CN1305529A - 利用微生物生产类异戊二烯化合物的方法和检测具有抗菌或除草活性的化合物的方法 - Google Patents

利用微生物生产类异戊二烯化合物的方法和检测具有抗菌或除草活性的化合物的方法 Download PDF

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Abstract

使用至少一种DNA生产蛋白或类异戊二烯化合物的方法,所述DNA包含编码具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的上述蛋白的DNA,所述类异戊二烯化合物可用于治疗心脏病或骨质疏松症、体内稳态、预防癌症、免疫强化等的药物、健康食品、防污涂料等;以及检测具有抗菌活性和除草活性的化合物的方法,该方法特征在于检测能够抑制非甲羟戊酸途径上的酶反应的上述DNA、上述蛋白或物质。

Description

利用微生物生产类异戊二烯化合物的方法和 检测具有抗菌或除草活性的化合物的方法
技术领域
本发明涉及利用由原核生物产生的转化体生产类异戊二烯化合物的方法；并涉及筛选具有抗生或除草活性的、与非甲羟戊酸途径有关的物质的方法。
背景技术
类异戊二烯是具有由5个碳原子作为主链结构组成的异戊二烯单元的化合物的通用术语。通过异戊烯焦磷酸(IPP)聚合生物合成类异戊二烯。在自然界中存在着各种各样的类异戊二烯化合物，其中许多对人类有用。
例如，泛醌作为电子传递体系的必需组分在体内起重要作用。泛醌不仅仅作为有效对抗心脏病的药物的需求正在增加，而且其在西方国家作为健康食品的需求也正在增加。
维生素K是一种参与血液凝固体系的重要的维生素，利用其作为止血剂。近来已经表明维生素K参与骨代谢，并预期其可用于治疗骨质疏松症。维生素K1和甲基萘醌类(menaquinone)已经被批准作为药物。
另外，泛醌和维生素K有效抑制附着物(barnacle)依附于物体，因此可制成极好的油漆产品添加剂，防止附着物的依附。
而且，具有由40个碳原子组成的异戊二烯主链的称为类胡萝卜素的化合物具有抗氧化剂作用。预计类胡萝卜素(诸如β-胡萝卜素、虾青素和隐黄素)具有癌症预防和免疫强化活性。
如上所述，类异戊二烯化合物包括许多有用的物质。建立一种生产这些物质的经济的方法将对医学界和社会极为有益。
已经研究了通过发酵生产类异戊二烯化合物的方法，并已经对培养条件的检验、通过诱变进行菌株育种和通过基因工程技术提高产量进行了试验。然而，实际的结果限于个别类型的化合物，还不知道对类异戊二烯化合物普遍有效的方法。
在诸如动物和酵母的真核生物中，已经证明类异戊二烯化合物主链单元_异戊烯焦磷酸(IPP)是由乙酰辅酶A通过甲羟戊酸(甲羟戊酸途径)生物合成。
据认为，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶在甲羟戊酸途径中是限速酶[Mol.Biol.Cell,5,655(1994)]。已经在酵母中进行了通过过量表达HMG-CoA还原酶提高类胡萝卜素产量的试验[Misawa等，Summaries of Lectures on Carotenoids,1997]。
没有资料证明在原核生物中存在甲羟戊酸途径。在许多原核生物中，已经发现了另一条途径-非甲羟戊酸途径，其中通过由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合产生的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生物合成IPP[Biochem.J., 295,517(1993)]。在一个使用13C标记的底物的试验中表明，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸通过2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸转化成IPP[Tetrahedron Lett. 38,4769(1997)]。
在大肠杆菌(Escherichia coli)中，鉴定了一种编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)的基因，它使得丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合而生物合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94,12857(1997)]。所述基因包含在由四个ORF组成的操纵子中，所述ORF包括编码法尼焦磷酸合酶的ispA。
而且在大肠杆菌中已知存在将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的活性[Tetrahedron Lett. 39,4509(1998)]。
目前，还没有关于通过这些包含在所述操纵子中的基因的工程基因提高类异戊二烯化合物产量的已知描述和提示。
尽管对原核生物中非甲羟戊酸途径的了解越来越多，但其中涉及的大多数酶和编码这些酶的基因仍处于未知状态。
在光合作用细菌中，已知一种通过引入ubiC酶基因(uviC基因，它将分支酸盐转变成4-羟基苯甲酸)和对-羟基苯甲酸转移酶(ubiA)基因，有效生产泛醌-10的方法(日本未审查专利申请107789/96)。然而，其中没有通过对参与非甲羟戊酸途径的酶的基因进行基因工程提高类异戊二烯化合物产量的实施例。
而且，其中没有关于当通过诱变或用药物处理抑制在非甲羟戊酸途径上的反应时，将怎样影响原核生物的论述。
发明公开
本发明的目的是提供：一种生产类异戊二烯化合物的方法，该方法包括将包含一个或多个参与类异戊二烯化合物(可用于针对心脏病、骨质疏松症、体内稳态、预防癌症和免疫强化的药物、健康食品和抗依附者的防污漆产品)生物合成的DNA的DNA整合到载体中，将产生的重组DNA引入到得自原核生物的宿主细胞中，在培养基中培养所获得的转化体，使所述转化体在培养物中产生和累积类异戊二烯化合物，并从所述培养物中回收类异戊二烯化合物；一种生产蛋白的方法，该方法包括将包含一个或多个编码蛋白(所述蛋白具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率的活性)的DNA的DNA整合到载体中，将产生的重组DNA引入到宿主细胞中，在培养基中培养所获得的转化体，使所述转化体在培养物中产生和累积所述蛋白，并从培养物中回收所述蛋白；所述蛋白；和编码该蛋白的DNA。本发明的另一个目的是提供一种筛选具有抗生活性和/或除草活性的物质的方法，包括筛选抑制非甲羟戊酸途径上的酶反应的物质。
本发明人发现，通过筛选能够在原核生物中提高类异戊二烯产量的DNA，并将获得的DNA引入到原核生物中，可以提高类异戊二烯的产量，本发明人据此完成本发明。
即，本中请的第一个发明是生产类异戊二烯化合物的方法，该方法包括将包含一个或多个选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的DNA的DNA整合到载体中：
(a)编码具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA，
(b)编码法尼焦磷酸合酶的DNA，
(c)编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA，或编码具有其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，
(b)编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白的DNA，或编码具有其中在SEQ ID NO:4的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA、
(e)编码具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA，
(f)编码能够在严格条件下与选自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的DNA杂交、并且其活性与所选择的DNA编码的蛋白的活性基本相同的蛋白的DNA；将产生的重组DNA引入到得自原核生物的宿主细胞中；在培养基中培养所获得的转化体；使所述转化体在培养物中产生和累积类异戊二烯化合物；并从所述培养物中回收所述类异戊二烯化合物。
可以通过定点诱变(在本申请提交之前，它是一种广为人知的技术)进行在本说明书中的氨基酸残基的缺失、置换或添加。此外，词组“一个至几个氨基酸残基”是指通过定点诱变可以缺失、置换或添加的氨基酸残基的数目，例如1-5个氨基酸残基。
可以按照在Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(下文称为Molecular Cloning，第二版),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley＆Sons(1987-1997),Nucleic AcidsResearch,10.6487(1982),Proc.Natl Acad.Sci.,USA,79,6409(1982),Gene,34,315(1985),Nucleic Acids Research,13,4431(1985)和ProcNatl Acad.Sci.,USA,82,488(1985)等中描述的方法，制备由具有一个至几个氨基酸残基缺失、置换或添加的氨基酸序列组成的蛋白。
上述的编码催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应的蛋白的DNA，是例如编码具有SEQ ID NO:1、26或28的氨基酸序列的蛋白的DNA，或者是编码具有其中在SEQ ID NO:1、26或28的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA。
此DNA的实例包括具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的DNA或具有SEQ ID NO:27或29的核苷酸序列的DNA。
编码法尼焦磷酸合酶的DNA的实例包括编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白的DNA，或编码具有其中在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有产生法尼焦磷酸的酶活性的蛋白的DNA。具体实例是具有SEQID NO:7的核苷酸序列的DNA。
编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA的具体实例是具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的DNA。
此外，编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白的DNA的具体实例是具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的DNA。
编码具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA的实例，包括编码具有SEQ IDNO:5或30的氨基酸序列的蛋白的DNA，或者是编码具有其中在SEQID NO:5或30的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA。
具体而言，这种DNA是具有SEQ ID NO:10或31的核苷酸序列的DNA。
上述词组“可以在严格条件下杂交…DNA”是指使用上述的DNA或DNA片段作为探针，通过菌落杂交、噬菌斑杂交、DNA印迹或类似的方法可以获得的DNA。可以通过使用其上固定有来自菌落或噬菌斑的DNA或其片段的滤膜，在0.7-1.0 mol/l NaCl存在下于65℃进行杂交，接着用约0.1-2倍SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mol/l氯化钠、15mol/l柠檬酸钠)于65℃洗涤该滤膜来鉴定这种DNA。
可以按照在Molecular Cloning，第二版中描述的方法进行杂交。能够杂交的DNA的实例包括与选自SEQ ID NO:1、2、3、4和5的核苷酸序列具有至少70％或更高同源性，优选90％或更高同源性的DNA。
类异戊二烯化合物的实例包括泛醌、维生素K2和类胡萝卜素。
本申请的第二个发明是具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率的活性、并选自以下(a)、(b)和(c)的蛋白：
(a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，
(b)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:4的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，和
(c)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白。
本申请的第三个发明是生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，该方法包括将编码在上述第二个发明中描述的蛋白的DNA整合到载体中；将产生的重组DNA引入到宿主细胞中；在培养基中培养所获得的转化体；使所述转化体在培养物中产生和累积所述蛋白；并从所述培养物中回收所述蛋白。
上述转化体包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)或欧文氏菌属(Erwiniia)的微生物。
本申请的第四个发明是编码具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白、并选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)的DNA:
(a)编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(b)编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(c)编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(d)具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的DNA，
(e)具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的DNA，
(f)具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的DNA，和
(g)可以在严格条件下与在(a)至(f)描述的任何一个DNA杂交的DNA。
本申请的第五个发明是筛选具有抗生活性的物质的方法，该方法包括筛选抑制蛋白反应的物质，所述蛋白具有选自那些存在于非甲羟戊酸途径上的酶的酶活性，在所述途径中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，而由2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成异戊烯焦磷酸。
本发明的第六个发明是筛选具有除草活性的物质的方法，该方法包括筛选抑制蛋白反应的物质，所述蛋白具有选自那些存在于非甲羟戊酸途径上的酶的酶活性，在所述途径中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，而由2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成异戊烯焦磷酸。
在上述的第五个和第六个发明中的蛋白的实例包括以下(a)或(b)中的蛋白：
(a)具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白，或
(b)具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白。
催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应的蛋白的实例，包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白。
催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的实例，包括具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白。
本发明的第七个发明是一种具有抗生活性的物质，并利用在上述第五个发明中的筛选方法获得。由上述筛选方法获得的已知物质不包括在本发明中。
本发明人着重于膦胺霉素[3-(N-甲酰-N-羟基氨基)丙膦酸]与2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的结构相似性，所述2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(reductoisomerase)反应的反应产物，或是假定在此酶反应中产生的反应中间体。
根据膦胺霉素具有抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的活性和抗生活性的假定，本发明人已经对第五个发明的筛选方法进行了试验，并还在以下的实施例10中进行了描述。结果，本发明人发现膦胺霉素是具有抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性和抗生活性的物质，另外，验证了上述第五个发明的筛选方法的合理性。然而，已知化合物膦胺霉素排除在本发明之外。
本发明的第八个发明是具有除草活性的物质，并通过上述第六个发明的筛选方法获得。如上所述，由该筛选方法获得并已知的任何物质都排除在本发明之外。
下文将给出对本发明的更详细的解释。Ⅰ．克隆编码参与类异戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA(1)使用编码DXS的DNA(DXS基因)的核苷酸序列克隆编码参与类异戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA
使用在预先确定的大肠杆菌染色体的核苷酸序列和DXS基因上的信息[Proc.Ntal.Acad.Sci.USA.,94,12857(1997)]，通过用PCR方法克隆，由大肠杆菌获得包含DXS基因或DXS基因相邻基因的DNA区[Science,230,1350(1985)]。
在包含DXS基因的核苷酸序列上的信息的实例是SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
克隆包含DXS基因的DNA区的方法的具体例子如下。
按照标准技术，在适于大肠杆菌的培养基，例如LB液体培养基[每升水包含10g细菌用胰蛋白胨(由Difco Laboratories生产)、5g酵母提取物(由Difco Laboratories生产)、5g NaCl，并调节至pH7.2]中培养大肠杆菌，诸如大肠杆菌XL1-Blue株系(得自TOYOBO CO.,LTD.)。
培养后，通过离心从培养物中回收细胞。
按照在例如Molecular Cloning，第二版中描述的已知方法，由获得的细胞中分离染色体DNA。
使用在SEQ ID NO:11的核苷酸序列上的信息，用DNA合成仪合成包含DXS基因或对应于DXS基因相邻基因的DNA区的核苷酸序列的有义引物和反义引物。
在PCR扩增后，为将扩增的DNA片段引入到质粒中，优选将合乎限制酶(例如BamHI和EcoRI)的识别位点加入到有义和反义引物的5＇末端。
有义和反义引物组合的实例包括具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:14和15、SEQ ID NO:12和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和13或SEQ ID NO:22和23组合的DNA。
使用所述染色体DNA作为模板，使用所述引物；TaKaRaLA-PCRTM试剂盒2型(由TAKARA SHUZO CO.,LTD.生产)或ExpandTM高保真性PCR系统(由Boehringer Manheim K.K.生产)，用DNA热循环仪(由Perkin Elmer Instruments,Inc.日本生产)进行PCR。
在PCR反应条件下，进行30个循环的PCR，在扩增的DNA片段为2kb或更少的情况下，一个循环包括在94℃反应30秒、55℃反应30秒至1分钟和在72℃反应2分钟；在扩增的DNA片段超过2kb的情况下，一个循环包括在98℃反应20秒和68℃反应3分钟；然后在72℃接着反应7分钟。
在与加入到上述引物中的限制酶切位点相同的位点切断扩增的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳、蔗糖密度梯度离心以及诸如此类的方法分离和收集。
使用收集的DNA片段，通过标准方法，诸如在MolecularClonmg，第二版，Current Protocols in Molecular Biology，附录1-38,John Wiley＆Sons(1987-1997),DNA Cloning 1:Core Techniques,APractical Approach，第二版，Oxford University Press(1995)中描述的那些方法，或者通过使用可从市场购买的试剂盒，诸如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript Plasmid System(由Life Technologies生产)或ZAP-cDNA合成试剂盒(由Stratagene生产)，构建克隆载体。然后使用上述的克隆载体转化大肠杆菌，例如大肠杆菌DH5α(得自TOYOBO CO.,LTD)。
为转化大肠杆菌，可以使用可在大肠杆菌K12中自主复制的任何克隆载体，包括噬菌体载体和质粒载体。用于大肠杆菌的表达载体可用作克隆载体。所述克隆载体的具体例子包括ZAP Express[由Stratagene生产，Strategies,5,58(1992)]、pBluescript Ⅱ SK(+)[NucleicAcids Research,17,9494(1989)]、λZAPⅡ(由Stratagene生产)、λgt10、λgtll(DNA Cloning,A Practical Approach,1,49(1985))、λTriplEx(由Clonetec生产)、λExCell(由Pharmacia生产)、pT7T318U(由Pharmacia生产)、pcD2[H.Okayama and P.Berg；Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]、pMW218(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES.,LTD生产)、pUC118(由TAKARA SHUZO CO.,LTD.生产)、pEG400[J.Bac.,172,2392(1990)]和pQE-30(由Qiagen.Inc生产)。
