1.00 36.86           CATOM   2485  O   GLU A 298      52.433  12.792  44.718  1.00 43.61           OATOM   2486  CB  GLU A 298      54.153  10.319  44.686  1.00 22.02           CATOM   2487  CG  GLU A 298      54.004   8.943  45.285  1.00 36.42           CATOM   2488  CD  GLU A 298      54.999   8.664  46.406  1.00100.00           CATOM   2489  OE1 GLU A 298      56.223   8.561  46.152  1.00 44.79           OATOM   2490  OE2 GLU A 298      54.526   8.470  47.547  1.00100.00           OATOM   2491  N   ILE A 299      53.232  12.800  42.639  1.00 23.49           NATOM   2492  CA  ILE A 299      53.268  14.244  42.562  1.00 13.25           CATOM   2493  C   ILE A 299      52.016  14.848  41.906  1.00 27.05           CATOM   2494  O   ILE A 299      51.681  14.530  40.757  1.00 26.73           OATOM   2495  CB  ILE A 299      54.586  14.711  41.862  1.00 15.93           CATOM   2496  CG1 ILE A 299      55.836  14.183  42.606  1.00 23.83           CATOM   2497  CG2 ILE A 299      54.596  16.213  41.541  1.00 17.37           CATOM   2498  CD1 ILE A 299      57.232  14.221  41.787  1.00 21.32           CATOM   2499  N   SER A 300      51.323  15.716  42.648  1.00 18.55           NATOM   2500  CA  SER A 300      50.177  16.449  42.091  1.00 19.58           CATOM   2501  C   SER A 300      50.714  17.415  41.042  1.00 17.29           CATOM   2502  O   SER A 300      51.824  17.941  41.178  1.00 21.06           OATOM   2503  CB  SER A 300      49.542  17.307  43.181  1.00 16.78           CATOM   2504  OG  SER A 300      50.548  17.969  43.923  1.00 75.80           OATOM   2505  N   LEU A 301      49.870  17.755  40.075  1.00 16.13           NATOM   2506  CA  LEU A 301      50.246  18.675  39.014  1.00 17.70           CATOM   2507  C   LEU A 301      50.689  19.964  39.646  1.00 20.11           CATOM   2508  O   LEU A 301      51.714  20.568  39.303  1.00 20.46           OATOM   2509  CB  LEU A 301      48.990  18.981  38.197  1.00 17.92           CATOM   2510  CG  LEU A 301      49.182  20.030  37.112  1.00 25.15           CATOM   2511  CD1 LEU A 301      50.233  19.552  36.086  1.00 18.82           CATOM   2512  CD2 LEU A 301      47.854  20.177  36.436  1.00 25.88           CATOM   2513  N   GLU A 302      49.845  20.398  40.554  1.00 27.01           NATOM   2514  CA  GLU A 302      50.053  21.636  41.280  1.00 37.72           CATOM   2515  C   GLU A 302      51.410  21.618  41.996  1.00 29.99           CATOM   2516  O   GLU A 302      52.245  22.514  41.798  1.00 27.15           OATOM   2517  CB  GLU A 302      48.899  21.841  42.275  1.00 43.10           CATOM   2518  CG  GLU A 302      49.061  23.061  43.174  1.00 90.85           CATOM   2519  CD  GLU A 302      48.451  24.324  42.580  1.00100.00           CATOM   2520  OE1 GLU A 302      47.566  24.209  41.706  1.00100.00           OATOM   2521  OE2 GLU A 302      48.808  25.432  43.036  1.00 64.50           OATOM   2522  N   ALA A 303      51.646  20.591  42.801  1.00  8.72           NATOM   2523  CA  ALA A 303      52.937  20.455  43.459  1.00 15.03           CATOM   2524  C   ALA A 303      54.102  20.355  42.450  1.00 19.85           CATOM   2525  O   ALA A 303      55.104  21.090  42.553  1.00 22.24           OATOM   2526  CB  ALA A 303      52.938  19.258  44.410  1.00 18.97           CATOM   2527  N   GLY A 304      53.953  19.472  41.467  1.00 13.05           NATOM   2528  CA  GLY A 304      54.970  19.321  40.448  1.00  8.94           CATOM   2529  C   GLY A 304      55.239  20.621  39.695  1.00 20.31           CATOM   2530  O   GLY A 304      56.394  20.900  39.322  1.00 14.30          OATOM   2531  N   LEU A 305      54.191  21.383  39.361  1.00 10.76          NATOM   2532  CA  LEU A 305      54.483  22.622  38.611  1.00 20.29          CATOM   2533  C   LEU A 305      55.281  23.669  39.456  1.00 28.92          CATOM   2534  O   LEU A 305      56.194  24.385  38.974  1.00 17.69          OATOM   2535  CB  LEU A 305      53.202  23.245  38.033  1.00 24.03          CATOM   2536  CG  LEU A 305      52.357  22.647  36.880  1.00 27.66          CATOM   2537  CD1 LEU A 305      50.975  23.384  36.789  1.00 13.44          CATOM   2538  CD2 LEU A 305      53.079  22.724  35.543  1.00 18.39          CATOM   2539  N   AL2 A 306      54.904  23.757  40.724  1.00 19.94          NATOM   2540  CA  ALA A 306      55.544  24.660  41.655  1.00 24.79          CATOM   2541  C   ALA A 306      57.035  24.380  41.743  1.00 27.51          CATOM   2542  O   A3A A 306      57.852  25.280  41.662  1.00 29.68          OATOM   2543  CB  ALA A 306      54.937  24.471  43.002  1.00 17.87          CATOM   2544  N   SER A 307      57.378  23.137  42.011  1.00 18.46          NATCM   2545  CA  SER A 307      58.793  22.756  42.162  1.00 16.31          CATOM   2546  C   SER A 307      59.547  22.885  40.832  1.00 22.66          CATOM   2547  O   SER A 307      60.742  23.212  40.786  1.00 28.47          OATOM   2548  CB  SER A 307      58.851  21.304  42.622  1.00 20.47          CATOM   2549  OG  SER A 307      58.517  20.454  41.526  1.00 29.03          OATOM   2550  N   THR A 308      58.849  22.631  39.735  1.00 27.31          NATOM   2551  CA  THR A 308      59.458  22.738  38.413  1.00 22.89          CATOM   2552  C   THR A 308      59.757  24.216  38.107  1.00 26.06          CATOM   2553  O   THR A 308      60.819  24.546  37.591  1.00 29.89          OATOM   2554  CB  THR A 308      58.536  22.115  37.318  1.00 18.72          CATOM   2555  OG1 THR A 308      58.356  20.714  37.545  1.00 20.17          OATOM   2556  CG2 THR A 308      59.094  22.330  35.923  1.00 12.37          CATOM   2557  N   TYR A 309      58.846  25.118  38.453  1.00 28.20          NATOM   2558  CA  TYR A 309      59.110  26.549  38.241  1.00 31.09          CATOM   2559  C   TYR A 309      60.383  27.059  39.045  1.00 16.31          CATOM   2560  O   TYR A 309      61.179  27.858  38.577  1.00 16.91          OATOM   2561  CB  TYR A 309      57.819  27.373  38.533  1.00 31.19          CATOM   2562  CG  TYR A 309      57.944  28.895  38.392  1.00 14.57          CATOM   2563  CD1 TYR A 309      58.397  29.457  37.224  1.00 17.51          CATOM   2564  CD2 TYR A 309      57.575  29.757  39.442  1.00 24.99          CATOM   2565  CE1 TYR A 309      58.527  30.801  37.100  1.00 18.41          