CN1243102C - 用于制备l－抗坏血酸和d－异抗坏血酸的微生物方法和微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于从2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸或它们各自的钠盐、钾盐或钙盐制备L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸或它们各自的钠盐、钾盐或钙盐的方法，该方法涉及在大约30℃-大约100℃的温度和大约1-大约6的pH条件下于溶液中将各自为游离酸或其钠盐、钾盐或钙盐形式的2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸与嗜酸性耐热微生物细胞一起孵育，以形成L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸或它们的适合盐，然后从该溶液中分离所述产物。L-抗坏血酸(维生素C)被广泛应用于医疗保健和食品、动物饲料如鱼料和化妆品中。D-异抗坏血酸主要作为抗氧化剂用作食品添加剂。
Description
本发明涉及用以制备L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸及它们的盐的一种新的微生物方法。更具体地说，本发明涉及采用嗜酸性耐热微生物，分别从2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸制备L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸，或从这些起始物的适合盐制备相应的盐的一种新方法。L-抗坏血酸(维生素C)不仅广泛用于医疗保健也广泛用于食品、动物饲料如鱼料、和化妆品。D-异抗坏血酸主要作为抗氧化剂用于食品添加剂。
通过熟知的Reichstein方法(Helv.Chim.Acta
17，311-328，1934)已从D-葡萄糖生产L-抗坏血酸。在这一多步骤方法中，通过化学方法从中间物2-酮-L-古洛糖酸得到L-抗坏血酸。这一方法用于商业用途已有60余年，期间有许多化学和技术上的改进以提高达到中间物D-山梨糖醇、L-山梨糖、二丙酮基-L-山梨糖、二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-L-古洛糖酸和2-酮-L-古洛糖酸甲酯，和终产物L-抗坏血酸的每一个步骤的效率。D-山梨糖醇转化成L-山梨糖是唯一的微生物步骤，其余都是化学步骤。将二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸转化成L-抗坏血酸有两种不同的方法：1)去保护以得到2-酮-L-古洛糖酸，随后用甲醇酯化及碱催化环化；和2)直接从受保护的或去保护的2-酮-L-古洛糖酸用酸催化环化为L-抗坏血酸。这些转化过程必须在非水性或少水的反应介质里进行。无论从环保还是经济的角度出发，优选用无有机溶剂的反应。
而D-异抗坏血酸从D-葡萄糖经2-酮-D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸甲酯制备，2-酮-D-葡糖酸本身能从属于假单胞菌属的菌株通过发酵产生。
人们投入许多时间和精力来寻找用微生物生产L-抗坏血酸的其它方法。关于用微生物生产L-抗坏血酸的研究大多数集中在中间物2-酮-L-古洛糖酸的生产上，特别是从L-山梨糖(G.Z.Yin等，Sheng Wu HsuehPao.20，246-251，1980；A，Fujiwara等，EP 213 591；T.Hoshino等，US专利4960695；和I.Nogami等，EP 221707)，D-山梨糖醇(A.Fujiwara等，EP213591；T.Hoshino等，US专利5,312,741；M.Niwa等，WO95/23220；和S.F.Stoddard等，WO 98/17819)或从D-葡萄糖经2，5-二酮-葡糖酸用单一或混合或重组培养物(T.Sonoyama等，Appl.Environ.Micvobiol.43，1064-1069，1982；和S.Anderson等，科学(Science)230，144-149，1985)生产。然后2-酮-L-古洛糖酸能用上述化学方法转化为L-抗坏血酸。
最近在美国专利6,022,719(J.C.Hubbs)里报道过将2-酮-L-古洛糖酸酯转化成L-抗坏血酸的生物学方法。这份专利里描述了一种通过2-酮-L-古洛糖酸或其酯与选自蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶的水解酶催化剂接触来生产L-抗坏血酸的方法。该专利举例说明了从2-酮-L-古洛糖酸的酯如2-酮-L-古洛糖酸丁酯形成L-抗坏血酸，而不是从2-酮-L-古洛糖酸自身来形成L-抗坏血酸。例如，该专利公开了，Candida antarticaB脂肪酶在8.6％甲醇中、pH3.1-3.2、38℃时催化从1％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸形成413-530毫克/升2-酮-L-古洛糖酸甲酯而不是L-抗坏血酸的反应。Candida antartica B脂肪酶在酸性pH下对2-酮-L-古洛糖酸，一种α-酮-羧酸，有明显的酯合成活性，但这种脂肪酶的分子内酯形成可以忽略不计。
除了水解酶反应，酯键合成例如蛋白质(氨基酯)，脂肪酸酯(羧基酯)，和核苷酸链(磷脂)的酯键合成在细胞中的功能活性也是很强的。与水解酶的逆向反应相比，甚至在水相中，该反应仍单方向进行并很少被产物所抑制。这类反应系统需要活化酯如活化的转移核糖核酸(tRNA)，腺苷三磷酸(ATP)和乙酰辅酶A(acyl-CoA)等的供应，它们在细胞能量转换代谢中产生。该反应的“体外”重建需要能量供体如ATP的化学计量供应或再生系统，这些能量供体对于商业化生产维生素和精细化学产品如L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸是昂贵的。商业上，利用完整细胞是优选方法之一。