可以按照标准技术，诸如在Molecular Cloning，第二版，CurrentProtocols in Molecular Biology，附录1-38,John Wiley＆Sons(1987-1997),DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach，第二版，Oxford University Press(1995)中描述的那些技术，由产生的转化体中获得包含目的DNA的质粒DNA。
通过上述方法，可以获得包含编码具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA、编码法尼焦磷酸合酶的DNA、编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA、编码具有SEQ ID NO:4或其它的氨基酸序列的蛋白的DNA的质粒DNA；以及包含上述一个或几个DNA的质粒DNA。
这些质粒包括含有以上所有DNA的质粒pADO-1、含有具有SEQID NO:6的核苷酸序列的DNA的质粒pDXS-1或pQEDXS-1、含有具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA的质粒pISP-1、含有具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的DNA的质粒pXSE-1和含有具有SEQID NO:9的核苷酸序列的DNA的质粒pTFE-1。
可以使用已经插入到这些质粒中的、得自大肠杆菌的DNA片段的核苷酸序列，以如上所述的相同的方式，由其它原核生物，诸如属于红细菌属的微生物，获得所述DNA的同源物。(2)克隆编码具有互补大肠杆菌甲基赤藓糖醇需要型突变体活性的蛋白的DNA(互补甲基赤藓糖醇需要型突变体的基因)①构建大肠杆菌甲基赤藓糖醇需要型突变体
按照标准技术培养大肠杆菌，诸如大肠杆菌W3110(ATCC14948)。
培养后，通过离心由获得的培养物中回收细胞。
用合适的缓冲剂如0.05mol/l Tris-马来酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤获得的细胞。然后在相同缓冲液中悬浮所述细胞，以使细胞密度为104至1010细胞/ml。
使用该悬浮液通过标准技术进行诱变。在此标准技术中，例如向所述悬浮液中加入NTG至终浓度为600mg/l，然后将该混合物在室温下保持20分钟。
将此诱变后的悬浮液涂布在补加0.05至0.5％甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上并培养。
基本琼脂培养基的实例是补加琼脂的M9培养基(MolecularCloning，第二版)。
可以使用按照在Tetrahedron Letters,38 35,6184(1997)中描述的方法化学合成的甲基赤藓糖醇。
将培养后生长的菌落复制到基本琼脂培养基和每个含有0.05至0.5％甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上。选择需要甲基赤藓糖醇生长的目的突变体。即选择能够在包含甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上生长、但不能在没有甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上生长的菌株。
菌株ME7是通过如上操作获得的生成物甲基赤藓糖醇需要型突变体的实例。②克隆互补甲基赤藓糖醇需要型特性的基因
将大肠杆菌，诸如大肠杆菌W3110(ATCC14948)，接种到例如LB液体培养基的培养基中，然后通过标准技术培养至对数生长期。
通过离心由产生的培养物中收集细胞。
按照标准技术，诸如在Molecular Cloning，第二版中描述的那些技术，由获得的细胞中分离和纯化染色体DNA。由以上(1)中描述的方法获得的染色体DNA可以用作分离和纯化的染色体DNA。
用合适的限制酶，诸如Sau 3 A I，部分消化适量的所述染色体DNA。按照标准技术，诸如蔗糖密度梯度离心(26,000rpm,20℃,20小时)，分离消化的DNA片段。
将通过以上分离获得的每个4至6kb的DNA片段连接至例如pMW118(Nippon Gene)的载体，该载体已经用合适的限制酶消化，以构建染色体DNA文库。
使用所述连接的DNA，按照标准技术，例如在MolecularCloning，第二版中描述的那些技术，转化在以上①中分离的甲基赤藓糖醇需要型突变体，诸如菌株ME7。
将产生的转化体涂布在补加药物的基本培养基上，该药物对应于所述载体具有的药物抗性基因，诸如包含100μg/l氨苄青霉素的M9琼脂培养基，然后在37℃过夜培养。
从而可以通过以上方法选择互补其甲基赤藓糖醇需要的转化体。
通过标准技术由产生的转化体中提取质粒。可以使所述转化体互补其甲基赤藓糖醇需要的质粒的实例是pMEW73和pQEDXR。
对整合到该质粒中的DNA的核苷酸序列测序。
这种核苷酸序列的实例是包含SEQ ID NO:10的yaeM基因的核苷酸序列的序列。使用在yaeM基因的核苷酸序列上的信息，以如上所述的相同的方式，可以由其它原核生物或植物获得yaeM基因的同源物。Ⅱ．生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白。
为在宿主细胞中表达所产生的DNA，用限制酶或脱氧核糖核酸酶将目的DNA片段消化成包含所述基因的适当长度的片段。接下来将该片段插入到在表达载体中的启动子区下游。然后将该表达载体引入到适于其的宿主细胞中。
可以使用任何可表达目的基因的宿主细胞。所述宿主细胞的实例包括属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)等的细菌、属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)等的酵母、动物细胞和昆虫细胞。
本文使用的表达载体可以在上述的宿主细胞中自主复制，或整合到染色体DNA中，并在可以转录如上所述的目的DNA的位置包含启动子。
当使用细菌作为宿主细胞时，表达上述DNA的优选表达载体可以在该细菌中自主复制，是包含启动子、核糖体结合序列、上述DNA和转录终止序列的重组载体。该表达载体可以含有调节启动子的基因。
表达载体的实例包括pBTrp2、pBTac1、pBTac2(它们都可由Boehringer Manheim K.K.获得)、pKK233-2(Pharmacia)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(Qiagen.Inc)、pQE-30(Qiagen.Inc)、pKYP10(日本专利公开公告第58-110600号)、pKYP200(Agricultural Biological Chemistry,48,669,1984)、pLSA1(Agric.Biol.Chem.,53,277,1989)、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306,1985)、pBluescriptⅡ SK+、pBluescriptⅡ SK(-)(Stratagene)、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia)、pET-3(Novagen)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18(gene,33,103,1985)、pUC19(gene, 33,103,1985)、pSTV28(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)、pSTV29(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)、pUC118(TAKARA SHUZO CO.,LTD)、pPA1(日本专利公开公告第63-233798号)、pEG400(J.Bacteriol.,172,2392,1990)和pQE-30(Qiagen.Inc)。
可以使用任何可在宿主细胞中起作用的启动子。这种启动子的实例包括得自大肠杆菌或噬菌体的启动子，诸如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子、SP01启动子、SP02启动子和penP启动子。而且，可以使用那些人工设计和修饰的启动子，如通过顺序连接两个P trp形成的P trp×2启动子以及 tac启动子、letI启动子和lacT7启动子。
可以使用任何可在宿主细胞中起作用的核糖体结合序列。优选的质粒在Shine-Dalgarno序列和起始密码子之间具有适当调节的间隔，例如6至18个碱基长。
对于表达目的DNA来说，不总是需要转录终止序列。最好在结构基因后立即排列转录终止序列。
本文使用的宿主细胞的实例包括属于埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、沙雷氏菌属、假单胞杆菌属、土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、Azobacter、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、Scenedesmun、链霉菌属(Streptomyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)的微生物。优选的宿主细胞包括属于埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、土壤杆菌属、脂环酸杆菌属、鱼腥蓝细菌属、组囊蓝细菌属、节杆菌属、Azobacter、着色菌属、欧文氏菌属、甲基杆菌属、席蓝细菌属、红细菌属、红假单胞菌属、红螺菌属、Scenedesmun、链霉菌属、Synnecoccus和发酵单胞菌属的微生物。
所述宿主细胞的更具体的实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) ATCC14067、乳发酸短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、种名待定的假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anbaena flos-aquqe)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis)、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、原玻璃绳节杆菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏着色菌(Chromatium buderi)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、沃氏着色菌(Chromatium warmingii)、Chromatium fluviatile、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、种名未定的席蓝细菌(Phomidium sp.)ATCC29409、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonasblastica)、海红假单孢菌(Rhodopseudomonas marina)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、需盐红螺菌(Rhodospirillum salexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseuis)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomycesvinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
可以使用任何将重组载体引入到如上所述的宿主细胞中的方法。这种方法的实例包括使用钙离子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110,1972)、原生质体方法(日本专利公开公告第63-2483942号)或在Gene,17,107(1982)或Molecular＆Genetics,168,111(1979)中描述的方法。
当使用酵母作为宿主细胞时，表达载体是例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19和pHS15。
可以使用任何可在酵母中起作用的启动子。这种启动子的实例包括PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热激蛋白启动子、MFα1启动子和CUP1启动子。
在此使用的宿主细胞包括啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)和河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)。
可以使用任何引入重组载体，即将DNA引入到酵母中的方法。这种方法的实例包括电穿孔(Methods Enzymol.,194,182,1990)，原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929,(1978))、乙酸锂法(J.Bacteriol.153,163(1983))和在Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)中描述的方法。
当使用动物细胞作为宿主细胞时，表达载体是例如pcDNAI、pcDM8(Funakoshi Co.,Ltd)、pAGE107[日本专利公开公告第3-22979号；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3[日本专利公开公告第2-227075号]；pCDM8(Nature,329,840(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[J.Biochem.,101, 1307(1987)]和pAGE210。
可以使用任何在动物细胞中起作用的启动子。这种启动子的实例包括巨细胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40初始(initial)启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子和SRα启动子。而且，人CMV IE基因的增强子可以和启动子一起使用。
本文使用的宿主细胞是例如Namalwa细胞、HBT5637(日本专利公开公告第63-299号)、COS1细胞、COS7细胞和CHO细胞。
可以使用任何将重组载体引入到动物细胞，即把DNA引入到动物细胞中的方法。这种方法的实例包括电穿孔(Cytotechnology,3,133(1990))，磷酸钙法(日本专利公开公告第2-227075号)、脂质转染法[ProcNatl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]和在Virology,52,456(1973)中描述的方法。可以按照在日本专利公开公告第2-227075号和日本专利公开公告第2-257891号中描述的方法进行转化体的回收和培养。
当使用昆虫细胞作为宿主细胞时，可以按照在诸如杆状病毒表达载体(Baculovirus Expression Vectors),A Laboratory Manual,CurrentProtocols in Molecular Biology附录1-38(1987-1997)和Bio/Technology,6,47(1988)中描述的方法表达蛋白。
亦即将引入重组基因的载体和杆状病毒共转导到昆虫细胞中，以在所述昆虫细胞的培养上清液中获得重组病毒。然后用该重组病毒感染昆虫细胞，从而表达目的蛋白。
转移基因的载体的实例包括pVL1392、pVL1393、pBlueBacⅢ(所有这些都由Invitrogen生产)。
本文使用的杆状病毒是例如感染甘蓝夜蛾属(Barathra)昆虫的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
昆虫细胞的实例包括秋粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞Sf9和Sf21(杆状病毒表达载体，A Laboratory Manual(W.H.Freemanand company，纽约，1992))以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞High 5(Invitrogen)。
将用于转移重组基因的载体和杆状病毒共转导到昆虫细胞中以制备重组病毒的方法包括磷酸钙转染法(日本专利公开公告第2-227075号)和脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]。
表达基因的方法除直接表达之外，还包括分泌生产和根据在Molecular Cloning，第二版中列出的技术的融合蛋白表达。
当在酵母、动物细胞或昆虫细胞中表达所述基因时，可以获得其中加入糖或糖链的蛋白。
可以通过在培养基中培养包含已经将上述DNA引入到其中的重组DNA的转化体、使所述转化体在培养物中产生和累积具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白，然后由所述培养物中收集所述蛋白，生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白。
可以通过培养宿主细胞的标准技术，培养本发明的用于生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的转化体。
当本发明的转化体是诸如大肠杆菌的原核生物或诸如酵母的真核生物时，培养这种转化体的培养基包含所述微生物可吸收的碳源、氮源和无机盐，并使得所述转化体有效生长。可以使用任一种满足以上条件的天然培养基或合成培养基。
可以使用所述微生物可吸收的任何碳源。这种碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖和含有它们的糖蜜，例如淀粉或淀粉水解产物的碳水化合物，例如乙酸和丙酸的有机酸以及例如乙醇和丙醇的醇类。
氮源的实例包括氨、无机酸或有机酸的盐，例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵，其它的含氮化合物，蛋白胨，肉羹，酵母提取物，玉米浆，酪蛋白水解产物，豆粉和豆粉水解产物，各种发酵微生物细胞或其消化液。
无机盐的实例包括磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
通过振摇培养进行培养或在有氧条件下进行浸没通气搅拌培养。优选的培养温度范围为15至40℃。优选的培养周期范围为16小时至7天。在培养时pH保持在3.0至9.0的范围内。用无机酸或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节pH。
如果必要，在培养时可以向所述培养基中加入抗生素，例如氨苄青霉素或四环素。
在培养用表达载体(使用诱导型启动子)转化的微生物时，如果必要可向所述培养基中加入诱导物。例如，在培养用包含lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向所述培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等；在培养用包含trp启动子的表达载体转化的微生物时，可以加入吲哚丙烯酸(IAA)等。
用于培养使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体的培养基，包括通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association,199,5l9(1967)]、Eagle’s MEM培养基[Science,122,501(1952)]、DMEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1(1950)]或那些其中加入胎牛血清等的培养基。
一般来说，所述转化体在5％CO2存在下，于pH6-8和30-40℃培养1至7天。
如果必要，在培养时可以向所述培养基中加入抗生素，例如卡那霉素或青霉素。
培养使用昆虫细胞作为宿主细胞获得的转化体的培养基的实例包括通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen),Sf-900 Ⅱ SFM培养基(GIBCO BRL)、ExCell400、ExCell405(都由JRH Biosciences生产)、Grace昆虫培养基(Grace,T.C.C.,Nature,195,788(1962))。
所述转化体一般于pH6-7和25℃-30℃培养1-5天。
如果必要，在培养时可以向所述培养基中加入抗生素，例如庆大霉素。
可以通过标准的酶分离和纯化技术，由本发明转化体的培养物中分离和纯化具有提高类异戊二烯化合物的生物合成效率活性的本发明的蛋白。
例如，当在细胞内以可溶形式表达本发明蛋白时，在培养完成后通过离心回收细胞，将其在水性缓冲液中悬浮，然后使用超声发生器、弗氏压碎器(french press)、Manton Gaulin匀浆器、Dyno-Mill等破碎，从而获得无细胞提取物。通过离心分离所述无细胞提取物，获得上清液。可以利用一种或几种并用的标准酶分离和纯化技术，由所述上清液中获得纯化的样品。这些技术包括溶剂提取技术、使用硫酸铵的盐析技术、脱盐技术、使用有机溶剂的沉淀技术、使用诸如二乙氨乙基(DEAE)琼脂糖凝胶和DIAION HPA-75(MitsubishiChemical Corp.)的树脂的阴离子交换层析、使用例如S-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia)树脂的阳离子交换层析、使用例如丁基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶的树脂的疏水层析、使用分子筛的凝胶过滤、亲和层析、层析聚焦和如等电聚焦的电泳。
当在细胞中表达形成内含体的蛋白时，回收、破碎所述细胞，并通过离心分离，从而获得沉淀部分。通过标准技术，由产生的沉淀部分中回收所述蛋白，然后使用蛋白变性剂使不溶蛋白溶解。将所述溶解的溶液稀释或透析至该溶液不含蛋白变性剂或蛋白变性剂的浓度不使蛋白变性的程度，从而使所述蛋白形成正常的三维结构。然后通过如上所述的相同的分离和纯化技术，获得纯化的样品。
当本发明的蛋白或其衍生物(诸如糖修饰蛋白)分泌到细胞外时，可以由培养物上清液回收所述蛋白或其衍生物(诸如糖链加合物)。即通过如上所述的离心等处理培养物，以便获得可溶性部分。使用如上所述的分离和纯化技术由所述可溶性部分中可获得纯化的样品。
如上所述产生的蛋白是例如其氨基酸序列选自SEQ ID NO:1至5的氨基酸序列的蛋白。
