CN117737268A - 一种基于袖状胃切除术发现的肠道菌群及其在肥胖诊治中的应用 - Google Patents
一种基于袖状胃切除术发现的肠道菌群及其在肥胖诊治中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及一种基于袖状胃切除术发现的肠道菌群及其在肥胖诊治中的应用。具体的，本发明利用全宏基因组鸟枪法测序及非靶向代谢组学技术，对肥胖患者接受袖状胃切除术前后的粪便及血清进行检测，并对其检测结果进行联合分析，最终筛选出与肥胖高度相关的菌群及其代谢物，研究表明，SG显著增加了微生物区系的多样性，并显著增加了部分微生物种群的数量。这些成分变化与脂代谢产物呈正相关。同时，部分微生物种群的增加与BMI呈负相关，且经过验证，表明其可作为肥胖的生物标志物使用，同时，其亦可成为治疗肥胖症的潜在靶标，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及一种基于袖状胃切除术发现的肠道菌群及其在肥胖诊治中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
过去半个世纪以来，肥胖的患病率一直在稳步上升。肥胖会导致多种代谢疾病，例如非酒精性脂肪肝(NAFLD)、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病、高血压、冠心病、抑郁症和癌症等。久坐的生活方式、运动量少、能量摄入过多是导致肥胖的主要原因；肥胖相关基因也构成重要的遗传因素。如何有效缓解和逆转肥胖，以及预防其并发症和潜在的破坏性影响，已引起公众健康的广泛关注。
肠道菌群是人体最大的微生物群落，在基因水平上，它含有比人类基因组多约30倍的基因，与人体的正常生理功能密切相关。最近的研究表明，肠道微生物群的变化与肥胖患者肥胖和肥胖相关并发症的发生密切相关。既往有研究报道，使用口服抗生素可能会增加肥胖风险，而来自瘦捐献者的粪便微生物移植可以改善肥胖患者的代谢状态，并减轻与肥胖相关的代谢性疾病；这些发现表明肠道微生物群在肥胖的发生和进展中发挥着重要作用。因此，针对肠道微生物群的靶向治疗逐渐成为肥胖及肥胖相关疾病的重要干预措施。
减重手术是治疗肥胖和高血糖最有效的方法之一，对代谢状态有重大影响。袖状胃切除术(SG)是一种常见的减重手术方法，因其操作简单、减肥效果强、营养不良风险低而被广泛应用于肥胖治疗。SG的显着减肥效果不仅仅取决于胃容量的减少，还可以通过调节激素水平、食欲和其他因素来重组全身内分泌功能，从而改善糖脂代谢。然而，该机制的细节还需要进一步研究。有证据表明，SG也可以影响肠道微生物群的组成和功能，且与其明显的治疗效果密切相关。然而，只有少数研究调查了SG对肠道微生物群的影响，主要是通过16S核糖体RNA基因扩增子测序，现需要对其对微生物群落影响的精确度和深度进行更多研究。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于袖状胃切除术发现的肠道菌群及其在肥胖诊治中的应用。基于袖状胃切除术，联合全宏基因组鸟枪法测序及非靶向代谢组学技术，筛选出与肥胖高度相关的菌群及其代谢物，该发现为肥胖的治疗提供了潜在靶点，基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种生物标志物，所述生物标志物包括选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
进一步的，所述生物标志物为Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides所组成的组。
本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物的物质在制备用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险的产品。
本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品包括用于检测上述生物标志物的物质，所述产品用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险。
所述产品包括但不限于检测待测样品中生物标志物的(相对)丰度和/或数量(OTU数目)的试剂、装置和/或设备。
本发明的第四个方面，提供一种用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖风险的系统，所系统包括分析单元和评估单元；
所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自生物标志物的相对丰度信息的检测物质，以及；
评估单元，所述评估单元包含：根据分析单元确定的所述生物标志物的相对丰度信息对所述受试者进行诊断其是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险。