如上所述，2-酮-L-古洛糖酸经2-酮-L-古洛糖酸γ-内酯化学转化为L-抗坏血酸是一个伴有水分子消除的酸催化反应。该反应的主要原理是羧基酯键的形成以在2-酮-L-古洛糖酸分子中提供一个γ内酯环。因此，特别是在水相中，该平衡反应的最终状态由物理化学条件来确定。通过化学转化从2-酮-L-古洛糖酸形成L-抗坏血酸的产率甚至在水相中也是可观的，但对于商业应用则是不够的。为了花费的有效性和符合环境要求，在水相中或含有低浓度有机溶剂的水相中采用这一方法是非常理想的。因此，对于水相中的生产，期望该化学转化的某种生物学增强。很明显，高温和酸性(低)pH是提高该化学反应效率的理想反应参数。但是，通常，已知这些物理化学条件与在中温条件下存活的大多数微生物的细胞生活和/或细胞活性是生物学上不相容的。耐热性或嗜酸性微生物的利用是熟知的，但对热和酸都耐受的嗜酸性耐热微生物的应用例子很少。
令人惊奇的是，现在已经发现，在生物学极端条件如高温和低(酸性)pH值下，通过嗜酸性耐热微生物能够有利地在水相中直接将游离酸或钠、钾或钙盐形式的2-酮-L-古洛糖酸转化为L-抗坏血酸或适宜的盐类。还令人惊奇地发现，可以在生物学极端条件下通过嗜酸性耐热微生物有利地在水相中直接将游离酸或钠、钾或钙盐形式的2-酮-D-葡糖酸转化为D-异抗坏血酸或适宜的盐类。
因此，本发明提供了一种用嗜酸性耐热微生物从2-酮-L-古洛糖酸或其钠盐、钾盐或钙盐生产L-抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，或从2-酮-D-葡糖酸或其钠盐、钾盐或钙盐生产D-异抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐的方法。更具体地，本发明方法是用于从2-酮-L-古洛糖酸或它的钠盐、钾盐或钙盐产生L-抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，或从2-酮-D-葡糖酸或它的钠盐、钾盐或钙盐产生D-异抗坏血酸或它的钠盐钾盐或钙盐的方法，该方法包括在高温即大约30℃-大约100℃和酸性pH即1-6的pH下于溶液中，将各自作为游离酸或钠盐、钾盐或钙盐的2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸，与能够从2-酮-L-古洛糖酸或它的钠盐、钾盐或钙盐产生和/或促进从2-酮-L-古洛糖酸或其钠盐、钾盐或钙盐产生L-抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，或从2-酮-D-葡糖酸或它的钠盐、钾盐或钙盐产生和/或促进从2-酮-D-葡糖酸或或其钠盐、钾盐或钙盐产生D-异抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐的嗜酸性耐热微生物的细胞共同孵育，以形成L-抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，或形成D-异抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，然后从这种溶液中分离L-抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐，或D-异抗坏血酸或它的钠盐、钾盐或钙盐。
本发明的进一步实施方案是具有以下特征、能产生L-抗坏血酸或其盐或D-异抗坏血酸或其盐的微生物：
(a)当采用Genetyx-SV/R软件程序时，与SEQ ID NOs：1、2或3至少98.1％一致的rDNA序列；
(b)杆状形态；
(c)宽度为大约0.8微米；
(d)不能在厌氧条件下生长；
(e)表现出过氧化氢酶活性；
(f)其主要的脂肪酸是ω-环己基酸；
(g)能在pH3.0和60℃的温度下生长；
(h)不能在下述条件下生长：
pH 温度
3.0 30℃
6.5 60℃
6.5 30℃
(i)能够(1)从2-酮-L-古洛糖酸或其盐产生L-抗坏血酸或其盐，(2)从2-酮-D-葡糖酸或其盐产生D-异抗坏血酸或其盐，或(3)分别从2-酮-L-古洛糖酸或其盐和2-酮-D-葡糖酸或其盐产生L-抗坏血酸或其盐和D-异抗坏血酸或其盐。
为简洁起见，当应用于“2-酮-L-古洛糖酸”、“2-酮-D-葡糖酸”、“L-抗坏血酸”或“D-异抗坏血酸”时，“或其钠盐、钾盐或钙盐”或同等表述在下文中将各自主要表述为“或其盐”。而且，除非对存在的酸或其特定的盐形式作了明确说明，任何指定浓度的这些酸或它们的盐形式将以游离酸的形式为基础来表示，即使盐形式可能存在。
在本说明书中，术语“耐热微生物”通常指的是在高于大约55℃的温度下生长最佳的微生物，术语“嗜酸性微生物”指的是在酸性范围pH下，特别是低于大约pH6下生长最佳，而在中性范围pH即大约6-大约8的pH范围内没有生长的微生物。因此在本发明的上下文中，术语“嗜酸性耐热微生物”指的是一种同时具有这两种性质的微生物，即该微生物在高于大约55℃的温度和低于大约6的pH下具有最佳生长，而在大约6到大约8的pH范围内没有生长。为了本发明的目的，术语“嗜酸性耐热微生物”也包括嗜酸性耐热微生物的突变体。
本发明所用术语“生长”是指孵育20小时后能观察到菌落的形成。本发明所用术语“没有生长”指的是在孵育20小时后没有观察到菌落。
正常情况下，嗜酸性耐热微生物存在于原核生物中并可从其中分离，分类为古细菌(Archaea)和细菌(Bacteria)下。在古细菌域(domain)中，硫化叶菌属(Sulfolobus)(T.D.Brock等，Arch Mikrobiol.
84，54-68，1972)和热原体属(Thermoplasma)(M.DeRosa等，植物化学(Phytochemistry)
170，1416-1418，1970)是熟知的嗜酸性耐热微生物，酸菌属(Acidanus)(A.H.Segerer等，系统细菌学国际杂志(Int.J.Syst.Bacteriol.)