而且，通过以上方法表达的蛋白可以通过包括Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)的技术化学合成。此外，可以使用Souwa Boeki K.K.(Advanced ChemTech，美国)、Perkin-Elmer Japan(Perkin-Elmer，美国)、Pharmacia BioTech(Pharmacia BioTech，瑞典)、ALOKA CO.,LTD.(Protein Technology Instrument)、KURABOINDUSTRIES LTD(Synthecell-Vega，美国)、PerSeptive Limited.,Japan(PerSeptive，美国)或SHIMADZU CORP的肽合成仪合成所述蛋白。Ⅲ．生产类异戊二烯化合物
按照以上Ⅱ的方法，通过培养如在以上Ⅱ中所述获得的转化体，使所述转化体在培养物中生产和累积类异戊二烯化合物，然后由所述培养物中回收所述类异戊二烯化合物，可以生产类异戊二烯化合物。
上述的培养可以产生类异戊二烯化合物，诸如泛醌、维生素K2和类胡萝卜素。类异戊二烯化合物的具体实例包括使用属于埃希氏菌属的微生物作为转化体生产的泛醌-8和甲基萘醌-8、使用属于红细菌属的细菌生产的泛醌-10、使用属于节杆菌属的细菌作为转化体生产的维生素K2、使用属于土壤杆菌属的细菌作为转化体生产的虾青素，以及使用属于欧文氏菌属的细菌作为转化体生产的番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素。
在所述培养完成后，为了分离和纯化类异戊二烯化合物，通过加入合适的溶剂到培养物中，提取类异戊二烯化合物，通过例如离心去除沉淀，然后对产物进行各种层析。Ⅳ．筛选抑制非甲羟戊酸途径上的酶活性的物质(1)测定非甲羟戊酸途径上的酶活性
按照测定酶活性的一般方法，可以测定非甲羟戊酸途径上的酶活性。
用作测定活性的反应溶液的缓冲液的pH应当在不抑制目的酶活性的范围内。优选的pH范围包括最适pH。
例如，pH5至10、优选6至9的缓冲液用于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。
本文可以使用任何缓冲液，只要其不抑制酶活性并可以调节至以上的pH。这种缓冲液的实例包括Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液和碳酸氢盐缓冲液。例如，Tris-HCl缓冲液可优选用于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。
可以使用任何浓度的缓冲液，只要其不抑制酶活性。优选的浓度范围为1mol/l至1mol/l。
当目的酶需要辅酶时，向所述反应溶液中加入辅酶。例如，NADPH、NADH或其它电子供体可以用作1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的辅酶。优选的辅酶是NADPH。
准备加入的辅酶的浓度可以使用任何浓度，只要其不抑制反应。该浓度的优选范围为0.01mol/l至100mol/l，更优选为0.1mol/l至10mol/l。
如果必要，可以向反应溶液中加入金属离子。可以加入任何金属离子，只要其不抑制反应。优选的金属离子包括Co2+、Mg2+和Mn2+。
金属离子可以以金属盐加入。例如，可以加入氯化物、硫酸盐、碳酸盐和磷酸盐。
准备加入的金属离子的浓度可以使用任何浓度，只要其不抑制反应。优选的浓度范围为0mol/l至100mol/l，更优选为0.1mol/l至10mol/l。
将目的酶的底物加入到所述反应溶液中。例如加入1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的底物1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。
所述底物的浓度可以使用任何浓度，只要其不抑制反应。在所述反应溶液中优选的浓度范围为0.01mol/l至0.2mol/l。
在反应中使用的酶浓度没有明确限制。通常浓度范围为0.01mg/ml至100mg/ml。
本文使用的酶不必纯化成单一物质。它可以含有杂质蛋白。在如下文(2)中描述的研究中，可以使用包含1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的细胞提取物或具有相同活性的细胞。
可以使用任何反应温度，只要其不抑制酶活性。优选的温度范围包括最适温度。即反应温度范围为10℃至60℃，更优选为30℃至40℃。
利用检测底物随反应减少或反应产物随反应进行增加的方法，可以检测活性。
这种方法是一种通过例如高效液相层析(HPLC)(如果必要)分离目的物质并定量测定的方法。当NADH或NADPH随着所述反应进行增加或减少时，通过检测反应溶液在340nm的吸光度，可以直接测定活性。例如，通过使用分光光度计检测在340nm的吸光度的减少，以测定随着反应进行NADPH量的减少，可以检测1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的活性。(2)筛选抑制非甲羟戊酸途径上的酶活性的物质
通过将待筛选的物质加入到如在以上(1)中描述的酶活性检测系统中，使混合物同样反应，然后筛选抑制所述底物的量(与不加入该物质的情况相比)减少的物质或抑制反应产物的产量的物质，可以筛选抑制非甲羟戊酸途径上的酶活性的物质。
筛选方法包括监测底物量随时间减少或反应产物量随时间增加的方法；或在反应已经进行一定时间后，检测底物量减少或反应产物量增加的方法。
在监测底物量随时间减少或反应产物量随时间增加的方法中，在反应过程中优选以15秒至20分钟的间隔，更优选以1至3分钟的间隔，检测所述量。
为检测在反应已经进行一定时间后的底物量减少或反应产物量增加，所述反应时间优选为10分钟至1天，更优选为30分钟至2小时。
抑制非甲羟戊酸途径上的酶活性的物质抑制具有非甲羟戊酸途径的微生物和植物的生长。本发明人首先发现了该物质抑制所述微生物和植物生长的事实。
所述非甲羟戊酸途径存在于微生物和植物中，但不存在于动物和人中。因此，通过上述的筛选方法可以获得抑制非甲羟戊酸途径上的酶活性但不影响人和动物的物质。
该物质可以是有效的抗生素或除草剂。
本说明书包括了部分或全部在本申请的优先权文件的日本专利申请第10-103101、10-221910和11-035739号的说明书和/或附图中公开的内容。
附图简述
图1显示了反应温度对1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的影响。
图2显示了反应溶液的pH对1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的影响。显示了在不同pH、于100mol/l Tris-HCl缓冲液中检测的酶活性。以pH8.0的活性为100％的相对活性表示活性。
图3显示了使用同源重组破坏染色体上yaeM基因的方法。
图4显示了膦胺霉素对1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的影响。
实施本发明的最佳方式
现在将利用实施例来描述本发明，但本发明不应限于其中。除非另有说明，否则按照在Melecular Cloning，第二版中描述的技术(后文称为标准技术)进行在实施例中提出的基因重组。实施例1克隆编码参与类异戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA(1)使用大肠杆菌DXS基因的核苷酸序列克隆编码参与类异戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA
将一接种环的大肠杆菌XL1-Blue(购自TOYOBO)接种到10mlLB液体培养基中，然后于37℃过夜培养。
培养后，通过离心由产生的培养物中收集细胞。
按照标准技术由所述细胞中分离和纯化染色体DNA。
用DNA合成仪，合成在其5＇末端都具有BamHI和EcoRI限制酶切位点、分别由SEQ ID NO:12和13、14和15、12和16、17和18以及19和13的核苷酸序列对组成的有义和反义引物；合成在其5＇末端都具有BamHI限制酶切位点、由SEQ ID NO:22和23的核苷酸序列对组成的有义和反义引物。
使用这些引物、作为模板的染色体DNA以及TaKaRa La-PCRTM试剂盒2型(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)、ExpandTM高保真性PCR系统(Boehringer Manheim K.K.)或Taq DNA聚合酶(Boehringer)，用DNA热循环仪(Perkin Elmer Instruments,Inc.日本)进行PCR。
进行30个循环的PCR。在扩增的DNA片段为2kb或更少的情况下，一个循环包括在94℃反应30秒、55℃反应30秒至1分钟和在72℃反应2分钟；在扩增的DNA片段超过2kb的情况下，一个循环包括在98℃反应20秒和68℃反应3分钟；然后在72℃接着反应7分钟。
在通过PCR扩增的DNA片段中，用在5＇末端都具有BamHI和EcoRI限制酶切位点的有义和反义引物扩增的DNA片段用限制酶BamHI和EcoRI消化；用在5＇末端都具有BamHI限制酶切位点的有义和反义引物扩增的DNA片段用限制酶BamHI消化。
在消化后，这些用所述限制酶处理的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，并回收BamHI和EcoRI处理的DNA片段和BamHI处理DNA片段。
用限制酶BamHI和EcoRI消化含有lac启动子的广泛宿主范围的载体pEG 400[J.Bac.,172,2392(1990)]，对其进行琼脂糖凝胶电泳，并回收BamHI和EcoRI处理的pEG 400片段。
用限制酶BamHI消化pUC 118(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)，然后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收BamHI处理的pUC 118片段。
将每种产生的BamHI和EcoRI处理的DNA片段和BamHI和EcoRI处理的pEG 400片段混合，然后用乙醇使所述混合物沉淀。将获得的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，从而获得每种重组DNA。
使用产生的重组DNA，按照标准技术转化大肠杆菌DH5α(购自TOYOBO)。然后将该转化体涂布在含有100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基上，接着于37℃过夜培养。
将所述转化体的一些抗壮观霉素的菌落在10ml含有100μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中于37℃振摇培养16小时。
对获得的培养物离心，以便收集细胞。
按照标准技术由所述细胞中分离质粒。
为证实所分离的质粒含有目的DNA片段，用各种限制酶切割所述质粒，以检验其结构，并对其核苷酸序列测序。
包含具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的DNA、具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA、具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的DNA和具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的DNA的质粒称为pADO-1。包含具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的DNA的质粒称为pDXS-1。包含具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA的质粒称为pISP-1。包含具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的DNA的质粒称为pTFE-1。
混合以上的BamHI处理的DNA片段和BamHI处理的pUC118片段，然后用乙醇使所述混合物沉淀。将获得的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，以获得重组DNA。使用所述重组DNA，以如上所述的相同的方式转化大肠杆菌，然后由该转化体中分离质粒。
为证实所分离的质粒含有目的DNA片段，用各种限制酶切割所述质粒，以检验其结构，并以如上所述的相同的方式对其核苷酸序列测序。
用BamHI消化这些质粒。以如上所述的相同的方式回收目的DNA片段，然后将其亚克隆到表达载体pQE30(Qiagen.Inc)中。
由以上亚克隆获得的并具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的质粒称为pQEDXS-1。(2)克隆互补甲基赤藓糖醇需要型特性的基因①选择大肠杆菌的甲基赤藓糖醇需要型突变体
将大肠杆菌W3110(ATCC14948)接种到LB液体培养基中，并将其培养至对数生长期。
培养后，通过离心由获得的培养物中回收细胞。
用0.05mol/l Tris-马来酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤所述细胞，然后将其在相同缓冲液中悬浮至细胞密度为109细胞/ml。
通过向所述悬浮液中加入NTG至终浓度为600mg/l诱导突变，然后将该混合物在室温下保持20分钟。
将这些NTG处理的细胞涂布在包含0.1％甲基赤藓糖醇的M9基本琼脂培养基(Molecular Cloning，第二版)平板上并培养。
按照在Tetrahedron Letters,38,35,6184(1997)中描述的方法化学合成甲基赤藓糖醇。
将在包含0.1％甲基赤藓糖醇的M9基本琼脂培养基上生长的菌落复制在M9基本琼脂培养基和包含0.1％甲基赤藓糖醇的M9基本琼脂培养基上。选择需要甲基赤藓糖醇生长的目的突变体菌株。即选择能够在包含0.1％甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上生长、但不能在没有甲基赤藓糖醇的基本琼脂培养基上生长的菌株。
在以下的实验中使用由此获得的甲基赤藓糖醇需要型突变体ME7。②克隆互补甲基赤藓糖醇需要型特性的基因
将大肠杆菌W3110(ATCC14948)接种到LB液体培养基中，然后将其培养至对数生长期。然后通过离心由产生的培养物中收集细胞。
按照标准技术由获得的细胞中分离和纯化染色体DNA。
用限制酶Sau 3AI部分消化200μg染色体DNA。通过蔗糖密度梯度离心(26,000rpm,20℃,20小时)分离产生的DNA片段。
将通过以上分离获得的每个4至6kb的DNA片段连接至已经用限制酶BamHI消化的pMW118载体(Nippon Gene)，构建基因组DNA文库。
使用此基因组DNA文库，按照标准技术转化在以上①中分离的菌株ME7。
将产生的转化体涂布在补加100μg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后在37℃过夜培养。
由每个在所述琼脂培养基上生长的菌落中提取质粒，然后测定核苷酸序列。
被测定核苷酸序列的质粒含有SEQ ID NO:10的核苷酸序列。这些质粒称为pMEW41和pMEW73。
由具有所述序列的克隆的一个菌株中提取的质粒称为pMEW73。
用HindⅢ和SacⅠ双重消化pMEW73。将产生的具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的HindⅢ和SacⅠ处理的DNA片段连接至广泛宿主范围的载体pEG400[J.Bac,172,2392(1990)]的多克隆位点，构建pEGYM1。
将HindⅢ-SacⅠ处理的DNA片段连接至载体pUC19(Gene,33,103(1985))的HindⅢ-SacⅠ位点，构建pUCYM1。
按照在基于Genbank数据库的大肠杆菌染色体DNA的核苷酸序列上的信息，证实已经插入到所述载体中的DNA片段包含yaeM基因。
通过以下的使用PCR的方法[Science,230,1350(1985)]构建可以有效表达yaeM基因的重组载体。
用DNA合成仪合成具有SEQ ID NO:20的序列的有义引物和具有SEQ ID NO:21的序列的反义引物。
将BamHI限制酶识别位点加入到每个所述有义和反义引物的5＇末端。
使用作为模板的大肠杆菌染色体DNA、这些引物和Taq DNA聚合酶(Boelinnger)，用DNA热循环仪(Perkin Elmer Instruments,Inc日本)通过PCR扩增yaeM基因。
进行30个循环的PCR，一个循环包括于94℃反应30秒、于55℃反应30秒并于72℃反应2分钟，接着于72℃反应7分钟。
在用限制酶BamHI消化扩增的DNA片段和pUC118(TAKARASHUZO CO.,LTD.)后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化每种DNA片段。
混合这些片段，然后用乙醇使所述混合物沉淀。将获得的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，从而获得重组DNA。
通过测定核苷酸序列证实所述重组DNA是yaeM基因，然后将其亚克隆到表达载体pQE30(Qiagen,Inc)中。
产生的重组DNA称为pQEYM1。
用pQEYM1通过标准技术转化菌株ME7。将转化体涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后在37℃过夜培养。
结果证实所述转化体以与野生型菌株相同的生长速率形成菌落，这表明yaeM基因互补在菌株ME7中的突变。实施例2使用重组大肠杆菌生产泛醌-8(CoQ8)(1)分别用在以上实施例1中获得的那些质粒pADO-1、pDXS-1和pXSE-1以及作为对照的pEG400，转化大肠杆菌DH5α，然后获得显示抗100μg/ml浓度壮观霉素的大肠杆菌DH5α/pADO-1、大肠杆菌DH5α/pDXS-1、大肠杆菌DH5α/pXSE-1和大肠杆菌DH5α/pEG400。
将这些转化体接种到含有10ml LB培养基的试管中，所述LB培养基补充以每种100mg/l的维生素B1和维生素B6、50mg/l的对羟基苯甲酸和100mg/ml的壮观霉素。然后将所述转化体于30℃振摇培养72小时。
在培养完成后，将每种培养物浓缩10倍。
将300μl的2-丁醇和300μl的玻璃珠加入到每种300μl的浓缩培养物中。在用Multi Beads Shocker MB-200(YASUI KIKAI)破碎细胞5分钟的同时，用所述溶剂提取类异戊二烯化合物。然后离心收集2-丁醇层。
通过使用高效液相层析(LC-10A,SHIMADZU CORP.)定量分析在丁醇层中的CoQ8，计算由所述转化体产生的CoQ8的量。
使用Develosil ODS-HG-5(NOMURA CHEMICAL K.K.)作为柱子，甲醇:正己烷=8∶2溶液作为流动相，以1ml/分钟的流速和275nm的检测波长，进行HPLC。
表1显示了结果。
                       表1
              大肠杆菌转化体的CoQ8产量
    转化体 细胞量(OD660) 产生的CoQ8的量(mg/L) 细胞内含量*1
大肠杆菌DH5α/pEG400     5.8     0.63     1.1
大肠杆菌DH5α/pADO-1     5.5     0.98     1.8
大肠杆菌DH5α/pDXS-1     5.2     0.85     1.6
大肠杆菌DH5α/pXSE-1     5.6     0.67     1.2
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在DH5α/pADO-1、DH5α/pDXS-1和DH5α/pXSE-1中产生的CoQ8的量明显高于在对照菌株DH5α/pEG400中的产量。特别是，将在实施例1中获得的所有DNA引入至其中的DH5α/pADO-1显示产量最高。(2)将在以上(1)中获得的大肠杆菌DH5α/pDXS-1或大肠杆菌DH5α/pEG400接种到含有10ml M9培养基的试管中，然后于30℃振摇培养72小时。
在培养完成后，以如以上(1)中相同的方式计算由所述转化体产生的CoQ8的量。
表2显示了结果。
                      表2
            大肠杆菌转化体的CoQ8产量
    转化体 细胞量(OD660) 产生的CoQ8的量(mg/L) 细胞内含量*1
大肠杆菌DH5α/pEG400     3.1     0.49     1.6
大肠杆菌DH5α/pDXS-1     2.5     1.02     4.1
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在DH5α/pDXS-1中产生的CoQ8的量明显高于在对照菌株DH5α/pEG400中的产量。(3)使用重组大肠杆菌生产CoQ8
将在实施例1中获得的质粒pEGYM1或作为对照的pEG400引入到大肠杆菌DH5α中，获得显示抗100μg/ml浓度壮观霉素的大肠杆菌DH5α/pEGYM1和大肠杆菌DH5α/pEG400。
将这些转化体接种到含有10ml LB培养基的试管中，所述LB培养基补充以1％的葡萄糖、100mg/l的维生素B1、100mg/l的维生素B6、50mg/l的对羟基苯甲酸。然后将所述转化体于30℃振摇培养72小时。
在培养完成后，以和以上(1)中相同的方式计算由所述转化体产生的CoQ8的量。
表3显示了结果。
                        表3
              大肠杆菌转化体的CoQ8产量
    转化体 细胞量(OD660) 产生的CoQ8的量(mg/L) 细胞内含量*1
大肠杆菌DH5α/pEG400     14.44     0.83     0.57
大肠杆菌DH5α/pEGYM1     13.12     0.94     0.71
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在DH5α/pEGYM1中产生的CoQ8的量明显高于在对照菌株DH5α/pEG400中的产量。实施例3由重组大肠杆菌生产甲基萘醌-8(MK-8)(1)将在实施例2(1)中获得的大肠杆菌DH5α/pADO-1或大肠杆菌DH5α/pEG400接种到含有10ml补充以100μg/ml壮观霉素的TB培养基的试管中，然后于30℃振摇培养72小时。通过将12g细菌用胰蛋白胨(Difco)、24g酵母提取物(Difco)和5g甘油溶解在900ml水中，接着加入100ml含有0.17mol/l KH2PO4和0.72mol/l KH2PO4的水溶液，制备所述TB培养基。
在培养完成后，以和在实施例2(1)中的CoQ8定量方法相同的方法定量MK-8，然后计算由所述转化体产生的MK-8的量。
表4显示了结果。
                          表4
                大肠杆菌转化体的MK-8产量
    转化体 细胞量(OD660) 产生的MK-8的量(mg/L) 细胞内含量*1
大肠杆菌DH5α/pEG400     23.2     1.1     0.46