所述分析单元中，所述生物标志物选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
本发明的第五个方面，提供上述生物标志物作为靶点用于筛选预防或治疗肥胖的药物的用途。
具体的，可以利用候选药物使用前和使用后对这些生物标志物的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗肥胖。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案利用全宏基因组鸟枪法测序及非靶向代谢组学技术，对肥胖患者接受袖状胃切除术前后的粪便及血清进行检测，并对其检测结果进行联合分析，最终筛选出与肥胖高度相关的菌群及其代谢物，研究表明，SG显著增加了微生物区系的多样性，并显著增加了Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bactreoidales和Enterobacteraies的数量。这些成分变化与脂代谢产物呈正相关，包括鞘脂、甘油磷脂和不饱和脂肪酸。Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroide的增加与BMI呈负相关，且经过验证，表明其可作为肥胖的生物标志物使用，同时，其亦可成为治疗肥胖症的潜在靶标，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中全宏基因组鸟枪测序法分析袖状胃切除术后肠道菌群多样性的群落结构变化。(A)Chao1，(B)物种覆盖指数，(C)物种和(D)shannon估计量来指示SG后α多样性的变化；(E)基于Bray-Curtis对两组样本进行主坐标分析(PCoA)；(F)使用算术平均的未加权配对方法(UPGMA)根据Bray-Curtis距离对样本进行聚类。
图2为本发明实施例中SG后肠道微生物组成的变化。(A)两组之间在门水平上肠道微生物群组成的差异以堆积图呈现；(B)两组肠道微生物群组成在目水平上的差异以堆积图呈现；(C)各物种肠道微生物群组成的两组之间的差异以堆积图呈现；(D)SG后细菌种群在物种水平上的变化以热图形式呈现；(E)SG引起的前20种差异菌种；(F)LDA效应大小(LEfSe)的分支图，用于识别SG组丰度存在显着差异的物种(LDA>4.0)；(G)LDA效应大小(LEfSe)的LDA评分，用于识别SG组丰度存在显着差异的物种(LDA>4.0)。
图3为本发明实施例中SG显着改变肠道微生物群的遗传特征和功能。(A)两组间差异基因的维恩图；(B)SG后肠道微生物基因计数发生改变；(C)两组间差异基因的KEGG富集分析；(D,E)基于KEGG 2级数据库，SG后肠道微生物群功能的改变；(F,G)基于KEGGPathwayDefinition水平的数据库，SG后肠道微生物群的功能发生改变；(H)两组之间肠道微生物群功能最显着差异的前20种。
图4为本发明实施例中代谢组学分析揭示了SG后肠道代谢物的变化。(A)MS1基于KEGG数据库识别的整体肠道代谢特征的注释；(B)MS2基于KEGG数据库识别的整体肠道代谢特征的注释；(C)对两组肠道代谢物进行PCA分析；(D)由SG引起的差异代谢离子计数变化的统计条形图；(E)热图揭示了两组之间不同的肠道代谢物；(F)MS1鉴定的肠道代谢物的KEGG富集分析；(G)MS2鉴定的肠道代谢物的KEGG富集分析。
图5为本发明实施例中代谢组学分析揭示了SG后血清代谢物的变化。(A)MS1基于KEGG数据库识别的整体血清代谢特征的注释；(B)基于KEGG数据库对MS2识别的总体血清代谢特征进行注释；(C)两组血清代谢物的PCA；(D)由SG引起的差异代谢离子计数变化的统计条形图；(E)热图显示两组之间不同的血清代谢物；(F)MS1鉴定的血清代谢物的KEGG富集分析；(G)MS2鉴定的血清代谢物的KEGG富集分析。
图6为本发明实施例中综合多组学分析揭示SG介导的肠道微环境重塑。(A)特定差异菌与粪便差异代谢物TOP 20的相关性分析；(B)特异性差异菌与TOP 20血清差异代谢物的相关性分析；(C)Alistipes丰度与BMI之间的线性相关分析；(D)Parabacteroides丰度与BMI的线性相关分析；(E)Rikenellaceae丰度与BMI之间的线性相关分析。
图7为本发明实施例中SG小鼠的粪便菌群移植可减轻HFD诱导的肥胖小鼠的肥胖相关指标。(A)动物实验流程图；16S rDNA基因测序检测微生物群限制效率(B)chao 1，(C)基于Bray-Curtis的两组样品的PCoA，(D)使用UPGMA方法根据Bray-Curtis对样品进行聚类；(E)SG后体重的变化；粪便菌群移植后肥胖相关指标的变化(F)体重，(G)总胆固醇，(H)甘油三酯，(I)LDL-胆固醇，(J)IPGTT，(K)IPGTTAUC。*P<0.05；**P<0.01。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