CATOM   2566  CE2 TYR A 309      57.744  31.129  39.351  1.00 19.04          CATOM   2567  CZ  TYR A 309      58.212  31.641  38.164  1.00 29.13          CATOM   2568  OH  TYR A 309      58.300  33.004  37.966  1.00 28.22          OATOM   2569  N   GLN A 310      60.560  26.579  40.260  1.00 15.41          NATOM   2570  CA  GLN A 310      61.705  26.964  41.087  1.00 22.35          CATOM   2571  C   GLN A 310      63.001  26.492  40.446  1.00 31.46          CATOM   2572  O   GLN A 310      64.009  27.191  40.442  1.00 33.42          OATOM   2573  CB  GLN A 310      61.587  26.335  42.482  1.00 17.67          CATOM   2574  CG  GLN A 310      62.579  26.921  43.461  1.00 57.58          CATOM   2575  CD  GLN A 310       62.287  28.370  43.782  1.00 65.14           OATOM   2576  OE1 GLN A 310       61.134  28.754  44.000  1.00 41.94           OATOM   2577  NE2 GLN A 310       63.330  29.194  43.801  1.00 99.09           NATOM   2578  N   TRP A 311       62.957  25.321  39.830  1.00 28.76           NATOM   2579  CA  TRP A 311       64.146  24.822  39.163  1.00 26.29           CATOM   2580  C   TRP A 311       64.474  25.769  38.040  1.00 17.91           CATOM   2581  O   TRP A 311       65.599  26.193  37.880  1.00 22.89           OATOM   2582  CB  TRP A 311       63.938  23.383  38.643  1.00 27.53           CATOM   2583  CG  TRP A 311       65.176  22.784  38.119  1.00 17.82           CATOM   2584  CD1 TRP A 311       66.132  22.090  38.826  1.00 20.21           CATOM   2585  CD2 TRP A 311       65.652  22.881  36.784  1.00 17.99           CATOM   2586  NE1 TRP A 311       67.197  21.776  37.992  1.00 20.39           NATOM   2587  CE2 TRP A 311       66.933  22.284  36.746  1.00 19.57           CATOM   2588  CE3 TRP A 311       65.141  23.461  35.621  1.00 20.26           CATOM   2589  CZ2 TRP A 311       67.686  22.236  35.599  1.00 14.25           CATOM   2590  CZ3 TRP A 311       65.901  23.446  34.501  1.00 18.59           CATOM   2591  CH2 TRP A 311       67.169  22.831  34.494  1.00 16.86           CATOM   2592  N   PHE A 312       63.469  26.109  37.256  1.00 17.47           NATOM   2593  CA  PHE A 312       63.665  27.064  36.179  1.00 20.14           CATOM   2594  C   PHE A 312       64.224  28.371  36.733  1.00 18.33           CATOM   2595  O   PHE A 312       65.080  29.024  36.104  1.00 24.76           OATOM   2596  CB  PHE A 312       62.328  27.318  35.458  1.00 29.51           CATOM   2597  CG  PHE A 312       62.328  28.544  34.603  1.00 28.52           CATOM   2598  CD1 PHE A 312       62.883  28.508  33.338  1.00 30.53           CATOM   2599  CD2 PHE A 312       61.825  29.758  35.104  1.00 29.31           CATOM   2600  CE1 PHE A 312       62.936  29.660  32.554  1.00 34.73           CATOM   2601  CE2 PHE A 312       61.900  30.904  34.362  1.00 38.40           CATOM   2602  CZ  PHE A 312       62.432  30.860  33.063  1.00 40.73           CATOM   2603  N   LEU A 313       63.697  28.787  37.876  1.00 22.46           NATOM   2604  CA  LEU A 313       64.170  30.025  38.516  1.00 28.47           CATOM   2605  C   LEU A 313       65.627  29.827  38.898  1.00 37.53           CATOM   2606  O   LEU A 313       66.452  30.693  38.629  1.00 34.20           OATOM   2607  CB  LEU A 313       63.375  30.410  39.783  1.00 20.44           CATOM   2608  CG  LEU A 313       61.955  30.897  39.555  1.00 16.29           CATOM   2609  CD1 LEU A 313       61.499  31.399  40.871  1.00 15.94           CATOM   2610  CD2 LEU A 313       61.959  31.961  36.524  1.00 14.44           CATOM   2611  N   GLU A 314       65.953  28.685  39.508  1.00 30.70           NATOM   2612  CA  GLU A 314       67.353  28.432  39.875  1.00 24.15           CATOM   2613  C   GLU A 314       68.291  28.149  38.703  1.00 36.34           CATOM   2614  O   GLU A 314       69.485  28.047  38.890  1.00 43.10           OATOM   2615  CB  GLU A 314       67.459  27.366  40.947  1.00 19.90           CATOM   2616  CG  GLU A 314       66.634  27.754  42.141  1.00 27.37           CATOM   2617  CD  GLU A 314       66.450  26.666  43.182  1.00 31.09           CATOM   2618  OE1 GLU A 314       67.157  25.648  43.085  1.00 59.60           OATOM   2619  OE2 GLU A 314       65.634  26.872  44.125  1.00 46.20           OATOM   2620  N   ASN A 315      67.778  28.114  37.479  1.00 40.17           NATOM   2621  CA  ASN A 315      68.637  27.802  36.343  1.00 37.76           CATOM   2622  C   ASN A 315      68.383  28.578  35.112  1.00 43.75           CATOM   2623  O   ASN A 315      68.591  28.001  34.047  1.00 39.15           OATOM   2624  CB  ASN A 315      68.425  26.360  35.884  1.00 33.74           CATOM   2625  CG  ASN A 315      69.028  25.383  36.801  1.00 53.18           CATOM   2626  OD1 ASN A 315      68.456  25.087  37.835  1.00 49.13           OATOM   2627  ND2 ASN A 315      70.239  24.926  36.479  1.00 97.72           NATOM   2628  N   GLN A 316      67.852  29.803  35.197  1.00 49.87           NATOM   2629  CA  GLN A 316      67.627  30.550  33.957  1.00 77.90           CATOM   2630  C   GLN A 316      68.797  31.448  33.525  1.00100.00           CATOM   2631  O   GLN A 316      69.272  31.387  32.375  1.00 51.33           OATOM   2632  CB  GLN A 316      66.280  31.276  33.902  1.00 75.89           CATOM   2633  CG  GLN A 316      65.683  31.589  35.231  1.00 80.97           CATOM   2634  CD  GLN A 316      65.233  33.036  35.350  1.00 54.58           CATOM   2635  OE1 GLN A 316      64.881  33.699  34.367  1.00 46.46           OATOM   2636  NE2 GLN A 316      65.257  33.538  36.566  1.00 33.46           NTER    2637      GLN A 316CONECT  110  111CONECT  111  110  112CONECT  112  111  113  114CONECT  113  112  118CONECT  114  112  115  116CONECT  115  114CONECT  116  114  117  118CONECT  117  116  129CONECT  118  113  116CONECT  120  121CONECT  121  120  122CONECT  122  121  123  124CONECT  123  122  128CONECT  124  122  125  126CONECT  125  124CONECT  126  124  127  128CONECT  127  126CONECT  128  123  126CONECT  129  117  130  131  132CONECT  130  129CONECT  131  129CONECT  132  129MASTER      208    0    1   13   10    0    3    6 2636    1   22   25END
虽已详述本发明的各种实施方案，但显然本领域技术人员可对这些实施方案进行修改。然而，应当理解这些修改均包括在本发明的精神和范围内，如以下权利要求书中所要求。
                         序列表<110>Berry,Alan
Running,Jeffrey A.
Severson,David K.