大肠杆菌DH5α/pADO-1     23.5     1.8     0.75
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在DH5α/pADO-1中产生的MK-8的量明显高于在对照DH5α/pEG400中的产量。(2)以和以上(1)中相同的方式培养在实施例2(1)中获得的大肠杆菌DH5α/pDXS-1或大肠杆菌DH5α/pEG400，然后计算由所述转化体产生的MK-8的量。
表5显示了结果。
                        表5
            大肠杆菌转化体的MK-8产量
    转化体 细胞量(OD660) 产生的MK-8的量(mg/L) 细胞内含量*1
大肠杆菌DH5α/pEG400     42.8     2.41     0.56
大肠杆菌DH5α/pDXS-1     44.0     2.96     0.67
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在DH5α/pDXS-1中产生的MK-8的量明显高于在对照菌株DH5α/pEG400中的产量。实施例4由重组胡萝卜软腐欧文氏菌生产CoQ8
将在实施例1中获得的质粒pDXS-1或作为对照的pEG400引入到胡萝卜软腐欧文氏菌IFO-3380中，从而获得转化体IFO-3380/pDXS-1和IFO-3380/pEG400，它们都抗100μg/ml浓度的壮观霉素。
将这些转化体接种到含有10ml补充以100μg/ml壮观霉素的LB培养基的试管中，然后于30℃振摇培养72小时。
在培养完成后，以和实施例2(1)中相同的方式计算由所述转化体产生的CoQ8的量。
表6显示了结果。
                          表6
          胡萝卜软腐欧文氏菌转化体的CoQ8产量
    转化体     细胞量(OD660) 产生的CoQ8的量(mg/L) 细胞内含量*1
IFO-3380/pEG400     1.68     0.26     1.5
 IFO-3380/pDXS-1     2.48     0.45     1.8
*1：用10倍的CoQ8产量(mg/L)除以细胞量(OD660)获得的值表示细胞内含量。
在IFO-3380/pDXS-1中产生的CoQ8的量明显高于在对照菌株IFO-3380/pEG400中的产量。实施例5由重组噬夏孢欧文氏菌生产泛醌和类胡萝卜素
通过电穿孔将在实施例1中获得的质粒pUCYM-1、pQEDXS-1、pQEYM-1或作为对照的pUC19和pQE30引入到噬夏孢欧文氏菌DSM-30080中，从而获得显示抗100μg/ml浓度氨苄青霉素的转化体噬夏孢欧文氏菌DSM-30080/pUCYM-1、噬夏孢欧文氏菌DSM-30080/pQEDXS-1、噬夏孢欧文氏菌DSM-30080/pQEYM-1、噬夏孢欧文氏菌DSM-30080/pUC19和噬夏孢欧文氏菌DSM-30080/pQE30。
将这些转化体接种到含有10ml LB培养基的试管中，所述LB培养基补充以100μg/l的氨苄青霉素、1％的葡萄糖、各100mg/l的维生素B1和维生素B6以及50mg/l的对羟基苯甲酸。然后将所述转化体于30℃振摇培养72小时。
在培养完成后，以和实施例2(1)中相同的方式计算由所述转化体产生的CoQ8的量。
通过使用分光光度计检测2-丁醇层于450nm的吸光度，以和实施例2(1)中相同的方式计算类胡萝卜素色素的产量。
表7显示了结果。
                          表7
      噬夏孢欧文氏菌转化体的CoQ8和类胡萝卜素产量
    转化体 细胞量     CoQ8     类胡萝卜素
OD660 产量mg/L 细胞内含量比率相对值 产量相对值 细胞内含量比率相对值
DSM-30080/pUC19  2.00  1.15     1.0     1.0     1.0
 DSM-30080/pUCYM-1  1.88  1.39     1.3     1.5     1.6
 DSM-30080/pQE30  2.52  1.29     1.0     1.0     1.0
 DSM-30080/pQEYM-1  1.92  1.36     1.4     1.7     2.2
 DSM-30080/pQEDXS-1  2.12  3.21     3.0     5.6     6.7
在DSM-30080/pUCYM-1中的CoQ8和类胡萝卜素色素的产量都明显高于在对照菌株DSM-30080/pUC19中的产量。
同样地，在DSM-30080/pQEYM-1和DSM-30080/pQEDXS-1中的CoQ8和类胡萝卜素色素的产量也都明显高于在对照菌株DSM-30080/pQE30中的产量。实施例6克隆编码蛋白的DNA，该蛋白参与由光合作用细菌类球红细菌类异戊二烯化合物的生物合成(1)克隆来自类球红细菌的DXS基因
使用在大肠杆菌中发现的DXS核苷酸序列检索Genbank数据库中在其它物种中保守的DXS同源物。结果，在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(P45205)、荚膜红细菌(P26242)、枯草杆菌(P54523)、种名待定的集胞蓝细菌(Synechchocystis sp.)PCC6803(P73067)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(007184)等中发现了DXS同源物。通过比较这些序列选择高度保守的氨基酸序列。考虑到在类球红细菌中的密码子选择，设计了对应于这种保守氨基酸序列的核苷酸序列。用DNA合成仪合成具有SEQ ID NO:32和SEQID NO:33的核苷酸序列的DNA片段，和具有SEQ ID NO:34的核苷酸序列的DNA片段。
使用作为模板的类球红细菌KY4113(FERM-P4675)的染色体DNA、上述引物和ExpandTM高保真性PCR系统(Boehringer ManheimK.K.)，用DNA热循环仪(Perkin Elmer Instruments,Inc.日本)进行PCR。
进行30个循环的PCR，一个循环包括在94℃反应40秒、在60℃反应40秒、在72℃反应1分钟；接着在72℃反应1分钟，从而获得目的DNA片段。使用DIG DNA标记试剂盒(Boehringer ManheimK.K.)对所述DNA片段进行DIG标记。
为获得全长类球红细菌DXS基因，构建菌株KY4113的基因组DNA文库。在LB培养基中过夜培养菌株KY4113，提取染色体DNA。用限制酶Sau3AI部分消化所述染色体DNA，然后通过蔗糖密度梯度离心纯化4至6kb的DNA片段。使用Ligation Pack(Nippon Gene)连接所述DNA片段和BamHI消化的载体pUC19，并使用此连接的DNA转化大肠杆菌DH5α。将转化体涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，从而获得约10,000个菌落。对其检测。通过测序，从每种DNA片段中发现具有与已知的其它物种的DXS基因高度序列同源性的ORF。SEQ ID NO:26的氨基酸序列称为DXS1，而SEQ ID NO:27的氨基酸序列称为DXS2。(2)使用大肠杆菌DXS基因缺失的突变体证实互补性①选择大肠杆菌DXS基因缺失菌株
将大肠杆菌W3110(ATCC14948)接种到LB液体培养基中，并将其培养至对数生长期。培养后，通过离心由培养物中收集细胞。
用0.05mol/l Tris-马来酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤所述细胞，并在相同缓冲液中悬浮至细胞密度为109细胞/ml。
向所述悬浮液中加入NTG至终浓度为600mg/l，然后将该混合物在室温下保持20分钟，以诱导突变。
将产生的NTG处理的细胞涂布在包含0.1％1-脱氧木酮糖的M9基本琼脂培养基(Molecular Cloning，第二版)平板上，然后培养。已经按照在J.C.S.Perkin Trans I,2131-2137(1982)中描述的方法化学合成了1-脱氧木酮糖。
将在包含0.1％1-脱氧木酮糖的M9基本琼脂培养基上生长的菌落复制在M9基本琼脂培养基和包含0.1％1-脱氧木酮糖的M9基本琼脂培养基上。选择需要1-脱氧木酮糖生长的目的突变体菌株。即选择能够在包含1-脱氧木酮糖的基本琼脂培养基上生长、但不能在没有1-脱氧木酮糖的基本琼脂培养基上生长的菌株。
由此选择和获得的突变体称为ME1。
当将pDXS-1引入到菌株ME1中时，互补了ME1菌株的1-脱氧木酮糖缺陷。因此证实所述菌株ME1是DXS基因缺失的菌株。(3)关于DXS1和DXS2的互补研究
编码SEQ ID NO:27的DXS1的DNA片段或编码SEQ ID NO:29的DXS2的DNA片段均得自菌株KY4113，分别将它们连接至载体pUC19的lac启动子的下游，以构建重组质粒。
当将构建的质粒引入到ME1中时，DXS1和DXS2每一个都互补菌株ME1中的1-脱氧木酮糖缺陷。
因此表明类球红细菌具有两个基因-DXS1和DXS2，他们具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的反应的活性。(4)克隆得自类球红细菌的互补甲基赤藓糖醇需要型特性的基因
将在实施例1(2)①中获得的大肠杆菌甲基赤藓糖醇需要型突变体ME7接种至包含0.1％甲基赤藓糖醇的LB液体培养基中，培养至其对数生长期，然后离心收集细胞。
用包含10％甘油的1mol/l HEPES水溶液洗涤所述细胞，以便尽可能去除培养基成分。
由在实施例6(1)中构建的类球红细菌KY4113基因组文库中提取质粒。然后按照标准技术通过电穿孔将该质粒引入到洗涤的细胞中。
接下来，将所述细胞涂布在包含100μg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后于37℃过夜培养。
在挑出于所述培养基上生长的菌落后，将所述菌落接种到LB液体培养基中培养，然后由培养的细胞中提取质粒。
当将提取的质粒再次引入到菌株ME7中时，转化体可以在没有甲基赤藓糖醇的培养基中生长。因此证实，所述质粒包含得自类球红细菌的互补甲基赤藓糖醇需要型特性的DNA片段。
通过对所述DNA片段的核苷酸序列测序，发现编码氨基酸序列的SEQ ID NO:31的DNA序列与大肠杆菌yaeM具有高度同源性。实施例7由重组光合作用细菌生产泛醌-10(CoQ10)
将得自菌株KY4113的glnB启动子连接至都在实施例6中获得的SEQ ID NO:27的DNA片段DXS1和SEQ ID NO:29的DNA片段DXS2的上游。然后将产物插入到广泛宿主范围的载体pEG400中，从而构建质粒。这些质粒分别称为pRSDX-1和pRSDX-2。另外，将yaeM和DXS1串联连接，然后将产物连接至glnB启动子的下游，从而构建质粒。该质粒称为pRSYMDX1。分别通过电穿孔(Bio-RadLaboratories)将这些质粒引入到类球红细菌KY4113中。
然后将细胞涂布在包含100μg/ml浓度壮观霉素的LB琼脂培养基上，然后于30℃培养3天。
接下来，将在该培养基上生长的菌落接种到包含100μg/ml浓度壮观霉素的LB培养基中，过夜培养。然后，通过离心收集培养的细胞。
通过由所述细胞(Qiagen,Inc)中提取质粒，证实每种菌株的细胞都包含引入的质粒。因此获得的转化体称为KY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2、KY4113/pRSYMDX1和KY4113/pEG400。
将一接种环的每种转化体接种到包含5ml种子培养基(2％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，用NaOH调节至pH7.2)的试管中，然后于30℃培养24小时。
将0.5ml获得的培养物接种到包含5ml泛醌-10生产培养基的试管中，然后于30℃振摇培养5天。
所述泛醌-10生产培养基包括4％赤糖糊、2.7％葡萄糖、4％玉米浆、0.8％硫酸铵、0.05％磷酸氢二钾、0.05％磷酸二氢钾、0.025％七水硫酸镁、3mg/l七水硫酸亚铁、8mg/l维生素B1、8mg/l烟酸和1ml/l痕量元素，预先调节至pH9，补加1％碳酸钙，然后高压灭菌。
以和在实施例2(1)中定量CoQ8相同的方式计算由所述转化体产生的CoQ10的量。表8显示了结果。
                  表8
细胞量[OD660] 累积的CoQ10的量[mg/l]
KY4113/pEG400     23.7     65.2
 KY4113/pRSDX-1     23     81
 KY4113/pRSDX-2     24.4     81.9
 KY4113/pRSYMDX1     25.8     117.9
在KY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2和KY4113/pRSYMDX1中产生的CoQ10的量明显高于在对照菌株KY4113/pEG400中的产量。实施例8测定yaeM基因编码的酶的活性(1)过量表达yaeM基因
使用PCR[Science,230,1350(1985)]如下构建可有效表达yaeM基因的重组质粒。
使用DNA合成仪合成具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的有义引物和具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的反义引物。
将限制酶BamHI位点加入到每种所述有义和反义引物的5＇-末端。
使用作为模板的大肠杆菌染色体DNA、这些引物、Taq DNA聚合酶(Boehringer)和DNA热循环仪(Perkin Elmer日本)，通过PCR扩增yaeM基因。
进行30个循环的PCR，一个循环包括于94℃反应30秒，于55℃反应30秒，和于72℃反应2分钟，接着于72℃反应7分钟。
用限制酶BamHI消化扩增的DNA片段和pUC118(TAKARASHUZO Co.,Ltd.)，然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化每种DNA片段。
将两种纯化的DNA片段混合在一起，然后用乙醇处理使DNA沉淀。将产生的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，从而获得重组DNA。
通过测定DNA序列证实所述重组DNA是yaeM基因。
由具有所述重组DNA的微生物中提取质粒，用限制酶BamHI消化并进行琼脂糖凝胶电泳，从而获得包含BamHI处理的yaeM基因的DNA片段。
用限制酶BamHI消化pQE30(Qiagen,Inc)，然后进行琼脂糖凝胶电泳，从而获得BamHI处理的pQE30片段。
将获得的包含BamHI处理的yaeM基因的DNA片段与BamHI处理的pQE30片段混合，并用乙醇处理以使DNA沉淀。将产生的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，从而获得重组DNA。
使用所述重组DNA通过标准技术转化大肠杆菌JM109。接着将所述转化体涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后于37℃过夜培养。
以如上所述的相同的方式由大肠杆菌中分离质粒。
同样地，用各种限制酶切割所分离的质粒以检查结构，然后测定核苷酸序列，从而证实所述质粒包含目的DNA片段。该质粒称为pQEDXR。(2)测定yaeM基因产物活性①纯化yaeM基因产物
通过标准技术，将在(1)中构建的pQEDXR引入到具有pREP4的大肠杆菌M15(Qiagen.Inc)中，获得抗200μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的菌株M15/pREP4+pQEDXR。
于37℃在包含200μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养所述菌株M15/pREP4+pQEDXR。当于660nm的浊度达到0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.2mol/l。随后，于37℃培养所述菌株5小时，然后通过离心(3000rpm,10分钟)去除培养物的上清液。在6ml 100mol/l的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中悬浮所述细胞，然后使用超声振荡器(SONIFIER,BRANSON)破碎，同时用冰冷却。获得的细胞破碎溶液于4℃、10,000rpm离心20分钟，从而收集上清液。将由细胞提取物中离心的上清液上Ni-NTA树脂柱(Qiagen.Inc)，然后用20ml洗涤缓冲液(100mol/l Tris-HCl(pH8.0)、50mol/l咪唑、0.5％Tween 20)洗涤。接着将10ml洗脱缓冲液(100mol/l Tris-HCl(pH8.0)、200mol/l咪唑)上所述柱，然后将流出液分部收集成每份1ml。
使用定量蛋白量的试剂盒(Bio-Rad Laboratories)检测每一流分的蛋白量，由此获得包含作为纯蛋白组分蛋白的流分。②制备底物1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸
如下制备反应底物1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。通过使用HPLC[柱：Senshu pak NH2-1251-N(4.6×250mm,Senshu)，流动相：100mol/lKH2PO4(pH3.5]测定于195nm的吸光度，检测1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。
以如上所述的相同的方式，将允许过量表达大肠杆菌dxs基因的质粒pQDXS-1引入到大肠杆菌M15/pREP4中，获得菌株M15/pREP4+pQDXS-1。
以如在实施例8(2)①中相同的方式培养该菌株，然后使用Ni-NTA树脂柱纯化dxs蛋白。
将纯化的dxs蛋白加入到20ml反应溶液[100mol/l Tris-HCl(pH7.5)、10mol/l丙酮酸钠、30mol/l DL-甘油醛-3-磷酸、1.5mol/l硫胺素丙酮酸、10mol/l MgCl2、1mol/l DL-二硫苏糖醇]中，然后保持在37℃。
反应12小时后，用水将反应溶液稀释至300ml，上活性炭柱(2.2×8厘米)继之以Dowex 1-X8(Cl型，3.5×25厘米)，然后用1％盐水溶液洗脱。在浓缩洗脱的流分后，将所述流分上Sephadex G-10(1.8×100厘米)，然后用水洗脱。最后冷冻干燥包含1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的流分，从而获得约50mg白色粉末。
通过NMR分析(A-500,JEOL Ltd.)证实该粉末是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。③测定yaeM基因产物的酶活性
将如上所述合成的0.3mol/l的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(终浓度)加入到1ml反应溶液中，所述反应溶液包含100mol/l Tris-HCl(pH7 5)、1mol/l MmCl2、0.3mol/l NADPH和在实施例8(2)①中获得的yaeM基因产物，然后于37℃温育。通过使用分光光度计(UV-160,SHIMADZU CORP.)读取于340nm的吸光度，监测在温育过程中NADPH的增加和减少，结果表明NADPH随时间减少。
为证实反应产物的结构，同样进行该反应，只是规模较大，然后分离产物。将200ml反应溶液于37℃温育30分钟，该反应溶液除1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸浓度为0.15mol/l以外，具有与如上所述的反应溶液相同的组成。然后将反应溶液的全部量加入到活性炭柱上，用水稀释至1L，然后加入到Dowex 1-X8柱(Cl型，3.5×20厘米)。
用400ml的1％盐水溶液洗脱该溶液，将其加入到Sephadex G-10(1.8×100厘米)，然后用水洗脱。冷冻干燥洗脱的流分，从而分离反应产物。
根据HR-FABMS分析推测分离的反应产物的分子式为C5H12O7P[m/z 215.0276(M-H)-,Δ-4.5 mmu]。1H和13C的NMR分析获得以下的化学位移。
1H NMR(D2O,500MHz):δ4.03(ddd,J=11.5,6.5,2.5Hz,1H),3.84(ddd,J=11.5,8.0,6.5Hz,1H),3.78(dd,J=80,2.5Hz,1H),3.60(d,J=12.0Hz,1H),3.50(d,J=12.0Hz,1H),1.15(s,3H)；13C NMR(D2O,125MHz):δ75.1(C-2).74.8(C-3),67.4(C-1),65.9(C-4),19.4(2-Me)。
用碱性磷酸酶(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)处理反应产物获得的化合物和用在Tetrahedron Letter,38,6184(1997)中描述的方法合成的2-C-甲基-D-赤藓糖醇的1H和13C NMR分析得到的化学位移完全一致。
而且，前一化合物的旋光角为[α]D 21=+6.0(c=0.050,H2O)，与在Tetrahedron Letter,38,6184(1997)中报导的2-C-甲基-D-赤藓糖醇的旋光角[α]D 25=+7.0(c=0.13,H2O)相同。
这些结果揭示，yaeM基因产物的反应产物是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。即发现yaeM基因产物具有由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的活性，同时消耗NADPH。基于此催化活性，将该酶命名为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。④特征鉴定1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶
使用如在实施例8(2)③中描述的1ml反应系统，检测1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的酶学特征。此处的1单位定义为每分钟氧化1mmol NADPH的活性。
当用NADH代替NADPH时，活性降低至1/100以下。
当使用1-脱氧-D-木酮糖代替1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸时，没有发生反应。
SDS-PAGE分析显示，该酶由42kDa的多肽组成。
表9显示了加入金属对所述反应系统的影响。
                       表9
      各种金属离子对1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸
                还原异构酶活性的影响
    添加物     比活(单位/mg蛋白)
    无     0.3
    EDTA     N.D.