术语“生物标志物”，是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”。例如，核酸标志物(也可以称为基因标志物，例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。其中，核酸标志物的含义并不局限于现有可以表达为具有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经过修饰的DNA或者RNA，也可以是未经修饰的DNA或者RNA，以及由它们组成的集合。在本发明中，生物标志物也可以用“淋巴结标志物”来表示，因为所发现的与头颈癌相关的生物标志物选自患者的淋巴结内。
所述的生物标志物，可以运用高通量测序，批量分析头颈癌患者的淋巴结样本。基于高通量测序数据，从而确定与头颈癌患者预后相关特异性核酸序列。对于生物标志物本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在淋巴结菌群中是否存在所述物种。例如，菌种鉴别可以通过进行16srRNA进行。
本发明的一个典型具体实施方式中，本发明的第一个方面，提供一种生物标志物，所述生物标志物包括选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
进一步的，所述生物标志物为Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides所组成的组。试验证明，当Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides联合应用时，其灵敏度、特异性均得到显著提升。
上述微生物菌群选自受试者的待测样品，所述待测样品可以为受试者粪便样品。
本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述生物标志物的物质在制备用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险的产品。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包括用于检测上述生物标志物的物质，所述产品用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险。
所述产品包括但不限于检测待测样品中生物标志物的(相对)丰度和/或数量(OTU数目)的试剂、装置和/或设备。
所述生物标志物的相对丰度信息是利用测序方法得到的，进一步包括：从受试者的所述样本(粪便)中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖风险的系统，所系统包括分析单元和评估单元；
所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自生物标志物的相对丰度信息的检测物质，以及；
评估单元，所述评估单元包含：根据分析单元确定的所述生物标志物的相对丰度信息对所述受试者进行诊断其是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险。
所述分析单元中，所述生物标志物选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
本发明的又一具体实施方式中，所述生物标志物为Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides所组成的组。试验证明，当Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides联合应用时，其灵敏度、特异性均得到显著提升。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述生物标志物作为靶点用于筛选预防或治疗肥胖的药物的用途。
本发明的又一具体实施方式中，可以利用候选药物使用前和使用后对这些生物标志物的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗肥胖。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实验方法
全宏基因组鸟枪法测序
1)微生物DNA的提取
根据制造商的说明，使用Stool DNAKit(D4015-02，Omega,Inc.，USA)从粪便样本中提取微生物DNA。样本空白由未使用的拭子组成，这些拭子经过DNA提取并确认不含DNA扩增子。根据制造商的方案，用50μl洗脱缓冲液洗脱总DNA，然后冷冻于-80℃。最后，总DNA由Lc-bio Technologies(Hangzhou)Co.,Ltd.进行定量检测。
2)微生物DNA文库的构建