36，559-564，1986)、硫还原叶菌属(Desulfurolobus)(W.Zilling等，系统应用微生物学(Syst.AppL.Microbiol.)8，197-209，1986)、生金球菌属(Metallosphaera)(G.Huber等，系统应用微生物学12，38-47，1989)、Picrophilus属(C.Schleper等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)177，7050-7059，1995)和栖冥河菌属(Stygiolobus)(A.H.Segerer等，系统细菌学国际杂志
41，495-501，1991)也都是被报道为古细菌域的嗜酸性耐热微生物。在细菌域中，Acidimicrobium属(D.A.Clark等，微生物学(Microbiology)142，785-790，1996)、热酸菌属(Acidothermus)(F.Rainey等，FEMS Microbiol.lett.，
108，27-30，1993)、硫化杆菌属(Sulfobacillus)(R.S.Golovacheva等，微生物学
47，658-665，1978)和脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)(G.Darland等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)
67，9-15，1971；G.Deinhard等，系统应用微生物学
10，47-53，1987)均是嗜酸性耐热微生物。
可以在本发明中使用的嗜酸性耐热微生物是能够实现和/或促进从2-酮-L-古洛糖酸或其盐产生L-抗坏血酸或其盐，或从2-酮-D-葡糖酸或其盐产生D-异抗坏血酸或其盐的任何嗜酸性耐热微生物。
用于本发明的嗜酸性耐热微生物能获自任何类型的天然来源，包括土壤和温泉，和人工来源，包括经过加工的酸性食品和饮料如果汁和混合的水果/蔬菜汁。
任何特定嗜酸性耐热微生物所表现出耐受的条件越极端，即温度越高并且pH值越低(越酸)，则在本发明的方法中越是优选采用该微生物。除对热和酸耐受外，当在高温和酸性pH孵育时还对溶液中高浓度，即大约5％-大约20％(w/v)的2-酮-L-古洛糖酸或其盐或2-酮-D-葡糖酸或其盐具有耐受性的嗜酸性耐热微生物，是该方法更为优选采用的。而且，对于有效即快速的细胞的生产，优选具有本发明所描述的需氧和化能有机营养特性的嗜酸性耐热微生物。
优选的嗜酸性耐热微生物来源于原核生物，包括细菌和古细菌。更优选的微生物是嗜酸性耐热细菌。尤其优选的嗜酸性耐热微生物是属于脂环酸杆菌属的细菌。
在嗜酸性耐热细菌当中，脂环酸杆菌属包括了大多数严格需氧的、孢子形成、杆状、化能有机营养细菌。这些微生物起初被定为芽孢杆菌属。然而，基于16S rRNA基因序列比较的系统发生分析表明，脂环酸杆菌属属于芽孢杆菌属的低G+C革兰氏阳性谱系中的一个不同的系(J.D.Wisotzkey等，系统微生物学国际杂志
42，263-269，1992)。脂环酸杆菌属(A.)中三个有效命名的种是：酸热脂环酸杆菌(A.acidocaldarius)(DSM 446T，G.Darland等，普通微生物学杂志67，9-15，1971)、酸土脂环酸杆菌(A.acidoterrestris)(DSM 3922T，G.Deinhard等，系统应用微生物学
10，47-53，1987)和环庚基脂环酸杆菌(A.cycloheptanicus)(DSM 4006T，G.Deinhard等，系统应用微生物学10，68-73，1987)。除了16S rRNA基因的序列比较外，这些微生物最易于区别的特征是具有ω-环己基脂肪酸(ω-环己基十一酸、ω-环己基十三酸)结构单元、或ω-环庚基脂肪酸(ω-环庚基十一酸、ω-环庚基十三酸)结构单元(L.Albuquerque等，系统进化微生物学国际杂志(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.)
50，451-457，2000)。迄今为止，已从地热地带的酸性土壤中及某些非地热地带土壤中分离了几种具有脂环酸杆菌属特征的菌株。除了土壤样品，它们还从许多酸性饮料中作为酸败细菌被分离(G.Cerny等，Z Lebens Unters Forsch 179，224-227，1984；K.Yamazaki等，生物科学生物技术生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)60，543-545，1996；M.Niwa等，日本专利申请(Kokai)140696/1996)。最近，提出在脂环酸杆菌属中除了这三个有效命名的物种外存在基因种的广泛多样性(A.Hiraishi等，普通应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)，43，295-304，1997；L.Albuquerque等，系统进化微生物学国际杂志
50，451-457，2000)。
用于本发明的优选嗜酸性耐热微生物具有如下特征：
1)嗜酸性耐热生长：
在60℃ pH3.0时20小时后表现出生长，而在30℃ pH3.0、30℃ pH6.5和60℃ pH6.5的所有情况下20小时后均不表现出生长。
2)ω-环己基脂肪酸：
根据气相色谱-质谱联用(GC/MS)分析具有ω-环己基脂肪酸结构单元。
3)16S rRNA的序列相似性：
对编码rRNA序列的16S基因的系统发生分析证实脂环酸杆菌属的定位(allocation)。
如上所述，本发明所用嗜酸性耐热微生物能从天然或人工来源获得，或通过商业途径从培养物保藏处获得。为从这些天然和人工来源中分离该微生物，将适宜的微生物来源物，例如天然来源物土壤或温泉，或人工来源物经加工的酸性食品或饮料，在有氧条件下方便地培养在补充了适宜营养物的含水培养基中或固体培养基上。培养便利地在高于大约40℃的温度和低于大约5的pH下进行，优选在高于大约50℃和pH低于大约4下进行，更优选在高于大约55℃和pH低于大有3.5下进行。尽管培养期随所用pH、温度和营养介质而变化，但12小时到几天的培养期通常将给出满意的结果。
用于本发明的属于脂环酸杆菌属的尤其优选的嗜酸性耐热微生物是可从德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorgismen undZellkulturen GmbH，DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国获得的脂环酸杆菌属DSM 13652和DSM 13653，从在日本的IwatePrefecture采集的土壤标本中分离的新菌株脂环酸杆菌属NA-20和NA-21，以及从在日本Kanagawa Prefecture的Kamakura-shi购买的商业酸性饮料，尤其是果汁中分离到的脂环酸杆菌属FJ-21。
所有五种特别优选的嗜酸性耐热微生物按布达佩斯条约于2000年8月16日保藏在DSMZ，并被分配了以下保藏号：
脂环酸杆菌属：DSM 13652
脂环酸杆菌属：DSM 13653
脂环酸杆菌属NA-20：DSM 13649
脂环酸杆菌属NA-21：DSM 13650
脂环酸杆菌属FJ-21：DSM 13651
以上提到的最后三个嗜酸性耐热微生物是新的，代表了本发明的又一方面。