    MnCl2     11.8
    CoCl2     6.0
    MgCl2     4.0
    CaCl2     0.2
    NiSO4     0.2
    ZnSO4     0.3
    CuSO4     N.D.
    FeSO4     N.D.
加入这些金属离子和EDTA，以使每种的浓度为1mol/l。N.D.表示检测不到活性。
在MgCl2存在的情况下，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸和NADP的Km分别为249μmol/l和7.4μmol/l。
图1显示了反应温度的影响，而图2显示了反应pH的影响。实施例9构建和特征鉴定yaeM缺失突变体(1)构建yaeM被破坏的失突变体
为测试1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶对细胞生长是否必要，如下所述构建1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶缺失突变体。
如下所述产生用于插入到yaeM基因中的卡那霉素抗性基因盒。
用限制酶BalⅠ消化在实施例1(2)②中获得的质粒pMEW41，并对其进行琼脂糖凝胶电泳，从而获得BalⅠ处理的DNA片段。
用限制酶HindⅢ和SamⅠ消化Tn5，然后使用DNA平端化试剂盒(TAKARA SHUZO CO.,LTD.)对两端平端化。
产生的平端DNA片段与先前获得的BalⅠ处理的pMEW41DNA片段混合，然后用乙醇处理该混合物。接下来将获得的DNA沉淀溶解在5μl蒸馏水中，发生连接反应，从而获得重组DNA。
使用此重组DNA按照标准技术转化大肠杆菌JM109(购自TAKARA SHUZO CO.,LTD.)。接着将该转化体涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，然后于37℃过夜培养。
将几个在该培养基上生长的氨苄青霉素抗性转化体菌落在10ml包含100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中于37℃振摇培养16小时。
对产生的培养物离心，以收集细胞。
按照标准技术由所述细胞中分离质粒。
用各种限制酶切割如上所述分离的质粒，以检测其结构。结果证实该质粒包含目的DNA片段，将其命名为pMEW41Km。
通过用pMEW41Km进行同源重组，破坏大肠杆菌染色体DNA上的yaeM基因。图3显示该重组的示意图。
用限制酶HindⅢ和SacⅠ消化pMEW41Km，进行琼脂糖凝胶电泳，由此纯化线性片段。使用所述片段按照标准技术转化大肠杆菌FS1576。所述菌株FS1576以菌株ME9019由国立遗传研究所(National Institute of Genetics)获得。将所述转化体涂布在包含15μg/ml卡那霉素和1g/l 2-C-甲基-D-赤藓糖醇的LB琼脂培养基上，然后于37℃过夜培养。
将几个在该培养基上生长的卡那霉素抗性菌落在10ml包含15μg/ml卡那霉素和1g/l 2-C-甲基-D-赤藓糖醇的LB液体培养基中于37℃振摇培养16小时。
对产生的培养物离心，以收集细胞。
通过标准技术由所述细胞中分离染色体DNA。
用限制酶SmaⅠ或PstⅠ消化所述染色体DNA。以同样的方式用限制酶消化菌株FS1576的染色体DNA。通过标准技术对这些用限制酶消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用卡那霉素抗性基因和yaeM基因作为探针进行DNA杂交分析。因此证实，卡那霉素抗性菌落的染色体DNA具有在图3中显示的结构，即所述卡那霉素抗性基因破坏yaeM基因。(2)特征鉴定yaeM被破坏的突变体
将如上所述产生的yaeM被破坏的菌株和其亲代菌株FS1576涂布在LB琼脂培养基和包含1g/l 2-C-甲基-D-赤藓糖醇的LB琼脂培养基上，然后于37℃培养。表10显示了在培养2天后的细胞生长情况。
                          表10
              yaeM基因缺失对大肠杆菌生长的影响
菌株 在每种培养基上的细胞生长*1
    LB  LB+ME*2
 FS1576     +     +
yaeM缺失菌株     -     +
*1：细胞生长(+表示良好生长；-表示无生长)
*2：ME表示加入1g/l的2-C-甲基-D-赤藓糖醇。
在没有2-C-甲基-D-赤藓糖醇的培养基上yaeM缺失突变体不生长。因此表明此基因在没有2-C-甲基-D-赤藓糖醇的情况下对细胞生长是必不可少的。实施例10    1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂对细胞生长的影响。
基于膦胺霉素能够抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的假设进行以下的实施例，因为作为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶反应产物的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸或预期在此酶反应中产生的反应中间体在结构上与膦胺霉素类似。
在膦胺霉素存在下，为了检测对酶活性的影响，通过如在实施例8中描述的方法检测1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性。
已经按照在Chem.Pharm Bull.,30,111-118(1982)中描述的方法合成膦胺霉素。
反应溶液的总体积由在实施例8(2)中描述的反应溶液的体积减少至0.2ml，但每种浓度都保持在和实施例8③的系统相同的水平上。向所述反应溶液中加入各种浓度的膦胺霉素，然后于37℃进行反应。使用Bench标记微量培养板读数器(Bio-Rad Laboratories)检测NADPH的增加和减少。
如图4所示，膦胺霉素显示抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。
在LB琼脂培养基、包含3.13mg/l膦胺霉素的LB琼脂培养基以及包含3.13mg/l膦胺霉素和0.25mg/l 2-C-甲基-D-赤藓糖醇的LB琼脂培养基上涂布大肠杆菌W3110，然后于37℃培养。
培养后两天，该微生物能够在两种类型的培养基，即LB琼脂培养基和包含膦胺霉素和0.25mg/l 2-C-甲基-D-赤藓糖醇的LB琼脂培养基上生长，但其不能在仅补充以膦胺霉素的LB琼脂培养基上生长。
这些结果清楚显示，膦胺霉素通过抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶而抑制细胞生长。因此，抑制yaeM基因产物(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)活性的物质可以是有效的抗生剂或除草剂。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体结合到本文中。
工业适用性
本发明可以提供：一种生产类异戊二烯化合物的方法，该方法包括将包含一个或多个参与类异戊二烯化合物(可用于针对心脏病、骨质疏松症、体内稳态、预防癌症和免疫强化的药物、健康食品和抗依附物的防污漆产品)生物合成的DNA的DNA整合到载体中，将产生的重组DNA引入到得自原核生物的宿主细胞中，在培养基中培养所获得的转化体，使所述转化体在培养物中产生和累积类异戊二烯化合物，并从所述培养物中回收所述类异戊二烯化合物；一种生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，该方法包括将包含一个或多个编码所述蛋白的DNA的DNA整合到载体中，将产生的重组DNA引入到宿主细胞中，在培养基中培养所获得的转化体，使所述转化体在培养物中产生和累积所述蛋白，并从该培养物中回收所述蛋白；所述蛋白；和新的具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的酶蛋白；以及筛选具有抗生和/或除草活性的化合物的方法，该方法包括筛选抑制所述酶的物质。
序列表的独立文本
SEQ ID NO:12:    合成DNA
SEQ ID NO:13:    合成DNA
SEQ ID NO:14:    合成DNA
SEQ ID NO:15:    合成DNA
SEQ ID NO:16:    合成DNA
SEQ ID NO:17:    合成DNA
SEQ ID NO:18:    合成DNA
SEQ ID NO:19:    合成DNA
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SEQ ID NO:22:    合成DNA
SEQ ID NO:23:    合成DNA
SEQ ID NO:24:    合成DNA
SEQ ID NO:25:    合成DNA
SEQ ID NO:32:    合成DNA
SEQ ID NO:33:    合成DNA
SEQ ID NO:34:    合成DNA
                          序列表<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD.<120>微生物生产类异戊二烯化合物的方法和筛选具有抗菌或除草活性的化合物的
方法<130><140>PCT/JP99/01987<141>1999-04-14<150>JP98/103101<151>1998-04-14<150>JP98/221910<151>1998-08-05<150>JP99/035739<151>1999-02-15<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>620<212>PRT<213>大肠杆菌<400>1Met Ser Phe Asp Ile Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser1               5                  10                  15Thr Gln Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys
         20                  25                  30Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly
     35                  40                  45His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His
 50                  55                  60Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His65                  70                  75                  80Gln Ala Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly
             85                  90                  95Thr Ile Arg Gln Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu
        100                 105                 110Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser
    115                 120                 125Ala Gly Ile Gly Ile Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg
130                 135                 140Arg Thr Val Cys Val Ile Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala145                 150                 155                 160Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val
            165                 170                 175Ile Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu
        180                 185                 190Asn Asn His Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu
    195                 200                 205Arg Glu Gly Gly Lys Lys Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu
210                 215                 220Leu Leu Lys Arg Thr Glu Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly225                 230                 235                 240Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly
            245                 250                 255His Asp Val Leu Gly Leu Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu
        260                 265                 270Lys Gly Pro Gln Phe Leu His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr
    275                 280                 285Glu Pro Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe
290                 295                 300Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser305                 310                 315                  320Tyr Ser Lys Ile Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp
            325                 330                 335Asn Lys Leu Met Ala Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met
        340                 345                 350Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile
    355                 360                 365Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly
370                 375                 380Tyr Lys Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr385                 390                 395                 400Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe
            405                 410                 415Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln
        420                 425                 430Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile
    435                 440                 445Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly
450                 455                 460Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn465                 470                 475                 480Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys
            485                 490                 495Gly Ile Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly
        500                 505                 510Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr
    515                 520                 525Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu
530                 535                 540Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala545                 550                 555                 560Ile Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His
            565                 570                 575Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile
        580                 585                 590Pro Gln Gly Thr Gln Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala
    595                 600                 605Ala Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ala Trp Leu Ala
   610               615                620<210>2<211>299<212>PRT<213>大肠杆菌<400> 2Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln1               5                  10                  15Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val
         20                  25                  30Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg
     35                  40                  45Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn
 50                  55                  60Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser65                  70                  75                  80Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg
             85                  90                  95Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu
        100                 105                 110Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala
    115                 120                 125Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu
130                 135                 140Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu145                 150                 155                 160Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg
            165                 170                 175Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu
        180                 185                 190Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu
    195                 200                 205Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp
210                 215                 220Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly225                 230                 235                 240Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu
            245                 250                 255Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln
        260                 265                 270Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu
    275                 280                 285Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys
290                 295<210>3<211>80<212>PRT<213>大肠杆菌<400>3Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser1               5                  10                  15Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu
         20                  25                  30Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln
     35                  40                  45Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu
 50                  55                  60Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr Pro Phe Thr Pro Asp Asn Glu65                  70                  75                  80<210>4<211>348<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Val Thr Gly Val Asn Glu Cys Ser Arg Ser Thr Cys Asn Leu Lys Tyr1               5                  10                  15Asp Glu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser Met Gln Tyr Asn Pro Leu Gly Lys
         20                  25                  30Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly Cys Met Thr Phe Gly
     35                  40                  45Glu Pro Asp Arg Gly Asn His Ala Trp Thr Leu Pro Glu Glu Ser Ser
 50                  55                  60Arg Pro Ile Ile Lys Arg Ala Leu Glu Gly Gly Ile Asn Phe Phe Asp65                  70                  75                  80Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu Glu Ile Val Gly Arg
             85                  90                  95Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val Val Val Ala Thr Lys
        100                 105                 110Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly Leu Ser Arg Ala Gln
    115                 120                 125Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg Leu Gly Met Asp Tyr
130                 135                 140Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr Asn Thr Pro Ile Glu145                 150                 155                 160Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys Ala Gly Lys Ala Arg
            165                 170                 175Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln Phe Ala Gln Ala Leu
        180                 185                 190Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe Val Ser Met Gln Asp
    195                 200                 205His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg Glu Met Leu Pro Leu
210                 215                 220Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp Ser Pro Leu Ala Arg225                 230                 235                 240Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr Ala Arg Leu Val Ser
            245                 250                 255Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser Asp Glu Asn Asp Ala
        260                 265                 270Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu Glu Leu Gly Ala Thr
    275                 280                 285Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser Lys Pro Gly Ile Ala
290                 295                 300Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln Leu Asp Glu Leu Leu305                 310                 315                 320Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln Ile Ala Glu Leu Glu
            325                 330                 335Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe Lys
        340                 345<210>5<211>398<212>PRT<213>大肠杆菌<400>5Met Lys Gln Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Cys Ser1               5                  10                  15Thr Leu Asp Val ValArg His Asn Pro Glu His Phe Arg Val Val Ala
         20                 25                  30Leu Val Ala Gly Lys Asn Val Thr Arg Met Val Glu Gln Cys Leu Glu
     35                  40                  45Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Val Met Asp Asp Glu Ala Ser Ala Lys Leu
 50                  55                  60Leu Lys Thr Met Leu Gln Gln Gln Gly Ser Arg Thr Glu Val Leu Ser65                  70                  75                  80Gly Gln Gln Ala Ala Cys Asp Met Ala Ala Leu Glu Asp Val Asp Gln
             85                  90                  95Val Met Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Pro Thr Leu Ala
        100                 105                 110Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu
    115                 120                 125Val Thr Cys Gly Arg Leu Phe Met Asp Ala Val Lys Gln Ser Lys Ala
130                 135                 140Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu145                 150                 155                 160Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn
            165                 170                 175Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu
        180                 185                 190Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg
    195                 200                 205His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr
210                 215                 220Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn225                 230                 235                 240Ala Ser Ala Ser Gln Met Clu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val Ile
            245                 250                 255His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly
        260                 265                 270Glu Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Pro Thr Pro Trp Ala Trp Pro Asn
    275                 280                 285Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala
290                 295                 300Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu305                 310                 315                 320Ala Met Glu Ala Phe Glu GIn Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn
            325                 330                 335Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg
        340                 345                 350Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp
    355                 360                 365Met Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn
370                 375                 380Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser385                 390                 395<210>6<211>1860<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1860)<400>6atg agt ttt gat att gcc aaa tac ccg acc ctg gca ctg gtc gac tcc   48Met Ser Phe Asp Ile Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser1               5                  10                  15acc cag gag tta cga ctg ttg ccg aaa gag agt tta ccg aaa ctc tgc   96Thr Gln Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys
         20                  25                  30gac gaa ctg cgc cgc tat tta ctc gac agc gtg agc cgt tcc agc ggg   144Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly
     35                  40                  45cac ttc gcc tcc ggg ctg ggc acg gtc gaa ctg acc gtg gcg ctg cac   192His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His
 50                  55                  60tat gtc tac aac acc ccg ttt gac caa ttg att tgg gat gtg ggg cat   240Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His65              70                      75                  80cag gct tat ccg cat aaa att ttg acc gga cgc cgc gac aaa atc ggc   288Gln Ala Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly
         85                      90                  95acc atc cgt cag aaa ggc ggt ctg cac ccg ttc ccg tgg cgc ggc gaa   336Thr Ile Arg Gln Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu
    100                     105                 110agc gaa tat gac gta tta agc gtc ggg cat tca tca acc tcc atc agt   384Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser
115                     120                 125gcc gga att ggt att gcg gtt gct gcc gaa aaa gaa ggc aaa aat cgc   432Ala Gly Ile Gly Ile Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg
130                 135                 140cgc acc gtc tgt gtc att ggc gat ggc gcg att acc gca ggc atg gcg   480Arg Thr Val Cys Val Ile Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala145                 150                 155                 160ttt gaa gcg atg aat cac gcg ggc gat atc cgt cct gat atg ctg gtg   528Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val
            165                 170                 175att ctc aac gac aat gaa atg tcg att tcc gaa aat gtc ggc gcg ctc   576Ile Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu
        180                 185                 190aac aac cat ctg gca cag ctg ctt tcc ggt aag ctt tac tct tca ctg   624Asn Asn His Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu
    195                 200                 205cgc gaa ggc ggg aaa aaa gtt ttc tct ggc gtg ccg cca att aaa gag   672Arg Glu Gly Gly Lys Lys Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu
210                 215                 220ctg ctc aaa cgc acc gaa gaa cat att aaa ggc atg gta gtg cct ggc   720Leu Leu Lys Arg Thr Glu Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly225                 230                 235                 240acg ttg ttt gaa gag ctg ggc ttt aac tac atc ggc ccg gtg gac ggt   768Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly
            245                 250                 255cac gat gtg ctg ggg ctt atc acc acg cta aag aac atg cgc gac ctg   816His Asp Val Leu Gly Leu Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu
        260                 265                 270aaa ggc ccg cag ttc ctg cat atc atg acc aaa aaa ggt cgt ggt tat   864Lys Gly Pro Gln Phe Leu His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr
    275                 280                 285gaa ccg gca gaa aaa gac ccg atc act ttc cac gcc gtg cct aaa ttt   912Glu Pro Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe
290                 295                 300gat ccc tcc agc ggt tgt ttg ccg aaa agt agc ggc ggt ttg ccg agc   960Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser305                 310                 315                 320tat tca aaa atc ttt ggc gac tgg ttg tgc gaa acg gca gcg aaa gac   1008Tyr Ser Lys Ile Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp
            325                 330                 335aac aag ctg atg gcg att act ccg gcg atg cgt gaa ggt tcc ggc atg   1056Asn Lys Leu Met Ala Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met
        340                 345                 350gtc gag ttt tca cgt aaa ttc ccg gat cgc tacttc gac gtg gca att   1104Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile
    355                 360                 365gcc gag caa cac gcg gtg acc ttt gct gcg ggt ctg gcg att ggt ggg   1152Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly
370                 375                 380tac aaa ccc att gtc gcg att tac tcc act ttc ctg caa cgc gcc tat   1200Tyr Lys Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr385                 390                 395                 400gat cag gtg ctg cat gac gtg gcg att caa aag ctt ccg gtc ctg ttc   1248Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe
            405                 410                 415gcc atc gac cgc gcg ggc att gtt ggt gct gac ggt caa acc cat cag   1296Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln
        420                 425                 430ggt gct ttt gat ctc tct tac ctg cgc tgc ata ccg gaa atg gtc att   1344Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile
    435                 440                 445atg acc ccg agc gat gaa aac gaa tgt cgc cag atg ctc tat acc ggc   1392Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly
450                 455                 460tat cac tat aac gat ggc ccg tca gcg gtg cgc tac ccg cgt ggc aac   1440Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn465                 470                 475                 480gcg gtc ggc gtg gaa ctg acg ccg ctg gaa aaa cta cca att ggc aaa   1488Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys
            485                 490                 495ggc att gtg aag cgt cgt ggc gag aaa ctg gcg atc ctt aac ttt ggt   1536Gly Ile Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly
        500                 505                 510acg ctg atg cca gaa gcg gcg aaa gtc gcc gaa tcg ctg aac gcc acg   l584Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr
    515                 520                 525ctg gtc gat atg cgt ttt gtg aaa ccg ctt gat gaa gcg tta att ctg   1632Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu
530                 535                 540gaa atg gcc gcc agc cat gaa gcg ctg gtc acc gta gaa gaa aac gcc   1680Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala545                 550                 555                 560att atg ggc ggc gca ggc agc ggc gtg aac gaa gtg ctg atg gcc cat   1728Ile Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His
            565                 570                 575cgt aaa cca gta ccc gtg ctg aac att ggc ctg ccg gac ttc ttt att   1776Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile
        580                 585                 590ccg caa gga act cag gaa gaa atg cgc gcc gaa ctc ggc ctc gat gcc   1824Pro Gln Gly Thr Gln Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala
     595                600                 605gct ggt atg gaa gcc aaa atc aag gcc tgg ctg gca                     1860Ala Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ala Trp Leu Ala
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50                  55                  60acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc gtt gag tgt atc cac gct tac tca   240Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala ValGlu Cys Ile His Ala Tyr Ser65                  70                 75                  80tta att cat gat gat tta ccg gca atg gat gat gac gat ctg cgt cgc   288Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg
             85                  90                  95ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc   336Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu
        100                 105                 110gct ggc gac gct tta caa acg ctg gcg ttc tcg att tta agc gat gcc   384Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala
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130                 135                 140ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc gga atg tgc ggt ggt cag gca tta   480Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu145                 150                 155                 160gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt   528Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg
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    195                 200                 205gac aag tat gca gag agc atc ggc ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac   672Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp
210                 215                 220atc ctg gat gtg gtg gga gat act gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt   720Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly225                 230                 235                 240gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt   768Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu
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        260                 265                 270tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa   864Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu
    275                 280                 285gcg cta gcg gac tac atc atc cag cgt aat aaa                         897Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys
290                 295<210>8<211>240<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(240)<400>8atg ccg aag aaa aat gag gcg ccc gcc agc ttt gaa aag gcg ctg agc   48Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser1               5                  10                  15gag ctg gaa cag att gta acc cgt ctg gaa agt ggc gac ctg ccg ctg   96Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu
         20                  25                  30gaa gag gcg ctg aac gag ttc gaa cgc ggc gtg cag ctg gca cgt cag   144Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln
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         20                  25                  30acc gac ctt cgc gtt tcc cga ctt tgc ctc ggc tgt atg acc ttt ggc   144Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly Cys Met Thr Phe Gly
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        100                 105                 110gtg ttc cat cgc gtt ggt gat tta ccg gaa gga tta tcc cgt gcg caa   384Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly Leu Ser Arg Ala Gln
    115                 120                 125att ttg cgc tct atc gac gac agc ctg cga cgt ctc ggc atg gat tat   432Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg Leu Gly Met Asp Tyr
130                 135                 140gtc gat atc ctg caa att cat cgc tgg gat tac aac acg ccg atc gaa   480Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr Asn Thr Pro Ile Glu145                 150                 155                 160gag acg ctg gaa gcc ctc aac gac gtg gta aaa gcc ggg aaa gcg cgt   528Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys Ala Gly Lys Ala Arg
            165                 170                 175tat atc ggc gcg tca tca atg cac gct tcg cag ttt gct cag gca ctg   576Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln Phe Ala Gln Ala Leu
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    195                 200                 205cac tac aat ctg att tat cgt gaa gaa gag cgc gag atg cta cca ctg   672His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg Glu Met Leu Pro Leu
210                 215                 220tgt tat cag gag ggc gtg gcg gta att cca tgg agc ccg ctg gca agg   720Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp Ser Pro Leu Ala Arg225                 230                 235                 240ggc cgt ctg acg cgt ccg tgg gga gaa act acc gca cga ctg gtg tct   768Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr Ala Arg Leu Val Ser
            245                 250                 255gat gag gtg ggg aaa aat ctc tat aaa gaa agc gat gaa aat gac gcg   816Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser Asp Glu Asn Asp Ala
        260                 265                 270cag atc gca gag cgg tta aca ggc gtc agt gaa gaa ctg ggg gcg aca   864Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu Glu Leu Gly Ala Thr
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290                 295                 300gca ccg att atc gga act tcg cgc gaa gaa cag ctt gat gag cta ttg   960Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln Leu Asp Glu Leu Leu305                 310                 315                 320aac gcg gtg gat atc act ttg aag ccg gaa cag att gcc gaa ctg gaa   1008Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln Ile Ala Glu Leu Glu
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        100                 105                 110gcg atc cgc gcg ggt aaa acc att ttg ctg gcc aat aaa gaa tca ctg   384Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu
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130                 135                 140caa ttg tta ccg gtc gat agc gaa cat aac gcc att ttt cag agt tta   480Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu145                 150                 155                 160ccg caa cct atc cag cat aat ctg gga tac gct gac ctt gag caa aat   528Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn
            165                 170                 175ggc gtg gtg tcc att tta ctt acc ggg tct ggt ggc cct ttc cgt gag   576Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu
        180                 185                 190acg cca ttg cgc gat ttg gca aca atg acg ccg gat caa gcc tgc cgt   624Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg
    195                 200                 205cat ccg aac tgg tcg atg ggg cgt aaa att tct gtc gat tcg gct acc   672His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr
210                 215                 220atg atg aac aaa ggt ctg gaa tac att gaa gcg cgt tgg ctg ttt aac   720Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn225                 230                 235                 240gcc agc gcc agc cag atg gaa gtg ctg att cac ccg cag tca gtg att   768Ala Ser Ala Ser Gln Met Glu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val Ile
            245                 250                 255cac tca atg gtg cgc tat cag gac ggc agt gtt ctg gcg cag ctg ggg   816His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly
        260                 265                 270gaa ccg gat atg gta cgc caa ttg ccc aca cca tgg gca tgg ccg aat   864Glu Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Pro Thr Pro Trp Ala Trp Pro Asn
    275                 280                 285cgc gtg aac tct ggc gtg aag ccg ctc gat ttt tgc aaa cta agt gcg   912Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala
290                 295                 300ttg aca ttt gcc gca ccg gat tat gat cgt tat cca tgc ctg aaa ctg   960Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu305                 310                 315                 320gcg atg gag gcg ttc gaa caa ggc cag gca gcg acg aca gca ttg aat   1008Ala Met Glu Ala Phe Glu Gln Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn
            325                 330                 335gcc gca aac gaa atc acc gtt gct gct ttt ctt gcg caa caa atc cgc   1056Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg
        340                 345                 350ttt acg gat atc gct gcg ttg aat tta tcc gta ctg gaa aaa atg gat   1104Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp
    355                 360                 365atg cgc gaa cca caa tgt gtg gac gat gtg tta tct gtt gat gcg aac   1152Mct Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn
370                 375                 380gcg cgt gaa gtc gcc aga aaa gag gtg atg cgt ctc gca agc           1194Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser385                 390                 395<210>11<211>4390<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(208)..(447)<220><221>CDS<222>(450)..(1346)<220><221>CDS<222>(1374)..(3233)<220><221>CDS<222>(3344)..(4390)<400>11atggcggcaa tggttcgttg gcaagcctta agcgacttgt atagggaaaa atacagcagc 60ccacacctgc ggctgcatcc aggcgcggaa gtataccact aacatcgctt tgctgtgcac 120atcaccttac cattgcgcgt tatttgctat ttgccctgag tccgttacca tgacggggcg 180aaaaatattg agagtcagac attcatt atg ccg aag aaa aat gag gcg ccc gcc 234
                          Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala
                            1               5agc ttt gaa aag gcg ctg agc gag ctg gaa cag att gta acc cgt ctg   282Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu10                  15                  20                  25gaa agt ggc gac ctg ccg ctg gaa gag gcg ctg aac gag ttc gaa cgc   330Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg
             30                  35                  40ggc gtg cag ctg gca cgt cag ggg cag gcc aaa tta caa caa gcc gaa   378Gly Val Glu Leu Ala Arg Gln Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu
         45                  50                  55cag cgc gta caa att ctg ctg tct gac aat gaa gac gcc tct cta acc   426Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr
     60                  65                  70cct ttt aca ccg gac aat gag ta atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa    473Pro Phe Thr Pro Asp Asn Glu    Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu
 75                  80      1               5gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca   521Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro
 10                  15                  20ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg gtc gaa acc atg cag tat ggc gca   569Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala25                  30                  35                  40tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt   617Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly
             45                  50                  55cat atg ttc ggc gtt agc aca aac acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc   665His Met Phe Gly Val Set Thr Asn Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala
         60                  65                  70gtt gag tgt atc cac gct tac tca tta att cat gat gat tta ccg gca   713Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala
     75                  80                  85atg gat gat gac gat ctg cgt cgc ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag   761Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys
 90                  95                 100ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc gct ggc gac gct tta caa acg ctg   809Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu105                 110                115                  120gcg ttc tcg att tta agc gat gcc gat atg ccg gaa gtg tcg gac cgc   857Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg
            125                 130                 135gac aga att tcg atg att tct gaa ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc   905Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala
        140                 145                 150gga atg tgc ggt ggt cag gca tta gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac   953Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His
    155                 160                 165gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt att cat cgt cat aaa acc ggc gca   1001Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala
170                 175                 180ttg att cgc gcc gcc gtt cgc ctt ggt gca tta agc gcc gga gat aaa   1049Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys185                 190                 195                 200gga cgt cgt gct ctg ccg gta ctc gac aag tat gca gag agc atc ggc   1097Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly
            205                 210                 215ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac atc ctg gat gtg gtg gga gat act   1145Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr
        220                 225                 230gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt   1193Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser
    235                 240                 245acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt gag caa gcc cgg aag aaa gcc cgg   1241Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg
250                 255                 260gat ctg atc gac gat gcc cgt cag tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag   1289Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln265                 270                 275                 280tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa gcg cta gcg gac tac atc atc cag   1337Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln
            285                 290                 295cgt aat aaa taaacaataa gtattaatag gcccctg atg agt ttt gat att gcc 1391Arg Asn Lys                               Met Ser Phe Asp Ile Ala
                                        1                5aaa tac ccg acc ctg gca ctg gtc gac tcc acc cag gag tta cga ctg   1439Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser Thr Gln Glu Leu Arg Leu
         10                  15                  20ttg ccg aaa gag agt tta ccg aaa ctc tgc gac gaa ctg cgc cgc tat   1487Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys Asp Glu Leu Arg Arg Tyr
     25                  30                  35tta ctc gac agc gtg agc cgt tcc agc ggg cac ttc gcc tcc ggg ctg   1535Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly His Phe Ala Ser Gly Leu
 40                  45                  50ggc acg gtc gaa ctg acc gtg gcg ctg cac tat gtc tac aac acc ccg   1583Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Tyr Asn Thr Pro55                  60                  65                  70ttt gac caa ttg att tgg gat gtg ggg cat cag gct tat ccg cat aaa   1631Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Pro His Lys
             75                  80                  85att ttg acc gga cgc cgc gac aaa atc ggc acc atc cgt cag aaa ggc   1679Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly Thr Ile Arg Gln Lys Gly
         90                  95                 100ggt ctg cac ccg ttc ccg tgg cgc ggc gaa agc gaa tat gac gta tta   1727Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu Ser Glu Tyr Asp Val Leu
    105                 110                 115agc gtc ggg cat tca tca acc tcc atc agt gcc gga att ggt att gcg   1775Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala Gly Ile Gly Ile Ala