Burlingame,Richard P.<120>“微生物和植物中的维生素C生产”<130>3161-24-PCT<140>尚未被批准<141>1999-05-25<150>60/125,073<151>1999-03-17<150>60/125,054<151>1999-03-18<150>60/088,549<151>1998-06-08<160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1583<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CD5<222>(49)..(993)<400>1tagtctttaa tttcgcagcg tttttataat tgtgcagagg tttcgtcc atg tct gac   57
                                                 Met Ser Asp
                                                   1aaa tct gcc aaa atc ttc gtc gcg ggt cat cgt ggt ttg gtt gga tct    105Lys Ser Ala Lys Ile Phe Val Ala Gly His Arg Gly Leu Val Gly Ser
  5                  10                  15gcc att gtc cgc aag ctt cag gaa caa ggt ttc acc aat ctc gtt ctt    153Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gly Phe Thr Asn Leu Val Leu20                  25                  30                  35aaa aca cac gcc gag ctt gat ctc act cgt caa gcc gat gtt gaa tcc    201Lys Thr His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala AsP Val Glu Ser
             40                  45                  50ttc ttt tct caa gag aag cca gtt tat gta atc cta gca gca gct aaa    249Phe Phe Ser Gln Glu Lys Pro Val Tyr Val Ile Leu Ala Ala Ala Lys
         55                  60                  65gtt ggt ggt att cac gct aac aac acc tat cct gct gat ttc att ggt    297Val Gly Gly Ile His Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile Gly
     70                  75                   80gtc aat ctc cag att cag acc aat gtg atc cac tct gca tat gag cac    345Val Asn Leu Gln Ile Gln Thr Asn Val Ile His Ser Ala Tyr Glu His
 85                  90                  95ggt gtg aag aag ctt ctc ttc ctt gga tca tcc tgc att tac cct aaa    393Gly Val Lys Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro Lys100                 105                 110                 115ttt gct cct cag cca att cct gag tct gct ttg tta aca gca tcg ctt    441Phe Ala Pro Gln Pro Ile Pro Glu Ser Ala Leu Leu Thr Ala Ser Leu
            120                 125                 130gaa cca act aat gag tgg tat gct att gct aag atc gct ggg att aag    489Glu Pro Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile Lys
        135                 140                 145act tgt cag gct tat agg att cag cac gga tgg gat gca atc tct ggc    537Thr Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Gln His Gly Trp Asp Ala Ile Ser Gly
    150                 155                 160atg cct act aat ctc tat ggt cct aat gac aat ttc cac ccg gag tct    585Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe His Pro Glu Ser
165                 170                 175cat gtg ctt cct gct ctt atg agg agg ttc cac gag gcg aaa gtg aat    633His Val Leu Pro Ala Leu Met Arg Arg Phe His Glu Ala Lys Val Asn180                 185                 190                 195tgg agc gga gga agt tgt ggt gtg ggg tac aag gta gtc ccg ttg gaa    681Trp Ser Gly Gly Ser Cys Gly Val Gly Tyr Lys Val Val Pro Leu Glu
            200                 205                 210ggg aag ttc ttg cat gtt gat gat ttg gct gat gct tgt gtt ttc ttg    729Gly Lys Phe Leu His Val Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val Phe Leu
        215                 220                 225ctg gat cgg ata cag cgg ggg ttg gag cat gtt aac att gga agt ggt    777Leu Asp Arg Ile Gln Arg Gly Leu Glu His Val Asn Ile Gly Ser Gly
    230                 235                 240caa gaa gtg act att aga gag ttg gct gag ttg gtg aaa gag gtt gtt    825Gln Glu Val Thr Ile Arg Glu Leu Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Val
245                 250                 255ggt ttt gaa ggg aag ctt gga tgg gat tgc act aag cca gat ggc aca    873Gly Phe Glu Gly Lys Leu Gly Trp Asp Cys Thr Lys Pro Asp Gly Thr260                 265                 270                 275ccg agg aaa ctt atg gac agc tca aag ctc gcg tct ttg ggt tgg aca    921Pro Arg Lys Leu Met Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Leu Gly Trp Thr
            280                 285                 290cct aag gtt tct ctt aga gat ggt ctg agc caa act tat gat tgg tat    969Pro Lys Val Ser Leu Arg Asp Gly Leu Ser Gln Thr Tyr Asp Trp Tyr
        295                 300                 305ttg aag aat gtt tgc aac cga taa gttaatggtt tctcttctca tatatacaca   1023Leu Lys Asn Val Cys Asn Arg
    310                 315actattgagt ctcaggtaaa tcagcttatc accacattgt gatttaaacc tttctttgag  1083attcgagaat tgcttttttt tttatcaaaa ttgattcatt tagagataag acttgcttct  1143ttatacaaca ttgtctgagg aattttaatt ttggatctcc gagtatggtc tattattagc  1203tctcttctat acaaattatc aaaacagttg taagaagttt caagaaaaac atttgatatc  1263tcactaattt ggctatcctt gcaagttgca acgctaaaat gacaaataat gaattctcgg  1323cccaatgggc ttacacaagc cttgttaaag atagcgtgaa caaaacgcgg ctcactagcc  1383ctaacctgtc tctctttcgc ttaccttctt cttcgtcttc gttggctcag tcacttgact  1443tcacggcccg ctcaagctct gacacgaaac tcatttcaaa ttaatttaat aaaaccttaa  1503tcacaaaagg ggcaaaagca atcgccggcg attatgcctt ctcctccggt gccggagacg  1563gttgtgagcc aacccgttcg                                              1583<210>2<211>314<212>PRT<213>拟南芥<400>2Met Ser Asp Lys Ser Ala Lys Ile Phe Val Ala Gly His Arg Gly Leu1               5                  10                  15Val Gly Ser Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gly Phe Thr Asn
         20                  25                  30Leu Val Leu Lys Thr His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Asp
     35                  40                  45Val Glu Ser Phe Phe Ser Gln Glu Lys Pro Val Tyr Val Ile Leu Ala
 50                  55                  60Ala Ala Lys Val Gly Gly Ile His Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp65                  70                  75                  80Phe Ile Gly Val Asn Leu Gln Ile Gln Thr Asn Val Ile His Ser Ala
             85                  90                  95Tyr Glu His Gly Val Lys Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile
        100                 105                 110Tyr Pro Lys Phe Ala Pro Gln Pro Ile Pro Glu Ser AAa Leu Leu Thr
    115                 120                 125Ala Ser Leu Glu Pro Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala
130                 135                 140Gly Ile Lys Thr Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Gln His Gly Trp Asp Ala145                 150                 155                 160Ile Ser Gly Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe His
            165                 170                 175Pro Glu Ser His Val Leu Pro Ala Leu Mat Arg Arg Phe His Glu Ala
        180                 185                 190Lys Val Asn Trp Ser Gly Gly Ser Cys Gly Val Gly Tyr Lys Val Val
    195                 200                 205Pro Leu Glu Gly Lys Phe Leu His Val Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys
210                 215                 220Val Phe Leu Leu Asp Arg Ile Gln Arg Gly Leu Glu His Val Asn Ile225                 230                 235                 240Gly Ser Gly Gln Glu Val Thr Ile Arg Glu Leu Ala Glu Leu Val Lys
            245                 250                 255Glu Val Val Gly Phe Glu Gly Lys Leu Gly Trp Asp Cys Thr Lys Pro
        260                 265                 270Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Met Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Leu
    275                 280                 285Gly Trp Thr Pro Lys Val Ser Leu Arg Asp Gly Leu Ser Gln Thr Tyr
290                 295                 300Asp Trp Tyr Leu Lys Asn Val Cys Asn Arg305                 310<210>3<211>966<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(966)<400>3atg agt aaa caa cga gtt ttt att gct ggt cat cgc ggg atg gtc ggt    48Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly1               5                  10                  15tcc gcc atc agg cgg cag ctc gaa cag cgc ggt gat gtg gaa ctg gta    96Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val
         20                  25                  30tta cgc acc cgc gac gag ctg aac ctg ctg gac agc cgc gcc gtg cat    144Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His
     35                  40                  45gat ttc ttt gcc agc gaa cgt att gac cag gtc tat ctg gcg gcg gcg    192Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala
 50                  55                  60aaa gtg ggc ggc att gtt gcc aac aac acc tat ccg gcg gat ttc atc     240Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile65                  70                  75                  80tac cag aac atg atg att gag agc aac atc att cac gcc gcg cat cag     288Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln
             85                  90                 95aac gac gtg aac aaa ctg ctg ttt ctc gga tcg tcc tgc atc tac ccg     336Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro
        100                 105                 110aaa ctg gca aaa cag ccg atg gca gaa agc gag ttg ttg cag ggc acg     384Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr
    115                 120                 125ctg gag ccg act aac gag cct tat gct att gcc aaa atc gcc ggg atc     432Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile
130                 135                 140aaa ctg tgc gaa tca tac aac cgc cag tac gga cgc gat tac cgc tca     480Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser145                 150                 155                 160gtc atg ccg acc aac ctg tac ggg cca cac gac aac ttc cac ccg agt     528Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser
            165                 170                 175aat tcg cat gtg atc cca gca ttg ctg cgt cgc ttc cac gag gcg acg    576Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phc His Glu Ala Thr
        180                 185                 190gca cag aat gcg ccg gac gtg gtg gta tgg ggc agc ggt aca ccg atg    624Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met
    195                 200                 205cgc gaa ttt ctg cac gtc gat gat atg gcg gcg gcg agc att cat gtc    672Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val
210                 215                 220atg gag ctg gcg cat gaa gtc tgg ctg gag aac acc cag ccg atg ttg    720Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu225                 230                 235                 240tcg cac att aac gtc ggc acg ggc gtt gac tgc act atc cgc gac gtg    768Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Asp Val
            245                 250                 255gcg caa acc atc gcc aaa gtg gtg ggt tac aaa ggc cgg gtg gtt ttt    826Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe
        260                 265                 270gat gcc agc aaa ccg gat ggc acg ccg cgc aaa ctg ctg gat gtg acg    864Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr
    275                 280                 285cgc ctg cat cag ctt ggc tgg tat cac gaa atc tca ctg gaa gcg ggg    912Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly
290                 295                 300ctt gcc agc act tac cag tgg ttc ctt gag aat caa gac cgc ttt cgg    960Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg305                 310                 315                 320ggg taa                                                            966Gly<210>4<211>321<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly1               5                  10                  15Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val
         20                  25                  30Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His
     35                  40                  45Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala
 50                  55                  60Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile65                  70                  75                  80Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln
             85                  90                  95Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro
        100                 105                 110Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr
    115                 120                 125Leu Glu Pro Thr Ash Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile
130                 135                 140Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser145                 150                 155                 160Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser
            165                 170                 175Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phe His Glu Ala Thr
        180                 185                 190Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met
    195                 200                 205Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val
210                 215                 220Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu225                 230                 235                 240Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Asp Val
            245                 250                 255Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe
        260                 265                 270Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr
    275                 280                 285Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly
290                 295                 300Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg305                 310                 315                 320Gly<210>5<211>1340<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(75)..(1040)<400>5ctagaattca gcggccgctg aattctagct agaattcagc ggccgctgaa ttctagaacc 60caggtgcaac tgac atg ggt gaa ccc cag gga tcc atg cgg att cta gtg    110
            Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val
              1               5                  10aca ggg ggc tct ggg ctg gta ggc aaa gcc atc cag aag gtg gta gca    158Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala
     15                  20                  25gat gga gct gga ctt cct gga gag gac tgg gtg ttt gtc tcc tct aaa    206Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys
 30                  35                  40gac gcc gat ctc acg gat aca gca cag acc cgc gcc ctg ttt gag aag    254Asp Ala Asp Leu Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys45                  50                  55                  60gtc caa ccc aca cac gtc atc cat ctt gct gca atg gtg ggg ggc ctg    302Val Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu
             65                  70                  75ttc cgg aat atc aaa tac aat ttg gac ttc tgg agg aaa aac gtg cac    350Phe Arg Asn Ile Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His
         80                  85                  90atg aac gac aac gtc ctg cac tcg gcc ttt gag gtg ggg gcc cgc aag    398Met Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys
     95                 100                 105gtg gtg tcc tgc ctg tcc acc tgt atc ttc cct gac aag acg acc tac    446Val Val Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr
110                 115                 120ccg ata gat gag acc atg atc cac aat ggg cct ccc cac aac agc aat    494Pro Ile Asp Glu Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn125                 130                 135                 140ttt ggg tac tcg tat gcc aag agg atg atc gac gtg cag aac agg gcc    542Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala
            145                 150                 155tac ttc cag cag tac ggc tgc acc ttc acc gct gtc atc ccc acc aac    590Tyr Phe Gln Gln Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn
        160                 165                 170gtt ttc ggg ccc cac gac aac ttc aac atc gag gat ggc cac gtg ctg    638Val Phe Gly Pro His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu
    175                 180                 185cct ggc ctc atc cac aag gtg cac ctg gcc aag agc agc ggc tcg gcc    686Pro Gly Leu Ile His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala
190                 195                 200ctg acg gtg tgg ggt aca ggg aat ccg cgg agg cag ttc ata tac tcg    734Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Aan Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser205                 210                 215                 220ctg gac ctg gcc cag ctc ttt atc tgg gtc ctg cgg gag tac aat gaa    782Leu Asp Leu Ala Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu
            225                 230                 235gtg gag ccc atc atc ctc tcc gtg ggc gag gaa gat gag gtc tcc atc    830Val Glu Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile
        240                 245                 250aag gag gca gcc gag gcg gtg gtg gag gcc atg gac ttc cat ggg gaa    878Lys Glu Ala Ala Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu
    255                 260                 265gtc acc ttt gat aca acc aag tcg gat ggg cag ttt aag aag aca gcc    926Val Thr Phe Asp Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala
270                 275                 280agt aac agc aag ctg agg acc tac ctg ccc gac ttc cgg ttc aca ccc    974Set Asn Set Lys Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro285                 290                 295                 300ttc aag cag gcg gtg aag gag acc tgt gct tgg ttc act gac aac tac    1022Phe Lys Gln Ala Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr
            305                 310                 315gag cag gcc cgg aag tga agctggaaga caggatcagg tgccagcgga           1070Glu Gln Ala Arg Lys