如上所述，在本发明中还可以使用以上提到的嗜酸性耐热微生物的突变物。用于本发明的微生物突变物可以通过诱变剂如用紫外线、X射线、γ射线进行辐射或与亚硝酸盐或其它适合的诱变物质接触，处理野生型菌株来诱导。也可以通过从由于自发突变所产生的克隆中分离突变体，这一过程可由技术人员为达到此目的采用已知方法来实现。在专业出版物中已描述过许多这些方法，如1973年日本东京Kodansha Scientific公司出版的Y.Tajima，T.Yoshida和T.Kada所编写的“化学诱变剂(Chemical Mutagens)”。
而且，还可以使用脂环酸杆菌属DSM 13652、DSM 13653、NA-20(DSM13649)、NA-21(DSM 13650)或FJ-21(DSM 13651)的生物学上和分类学上均等的培养物。本发明中所述术语“生物学上和分类学上均等的培养物”是指具有如下生物学和分类学特点的培养物：
-生长：需氧并嗜酸耐热
-孢子：形成
-细胞形态：杆状
-主要脂肪酸：ω-环己基脂肪酸
-系统发生位置：与归类于脂环酸杆菌属的菌株如脂环酸杆菌属DSM13652、脂环酸杆菌属UZ-1、脂环酸杆菌属MIH-2、脂环酸杆菌属KHA-31和酸热脂环酸杆菌DSM446T最近(在16S rRNA基因的核苷酸序列上有超过90％的一致性)，其中该核苷酸的一致性使用核苷酸序列同源性程序(Genetyx-SV/R，4.0版本，SoftwareDevelopment公司，东京，日本)以及默认条件(待比较的单位大小＝1)来确定。
以上提到的嗜酸性耐热微生物可以以任何形式使用，具体是以完整细胞、修饰的细胞或固定化细胞的形式使用。固定细胞的方法是本领域所熟知的(见例如W.M.Fogarty等，微生物酶学和生物技术(MicrobialEnzymes and Biotechnology)，第2版，ELsevier Applied Science，第373-394页(1983)，和日本专利公开文本61265/1994)。
可以采用下述方法筛选嗜酸性耐热微生物以评价其对于本发明方法的适用性：
在含有底物2-酮-L-古洛糖酸或其盐或2-酮-D-葡糖酸或其盐并补充了适当营养物的液体培养基中，于适度的有氧条件下，即在不进行强制通气或剧烈振荡的有氧孵育下，培养适宜的微生物来源。为了进行该培养，底物2-酮-L-古洛糖酸或其盐，或2-酮-D-葡糖酸或其盐的浓度可以是从大约3％(w/v)到大约20％(w/v)，优选从大约4％(w/v)到大约18％(w/v)，更优选从大约5％(w/v)到大约16％(w/v)。可以在pH大约0.5-大约4.0、优选大约1.0-大约3.5、更优选大约1.5-大约3.0，温度大约45℃-大约90℃、优选大约50℃-大约85℃、更优选大约55℃-大约80℃的条件下，进行该孵育。尽管孵育期随所用pH、温度和营养培养基的变化而改变，但大约12个小时到几天的孵育期通常将取得良好的效果。孵育后，所鉴别的嗜酸性耐热微生物在本发明方法中的适用性可以通过与无嗜酸性耐热微生物的“空白”孵育的生产能力相比，其L-抗坏血酸或其盐、或D-异抗坏血酸或其盐的生产能力(产物的大量积累)水平来评估，但是优选比空白孵育的生产能力增加2倍以上的生产能力。
在上述孵育中，除了高温和酸性pH外，还存在高浓度的底物2-酮-L-古洛糖酸或其盐、或2-酮-D-葡糖酸或其盐，即使对嗜酸性耐热微生物来说，这可能也是一种极端的物理化学条件。为了保持(维持)活细胞状态，在高温和酸性pH下对2-酮-L-古洛糖酸或其盐、或2-酮-D-葡糖酸或其盐的耐受性可能是用于本发明方法的嗜酸性耐热微生物的一个重要特性。
本发明方法中采用嗜酸性耐热微生物的细胞从2-酮-L-古洛糖酸或其盐产生和/或增强产生L-抗坏血酸或其盐，或从2-酮-D-葡糖酸或其盐产生和/或增强产生D-异抗坏血酸或其盐的孵育在水相溶液中进行。水相溶剂优选单纯的水，即没有添加任何其它的溶剂。然而，如果采用添加溶剂，则优选低级烷醇如甲醇。用于从2-酮-L-古洛糖酸产生和/或增强产生L-抗坏血酸，或从2-酮-D-葡糖酸产生和/或增强产生D-异抗坏血酸(其中这些产物和底物均以游离酸或相应的钠、钾或钙盐的形式存在)的孵育需要营养物如可同化的碳源、可消化或同化的氮源和无机物、痕量元素、维生素、L-氨基酸以及其它生长促进因子。可以采用D-葡萄糖、蔗糖、D-葡糖酸-δ-内酯、淀粉等作为可同化的碳源。各种有机物或无机物可用作氮源，如酵母抽提物、肉膏、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐如硫酸铵等。硫酸镁、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、氯化钙等可用作无机物。而且，可以采用钙、镁、锌、锰、钴、和铁的硫酸盐、盐酸盐或磷酸盐作为微量元素。尤其适合用作无机盐的是磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。而且如果有必要，可以添加常规营养因子或防沫剂，如动物油、植物油或矿物油。
孵育条件可随所用嗜酸性耐热微生物的种属特点而改变。在对于孵育而言是高温的温度，即在大约30℃到大约100℃、优选大约40℃到大约95℃、最优选大约55℃到大约95℃的温度，以及酸性pH，尤其是pH大约1.0-大约6.0、优选大约1.0-大约4.5、最优选大约1.5-大约3.0的条件下，于有氧条件下进行该孵育。通常情况下，大约1-大约100个小时范围内的孵育期已足够。
如果适当的话，用于孵育的2-酮-L-古洛糖酸或其盐、或2-酮-D-葡糖酸或其盐的适合初始浓度取决于所采用的特定嗜酸性耐热微生物。然而，通常采用各自基于(等同)游离酸量的大约5％(w/v)到大约20％(w/v)浓度的2-酮-L-古洛糖酸或其盐、或2-酮-D-葡糖酸或其盐。
本发明的方法表现出如下特点：
a)L-抗坏血酸或其盐的比生产速率
例如(在有8％(w/v)的2-酮-L-古洛糖酸底物和2.5g/L的L-抗坏血酸产物时，由NA-21菌株(DSM 13650)于59℃、pH2.5条件下作用20小时)，L-抗坏血酸的比生产速率估计为大约每小时每毫克粗细胞蛋白产2.3mg L-抗坏血酸。这是以下文实施例7中给出的结果为基础的。
b)产物抑制：
本发明中该生产很少被产物L-抗坏血酸或其盐、或D-异抗坏血酸或其盐所抑制。本发明方法中的生产可以提供比通过水相可逆转反应所获得的更高的转化产量。
在溶液中形成的L-抗坏血酸或其盐、或D-异抗坏血酸或其盐可以采用本领域已知的常规方法来分离和纯化。如果产物是各自酸的钠盐、钾盐或钙盐，则如果需要的话可以采用本领域已知的常规方法将该盐转化成相应的游离酸。在所有情况下，产物的分离都可以通过基于产物和杂质(包括未转化的底物)之间在性质上例如可溶性、吸附能力、电化学性质和两种溶剂中的分布系数上的差异的方法来实现。吸附剂如离子交换树脂的使用是一个便利的产物分离方法例子。电透析系统的使用是另一个便利的产物分离方法例子。如果产物达不到其随后应用所需的足够纯度，则可以通过常规方法如重结晶和层析来纯化。
L-抗坏血酸可以通过联合使用具有将2-酮-L-古洛糖酸转化为L-抗坏血酸或将2-酮-D-葡糖酸转化为D-异抗坏血酸活性的生物，与具有L-山梨糖/L-山梨糖酮(L-sorbosone)脱氢酶和D-山梨糖醇脱氢酶活性并能将D-山梨糖醇和/或L-山梨糖转化成2-酮-L-古洛糖酸的生物(见A.Fujiwara等，EP 213 591；T.Hoshino等，美国专利4,960,695；T.Hoshino等，美国专利5,312,741)例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)DSM 4025，采用一个容器一步转化或两个容器两步转化，从L-山梨糖或D-山梨糖醇产生。