120                 125                 130gtt gct gcc gaa aaa gaa ggc aaa aat cgc cgc acc gtc tgt gtc att    1823Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg Arg Thr Val Cys Val Ile135                 140                 145                 150ggc gat ggc gcg att acc gca ggc atg gcg ttt gaa gcg atg aat cac   1871Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala Phe Glu Ala Met Asn His
            155                 160                 165gcg ggc gat atc cgt cct gat atg ctg gtg att ctc aac gac aat gaa   1919Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val Ile Leu Asn Asp Asn Glu
        170                 175                 180atg tcg att tcc gaa aat gtc ggc gcg ctc aac aac cat ctg gca cag   1967Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu Asn Asn His Leu Ala Gln
    185                 190                 195ctg ctt tcc ggt aag ctt tac tct tca ctg cgc gaa ggc ggg aaa aaa   2015Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu Arg Glu Gly Gly Lys Lys
200                 205                 210gtt ttc tct ggc gtg ccg cca att aaa gag ctg ctc aaa cgc acc gaa   2063Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu Leu Leu Lys Arg Thr Glu215                 220                 225                  230gaa cat att aaa ggc atg gta gtg cct ggc acg ttg ttt gaa gag ctg   2111Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu
            235                 240                 245ggc ttt aac tac atc ggc ccg gtg gac ggt cac gat gtg ctg ggg ctt   2159Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly His Asp Val Leu Gly Leu
        250                 255                 260atc acc acg cta aag aac atg cgc gac ctg aaa ggc ccg cag ttc ctg   2207Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu Lys Gly Pro Gln Phe Leu
    265                 270                 275cat atc atg acc aaa aaa ggt cgt ggt tat gaa ccg gca gaa aaa gac   2255His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr Glu Pro Ala Glu Lys Asp
280                 285                 290ccg atc act ttc cac gcc gtg cct aaa ttt gat ccc tcc agc ggt tgt   2303Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe Asp Pro Ser Ser Gly Cys295                 300                 305                 310ttg ccg aaa agt agc ggc ggt ttg ccg agc tat tca aaa atc ttt ggc   2351Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser Tyr Ser Lys Ile Phe Gly
            315                 320                 325gac tgg ttg tgc gaa acg gca gcg aaa gac aac aag ctg atg gcg att   2399Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp Asn Lys Leu Met Ala Ile
        330                 335                 340act ccg gcg atg cgt gaa ggt tcc ggc atg gtc gag ttt tca cgt aaa   2447Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met Val Glu Phe Ser Arg Lys
    345                 350                 355ttc ccg gat cgc tac ttc gac gtg gca att gcc gag caa cac gcg gtg   2495Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile Ala Glu Gln His Ala Val
360                 365                 370acc ttt gct gcg ggt ctg gcg att ggt ggg tac aaa ccc att gtc gcg   2543Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly Tyr Lys Pro Ile Val Ala375                 380                 385                 390att tac tcc act ttc ctg caa cgc gcc tat gat cag gtg ctg cat gac   2591Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Val Leu His Asp
            395                 400                 405gtg gcg att caa aag ctt ccg gtc ctg ttc gcc atc gac cgc gcg ggc   2639Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly
        410                 415                 420att gtt ggt gct gac ggt caa acc cat cag ggt gct ttt gat ctc tct   2687Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln Gly Ala Phe Asp Leu Ser
    425                 430                 435tac ctg cgc tgc ata ccg gaa atg gtc att atg acc ccg agc gat gaa   2735Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile Met Thr Pro Ser Asp Glu
440                 445                  450aac gaa tgt cgc cag atg ctc tat acc ggc tat cac tat aac gat ggc   2783Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly Tyr His Tyr Asn Asp Gly455                 460                 465                 470ccg tca gcg gtg cgc tac ccg cgt ggc aac gcg gtc ggc gtg gaa ctg   2831Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Ala Val Gly Val Glu Leu
            475                 480                 485acg ccg ctg gaa aaa cta cca att ggc aaa ggc att gtg aag cgt cgt   2879Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys Gly Ile Val Lys Arg Arg
        490                 495                 500ggc gag aaa ctg gcg atc ctt aac ttt ggt acg ctg atg cca gaa gcg   2927Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly Thr Leu Met Pro Glu Ala
    505                 510                 515gcg aaa gtc gcc gaa tcg ctg aac gcc acg ctg gtc gat atg cgt ttt   2975Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr Leu Val Asp Met Arg Phe
520                 525                 530gtg aaa ccg ctt gat gaa gcg tta att ctg gaa atg gcc gcc agc cat   3023Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu Glu Met Ala Ala Ser His535                 540                 545                 550gaa gcg ctg gtc acc gta gaa gaa aac gcc att atg ggc ggc gca ggc   3071Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala Ile Met Gly Gly Ala Gly
            555                 560                 565agc ggc gtg aac gaa gtg ctg atg gcc cat cgt aaa cca gta ccc gtg   3119Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His Arg Lys Pro Val Pro Val
        570                 575                 580ctg aac att ggc ctg ccg gac ttc ttt att ccg caa gga act cag gaa   3167Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile Pro Gln Gly Thr Gln Glu
    585                 590                 595gaa atg cgc gcc gaa ctc ggc ctc gat gcc gct ggt atg gaa gcc aaa   3215Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala Ala Gly Met Glu Ala Lys
600                 605                 610atc aag gcc tgg ctg gca taatccctac tccactcctg ctatgcttaa           3263Ile Lys Ala Trp Leu Ala615                 620gaaattattc atagactcta aataattcga gttgcaggaa ggcggcaaac gagtgaagcc 3323ccaggagctt acataagtaa gtg act ggg gtg aac gaa tgc agc cgc agc aca 3376
                  Val Thr Gly Val Asn Glu Cys Ser Arg Ser Thr
                    1               5                  10tgc aac ttg aag tat gac gag tat agc agg agt ggc agc atg caa tac   3424Cys Asn Leu Lys Tyr Asp Glu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser Met Gln Tyr
         15                  20                  25aac ccc tta gga aaa acc gac ctt cgc gtt tcc cga ctt tgc ctc ggc   3472Asn Pro Leu Gly Lys Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly
     30                  35                  40tgt atg acc ttt ggc gag cca gat cgc ggt aat cac gca tgg aca ctg   3520Cys Met Thr Phe Gly Glu Pro Asp Arg Gly Asn His Ala Trp Thr Leu
 45                  50                  55ccg gaa gaa agc agc cgt ccc ata att aaa cgt gca ctg gaa ggc ggc   3568Pro Glu Glu Ser Ser Arg Pro Ile Ile Lys Arg Ala Leu Glu Gly Gly 60                  65                  70                  75ata aat ttc ttt gat acc gcc aac agt tat tct gac ggc agc agc gaa   3616Ile Asn Phe Phe Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu
             80                  85                  90gag atc gtc ggt cgc gca ctg cgg gat ttc gcc cgt cgt gaa gac gtg   3664Glu Ile Val Gly Arg Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val
         95                 100                 105gtc gtt gcg acc aaa gtg ttc cat cgc gtt ggt gat tta ccg gaa gga   3712Val Val Ala Thr Lys Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly
    110                 115                 120tta tcc cgt gcg caa att ttg cgc tct atc gac gac agc ctg cga cgt   3760Leu Ser Arg Ala Gln Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg
125                 130                 135ctc ggc atg gat tat gtc gat atc ctg caa att cat cgc tgg gat tac   3808Leu Gly Met Asp Tyr Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr140                 145                 150                 155aac acg ccg atc gaa gag acg ctg gaa gcc ctc aac gac gtg gta aaa   3856Asn Thr Pro Ile Glu Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys
            160                 165                 170gcc ggg aaa gcg cgt tat atc ggc gcg tca tca atg cac gct tcg cag   3904Ala Gly Lys Ala Arg Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln
        175                 180                 185ttt gct cag gca ctg gaa ctc caa aaa cag cac ggc tgg gcg cag ttt   3952Phe Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe
    l90                 195                 200gtc agt atg cag gat cac tac aat ctg att tat cgt gaa gaa gag cgc   4000Val Ser Met Gln Asp His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg
205                 210                 215gag atg cta cca ctg tgt tat cag gag ggc gtg gcg gta att cca tgg   4048Glu Met Leu Pro Leu Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp220                 225                 230                 235agc ccg ctg gca agg ggc cgt ctg acg cgt ccg tgg gga gaa act acc   4096Ser Pro Leu Ala Arg Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr
            240                 245                 250gca cga ctg gtg tct gat gag gtg ggg aaa aat ctc tat aaa gaa agc   4144Ala Arg Leu Val Ser Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser
        255                 260                 265gat gaa aat gac gcg cag atc gca gag cgg tta aca ggc gtc agt gaa   4192Asp Glu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu
    270                 27                  280gaa ctg ggg gcg aca cga gca caa gtt gcg ctg gcc tgg ttg ttg agt   4240Glu Leu Gly Ala Thr Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser
285                 290                 295aaa ccg ggc att gcc gca ccg att atc gga act tcg cgc gaa gaa cag   4288Lys Pro Gly Ile Ala Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln300                 305                 310                 315ctt gat gag cta ttg aac gcg gtg gat atc act ttg aag ccg gaa cag   4336Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln
            320                 325                 330att gcc gaa ctg gaa acg ccg tat aaa ccg cat cct gtc gta gga ttt   4384Ile Ala Glu Leu Glu Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe
        335                 340                 345aaa taa                                                            4390Lys<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>12ccggatccat ggcggcaatg gttcgttggc aag                33<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>13ccgaattctt atttaaatcc tacgacagga tgcg                   34<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>14ccggatccat gagttttgat attgccaaat acc                   33<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>15ccgaattctt atgccagcca ggccttgatt ttg                33<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>16ccgaattctt actcattgtc cggtgtaaaa ggg                   33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>17ccggatccat ggactttccg cagcaactcg aag                     33<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>18ccgaattctt atttattacg ctggatgatg tag                      33<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>19ccggatccta atccctactc cactcctgct atg                  33<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>20gggggatcca agcaactcac cattctgggc                     30<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>21gggggatccg cttgcgagac gcatcacctc                          30<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>22gggggatcca gttttgatat tgccaaatac cc                     32<210>23<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>23gggggatcct gccagccagg ccttgatttt gg                      32<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>24gggggatccg agcaactcac cattctgggc                       30<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成DNA<400>25gggggatccg cttgcgagac gcatcacctc                        30<210>26<211>637<212>PRT<213>类球红细菌<400>26Met Thr Asp Arg Pro Cys Thr Pro Thr Leu Asp Arg Val Thr Leu Pro1               5                  10                  15Val Asp Met Lys Gly Leu Thr Asp Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala Asp
         20                  25                  30Glu Leu Arg Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Ser Val Thr Gly Gly His
     35                  40                  45Leu Gly Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Ala
 50                  55                  60Val Phe Asp Ala Pro Arg Asp Lys Ile Ile Trp Asp ValGly His Gln65                  70                  75                 80Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ile Arg Thr
                 85              90                  95Leu Arg Gln Gly Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser
            100             105                 110Pro Tyr Asp Cys Phe Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala
        115             120                 125Ala Val Gly Phe Ala Ala Ala Arg Glu Met Gly Gly Asp Thr Gly Asp
130                 135                 140Ala Val Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Met Ser Ala Gly Met Ala Phe145                 150                 155                 160Glu Ala Leu Asn His Gly Gly His Leu Lys Asn Arg Val Ile Val Ile
            165                 170                 175Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser
       180                 185                  190Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Gln Asp Phe Lys
    195                 200                 205Ala Ala Ala Lys Gly Ala Leu Gly Leu Leu Pro Glu Pro Phe Gln Glu
210                 215                 220Gly Ala Arg Arg Ala Lys Glu Met Leu Lys Ser Val Thr Val Gly Gly225                 230                 235                 240Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro Ile Asp Gly
            245                 250                 255His Asp Leu Asp Gln Leu Leu Pro Val Leu Arg Thr Val Lys Gln Arg
        260                 265                 270Ala His Ala Pro Val Leu Ile His Val Ile Thr Lys Lys Gly Arg Gly
    275                 280                 285Tyr Ala Pro Ala Glu Ala Ala Arg Asp Arg Gly His Ala Thr Asn Lys
290                 295                 300Phe Asn Val Leu Thr Gly Ala Gln Val Lys Pro Val Ser Asn Ala Pro305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr Lys Val Phe Ala Gln Ser Leu Ile Lys Glu Ala Glu Val
            325                 330                 335Asp Glu Arg Ile Cys Ala Val Thr Ala Ala Met Pro Asp Gly Thr Gly
        340                 345                 350Leu Asn Leu Phe Gly Glu Arg Phe Pro Lys Arg Thr Phe Asp Val Gly
    355                 360                 365Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly
370                 375                 380Gly Met Arg Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Gly385                 390                 395                 400Tyr Asp Gln Ile Val His Asp Val Ala Ile Gln Arg Leu Pro Val Arg
            405                 410                 415Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Ala Thr His
        420                 425                 430Ala Gly Ser Phe Asp Val Ala Phe Leu Ser Asn Leu Pro Gly Ile Val
    435                 440                 445Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Val His Met Val Ala Thr
450                 455                 460Ala Ala Ala His Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Tyr Pro Arg Gly465                 470                 475                 480Asp Gly Val Gly Val Glu Met Pro Val Lys Gly Val Pro Leu Gln Ile
            485                 490                 495Gly Arg Gly Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Arg Ile Ala Leu Leu Ser
        500                 505                 510Phe Gly Thr Arg Leu Ala Glu Val Gln Val Ala Ala Glu Ala Leu Arg
    515                 520                 525Ala Arg Gly Ile Ser Pro Thr ValAla Asp Ala Arg Phe Ala Lys Pro
530                 535                 540Leu Asp Arg Asp Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ala His His Glu Ala Leu545                 550                 555                 560Ile Thr Ile Glu Glu Gly Ala Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala
            565                 570                 575Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gly Val Phe Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Arg
        580                 585                 590Ser Met Val Leu Pro Asp Thr Phe Ile Asp His Asn Ser Ala Glu Val
    595                 600                 605Met Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp Ile Glu Arg Lys Ala
610                 615                 620Leu Glu Thr Leu Gly Val Glu Val Leu Ala Arg Arg Ala625                 630                 635<210>27<211>1911<212>DNA<213>类球红细菌<220><221>CDS<222>(1)..(1911)<400>27atg acc gac aga ccc tgc acg ccg acg ctc gac cgg gtg acg ctc ccg   48Met Thr Asp Arg Pro Cys Thr Pro Thr Leu Asp Arg Val Thr Leu Pro1               5                  10                  15gtg gac atg aag ggc ctc acg gac cgt gag ctg cgc tcg ctg gcc gac   96Val Asp Met Lys Gly Leu Thr Asp Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala Asp
         20                  25                  30gag ctg cgg gcc gaa acg atc tcg gcc gtg tcg gtg acg ggc ggg cat   144Glu Leu Arg Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Ser Val Thr Gly Gly His
     35                  40                  45ctg ggc gca ggc ctc ggc gtg gtg gag ttg acg gtt gcg ctg cat gcg   192Leu Gly Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Ala
 50                  55                  60gtc ttc gat gcg ccg cgc gac aag atc atc tgg gac gtg ggc cac cag   240Val Phe Asp Ala Pro Arg Asp Lys Ile Ile Trp Asp Val Gly His Gln65                  70                  75                  80tgc tac ccc cac aag atc ctg acc ggg cgg cgc gac cgc atc cgc aca   288Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ile Arg Thr
             85                  90                  95ctg cgg cag ggc ggg ggt ctc tcg ggc ttc acc aag cgc tcc gag agc   336Leu Arg Gln Gly Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser
        100                 105                 110ccc tac gac tgt ttc ggc gcg ggc cat tcc tcg acc tcg atc tcg gcc   384Pro Tyr Asp Cys Phe Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala
    115                 120                 125gcg gtg ggc ttt gcc gcg gcg cgc gag atg ggc ggc gac acg ggc gac   432Ala Val Gly Phe Ala Ala Ala Arg Glu Met Gly Gly Asp Thr Gly Asp
130                 135                 140gcg gtg gcg gtg atc ggc gat ggc tcg atg tcg gcc ggc atg gcc ttc   480Ala Val Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Met Ser Ala Gly Met Ala Phe145                 150                 155                160gag gcg ctg aac cac ggc ggg cac ctg aag aac cgg gtg atc gtg atc   528Glu Ala Leu Asn His Gly Gly His Leu Lys Asn Arg Val Ile Val Ile
            165                 170                 175ctg aac gac aat gag atg agc atc gcg ccg ccg gtg ggg gcg ctg tcg   576Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser
        180                 185                 190tcc tat ctc tcg cgg ctc tat gcg ggc gcg ccg ttc cag gac ttc aag   624Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Gln Asp Phe Lys
    195                 200                 205gcg gcc gcc aag gga gcg ctc ggg ctt ctg ccc gaa ccg ttc cag gag   672Ala Ala Ala Lys Gly Ala Leu Gly Leu Leu Pro Glu Pro Phe Gln Glu
210                 215                 220ggc gcg cgc cgc gcc aag gag atg ctg aag agc gtc acc gtc ggc ggc   720Gly Ala Arg Arg Ala Lys Glu Met Leu Lys Ser Val Thr Val Gly Gly225                 230                 235                 240acg ctc ttc gag gag ctg ggt ttc tcc tat gtc ggc ccg atc gac ggg   768Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro Ile Asp Gly