        320ccatcggctg gcagagccca gcggccacca cccgtcaacc ctgccaggag ctgagggcac  1130cacccagcaa cctgggcctg cattccatcc gctctgcagc cccaagcatc tttccagtgg  1190ggcccccatt cacgttggtc ctcagggaaa ccagggtccg gggcaggccc ggcgctttgc  1250tccccacacc agccccctgc gcgtgtccac tctgatcctg catcccactc cctgggagcc  1310aataaagtgc attttcacag aaaaaaaaaa                                   1340<210>6<211>321<212>PRT<213>人类<400>6Met Gly Glu Pro Gln Gly Sar Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser1               5                  10                  15Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
         20                  25                  30Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
     35                  40                  45Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr
 50                  55                  60His Val Ile His Leu Pla Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile65                  70                  75                  80Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn
             85                  90                  95Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys
        100                 105                 110Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
    115                 120                 125Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
130                 135                 140Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln145                 150                 155                 160Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
            165                 170                 175His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
        180                 185                 190His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
    195                 200                 205Gly Thr GlyAsn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
210                215                 220Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile225                 230                 235                 240Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
            245                 250                 255Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp
        260                 265                 270Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys
    275                 280                 285Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
290                 295                 300Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg305                 310                 315                 320Lys<210> 7<211> 1017<212> DNA<213> 大肠杆菌<220><221> CDS<222> (1)..(1017)<400> 7atg aga gtt ctg gtt acc ggt ggt agc ggt tac att gga agt cat acc    48Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15tgt gtg caa tta ctg caa aac ggt cat gat gtc atc att ctt gat aac    96Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile Ile Leu Asp ASn
         20                  25                  30ctc tgt aac agt aag cgc agc gta ctg cct gtt atc gag cgt tta ggc    144Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly
     35                  40                  45ggc aaa cat cca acg ttt gtt gaa ggc gat att cgt aac gaa gcg ttg    192Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg Asn Glu Ala Leu
 50                  55                  60atg acc gag atc ctg cac gat cac gct atc gac acc gtg atc cac ttc    240Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr Val Ile His Phe 65                  70                  75                  80gcc ggg ctg aaa gcc gtg ggc gaa tcg gta caa aaa ccg ctg gaa tat    288Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys Pro Leu Glu Tyr
             85                  90                  95tac gac aac aat gtc aac ggc act ctg cgc ctg att agc gcc atg cgc    336Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile Ser Ala Met Arg
        100                 105                 110gcc gct aac gtc aaa aac ttt att ttt agc tcc tcc gcc acc gtt tat    384ALa Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125ggc gat cag ccc aaa att cca tac gtt gaa agc ttc ccg acc ggc aca    432Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe Pro Thr Gly Thr
130                 135                 140ccg caa agc cct tac ggc aaa agc aag ctg atg gtg gaa cag atc ctc    480Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val Glu Gln Ile Leu145                 150                 155                 160acc gat ctg caa aaa gcc cag ccg gac tgg agc att gcc ctg ctg cgc    528Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg
            165                 170                 175tac ttc aac ccg gtt ggc gcg cat ccg tcg ggc gat atg ggc gaa gat    576Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp
        180                 185                 190ccg caa ggc att ccg aat aac ctg atg cca tac atc gcc cag gtt gct    624Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala
    195                 200                 205gta ggc cgt cgc gac tcg ctg gcg att ttt ggt aac gat tat ccg acc    672Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr
210                 215                 220gaa gat ggt act ggc gta cgc gat tac atc cac gta atg gat ctg gcg    720Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala225                 230                 235                 240gac ggt cac gtc gtg gcg atg gaa aaa ctg gcg aac aag cca ggc gta     768Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val
            245                 250                 255cac atc tac aac ctc ggc gct ggc gta ggc aac agc gtg ctg gac gtg    816His Ile Tyr Asn Leu Gly A la Gly Val Gly Asn Set Val Leu Asp Val           260                 265                 270gtt aat gcc ttc agc aaa gcc tgc ggc aaa ccg gtt aat tat cat ttt    864Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe
    275                 280                 285gca ccg cgt cgc gag ggc gac ctt ccg gcc tac tgg gcg gac gcc agc    912Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser
290                 295                 300aaa gcc gac cgt gaa ctg aac tgg cgc gta acg cgc aca ctc gat gaa    960Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu305                 310                 315                 320atg gcg cag gac acc tgg cac tgg cag tca cgc cat cca cag gga tat    1008Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr
            325                 330                 335ccc gat taa                                                        1017Pro Asp<210> 8<211> 338<212> PRT<213> 大肠杆菌<400> 8Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile Ile Leu Asp Asn
         20                  25                  30Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly
     35                  40                  45Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg Asn Glu Ala Leu
 50                  55                  60Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr Val Ile His Phe65                  70                  75                  80Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys Pro Leu Glu Tyr
             85                  90                  95Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile Ser Ala Met Arg
        100                 105                 110Ala Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe Pro Thr Gly Thr
130                 135                 140Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val Glu Gln Ile Leu145                 150                 155                 160Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg
            165                 170                 175Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp
        180                 l85                 190Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala
    195                 200                 205Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr
210                 215                 220Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala225                 230                 235                 240Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val
            245                 250                 255His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Asn Ser Val Leu Asp Val
        260                 265                 270Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe
    275                 280                 285Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser
290                 295                 300Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu305                 310                 315                 320Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr
            325                 330                 335Pro Asp<210>9<211>1047<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(1)..(1047)<400>9atg gca gag aag gtg ctg gta aca ggt ggg gct ggc tac att ggc agc    48Met Ala Glu Lys Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser1               5                  10                  15cac acg gtg ctg gag ctg ctg gag gct ggc tac ttg cct gtg gtc atc    96His Thr Val Leu Glu Leu Leu Glu Ala Gly Tyr Leu Pro Val Val Ile