使用TruSeq Nano DNALT文库制备试剂盒(FC-121-4001)构建微生物DNA文库。通过在37℃下与dsDNA片段酶(NEB，M0348S)一起孵育30分钟将DNA片段化。结合填充反应和核酸外切酶活性生成平末端DNA片段，然后将其连接到索引接头上。接下来，在以下条件下对连接产物进行聚合酶链式反应扩增：95℃初始变性3分钟；98℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒8个循环；最后在72℃延伸5分钟。
3)数据处理
在分析之前，使用cutadapt v1.9、fqtrim v0.94和Bowtie2 v2.2.0修剪原始数据。经过质量过滤的数据通过IDBA-UD v1.1.1进行从头组装，以构建每个样本的宏基因组。MetaGeneMark v3.26用于预测宏基因组重叠群的所有编码区域。使用CD-HIT v4.6.1去除冗余基因，得到unigenes。为了生成功能信息，unigenes被DIAMOND v0.9.14用作功能数据库(KEGG)分析的查询。基于上述数据以及unigene丰度谱，Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验(重复组)、UPGMA和线性判别分析效应大小(LEfSe)使用方法来识别各组之间丰度显着差异的特征。随后，鉴定出差异富集的KEGG通路。使用Chao1、物种覆盖率、观察到的物种和shannon指数对Alpha多样性进行量化。Beta多样性使用Bray-Curtis或Jensen-Shannon计算。
代谢组学分析
1)代谢物提取
血清和粪便样本(各20μl)分别用120μl或1ml预冷的50％甲醇提取，然后在室温下孵育10分钟。随后，将提取混合物在-20℃下储存过夜。离心(4000g，20分钟)后，将上清液转移至96孔板中，并于-80℃保存，用于液相色谱-质谱(LC-MS)分析。
2)LC-MS数据采集
根据系统制造商的说明，通过LC-MS分析样品。Vanquish Flex UHPLC系统(ThermoFisher Scientific)用于色谱分离。使用ACQUITY UPLC TC柱(35℃，0.4ml/min，100mm×2.1mm，1.8μm，Waters，Milford)进行反相分离；流动相由溶剂A(水，0.1％甲酸)和溶剂B(乙腈，0.1％甲酸)组成。梯度洗脱条件如下：0～0.5min，5％ B；0.5-7分钟，5％至100％ B；7-8分钟，100％ B；8-8.1分钟，100％至5％ B；8.1-10分钟，5％B。使用Q-Exactive高分辨率串联质谱仪(Thermo Fisher Scientific)检测洗脱的代谢物。以70000分辨率收集前体光谱(70-1050m/z)；数据采集的前三种配置使用DDA模式。最后，以17500分辨率收集碎片光谱。
3)数据处理
上述MS数据预处理步骤(包括峰拾取、峰分组、保留时间校正、第二峰分组以及同位素和加合物的注释)均通过XCMS软件进行。记录每个峰值强度，生成一个三维矩阵，其中包含任意指定的峰索引、样品名称和离子强度信息。使用KEGG数据库和人类代谢组数据库(HMDB)来注释代谢物。内部代谢物片段谱库也用于注释代谢物。Meta X用于峰强度数据的额外预处理。删除了不到50％的质量控制样本或80％的生物样本中检测到的特征，以提高数据质量。此外，还计算了质量控制样本的标准偏差，标准偏差>30％的样本被移除。最后，进行t检验以确定代谢物浓度的差异。Meta X软件用于区分组间变量。此外，还计算了预测变量重要性(VIP)值；VIP截止值1.0用于选择重要特征。
动物实验
1)动物模型
雄性C57BL/6J小鼠(6周龄；体重＝20±2.0g)被放置在山东第一医科大学第一附属医院动物实验室的SPF条件下。环境条件保持在20-26℃的温度范围、50-60％的湿度以及12/12小时的光/暗循环。涉及动物的实验方案经过山东第一医科大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会的彻底审查和批准。经过一周的适应期后，给小鼠喂食高脂肪饮食(HFD，40％的热量是脂肪)，持续12周，如图7A所示。
2)袖状胃切除术
肥胖小鼠在手术前禁食12小时。使用2％异氟烷气体诱导麻醉。在上腹部中部小心地切一个2厘米的切口，以便清晰地观察和区分胃血管和组织结构。然后使用7-0线结扎胃底和胃大弯的血管。随后切除了大部分胃底和胃大弯，留下了剩余的胃。使用5-0线仔细缝合剩余的胃。最后，使用3-0线逐层仔细封闭腹腔。手术后8周收集粪便以制备粪便悬浮液。
粪便菌群移植