            245                 250                 255cac gat ctc gac cag ctt ctg ccg gtg ctg cgg acc gtc aag cag cgg   816His Asp Leu Asp Gln Leu Leu Pro Val Leu Arg Thr Val Lys Gln Arg
        260                 265                 270gcg cat gcg ccg gtg ctg atc cat gtc atc acc aag aag ggc agg ggc   864Ala His Ala Pro Val Leu Ile His Val Ile Thr Lys Lys Gly Arg Gly
    275                 280                 285tat gct ccg gcc gag gcc gcg cgc gac cgc ggc cat gcc acg aac aag   912Tyr Ala Pro Ala Glu Ala Ala Arg Asp Arg Gly His Ala Thr Asn Lys
290                295                  300ttc aac gtc ctg acc ggc gcg cag gtg aag ccg gtc tcg aac gcc ccc   960Phe Asn Val Leu Thr Gly Ala Gln Val Lys Pro Val Ser Asn Ala Pro305                 310                 315                 320tcc tac acc aag gtc ttc gcc cag agc ctc atc aag gag gcc gag gtc   1008Ser Tyr Thr Lys Val Phe Ala Gln Ser Leu Ile Lys Glu Ala Glu Val
            325                 330                 335gac gag cgg atc tgc gcg gtg acg gcc gcc atg ccg gac ggg acg ggg   1056Asp Glu Arg Ile Cys Ala Val Thr Ala Ala Met Pro Asp Gly Thr Gly
        340                 345                 350ctc aac ctc ttc ggc gag cgg ttt ccg aag cgc acc ttc gac gtg ggc   1104Leu Asn Leu Phe Gly Glu Arg Phe Pro Lys Arg Thr Phe Asp Val Gly
    355                 360                 365atc gcg gaa cag cat gcg gtg acc ttc tcg gcg gcg ctt gcg gca ggc   1152Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly
370                 375                 380ggc atg cgg ccc ttc tgc gcg atc tat tcc acc ttc ctc cag cgc ggc   1200Gly Met Arg Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Gly385                 390                 395                 400tac gac cag atc gtg cat gac gtg gcg atc cag cgc ctg ccg gtg cgc   1248Tyr Asp Gln Ile Val His Asp Val Ala Ile Gln Arg Leu Pro Val Arg
            405                 410                 415ttc gcc atc gat cgc gcg ggc ctc gtg ggg gcg gac ggc gcc acc cat   1296Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Ala Thr His
        420                 425                 430gcg ggc tcg ttc gac gtg gcc ttc ctg tcg aac ctg ccc ggc atc gtg   1344Ala Gly Ser Phe Asp Val Ala Phe Leu Ser Asn Leu Pro Gly Ile Val
    435                 440                 445gtg atg gcc gcc gcc gac gag gcc gag ctc gtc cat atg gtg gcc acc   1392Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Val His Met ValAla Thr
450                  455                460gcc gcc gcc cat gac gaa ggg ccc atc gcc ttc cgc tac ccg cgc ggc   1440Ala Ala Ala His Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Tyr Pro Arg Gly465                 470                 475                 480gac ggc gtg ggg gtc gag atg ccg gtg aag ggc gtg ccg ctc cag atc   1488Asp Gly Val Gly Val Glu Met Pro Val Lys Gly Val Pro Leu Gln Ile
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        500                 505                 510ttc ggc acc cgt ctg gcc gag gtg cag gtg gcc gcc gag gcg ctg cgt   1584Phe Gly Thr Arg Leu Ala Glu Val Gln Val Ala Ala Glu Ala Leu Arg
    515                 520                 525gcg cgc ggg atc tct ccc acg gtt gcg gat gcg cgc ttt gca aag ccg   1632Ala Arg Gly Ile Ser Pro Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Lys Pro
530                 535                 540ctc gac cgg gat ctg atc ctg cag ctc gcg gcc cat cac gag gcg ctt   1680Leu Asp Arg Asp Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ala His His Glu Ala Leu545                 550                 555                 560atc acc atc gag gag ggc gcc atc ggc ggt ttc ggc agc cat gtg gcg   1728Ile Thr Ile Glu Glu Gly Ala Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala
            565                 570                 575cag ctt ctg gcc gag gcc ggg gtc ttc gac cgc ggc ttc cgg tat cgc   1776Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gly Val Phe Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Arg
        580                 585                 590rcg atg gtg ctg ccc gac acg ttc atc gac cac aac agc gcg gag gtg   1824Ser Met Val Leu Pro Asp Thr Phe Ile Asp His Asn Ser Ala Glu Val
    595                 600                 605atg tat gcc acc gcc ggg ctg aat gcg gcc gac ata gag cgg aag gcg   1872Met Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp Ile Glu Arg Lys Ala
610                 615                 620ctg gag acg ctg ggg gtg gag gtc ctc gcc cgc cgc gcc               1911Leu Glu Thr Leu Gly Val Glu Val Leu Ala Arg Arg Ala625                 630                 635<210>28<211>648<212>PRT<213>类球红细菌<400>28Met Thr Asn Pro Thr Pro Arg Pro Glu Thr Pro Leu Leu Asp Arg Val1               5                  10                  15Cys Cys Pro Ala Asp Met Lys Ala Leu Ser Asp Ala Glu Leu Glu Arg
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450                 455                 460Ile Ala Thr Ala Val Ala Phe Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Phe465                 470                 475                 480Pro Arg Gly Glu Gly Val Gly Val Glu Met Pro Glu Arg Gly Thr Val
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    595                 600                 605Pro Glu Asp Met Tyr Ala Asp Ala Gly Leu Arg Ala Glu Asp Ile Ala
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 50                  55                  60ctg cat gca gtc ttc aac acg ccc acc gac aag ctc gtc tgg gac gtg   240Leu His Ala Val Phe Asn Thr Pro Thr Asp Lys Leu Val Trp Asp Val65                  70                  75                  80ggc cac cag tgc tac ccc cac aag atc ctc acc ggc cgg cgc gag cag   288Gly His Gln Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Glu Gln
             85                  90                  95atg cgc acc ctg cgc cag aag ggc ggc ctc tcg ggc ttc acc aag cgc   336Met Arg Thr Leu Arg Gln Lys Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg
        100                 105                 110tcg gaa tcc gcc tac gac ccg ttc ggc gcg gcc cat tcc tcg acc tcg   384Ser Glu Ser Ala Tyr Asp Pro Phe Gly Ala Ala His Ser Ser Thr Ser
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    195                 200                 205acg ctg cgc gcg gcc gcc gac ggg ctc gag gcc tcg ctg ccg ggg ccg   672Thr Leu Arg Ala Ala Ala Asp Gly Leu Glu Ala Ser Leu Pro Gly Pro
210                 215                 220ctc cgc gac ggg gcg cgc cgg gcg cgc cag ctc gtg acc ggg atg ccg   720Leu Arg Asp Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gln Leu Val Thr Gly Met Pro225                 230                 235                 240ggc ggg ggc acg ctc ttc gag gag ctg ggc ttc acc tat gtg ggt ccc   768Gly Gly Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Thr Tyr Val Gly Pro
            245                 250                 255atc gac ggc cac gac atg gag gcg ctg ctc cag acg ctg cgc gcg gcg   816Ile Asp Gly His Asp Met Glu Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Ala Ala
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            325                 330                 335gcc gcg cgc gat ccg cgc atc gtg gcc atc acc gcg gcc atg ccc tcg   1056Ala Ala Arg Asp Pro Arg Ile Val Ala lle Thr Ala Ala Met Pro Ser
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            565                 570                 575cat gtc atg cac tat ctc gcc aat tcc ggc ggc ttc gac ggg ggc ctc   1776His Val Met His Tyr Leu Ala Asn Ser Gly Gly Phe Asp Gly Gly Leu
        580                 585                 590gcg ctc cgg gtc atg acg ctg ccc gac cgc ttc atc gag cag gcg agc   1824Ala Leu Arg Val Met Thr Leu Pro Asp Arg Phe Ile Glu Gln Ala Ser
    595                 600                 605ccc gag gac atg tat gcc gat gcg ggg ctg cgg gcc gag gat atc gcg   1872Pro Glu Asp Met Tyr Ala Asp Ala Gly Leu Arg Ala Glu Asp Ile Ala
610                 615                 620gcc acc gcg cgg ggc gcg ctc gcc cgg ggg cgc gtg atg ccg ctc cgg   1920Ala Thr Ala Arg Gly Ala Leu Ala Arg Gly Arg Val Met Pro Leu Arg625                 630                 635                 640cag acg gca aag ccg cgg gcg gtc                                      1944Gln Thr Ala Lys Pro Arg Ala Val
            645<210>30<211>394<212>PRT<213>类球红细菌<400>30Met Arg Ser Leu Ser Ile Phe Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Glu Ser  1               5                  10                  15Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr
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     35                  40                  45Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala ValThr Ala His Glu Asp Cys Leu
 50                  55                 60Pro Ala Leu Arg Clu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly65                  70                  75                  80Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr
             85                  90                  95Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala
        100                 105                 110Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val
    115                 120                 125Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thr
130                 135                 140Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Ala145                 150                 155                 160Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly
            165                 170                 175Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val
        180                 185                 190Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser
    195                 200                 205Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr
210                 215                 220Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His225                 230                 235                 240Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu
            245                 250                 255Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala
        260                 265                 270Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu
    275                 280                 285Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe
290                 295                 300Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser305                 310                 315                 320Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile
            325                 330                 335Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr
        340                 345                 350Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala
    355                 360                 365Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu
370                 375                 380Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg385                 390<210>31<211>1182<212>DNA<213>类球红细菌<220><221> CDS<222>(1)..(1182)<400>31atg cgc agc ctg tcg atc ttt ggg gcc acc ggc tcc atc ggc gaa tcc   48Met Arg Ser Leu Ser Ile Phe Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Glu Ser1               5                  10                  15acc ttc gac ctc gtc atg cgg aag ggc ggg ccc gag gcg ttc cgc acc   96Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr
         20                  25                  30gtc gct ctg acc ggc ggg cgc aac atc cgg cga ctg gcc gaa atg gcg   144Val Ala Leu Thr Gly Gly Arg Asn Ile Arg Arg Leu Ala Glu Met Ala
     35                  40                  45cgt gcg ctg aag gcg gag ctt gcc gtc acc gcg cat gag gac tgc ctg   192Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala Val Thr Ala His Glu Asp Cys Leu
 50                  55                  60ccc gcg ctg cgc gag gcg ctg gcc ggg acg ggc acc gag gtc gcg ggc   240Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly65                  70                  75                  80ggg gcg cag gcc atc gcc gag gcc gcc gac cgg ccg gcc gac tgg acc   288Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr
             85                  90                  95atg tcg gcc atc gtg ggc gcc gcg ggc ctc gtg ccc gga atg cgg gcg   336Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala
        100                 105                 110ctg aag cac ggc cgc acg ctg gcg ctc gcc aac aag gaa agc ctc gtg   384Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val
    115                 120                 125acg gca ggg caa ctc ctg atg cgg acg gcc cag gag aac ggc gcc acg   432Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thrl30                  l35                 l40atc ctg ccg gtg gac agc gag cac tcc gcg gtc ttt cag gcg ctg gcg   480Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Alal45                 l50                 l55                l60ggc gag gac acg gcc tgc gtc gag cgc gtc atc atc acg gcg tcc ggc   528Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly
            l65                 l70                 l75ggg ccg ttc cgc gac tgg agc ctc gag cgc atc cgc gcc tgc acc gtg   576Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val
        l80                 185                 190gcc gag gcg cag gcc cat ccc aac tgg tcc atg ggc cag cgg atc tcc   624Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser
    195                 200                 205atc gac agc gcc tcg atg ttc aac aag gcg ctc gag ctg atc gag acg   672Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr
210                 215                 220cgc gaa ttc ttc ggc ttc gag ccg gac cgg atc gag gcg gtc gtc cat   720Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His225                 230                 235                 240ccg caa tcc atc gtc cat gcg atg gtg ggc ttc tgc gac ggg ggc ctg   768Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu
            245                 250                 255atg gcc cat ctc ggc ccc gcc gac atg cgc cac gcc atc gga ttc gcg   816Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala
        260                 265                 270ctg aac tgg ccg ggt cgc ggc gag gtg ccc gtc gcc cgg atc gac ctc   864Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu
    275                 280                 285gca cag att gcg agc ctc acc ttc cag aag cct gac gag gaa cgc ttt   912Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe
290                 295                 300ccg gcc ctg agg ctt gcg cga gac gtc atg gcg gcg cgc ggc ctg tcg   960Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser305                 310                 315                 320ggc gcc gcc ttc aac gcg gcc aag gag atc gcg ctc gat cat ttc atc   1008Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile
            325                 330                 335gcc gga cgc atc ggg ttt ctg gac atg gcg gcg gtg gtc gag gag acg   1056Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr
        340                 345                 350ctc gcg ggc gtt tcg acc gac ccc ctg ttc gga aaa gtg ccc gac gcc   1104Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala
    355                 360                 365ctt gag gaa gtg ctg gcc atg gac cat ctc gct cgg aga gcg gca gag   1152Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu
370                 375                 380gaa gcc gcc ggt ctc cgc cag cag aaa agg                             1182Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg385                 390<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>32aagctgatct gggacgtggg gca                             23<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>33tgctatccgc acaagatcct gac                         23<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>34gcatgctgtt ccgcgatgcc gac                           23

Claims (22)

1．生产类异戊二烯化合物的方法，该方法包括将包含一个或多个选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的DNA的DNA整合到载体中：
(a)编码具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA，
(b)编码法尼焦磷酸合酶的DNA，
(c)编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA，或编码具有其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，
(d)编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白的DNA，或编码具有其中在SEQ ID NO:4的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，
(e)编码具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA，
(f)编码能够在严格条件下与选自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的DNA杂交、并且其活性与由所选择的DNA编码的蛋白的活性基本相同的蛋白的DNA；将产生的重组DNA引入到得自原核生物的宿主细胞中；在培养基中培养所获得的转化体；使所述转化体在培养物中产生和累积类异戊二烯化合物；并从所述培养物中回收所述类异戊二烯化合物。
2．按照权利要求1的方法，其中所述编码具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA，是编码具有SEQ ID NO:1、26和28中任何一个的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是编码具有其中在SEQ ID NO:1、26或28的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列，并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白的DNA。
3．按照权利要求1或2的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO:6、27和29中任何一个的核苷酸序列。
4．按照权利要求1的方法，其中编码法尼焦磷酸合酶的DNA是编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是编码具有其中在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的法尼焦磷酸合酶的DNA。
5．按照权利要求1或4的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
6．按照权利要求1的方法，其中所述编码具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA，是编码具有SEQ ID NO:5或30的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是编码具有其中在SEQ ID NO:5或30的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白的DNA。
7．按照权利要求1或6的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO:10或31的核苷酸序列。
8．按照权利要求1的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO:8或9的核苷酸序列。
9．按照权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯化合物选自泛醌、维生素K2和类胡萝卜素。
10．具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率的活性、并选自以下(a)、(b)和(c)的蛋白：
(a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，
(b)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:4的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，和
(c)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白。
11．生产具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，该方法包括将编码权利要求10的蛋白的DNA整合到载体中，将产生的重组DNA引入到宿主细胞中，在培养基中培养所获得的转化体，使该转化体在培养物中产生和累积所述蛋白，并从培养物中回收所述蛋白。
12．按照权利要求1或11的方法，其中所述转化体是属于埃希氏菌属、红细菌属或欧文氏菌属的微生物。
13．编码具有提高类异戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白、并描述于以下(a)至(g)中任何一个的DNA:
(a)编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(b)编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(c)编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白的DNA，
(d)具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的DNA，
(e)具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的DNA，
(f)具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的DNA，和
(g)可以在严格条件下与(a)至(f)中的任何一个DNA杂交的DNA。
14．筛选具有抗生活性的物质的方法，该方法包括筛选抑制蛋白反应的物质，所述蛋白具有选自那些存在于非甲羟戊酸途径上的酶的酶活性，在所述途径中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成产生的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，而由所述2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成异戊烯焦磷酸。
15．筛选具有除草活性的物质的方法，该方法包括筛选抑制蛋白反应的物质，所述蛋白具有选自那些存在于非甲羟戊酸途径上的酶的酶活性，在所述途径中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成产生的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，而由所述2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成异戊烯焦磷酸。
16．按照权利要求14或15的方法，其中所述蛋白是描述于以下(a)或(b)中的蛋白：
(a)具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白，或
(b)具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白。
17．按照权利要求16的筛选方法，其中所述催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应的蛋白，是具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白，或是具有其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸产生1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应活性的蛋白。
18．按照权利要求16的筛选方法，其中所述具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白，是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白，或是具有其中在SEQ IDNO:5的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至几个氨基酸残基的氨基酸序列、并具有催化由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸产生2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸反应活性的蛋白。
19．通过按照权利要求14的筛选方法获得的具有抗生活性的物质。
20．通过按照权利要求15的筛选方法获得的具有除草活性的物质。
21．包含权利要求19的物质的抗生剂。
22．包含权利要求20的物质的除草剂。
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