         20                  25                  30gat aac ttc cat aat gcc ttc cgt gga ggg ggc tcc ctg cct gag agc    144Asp Asn Phe His Asn Ala Phe Arg Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Ser
     35                  40                  45ctg cgg cgg gtc cag gag ctg aca ggc cgc tct gtg gag ttt gag gag    192Leu Arg Arg Val Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ser Val Glu Phe Glu Glu
 50                  55                  60atg gac att ttg gac cag gga gcc cta cag cgt ctc ttc aaa aag tac    240Met Asp Ile Leu Asp Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Phe Lys Lys Tyr65                  70                  75                  80agc ttt atg gcg gtc atc cac ttt gcg ggg ctc aag gcc gtg ggc gag    288Ser Phe Met Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu
             85                  90                  95tcg gtg cag aag cct ctg gat tat tac aga gtt aac ctg acc ggg acc     336Ser Val Gln Lys Pro Leu Asp Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Thr Gly Thr
        100                 105                 110atc cag ctt ctg gag atc atg aag gcc cac ggg gtg aag aac ctg gtg    384Ile Gln Leu Leu Glu Ile Met Lys Ala His Gly Val Lys Asn Leu Val
    115                 120                 125ttc agc agc tca gcc act gtg tac ggg aac ccc cag tac ctg ccc ctt    432Phe Ser Ser SerA la Thr Val Tyr Gly Asn Pro Gln Tyr Leu Pro Leu
130                 135                 140gat gag gcc cac ccc acg ggt ggt tgt acc aac cct tac ggc aag tcc    480Asp Glu Ala His Pro Thr Gly Gly cys Thr Asn Pro Tyr Gly Lys Ser145                 150                 155                 160aag ttc ttc atc gag gaa atg atc cgg gac ctg tgc cag gca gac aag    528Lys Phe Phe Ile Glu Glu Met Ile Arg Asp Leu Cys Gln Ala Asp Lys
            165                 170                 175act tgg aac gta gtg ctg ctg cgc tat ttc aac ccc aca ggt gcc cat    576Thr Trp Asn Val Val Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Thr Gly Ala His
        180                 185                 190gcc tct ggc tgc att ggt gag gat ccc cag ggc ata ccc aac aac ctc    624Ala Ser Gly Cys Ile Gly Glu Asp Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu
    195                 200                 205atg cct tat gtc tcc cag gtg gcg atc ggg cga cgg gag gcc ctg aat    672Met Pro Tyr Val Ser Gln Val Ala Ile Gly Arg Arg Glu Ala Leu Asn
210                 215                 220gtc ttt ggc aat gac tat gac aca gag gat ggc aca ggt gtc cgg gat    720Val Phe Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp225                 230                 235                 240tac atc cat gtc gtg gat ctg gcc aag ggc cac att gca gcc tta agg    768Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Lys Gly His Ile Ala Ala Leu Arg
            245                 250                 255aag ctg aaa gaa cag tgt ggc tgc cgg atc tac aac ctg ggc acg ggc    816Lys Leu Lys Glu Gln Cys Gly Cys Arg Ile Tyr Asn Leu Gly Thr Gly
        260                 265                 270aca ggc tat tca gtg ctg cag atg gtc cag gct atg gag aag gcc tct    864Thr Gly Tyr Ser Val Leu Gln Met Val Gln Ala Met Glu Lys Ala Ser
    275                 280                 285ggg aag aag atc ccg tac aag gtg gtg gca cgg cgg gaa ggt gat gtg    912Gly Lys Lys Ile Pro Tyr Lys Val Val Ala Arg Arg Glu Gly Asp Val
290                 295                 300gca gcc tgt tac gcc aac ccc agc ctg gcc caa gag gag ctg ggg tgg    960Ala Ala Cys Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Ala Gln Glu Glu Leu Gly Trp305                 310                 315                 320aca gca gcc tta ggg ctg gac agg atg tgt gag gat ctc tgg cgc tgg    1008Thr Ala Ala Leu Gly Leu Asp Arg Met Cys Glu Asp Leu Trp Arg Trp
            325                 330                 335cag aag cag aat cct tca ggc ttt ggc acg caa gcc tga                1047Gln Lys Gln Asn Pro Ser Gly Phe Gly Thr Gln Ala
        340                 345<210>10<211>348<212>PRT<213>人类<400>10Met Ala Glu Lys Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser1               5                  10                  15His Thr Val Leu Glu Leu Leu Glu Ala Gly Tyr Leu Pro Val Val Ile
         20                  25                  30Asp Asn Phe His Asn Ala Phe Arg Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Ser
     35                  40                  45Leu Arg Arg Val Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ser Val Glu Phe Glu Glu
 50                  55                  60Met Asp Ile Leu Asp Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Phe Lys Lys Tyr65                  70                  75                  80Ser Phe Met Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu
             85                  90                  95Ser Val Gln Lys Pro Leu Asp Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Thr Gly Thr
        100                 105                 110Ile Gln Leu Leu Glu Ile Met Lys Ala His Gly Val Lys Asn Leu Val
    115                 120                 125Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Asn Pro Gln Tyr Leu Pro Leu
130                 135                 140Asp Glu Ala His Pro Thr Gly Gly Cys Thr Asn Pro Tyr Gly Lys Ser145                 150                 155                 160Lys Phe Phe Ile Glu Glu Met Ile Arg Asp Leu Cys Gln Ala Asp Lys
            165                 170                 175Thr Trp Asn Val Val Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Thr Gly Ala His
        180                 185                 190Ala Ser Gly Cys Ile Gly Glu Asp Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu
    195                 200                 205Met Pro Tyr Val Ser Gln Val Ala Ile Gly Arg Arg Glu Ala Leu Asn
210                 215                 220Val Phe Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp225                 230                 235                 240Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Lys Gly His Ile Ala Ala Leu Arg
            245                 250                 255Lys Leu Lys Glu Gln Cys Gly Cys Arg Ile Tyr Asn Leu Gly Thr Gly
        260                 265                 270Thr Gly Tyr Ser Val Leu Gln Met Val Gln Ala Met Glu Lys Ala Ser
    275                 280                 285Gly Lys Lys Ile Pro Tyr Lys Val Val Ala Arg Arg Glu Gly Asp Val
290                 295                 300Ala Ala Cys Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Ala Gln Glu Glu Leu Gly Trp305                 310                 315                 320Thr Ala Ala Leu Gly Leu Asp Arg Met Cys Glu Asp Leu Trp Arg Trp
            325                 330                 335Gln Lys Gln Asn Pro Ser Gly Phe Gly Thr Gln Ala
        340                 345<210> 11<211> 317<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 对人工序列的描述：共有序列<400> 11Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
         20                  25                  30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
     35                  40                  45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa
 50                  55                  60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65                  70                  75                  80Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             85                  90                  95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        100                 105                 110Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa
    115                 120                 125Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
130                 135                 140Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa145                 150                 155                 160Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Gly Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            165                 170                 175Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        180                 185                 190Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa
    195                 200                 205Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
210                 215                 220Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa225                 230                 235                 240Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            245                 250                 255Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa
        260                 265                 270Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    275                 280                 285Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
290                 295                 300Xaa Thr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa305                 310                 315<210>12<211>34<212>DNA<213>大肠杆菌<400>12tagaattcag taaacaacga gtttttattg ctgg    34<210>13<211>32<212>DNA<213>大肠杆菌<400>13aactcgagtt acccccaaag cggtcttgat tc      32<210>14<211>30<212>DNA<213>大肠杆菌<400>14ctggagtcga attcatgagt aaacaacgag         30<210>15<211>33<212>DNA<213>大肠杆菌<400>15aactgcagtt acccccgaaa gcggtcttga ttc     33