将肥胖小鼠分为4组(Obes组：整个研究过程中饲喂HFD；Obes+PBS组：肥胖小鼠经口灌胃连续2周；Obes+ObesFMT组：肥胖小鼠饲喂PBS，肥胖小鼠连续2周经口灌胃粪便菌群；Obes+SGFMT组：肥胖小鼠连续2周经口灌胃SG小鼠粪便菌群)，每组10只。首先，将肥胖小鼠和SG小鼠的粪便(分别10g)混合、浸泡并在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4；分别100ml)中摇动。然后将悬浮液涡旋1分钟，4℃、1000g离心5分钟。最后，将粪便悬浮液(200μl)转移至肥胖小鼠体内。随后，我们选择通过联合口服强饲法提供为期3天的广谱抗生素鸡尾酒方案(万古霉素，5mg/ml，100μl；甲硝唑，10mg/ml，100μl)，并提供抗生素，以消耗宿主肠道微生物群。饮用水中加抗生素(氨苄青霉素，1g/L；新霉素，0.5g/L)。对三只随机选择的小鼠进行16S rDNA基因测序，以评估微生物群限制的功效。抗生素清除后，受者被重新安置在供体笼中，连续两周每天接受一次粪便菌群移植，如图7A所示。
16S rDNA基因测序与分析
根据制造商的方案，使用CTAB从粪便样本中提取DNA。使用引物27F(5'AGRGTTYGATYMTGGCT-3')和1492R(5'-RGYTACCTTGTTACGACTT-3')扩增全长16S rDNA基因，每个样本都用特定条形码标记。进一步对PCR产物进行了确认和纯化。使用QuantiFluorTM-ST试剂盒(Promega)定量后，准备扩增子池用于文库构建。使用Pacific BiosciencesSMRTbellTM Template Prep kit 1.0(PacBio)制备SMRTbell库，并在PacBio Sequel II(LC-Bio Technology Co.,Ltd)上测序。长度过滤后保留了范围从1200bp到1650bp的循环共识序列(CCS)读数。使用DADA2去重复和去除嵌合序列后，我们得到了特征表和特征序列。最后，使用QIIME2分析肠道微生物群的α和β多样性。
血液生化检测
将血样在4℃下3000rpm离心8min，然后收集上层血清并保存在-80℃冰冻管中。使用相关试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清中总胆固醇、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇水平。
腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)
粪便菌群移植完成后，在禁食过夜后对小鼠进行IPGTT。小鼠腹腔注射50％葡萄糖，剂量为2g/kg。随后，使用血糖仪(Roche One Touch Ultra)通过尾静脉在0、30、60、90和120分钟测量血糖。使用梯形法计算IPGTT的曲线下面积(AUC)。
实验结果
全宏基因组鸟枪法测序分析SG后肠道微生物群多样性的群落结构变化
我们收集了接受SG的肥胖患者的术前和术后粪便样本。我们将术前肥胖患者定义为OB组，SG术后患者定义为SG组，样本和临床数据然后对这两组之间的情况进行分析。就我们的样本量而言，基因数量总体稳定，表明数据已准备好用于后续分析。物种水平的Alpha多样性分析显示，SG组的Chao1、观察到的物种和Shannon指数在统计上显着高于OB组，这表明SG导致肠道微生物群的丰富度、均匀度和多样性显着更高(图1A-D)。然后，我们通过基于Bray-Curtis的主坐标分析(图1E)和使用UPGMA的样本聚类(图1F)研究了SG对肥胖患者肠道微生物群组成的影响。我们观察到两组之间微生物组成存在显着差异。
SG后肠道微生物组成的变化
通过堆积条形图及门和目级别的热图进行的比较宏基因组学分析表明，各组之间的分类分布存在显着差异(图2A、B)。在门水平上，与OB组相比，SG组Verrucomicrobia丰富度显着增加。此外，在目水平上，Enterobacterales、Desulfovibrionales、Acidaminococcales、Verrucomicrobiales和Bacteroidetes在SG后显着增加，而Veillonellales则减少。为了更全面地研究SG对肠道微生物群的重塑作用，我们重点关注物种水平的变化，这是鸟枪法测序和宏基因组范围关联研究与传统16S rDNA测序相比的优势。结果数据被分类并呈现为堆叠条形图、热图和条形图(图2C-E)。在物种水平上，我们发现，与SG之前收集的样本相比，SG处理后，Bacteroidales、Alistipes和Parabacteroides显着增加，而Prevotella合并Clostridium显着减少。为了识别具有更大生物学相关性潜力的生物标志物，我们建立了4.0的LDA阈值；利用该值，我们检测了SG的生物标志物种类，包括Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales和Enterobacterales；我们还检测到了OB组的生物标志物Prevotella(图2F、G)。
SG显着改变肠道微生物群的遗传特征和功能