D-异抗坏血酸可以通过联合使用具有将2-酮-L-古洛糖酸转化为L-抗坏血酸或将2-酮-D-葡糖酸转化为D-异抗坏血酸活性的生物，与具有D-葡萄糖脱氢酶(Ameyama等，农业生物化学(Agric Biol.Chem.)48：851-861，1981)和/或D-葡萄糖酸酯脱氢酶(Shinagawa等，农业生物化学48：1517-1522，1984)活性并能将D-葡萄糖和/或D-葡糖酸转化为2-酮-D-葡糖酸的生物例如Gluconobacter Dioxyacetonicus IFO 3271，采用一个容器一步转化或两个容器两步转化，从D-葡萄糖或D-葡糖酸产生。
以下实施例是对本发明方法的说明而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
筛选嗜酸性耐热微生物：
A)从土壤样品中分离
在日本Iwate Prefecture的酸性温泉区域收集的土壤样品用于此筛选。从0.9％(w/v)氯化钠溶液中的土壤样品回收嗜酸性耐热微生物，并通过将该溶液涂布在573c(pH3.5)琼脂平板培养基上进行分离，其中所述培养基含有0.1％(w/v)D-葡萄糖、0.13％(w/v)硫酸铵、0.1％(w/v)酵母抽提物、0.15％(w/v)磷酸二氢钾、0.025％(w/v)七水硫酸镁、0.007％(w/v)二水氯化钙和2％(w/v)琼脂(用6N的硫酸调节pH；D-葡萄糖和琼脂分开灭菌)。60℃孵育20个小时后，随机挑取在pH3.5和60℃下生长的单菌落，并通过将其在同样条件下三次转移至同样的琼脂平板培养基上进行纯化。对所获的分离微生物编号，并指定为属于“NA”系列。例如，一个这样的分离微生物被命名为NA-20，另一个命名为NA-21。
B)从酸性饮料中分离
将各种商业酸性饮料例如果汁产品和混合的水果/蔬菜汁产品用于从其中分离嗜酸性耐热微生物的实验。在每种情况中，对1毫升商业产品进行离心，所获沉淀用1毫升无菌蒸馏水洗涤，得到洗过的沉淀。将沉淀重悬于0.1毫升无菌蒸馏水中，并将该重悬物涂布在573c培养基的琼脂平板上。然后平板在60℃孵育1到3天以观察单菌落，通过将它们在同样条件下三次转移至相同的琼脂平板培养基上对其进行纯化。对所获的分离微生物编号，并指定为属于“FJ”系列。例如，一个这样的分离微生物被命名为FJ-21。
实施例2
筛选用于从2-酮-L-古洛糖酸制备L-抗坏血酸的NA-和FJ-系列分离微生物
通过以下活细胞反应系统进行从2-酮-L-古洛糖酸制备L-抗坏血酸的筛选。LM101型培养基、矿物质混合物[MM]、维生素混合物[VM]和氨基酸混合物[AM]的组成列于下表1。
表1
表1a：培养基(盐基质)
| LM101c LM101d | |
| D-葡萄糖硫酸铵磷酸二氢钾七水硫酸镁氯化钠氯化钾二水氯化钙 | 变量 变量4 1.31.5 1.50.25 0.250.1 0.10.1 0.10.07 0.07 |
[g/L]
| pH | 2.5a 2.5b |
a：加入2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物后，用6N硫酸调节pH值
b：加入2-酮-L-古洛糖酸后，用6N氢氧化钾调节pH值。
表1b
| 矿物质混合物[×1000浓缩物] | |
| 五水硫酸铜五水硫酸亚铁五水硫酸锰五水硫酸锌五水氯化钴五水钼酸钠 | 620600600600790700 |
[mg/L]
表1c
| 维生素混合物[×100浓缩物] | |
| 生物素泛酸钙(+)叶酸环己六醇一水磷酸吡哆醛核黄素盐酸硫胺素烟酰胺 | 10010010020010010100100 |
[mg/L]
表1d
| L-氨基酸混合物[×5浓缩物] | |
| 盐酸精氨酸半胱氨酸谷氨酰胺一水盐酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸盐酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸 | 63012014602102602603607616524050180230 |
[mg/L]
将按实施例1中所述分离的NA和FJ系列嗜酸性耐热微生物培养在573c琼脂平板培养基上(pH3.5，60℃，15个小时)，然后接种在含有0.25％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus[“plus”意为补充了MM(×1浓度)、VM(×0.1浓度)和AM(×0.01浓度)]培养基中。在试管中有氧培养(60℃，8小时)后，离心收集所获细胞，重悬于LM101c盐基质中(660纳米处的光密度[OD660]为大约25)用作菌种细胞。按最终OD660为0.2的量将细胞接种在0.8毫升含6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物和0.2％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus培养基(pH2.5)中。在59℃适度通气条件下孵育所获细胞反应混合液；将顶端带有一个针孔(0.65毫米)的试管(2.0毫升微试管，Eppendorf，德国)在旋转振荡(120rpm，半径为45毫米)下孵育。通过HPLC分析确定L-抗坏血酸的产量：YMC-PackPolyamine II柱(ID.4.6×150毫米；YMC公司，日本)，在264纳米处，流动相溶剂含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氢铵，流速为1.5毫升/分钟。按孵育期间减少的重量估计经蒸发丢失的水量，并加入补偿的水量以保持原体积。经过23个小时的培养后，与“有氧空白”和“厌氧对照”两个对照值比较每种菌株的L-抗坏血酸产量：“有氧空白”是采用相同的培养基和条件但不接种细胞时所得到的L-抗坏血酸产量，“厌氧对照”是在一个带氩气的密闭微试管中采用相同的培养基但不接种细胞时所得到的L-抗坏血酸产量。作为筛选结果，选择NA-20、NA-21和FJ-21菌株作为有效的L-抗坏血酸生产株；它们分别产生1.07、1.19和1.23克/升L-抗坏血酸。有氧空白和厌氧对照中L-抗坏血酸的量分别是0.10和0.30克/升。
除了用1.2％(w/v)2-酮-D-葡糖酸代替6％(w/v)2-酮L-古洛糖酸钠一水化物作为底物外，按以上所述在相同条件下，用2-酮-D-葡糖酸(含有1.5mol/mol H2O的半钙盐(hemicalcium salt)，SIGMA化学公司，St.Louis，MO，USA)进行活细胞反应。L-异抗坏血酸的产量采用相同的HPLC分析方法确定。在培养23个小时后NA-21菌株产生0.051克/升D-异抗坏血酸。有氧空白和厌氧对照中D-异抗坏血酸的量均检测不到(低于0.001克/升)。
实施例3
所分离的微生物的分类
所分离的三种微生物NA-20、NA-21和FJ-21是需氧、形成孢子的杆状细菌，下表2中总结了这些分离物的表型特征。
表2
| NA-20 NA-21 FJ-21 | |
| 形状大小(宽度，微米)(长度，微米)革兰氏染色游动性厌氧生长氧化酶试验过氧化氢酶试验主要脂肪酸生长在apH 温度(℃)3.0 603.0 306.5 606.5 30 | 杆状 杆状 杆状0.8 0.8 0.82-3 3-5 2-3可变 可变 阴性+ + -- - -- - -+ + +ω-环己基酸 ω-环己基酸 ω-环己基酸(C17和19) (C17和19) (C17和19)+ + +- - -- - -- - - |
a：在573c琼脂平板上生长20个小时
这些微生物在pH3.0/60℃经20小时后表现出生长，但在pH3.0/30℃、pH6.5/30℃和pH6.5/60℃20小时后均未表现出生长。因此将它们定性为嗜酸性耐热芽孢杆菌组细菌。脂肪酸的GC/MS分析表明，这三种分离的微生物的主要成分和所调查的作为对照的酸热脂环酸杆菌DSM466T是一样的，这提示ω-环己基脂肪酸是这三种分离微生物和酸热脂环酸杆菌DSM 466T的主要成分。用16S rRNA基因试剂盒(PE AppliedBiosystems，USA；对于NA-20，NA-21和FJ-21菌株分别是SEQ ID NOs：1、2和3)测定这些分离的微生物的16S rRNA基因序列，并用于BLAST检索程序(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215，403-410，1990；核酸研究(Nucleic Acids Res.)25，3389-3402，1997)。采用核苷酸序列同源性程序(Genetyx-SV/R，4.0版本，Software Development公司，东京，日本)和默认条件(待比较的单位大小＝1)进行的序列相似性分析表明，这些分离的微生物在种系发生上可能属于脂环酸杆菌属。下表3显示了这些分离的微生物和参考菌株(包括三种类型的菌株)之间16S rRNA基因序列中的两两序列一致性水平(％)。
表3
16S rRNA基因的一致性(％)
| 序列录入号 | NA-20 NA-21 FJ-21 |
| 酸热脂环酸杆菌 DSM 446T X60742酸土脂环酸杆菌 DSM 3922T AJ133631环庚基脂环酸杆菌 DSM 4006T X51928脂环酸杆菌属 UZ-1 AB004579脂环酸杆菌属 MIH-2 AB004580脂环酸杆菌属 KHA-31 AB004581脂环酸杆菌属 DSM 13652 AJ133634 | 96.9 97.0 98.394.0 94.1 94.592.6 92.6 92.999.5 99.6 97.899.5 99.6 97.899.2 99.3 97.699.0 99.1 97.6 |
| 脂环酸杆菌属 NA-20脂环酸杆菌属 NA-21脂环酸杆菌属 FJ-21 | 100.0 99.7 98.199.7 100.0 98.198.1 98.1 100.0 |
NA-20和NA-21的16S rRNA序列相互之间(99.7％)，以及和脂环酸杆菌属UZ-1、MIH-2、KHA-31的序列(普通应用微生物学杂志(J.Gen.Appl.Microbiol.)43，295-304，1997)以及脂环酸杆菌属DSM 13652的序列(99.0-99.6％)之间最为相似。FJ-21的序列与酸热脂环酸杆菌DSM446T、NA-20和NA-21的最相似(98.1-98.3％)。根据这些结果，将这三种分离的微生物归于脂环酸杆菌属，并分别命名为脂环酸杆菌属NA-20、NA-21和FJ-21。
在如实施例2中所述的相同筛选条件下，脂环酸杆菌属DSM 13652和13653分别从2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物产生0.91和0.95克/升L-抗坏血酸。
实施例4
碳源/能源和通氧的影响
在实施例2中所述的L-抗坏血酸制备方法中，采用含有0.2％(w/v)D-葡萄糖和6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物的培养基来维持细胞的生活。对采用脂环酸杆菌属NA-21进行的该制备，代替D-葡萄糖加入D-葡糖酸-δ-内酯[0.1％(w/v)]、蔗糖[0.1％(w/v)]或可溶性淀粉[1％(w/v)]，结果导致几乎同样的L-抗坏血酸产量，但不加碳源/能源则不会导致超过有氧空白的额外产量(见表4)。
表4
| 碳源 | [％w/v] | 细胞 | L-抗坏血酸[克/升]a |
| 蔗糖可溶性淀粉D-葡糖酸-δ-内酯D-葡萄糖D-葡萄糖没有碳源有氧空白 | 0.11.00.10.10.025-- | ++++++- | 0.690.650.760.800.660.100.09 |
a：13个小时后从6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物产生的产量。
在实施例2中描述的L-抗坏血酸制备方法中，为了细胞的存活，在适度有氧条件下进行该制备。采用脂环酸杆菌属NA-21，比较在有氧和厌氧条件下实施该方法的结果。处于一个完全密闭的微试管中的相同反应混合液在用氩气气化后用作厌氧条件下的系统。有氧条件在38小时内都给出近线性的产量产生，而厌氧条件甚至在15个小时后也未使该生产成为可能(见表5)。
表5
有氧条件下L-抗坏血酸的产生(克/升)
| 反应时间[小时]0 15 23 38 | |
| 有细胞无细胞 | 0.00 0.80 1.29 2.100.00 0.12 0.13 0.17 |
厌氧条件下L-抗坏血酸的产生(克/升)
| 反应时间[小时]0 15 23 38 | |
| 有细胞无细胞 | 0.00 0.79 0.87 1.050.00 0.25 0.36 0.59 |
实施例5
采用NA-21菌株或其衍生物制备L-抗坏血酸。
通过采用脂环酸杆菌属NA-21，检查从6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物进行的L-抗坏血酸制备。按实施例2所述的相同方法制备菌种细胞。按最终OD660为0.2的量将细胞接种在0.8毫升含有6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸钠一水化物和0.1％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus(pH2.5)培养基中。在适度有氧条件下59℃孵育所获细胞反应混合物；将顶端带有针孔(0.65毫米)的试管旋转振荡(120rpm，45毫米半径)孵育。由脂环酸杆菌属NA-21.所产生的L-抗坏血酸产量线性持续了38小时，达到2.23克/升L-抗坏血酸。生产能力明显比有氧空白和厌氧对照更为有效(见表6)。
表6
OD660
| 反应时间[小时]0 15 23 38 | |
| 有细胞 | 0.25 0.22 0.20 0.15 |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 0.00 0.00 0.00 0.000.00 0.00 0.00 0.00 |
pH
| 反应时间[小时]0 15 23 38 | |
| 有细胞 | 2.46 2.46 2.45 n.d |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 2.46 2.44 2.43 n.d2.46 2.44 2.44 n.d |
n.d.：未测定
L-抗坏血酸的产量(克/升)
| 反应时间[小时]0 15 23 38 | |
| 有细胞 | 0.00 0.76 1.25 2.23 |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 0.00 0.12 0.13 0.170.00 0.25 0.36 0.59 |
通过常规突变，之后进行下述筛选步骤，从原始菌株脂环酸杆菌属NA-21先后得到2个衍生物MA-10和MB-6。紫外辐射后，从原始菌株选择对更高浓度的2-酮-L-古洛糖酸具有耐受性的菌株MA-10(在60℃pH2.5时从10％(w/v)明显提高了大约1％(w/v))。随后，在用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理后，从MA-10选择到对更高温度具有耐受性的菌株MB-6(在11％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和pH2.5时从60℃明显提高了大约2℃)。通过上述相同的活细胞反应，在62℃和pH2.5下采用11％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和含有0.5倍浓度的LM101d盐基质、0.25％(w/v)D-葡萄糖、0.1倍浓度的MM、0.05倍浓度的VM和0.005倍浓度的AM的培养基，比较原始菌株、MA-10和MB-6的L-抗坏血酸生产能力。在第23个小时原始菌株、MA-10和MB-6分别生产2.02、2.22和2.80克/升L-抗坏血酸。有氧空白和厌氧对照分别生产1.63和1.94克/升L-抗坏血酸。
实施例6
采用细胞和D-葡萄糖补料从8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸制备L-抗坏血酸
通过采用脂环酸杆菌属NA-21，检查采用细胞和D-葡萄糖补料从8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸进行的L-抗坏血酸制备。按实施例2所述的相同方法制备菌种细胞。按最终OD660为0.25的量将细胞接种在0.8毫升含有8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和0.15％(w/v)D-葡萄糖的LM101d-plus(pH2.5)培养基中。在适度有氧条件下59℃孵育所获细胞反应混合物；将顶端带有针孔(0.65毫米)的试管旋转振荡(120rpm，45毫米半径)孵育。作为点补料，在第24小时供应菌种细胞和D-葡萄糖(分别是0.25OD660和0.15％(w/v)终浓度)。由脂环酸杆菌属NA-21产生的L-抗坏血酸产量在47个小时之前线性持续增长，达到3.70克/升L-抗坏血酸(见表7)。
表7
L-抗坏血酸的产量(克/升)
| 反应时间[小时] | 0 15 23 39 47 | 71 87 95 |
| 有细胞 | 0.00 1.13 1.97 2.99 3.70 | n.d n.d n.d |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 0.00 0.23 0.32 0.35 0.360.00 0.49 0.74 1.20 1.52 | 0.39 0.32 0.282.26 2.57 2.44 |
n.d.：未测定
另一方面，厌氧对照的产量在大约80个小时之后达到最大，约为2.5g/L L-抗坏血酸。
实施例7在有L-抗坏血酸时从8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸进行的L-抗坏血酸制备
通过采用脂环酸杆菌属NA-21，检查在有0-4.5克/升L-抗坏血酸时从8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸进行的L-抗坏血酸制备。按实施例2所述的相同方法制备菌种细胞。按最终OD660为0.25的量将细胞接种在0.8毫升含有0.1倍浓度的MM而不是1倍浓度的MM以及8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和0.20％(w/v)D-葡萄糖的LM101d-plus(pH2.5)培养基中。在适度有氧条件下59℃孵育所获细胞反应混合物；将顶端带有针孔(0.65毫米)的试管旋转振荡(120rpm，45毫米半径)孵育20小时。在第0小时(生产前)，向上述培养基加入0.0、1.1、2.3或4.5克/升L-抗坏血酸(产物)。脂环酸杆菌属NA-21的生产能力在有和无该产物时近乎相同。另一方面，厌氧对照的生产能力逐渐被存在的较高浓度的该产物所抑制(见表8)。
表8
来自0.0克/升的起始L-抗坏血酸
| L-抗坏血酸[克/升]反应时间[小时]0 20 | 净产量*20小时减去0小时[克/升] | |
| 有细胞 | 0 1.81 | 1.81 |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 0 0.440 0.83 | 0.440.83 |
来自1.3克/升的起始L-抗坏血酸
| L-抗坏血酸[克/升]反应时间[小时]0 20 | 净产量*20小时减去0小时[克/升] | |
| 有细胞 | 1.32 3.16 | 1.84 |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 1.32 0.801.32 1.75 | -0.520.43 |
来自2.5克/升的起始L-抗坏血酸
| L-抗坏血酸[克/升]反应时间[小时]0 20 | 净产量*20小时减去0小时[克/升] | |
| 有细胞 | 2.48 4.33 | 1.85 |
| 无细胞 有氧空白厌氧对照 | 2.48 1.552.48 2.7 | -0.930.22 |
来自4.6克/升的起始L-抗坏血酸
| L-抗坏血酸[克/升]反应时间[小时]0 20 | 净产量*20小时减0小时[克/升] | |
| 有细胞 | 4.55 6.64 | 2.09 |
| 无细胞 需氧空白厌氧对照 | 4.55 3.024.55 4.21 | -1.53-0.34 |
*：净产量是指第20小时所积累的L-抗坏血酸量减去第0小时加入的L-抗坏血酸量。
序列表
<110>Roche Vitamins AG
<120>用于制备L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的微生物方法
<130>脂环酸杆菌属NA20，21，FJ21 16S nuc
<140>
<141>
<150>EP Application No.00118059.5
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<160>3
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1529
<212>DNA
<213>脂环酸杆菌属
<220>
<221>rRNA
<222>(1)..(1529)
<223>NA-20的部份16SrRNA基因序列
<400>1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gggtctcttc ggaggccagc ggcggacggg tgaggaacac gtgggtaatc tgcctttcag 120
gccggaataa cgcccggaaa cgggcgctaa tgccggatac gcccgcgagg aggcatcttc 180
ttgcggggga aggcccaatt gggccgctga gagaggagcc cgcggcgcat tagctngttg 240
gcggggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360