Claims (72)

1．在微生物中生产抗坏血酸或其酯的方法，其包括培养微生物，所述微生物经遗传修饰增加了选自下组的一种酶的活性：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶；并回收所述抗坏血酸或其酯。
2．权利要求1的方法，其中所述遗传修饰可增加选自下组的一种酶的活性：GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。
3．权利要求1的方法，其中所述遗传修饰可增加催化GDP-D-甘露糖到GDP-L-半乳糖转化之酶的作用。
4．权利要求3的方法，其中所述遗传修饰可增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
5．权利要求3的方法，其中所述遗传修饰包括用表达该差向异构酶的重组核酸分子转化所述微生物。
6．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶具有基本符合由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶中三级结构的三级结构。
7．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点的平均均方根偏差小于约2.5埃的结构。
8．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点的平均均方根偏差小于约1埃的结构。
9．权利要求5中的方法，其中所述差向异构酶包括一底物结合位点，其三级结构基本符合由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶中底物结合位点的三级结构。
10．权利要求9的方法，其中所述底物结合位点具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点的平均均方根偏差小于约2.5埃的三级结构。
11．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶包括一催化位点，其三级结构基本符合由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶中催化位点的三级结构。
12．权利要求11的方法，其中所述催化位点具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的C α位点的平均均方根偏差小于约2.5埃的三级结构。
13．权利要求11的方法，其中所述催化位点包含氨基酸残基丝氨酸、酪氨酸和赖氨酸。
14．权利要求11的方法，其中所述氨基酸残基丝氨酸、酪氨酸和赖氨酸的三级结构位置分别与由Broodhaven蛋白数据库登录码为1bws的原子坐标所代表的Ser107、Tyr136和Lys140的三级结构位置基本一致。
15．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶结合NADPH。
16．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶包含与SEQ ID NO:11用CLUSTAL对比排列程序可对比排列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与SEQ IDNO:11中至少约50％的非Xaa残基有100％的同一性。
17．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶包含与SEQ ID NO:11用CLUSTAL对比排列程序可对比排列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与SEQ ID NO:11中至少约75％的非Xaa残基有100％的同一性。
18．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶包含与SEQ ID NO:11用CLUSTAL对比排列程序可对比排列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与SEQ ID NO:11中至少约90％的非Xaa残基有100％的同一性。
19．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶具有的氨基酸序列有至少4个连续氨基酸残基与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的氨基酸序列中至少4个连续氨基酸残基100％相同。
20．权利要求5的方法，其中所述重组核酸分子具有的核酸序列有至少12个连续核苷酸与选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的核酸序列中至少12个连续核苷酸100％相同。
21．权利要求5的方法，其中所述差向异构酶包含带有基序：Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly的氨基酸序列。
22．权利要求5的方法，其中所述重组核酸分子包含的核酸序列至少约15％等同于选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的核酸序列，如用Lipman-Pearson方法以Lipman-Person标准缺省参数所测定。
23．权利要求5的方法，其中所述重组核酸分子包含的核酸序列至少约20％等同于选自SEQID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的核酸序列，如用Lipman-Pearson方法以Lipman-Person标准缺省参数所测定。
24．权利要求5的方法，其中所述重组核酸分子包含的核酸序列至少约25％等同于选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的核酸序列，如用Lipmain-Pearson方法以Lipman-Person标准缺省参数所测定。
25．权利要求5的方法，其中所述重组核酸分子包含与编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核酸序列在严谨条件下杂交的核酸序列。
26．权利要求25的方法，其中所述编码GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶的核酸序列选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3和SEQID NO:5。
27．权利要求25的方法，其中所述GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶包含选自SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:4和SEQID NO:6的氨基酸序列。
28．权利要求1的方法，其中所述微生物选自细菌、真菌和微藻。
29．权利要求1的方法，其中所述微生物耐酸。
30．权利要求1的方法，其中所述微生物为细菌。
31．权利要求30的方法，其中所述细菌选自固氮菌和假单胞菌。
32．权利要求1的方法，其中所述微生物为真菌。
33．权利要求32的方法，其中所述微生物为酵母。
34．权利要求33的方法，其中所述酵母选自Saccharomyces。
35．权利要求1的方法，其中所述微生物为微藻。
36．权利要求35的方法，其中所述微藻选自Prototheca和Chlorella。
37．权利要求36的方法，其中所述微藻选自Prototheca。
38．权利要求1的方法，其中所述微生物还包含一种遗传修饰，其可降低以GDP-D-甘露糖为底物之酶的作用，而不降低GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
39．权利要求38的方法，其中所述可降低以GDP-D-甘露糖为底物之酶的作用，而不降低GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用的遗传修饰是降低GDP-D-甘露糖脱氢酶的作用。
40．权利要求1的方法，其中所述微生物耐酸且所述培养步骤在pH小于约6.0的条件下实施。
41．权利要求1的方法，其中所述微生物耐酸且所述培养步骤在pH小于约5.5的条件下实施。
42．权利要求1的方法，其中所述微生物耐酸且所述培养步骤在pH小于约5.0的条件下实施。
43．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在限制镁(Mg)的发酵培养基中实施。
44．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在限制细胞生长期的Mg的发酵培养基中实施。
45．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在控制细胞生长期间Mg浓度小于约0.5g/L的发酵培养基中实施。
46．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在控制细胞生长期间Mg浓度小于约0.2g/L的发酵培养基中实施。
47．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在控制细胞生长期间Mg浓度小于约0.1g/L的发酵培养基中实施。
48．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在含除D-甘露糖以外的其它碳源的发酵培养基中实施。
49．权利要求1的方法，其中所述培养步骤在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中实施。
50．一种产生抗坏血酸或其酯的微生物，其中该微生物具有增加选自下组之酶的作用的遗传修饰：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。
51．权利要求50的微生物，其中所述遗传修饰是增加选自GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶的一种酶的作用。
52．权利要求50的微生物，其中所述遗传修饰是增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
53．权利要求50的微生物，其中该微生物经遗传修饰而表达能编码催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化之差向异构酶的重组核酸分子，其中该差向异构酶具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点的平均均方根偏差小于约2.5埃的结构。
54．权利要求50的微生物，其中该微生物选自细菌、真菌和微藻。
55．权利要求50的微生物，其中该微生物为细菌。
56．权利要求55的微生物，其中该细菌选自固氮菌和假单胞菌。
57．权利要求50的微生物，其中该微生物为真菌。
58．权利要求57的微生物，其中该真菌为酵母。
59．权利要求58的微生物，其中该酵母选自Saccharomyces。
60．一种产生抗坏血酸或其酯的植物，其中该植物具有增加选自下组之酶的作用的遗传修饰：己糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶，磷酸甘露糖异构酶，磷酸甘露糖变位酶，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶。
61．权利要求60的植物，其中所述遗传修饰是增加选自GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶，GDP-L-半乳糖磷酸化酶，L-半乳糖-1-P-磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶，和L-半乳糖酸-γ-内酯脱氢酶的一种酶的作用。
62．权利要求60的植物，其中所述遗传修饰是增加GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
63．权利要求60的植物，其中该植物经遗传修饰而表达能编码催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化之差向异构酶的重组核酸分子，其中该差向异构酶具有与由Brookhaven蛋白数据库登陆码为1bws的原子坐标代表的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶三级结构中至少25％的Cα位点的平均均方根偏差小于约2.5埃的结构。
64．权利要求60的植物，其中该植物还包含一种遗传修饰，其可降低以GDP-D-甘露糖为底物之酶的作用，而不降低GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用。
65．权利要求60的植物，其中所述可降低以GDP-D-甘露糖为底物之酶的作用，而不降低GDP-D-甘露糖：GDP-L-半乳糖差向异构酶的作用的遗传修饰是降低GDP-D-甘露糖脱氢酶的作用。
66．权利要求60的植物，其中该植物为微藻。
67．权利要求66的植物，其中该植物选自Prototheca和Chlorella。
68．权利要求66的植物，其中该微藻选自Prototheca。
69．权利要求60的植物，其中该植物是高等植物。
70．权利要求60的植物，其中该植物可消费的高等植物。
71．一种产生抗坏血酸或其酯的微生物，其中该微生物经遗传修饰而表达能编码催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化之差向异构酶的一种重组核酸分子，其中该差向异构酶包含与SEQ ID NO:11用CLUSTAL对比排列程序可对比排列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与SEQ ID NO:11中至少约50％的非Xaa残基有100％的同一性。
72．一种产生抗坏血酸或其酯的植物，其中该植物经遗传修饰而表达能编码催化GDP-D-甘露糖向GDP-L-半乳糖转化之差向异构酶的一种重组核酸分子，其中该差向异构酶包含与SEQ ID NO:11用CLUSTAL对比排列程序可对比排列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列中的氨基酸残基与SEQID NO:11中至少约50％的非Xaa残基有100％的同一性。
CN99809475A 1998-06-08 1999-05-26 微生物和植物中的维生素c生产 Pending CN1314950A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8854998P 1998-06-08 1998-06-08
US60/088,549 1998-06-08
US12507399P 1999-03-17 1999-03-17
US60/125,073 1999-03-17
US12505499P 1999-03-18 1999-03-18
US60/125,054 1999-03-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1314950A true CN1314950A (zh) 2001-09-26

Family

ID=27376004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99809475A Pending CN1314950A (zh) 1998-06-08 1999-05-26 微生物和植物中的维生素c生产

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20020012979A1 (zh)
EP (1) EP1084267A4 (zh)
JP (1) JP2002517256A (zh)
CN (1) CN1314950A (zh)
AU (1) AU4205199A (zh)
CA (1) CA2331198A1 (zh)
MX (1) MXPA00012246A (zh)
WO (1) WO1999064618A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101978043B (zh) * 2007-05-08 2013-06-19 贺利氏贵金属有限及两合公司 产生可用作抗癌药的蒽环类代谢物的遗传修饰菌株
CN101918571B (zh) * 2007-11-19 2014-07-09 诺维信公司 产生发酵产物的方法
CN104004776A (zh) * 2003-08-14 2014-08-27 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对l-抗坏血酸进行微生物生产的方法
CN104372015A (zh) * 2014-11-03 2015-02-25 青岛农业大学 花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用
CN107034142A (zh) * 2008-11-28 2017-08-11 泰拉瑞亚控股公司 在异养型微生物中制备特制油
CN108384877A (zh) * 2018-04-17 2018-08-10 南京农业大学 BcGGP基因的InDel分子标记引物及应用
CN108611344A (zh) * 2016-12-10 2018-10-02 中国科学院大连化学物理研究所 AtAGM2与AtAGM3编码基因及酶的制备与应用
CN112708687A (zh) * 2021-02-04 2021-04-27 瑞安市人民医院 肠道菌群在肝性脑病检测中的应用
CN113265434A (zh) * 2021-05-19 2021-08-17 吉林大学 一种合成udp-半乳糖及合成半乳糖基化合物的方法

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020100075A1 (en) * 1999-03-29 2002-07-25 Conklin Patricia L. Transgenic plants with increased expression of VTC4 gene
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP2001145488A (ja) 1999-11-19 2001-05-29 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子
CN1311329A (zh) * 2000-02-29 2001-09-05 复旦大学 一种新的多肽——人磷酸甘露糖异构酶16和编码这种多肽的多核苷酸
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US6630330B1 (en) * 2000-08-02 2003-10-07 Biopolo S.C.A.R.L. Ascorbic acid production from yeast
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
MXPA03002974A (es) * 2000-10-06 2004-05-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas que producen composiciones de anticuerpo.