比较分析显示，SG组肠道微生物群中的基因数量显着高于OB组(图3A)。此外，与OB组相比，SG组显示出113420个上调基因和9305个下调基因(图3B)。使用KEGG数据库的分析显示，差异基因主要富集在代谢相关途径中，这表明SG后肠道微生物群的变化与宿主代谢状态的改善相关(图3C)。接下来，我们根据KEGG数据库的结果分析了两组之间微生物功能的差异。我们发现两组之间在KEGG level2水平上存在显着差异(图3D)。在差异途径中，脂质代谢途径在SG组中显着增强(图3E)。我们又进一步分析揭示了代谢通路的其他差异(图3F)，最终确定了KEGG PathwayDefinition中差异最大的前30条功能途径(图3G)，然后对前20条进行排名并在箱线图中描绘它们(图3H)。结果显示，SG后氨基酸代谢(如赖氨酸和色氨酸)和脂质代谢(如脂肪酸、醚脂和α-亚麻酸)途径成分的水平显着增加。
SG后肠道代谢物谱发生变化
粪便样本的非靶向代谢组学分析在负离子模式(NIM)下产生了10955个位点，在正离子模式(PIM)下产生了18498个位点；分别鉴定了所有次生代谢物的1194个和986个离子。此外，NIM和PIM中分别注释了5576和9053个初级代谢物。总共在PIM和NIM中分别注释了4333个和7296个识别特征的个体样本；最丰富的代谢物是脂质或脂质类似物。基于KEGG数据库的MS1分析显示，这些代谢物主要富集于脂质代谢、氨基酸代谢、辅因子、维生素等代谢功能途径；它们还与内分泌失调和消化系统疾病密切相关。随后，二次质谱分析(MS2)鉴定出主要与脂质代谢相关的代谢物(例如鞘脂、甘油磷脂和不饱和脂肪酸)(图4B)。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLSDA)显示SG组和OB组之间存在显着差异(图4C)。与OB组相比，SG组有2899个上调代谢离子和2827个下调代谢离子(图4D)。接下来，根据P值差异，通过数据库注释确定被MS2识别为差异特征的前20种代谢物(图4E)。SG后，小分子脂质分子包括游离脂肪酸、甘油三酯和神经酰胺显着增加；酯化胆汁酸也有所增加，主要包括酯化脱氧胆酸和酯化甘脱氧胆酸。为了阐明这些代谢物的功能，我们使用KEGG数据库对它们进行注释，然后将它们分为初级代谢物和次级代谢物。两组之间差异的初级代谢物主要富集于多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢途径，如亚麻酸、亚油酸和花生四烯酸；它们还与初级胆汁酸合成和类固醇合成等代谢途径密切相关(图4F)。次生代谢物也主要富集于代谢相关途径，包括脂肪酸合成、延长、降解、甘油磷脂、醚脂和亚油酸(图4G)。以上结果均支持了上述宏基因组鸟枪法测序研究。
SG后血清代谢谱发生变化
血清样本的非靶向代谢组学分析显示，根据MS1，有11451和15496个代谢特征，根据MS2，有348和477个代谢特征，NIM和PIM中分别有6062和7812个已注释的初级代谢物。与粪便代谢组学分析类似，根据HMDB，鉴定出的主要代谢物为脂质或脂质类似物。我们确定了SG组和OB组之间不同的代谢物，然后通过PCA和PLSDA分析这些代谢特征(图5C)；我们发现OB组和SG组内的样本表现出相似性，但组间差异显着。SG后，2060个特征被上调，1913个特征被下调(图5D)。SG后二羟基十八烷酸酯、隐丹参酮、四甘醇和异亮氨酸谷氨酸(Ile-Glu)的水平显着降低，而3羟基十二烷酸、氢化可的松、月桂酰-L-肉碱和酰基肉碱的水平显着升高。最后，我们通过KEGG富集分析和气泡图对初级和次级差异代谢物进行了单独的功能分析。差异性初级代谢物主要与亚油酸(一种PUFA)和类固醇激素生物合成途径相关(图5F)。相反，差异性次生代谢物主要与嘌呤代谢、甘油磷酸代谢和亚油酸代谢相关(图5G)。
联合多组学分析揭示SG介导的肠道微环境重塑
为了系统评估SG通过肠道微环境重塑减轻肥胖的机制，我们采用多组学方法结合临床数据进行了综合分析。在全宏基因组鸟枪法测序和LEfSe分析中，我们初步鉴定了SG后丰度发生显着变化的几种微生物，包括Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella；我们将它们与粪便样本和血清样本的差异代谢物进行了比较。由于数据量大，我们对上述差异菌群与粪便(图6A)和血清(图6B)中差异最显著的20种代谢物进行相关性分析。我们发现Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides和Enterobacterales与大多数差异代谢物具有统计学显着相关性，而Prevotella和Bacteroidales与差异代谢物相关性较差；这些发现在粪便和血清样本的代谢物中是一致的，表明前四种细菌有助于SG的减肥效果。因此，我们利用上述六组细菌对肥胖的重要临床指标BMI进行了线性分析。我们发现Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides与BMI相关(图6C-E)，而其他三种微生物群与BMI不相关。综上所述，这些结果表明，SG后肠道微生物群中Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides丰度的增加对SG介导的减肥治疗结果具有重要影响。
为验证上述三种微生物是否可作为肥胖的诊断生物标志物，另选取来自本中心10名肥胖症患者(BMI≥28)和10名健康对照者(BMI均在18.5～23.9之间)进行微生物丰度变化检测发现，由表1可以看出，Rikenellaceae、Alistipes在单独用于诊断区分肥胖与健康人的能力强于Parabacteroides，但是其灵敏度不高。而Parabacteroides的灵敏度较高，但是特异性差，而当将其联用后，灵敏度和特异性有所上升，特别是三种差异菌属联合应用后，AUC、特异性和灵敏度均为最高，表明其具有良好的肥胖诊断效果。
表1单独差异菌属诊断区分肥胖患者与健康人群
| 差异菌属 | 特异性 | 灵敏度 | AUC |
| Rikenellaceae | 66.1％ | 65.6％ | 0.82 |
| Alistipes | 73.4％ | 61.3％ | 0.79 |
| Parabacteroides | 56.2％ | 80.3％ | 0.58 |
表2两种差异菌属联合诊断区分肥胖患者与健康人群
| 差异菌属 | 特异性 | 灵敏度 | AUC |
| Rikenellaceae+Alistipes | 78.2％ | 72.1％ | 0.84 |
| Rikenellaceae+Parabacteroides | 71.6％ | 83.5％ | 0.87 |
| Alistipes+Parabacteroides | 75.3％ | 82.3％ | 0.78 |
表3三种差异菌属联合诊断区分肥胖患者与健康人群
| 差异菌属 | 特异性 | 灵敏度 | AUC |
| Rikenellaceae+Alistipes+Parabacteroides | 96.2％ | 98.1％ | 0.97 |
SG的抗肥胖作用可部分通过FMT转移
为了进一步验证SG后肠道微生物组的改变与其代谢益处之间的关联，我们在小鼠中进行了一系列FMT实验(图7A)。最初，我们对从接受ABX处理的小鼠和接受PBS处理的小鼠获得的粪便样本进行了16S rDNA测序。我们的分析揭示了ABX组肠道微生物组组成的显着变化，伴随着α多样性的显着下降，表明向细菌限制的转变(图7B-7D)。随后，我们评估了FMT对体重和脂质代谢指标的影响。有趣的是，尽管甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白水平没有统计学上的显着改善，但是从SG小鼠到肥胖小鼠的FMT导致体重和总胆固醇水平显着降低(图7E-7I)。最后，为了评估葡萄糖代谢，我们采用了IPGTT，并观察到FMT后从SG小鼠到肥胖小鼠的胰岛素敏感性显着增强(图7J和K)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides所组成的组。
3.如权利要求1或2所述生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自受试者的待测样品，所述待测样品为受试者粪便样品。
4.检测权利要求1-3任一项所述生物标志物的物质在制备用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险的产品。
5.一种产品，其特征在于，所述产品包括用于检测权利要求1-3任一项所述生物标志物的物质，所述产品用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险。
6.如权利要求5所述产品，其特征在于，所述产品包括检测待测样品中生物标志物的(相对)丰度和/或数量的试剂、装置和/或设备。
7.如权利要求5或6所述产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.一种用于诊断受试者是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖风险的系统，其特征在于，所系统包括分析单元和评估单元；
所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自生物标志物的相对丰度信息的检测物质，以及；
评估单元，所述评估单元包含：根据分析单元确定的所述生物标志物的相对丰度信息对所述受试者进行诊断其是否患有肥胖或者预测受试者是否患有肥胖的风险；
所述分析单元中，所述生物标志物选自下列中的至少一种：
Rikenellaceae、Alistipes、Parabacteroides、Bacteroidales、Enterobacterales和Prevotella。
9.如权利要求8所述系统，其特征在于，所述生物标志物为Rikenellaceae、Alistipes和Parabacteroides所组成的组。
10.权利要求1-3任一项所述生物标志物作为靶点用于筛选预防或治疗肥胖的药物的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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