tgggcgcaag cctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggccttcgg gttgtaaagc 420
tctgttgctc ggggagagcg gcatggggga tggaaagccc catgcgagac ggtaccgagt 480
gaggaagccc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa aacgtagggg gcgagcgttg 540
tccggaatca ctgggcgtaa agggtgcgta ggcggtcgag caagtctgga gtgaaagtcc 600
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gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccagt ggcgaaggcg 720
ccttgctgga cagtgactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggggggaca caccccagtg 840
ccgaaggaaa cccaataagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc agggcttgac atccctctga cacnctcaga gatgaggggt cccttcgggg 1020
cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttcagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgacctgtgt taccagcgcg ttgaggcggg gactcacagg 1140
tgactgccgg cgtaagtcgg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gcccctgatg 1200
tcctgggcta cacacgtgct acaatgggcg gaacaaaggg aggcgaagcc gcgaggcgga 1260
gcgaaaccca aaaagccgct cgtagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc 1320
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acaccgcccg tcacaccacg agagtcggca acacccgaag tcggtgaggt aacccctnng 1440
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accggaaggt gcggctggat cacctcctt 1529
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<212>DNA
<213>脂环酸杆菌属
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<223>NA21的部份16SrRNA基因
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<210>3
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<212>DNA
<213>脂环酸杆菌属
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<222>(1)..(1495)
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<400>3
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Claims (13)
1.用于从2-酮-L-古洛糖酸或其钠盐、钾盐或钙盐产生L-抗坏血酸或其钠盐、钾盐或钙盐，或从2-酮-D-葡糖酸或其钠盐、钾盐或钙盐产生D-异抗坏血酸或其钠盐、钾盐或钙盐的方法，包括在大约30℃至大约100℃的温度和大约1至大约6的pH条件下于溶液中将各自为游离酸或其钠盐、钾盐或钙盐形式的2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸与脂环酸杆菌属嗜酸性耐热微生物细胞一起孵育，以形成L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸或它们的钠盐、钾盐或钙盐，然后从该溶液中分离所述的L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸或它们的钠盐、钾盐或钙盐。
2.根据权利要求1的方法，其中脂环酸杆菌属的该嗜酸性耐热微生物是脂环酸杆菌属DSM 13652、DSM 13653、DSM 13649、DSM 13650或DSM 13651或它们各自的突变体。
3.根据权利要求1的方法，其中脂环酸杆菌属的该嗜酸性耐热微生物是具有脂环酸杆菌属DSM 13652、DSM 13653、DSM 13649、DSM 13650或DSM 13651的鉴别特征的生物学和分类学上均等的培养物。
4.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中所述溶液含有水作为溶剂。
5.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中所述孵育在有氧条件下进行。
6.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中所述孵育在有氧条件下并存在营养物时进行。
7.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中在所述溶液中底物2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-D-葡糖酸或它们各自的钠、钾或钙盐的浓度，基于游离酸的量，是从大约5％w/v到大约20％w/v。
8.根据权利要求7的方法，其中在所述溶液中底物2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-D-葡糖酸或它们各自的钠、钾或钙盐的浓度，基于游离酸的量，是，大约10％w/v到大约15％w/v。
9.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中所述孵育在大约40℃至大约95℃的温度下进行。
10.根据权利要求9的方法，其中所述孵育在大约55℃至大约95℃的温度下进行。
11.根据权利要求1-3之任意一项的方法，其中所述孵育在大约1.0至大约4.5的pH时进行。
12.根据权利要求11的方法，其中所述孵育在大约1.5至大约3.0的pH时进行。
13.脂环酸杆菌属微生物，其选自：脂环酸杆菌属DSM 13649、脂环酸杆菌属DSM 13650和脂环酸杆菌属DSM 13651。
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