FR2820973B1 (fr) * 2001-02-19 2003-05-23 Oreal Composition comportant de la vitamine c preparee durant l'application, utilisation d'enzymes pour la formation de vitamine c a usage topique et procede de traitement cosmetique
WO2002103001A1 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Gdp-mannose-3',5'-epimerase and methods of use thereof
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7691810B2 (en) 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
JP2007535317A (ja) * 2004-04-15 2007-12-06 グライコフィ， インコーポレイテッド 下等真核生物におけるガラクトシル化された糖タンパク質の産生
US20080305532A1 (en) * 2005-02-11 2008-12-11 Bastien Chevreux Gene For Coenzyme Pqq Synthesis Protein B From Gluconobacter Oxydans
EP2371967B1 (en) 2005-03-18 2015-06-03 DSM IP Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US20060234360A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Paola Branduardi Ascorbic acid production from D-glucose in yeast
EP2078092A2 (en) 2006-09-28 2009-07-15 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
MY154965A (en) * 2007-06-01 2015-08-28 Solazyme Inc Production of oil in microorganisms
US20100170144A1 (en) * 2008-04-09 2010-07-08 Solazyme, Inc. Hydroprocessing Microalgal Oils
CN104561150A (zh) 2008-04-09 2015-04-29 索拉兹米公司 微生物生物质和微生物油的直接化学修饰
KR101916421B1 (ko) 2010-05-28 2018-11-08 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 종속영양 미생물유기체로부터 생성된 맞춤 오일
EP3521408B1 (en) 2010-11-03 2021-12-22 Corbion Biotech, Inc. Genetically-engineered chlorella or prototheca microbe and oil produced therefrom
MX351063B (es) 2011-02-02 2017-09-29 Terravia Holdings Inc Aceites adaptados producidos a partir de microorganismos oleaginosos recombinantes.
CN103608450A (zh) 2011-05-06 2014-02-26 索拉兹米公司 基因工程改造的代谢木糖的微生物
JP6499577B2 (ja) 2012-04-18 2019-04-10 テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド 調整油
US9249252B2 (en) 2013-04-26 2016-02-02 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
CA2925527A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Solazyme, Inc. Tailored oils
EP3167053B1 (en) 2014-07-10 2019-10-09 Corbion Biotech, Inc. Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof
EP3547826A4 (en) * 2016-12-01 2020-05-20 Arkansas State University-Jonesboro METHOD FOR IMPROVING CHLOROPLASTIC FUNCTION AND INCREASING SEEDLING YIELD
FR3061544B1 (fr) 2016-12-30 2019-08-23 Produits Berger Bruleur a combustion catalytique en materiau poreux a performances de fonctionnement optimisees et flacon equipe d'un tel bruleur

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4595659A (en) * 1983-10-20 1986-06-17 Kraft, Inc. Fermentation production of ascorbic acid from L-galactonic substrate
AU1775299A (en) * 1997-12-23 1999-07-19 Ascorbex Limited Plant galactose dehydrogenase

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004776A (zh) * 2003-08-14 2014-08-27 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对l-抗坏血酸进行微生物生产的方法
CN101978043B (zh) * 2007-05-08 2013-06-19 贺利氏贵金属有限及两合公司 产生可用作抗癌药的蒽环类代谢物的遗传修饰菌株
CN101918571B (zh) * 2007-11-19 2014-07-09 诺维信公司 产生发酵产物的方法
CN107034142A (zh) * 2008-11-28 2017-08-11 泰拉瑞亚控股公司 在异养型微生物中制备特制油
CN104372015A (zh) * 2014-11-03 2015-02-25 青岛农业大学 花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用
CN108611344A (zh) * 2016-12-10 2018-10-02 中国科学院大连化学物理研究所 AtAGM2与AtAGM3编码基因及酶的制备与应用
CN108384877A (zh) * 2018-04-17 2018-08-10 南京农业大学 BcGGP基因的InDel分子标记引物及应用
CN108384877B (zh) * 2018-04-17 2021-05-07 南京农业大学 BcGGP基因的InDel分子标记引物及应用
CN112708687A (zh) * 2021-02-04 2021-04-27 瑞安市人民医院 肠道菌群在肝性脑病检测中的应用
CN112708687B (zh) * 2021-02-04 2021-11-09 瑞安市人民医院 肠道菌群在肝性脑病检测中的应用
CN113265434A (zh) * 2021-05-19 2021-08-17 吉林大学 一种合成udp-半乳糖及合成半乳糖基化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA00012246A (es) 2002-10-17
AU4205199A (en) 1999-12-30
JP2002517256A (ja) 2002-06-18
CA2331198A1 (en) 1999-12-16
EP1084267A4 (en) 2001-12-05
WO1999064618A1 (en) 1999-12-16
EP1084267A1 (en) 2001-03-21
US20020012979A1 (en) 2002-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1314950A (zh) 微生物和植物中的维生素c生产
CN100347308C (zh) 合成有机产物的方法和材料
CN1117870C (zh) 生产核苷－5’－磷酸酯的方法
CN1105778C (zh) 核苷－5’－ 磷酸酯的制造方法
CN1305529A (zh) 利用微生物生产类异戊二烯化合物的方法和检测具有抗菌或除草活性的化合物的方法
CN1415014A (zh) 通过基因扩增增加赖氨酸产量
CN1298855C (zh) 在宿主细胞中生成产物的方法
CN1688690A (zh) 大肠杆菌appa肌醇六磷酸酶突变体
CN1486366A (zh) 合成有机产物的方法和材料
CN1065277C (zh) 阿凡曼菌素的制备方法
CN1198777A (zh) 有关谷氨酸脱氢酶α－和β－亚基的新多肽和多核苷酸及用法
JP4573365B2 (ja) 改良された性質を有する形質転換微生物
CN1688689A (zh) 醛脱氢酶基因
CN1882691A (zh) 对l－抗坏血酸进行微生物生产的方法
CN1303921A (zh) 连续发酵方法
CN1993377A (zh) 丙氨酸2,3氨基变位酶
CN1172003C (zh) N-乙酰神经氨酸的制造方法
CN1183472A (zh) 新的醇醛脱氢酶
CN1243102C (zh) 用于制备l－抗坏血酸和d－异抗坏血酸的微生物方法和微生物
CN1452656A (zh) 脂肪氧合酶
CN1484708A (zh) 由酵母生产抗坏血酸
CN1237206A (zh) 编码具有糖转移活性的蛋白质的基因
CN1439054A (zh) 通过遗传改变莽草酸路径来改变生物体中精细化学品含量
CN1247230A (zh) 醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因
CN1788087A (zh) 醋酸菌的乙醇脱氢酶基因

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
C10 Entry into substantive examination
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication