CN109486967A - 一种检测肥胖风险的试剂盒和用途 - Google Patents

一种检测肥胖风险的试剂盒和用途 Download PDF

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CN109486967A CN201811653754.1A CN201811653754A CN109486967A CN 109486967 A CN109486967 A CN 109486967A CN 201811653754 A CN201811653754 A CN 201811653754A CN 109486967 A CN109486967 A CN 109486967A
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flora
bacteria
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卢秦
宋卓
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

本发明属于微生物菌群分析的应用领域，具体是涉及一种检测肥胖风险的试剂盒和用途，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15所示，本发明还提供试剂盒的非医疗目的用于检测肥胖风险的用途，所述肥胖风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与肥胖相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。本发明通过选定特定的微生物菌群，通过其OUT序列和菌群丰度分析其处于肥胖的风险，准确度高，需要分析的菌群数量少，方便快捷。

Description

一种检测肥胖风险的试剂盒和用途
技术领域
本发明属于微生物菌群分析的应用领域，具体是涉及一种检测肥胖风险的试剂盒和用途。
背景技术
随着现代的生活节奏逐渐加快，压力增大以及物质条件的丰富，肥胖正越来越成为困扰现代人的重要健康问题，肥胖越来越呈现年轻化的趋势。肥胖是二型糖尿病、心血管疾病等的重要风险因素之一，同时肥胖也会严重影响个人形象，造成相应的社会、心理方面的问题，然而目前对于肥胖的机制认识依然不够清晰，除了遗传因素与社会环境因素之外，目前的研究表明，肠道菌群与肥胖之间存在着密切的关系。
人们对肠道菌群与肥胖之前的关系进行了一定的研究，如：肥胖人群的肠道菌群厚壁菌门与拟杆菌门的比值升高，而某些有益菌如Akk菌，栖粪杆菌等丰度下降，而某些菌如布劳特菌、多里奥菌等的丰度下降。同时肠道菌群与肥胖相关的激素如脂联素、瘦素以及血清代谢物存在着相关性。将诱导肥胖小鼠的菌群移植到正常小鼠体内可诱导正常小鼠肥胖，将肥胖人群的菌群移植到正常小鼠体内可诱导正常小鼠肥胖。但随着人群、地域、饮食的差异，肠道菌群具有重大差异，因此对不同地域的肥胖人群进行肠道菌群检测，确定其肠道菌群改变以获得精准治疗靶点，是非常有必要的。
现有技术通过微生物菌群的情况来预测肥胖风险的准确度并不十分理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测肥胖风险的试剂盒和用途，本发明通过选定特定的微生物菌群，通过其OUT序列和菌群丰度分析其处于肥胖的风险，准确度高，需要分析的菌群数量少，方便快捷。
一种检测肥胖风险的试剂盒，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15所示。
所述试剂盒检测的目标菌群包括健康人富集菌群和肥胖人群富集菌群，健康人群富集菌群至少含有：
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Lachnospiraceae|g__Blautia，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Gammaproteobacteria|o__Pasteurellales|f__Pasteurellaceae|g__Haemophilus|s__parainfluenzae，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Deltaproteobacteria|o__Desulfovibrionales|f__Desulfovibrionaceae|g__Desulfovibrio，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Ruminococcaceae|g__Ruminococcus，
k__Bacteria|p__Bacteroidetes|c__Bacteroidia|o__Bacteroidales|f__Bacteroidaceae|g__Bacteroides|s__ovatus，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Ruminococcaceae；
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales，
k__Bacteria|p__Bacteroidetes|c__Bacteroidia|o__Bacteroidales|f__Bacteroidaceae|g__Bacteroides|s__coprophilus；
所述肥胖人富集菌群至少含有：
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Gammaproteobacteria|o__Enterobacteriales|f__Enterobacteriaceae|g__Klebsiella，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Betaproteobacteria|o__Burkholderiales|f__Oxalobacteraceae|g__Ralstonia，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Tissierellaceae|g__Finegoldia，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Veillonellaceae|g__Veillonella，
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Nocardiaceae|g__Rhodococcus，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Bacilli|o__Lactobacillales|f__Lactobacillaceae，
k__Bacteria|p__Fusobacteria|c__Fusobacteriia|o__Fusobacteriales|f__Fusobacteriaceae|g__Cetobacterium|s__somerae。
本发明的试剂盒，含有定量检测目标菌群的试剂。
一种试剂盒的非医疗目的用于检测肥胖风险的用途，所述肥胖风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：
式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与肥胖相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。
|N|＝8，|M|＝7，Ij的临界值为-5.015959—-5.807885。
本发明的有益效果是：
基于本发明的微生物群，可以有效预测肥胖风险。
基于本发明微生物群开发的诊断试剂，可以有效预测肥胖风险，检测过程无创，安全性高。同时因为菌群样本可以常温运输，大大提高了检测的方便性。
附图说明
图1是微生物菌在人群中的分布情况；
图2是健康指数的受试者工作特征(ROC)曲线；
图3是健康指数在肥胖与健康人的分布情况；
图4是训练集的ROC曲线；
图5是测试集的ROC曲线。
具体实施方式
发明人基于测定的总计156个健康对照、66个肥胖粪便样本测序数据的分析，鉴别出其中的菌群分类标记物，微生物菌在人群中的分布情况如图1所示。具体如下：健康人富集菌群：f__Prevotellaceae|g__Prevotella|s__stercorea、g__Bacteroides|s__plebeius；肥胖人群富集菌：f__Lachnospiraceae|g__Roseburia、o__Clostridiales|f__Mogibacteriaceae、g__Gemella|f__Gemellaceae、f__Lachnospiraceae|g__Blautia、f__Coriobacteriaceae|g__Eggerthella|s__lenta、o__Lactobacillales|f__Leuconostocaceae、f__Ruminococcaceae|g__Oscillospira、f__Clostridiaceae|g__Clostridium、f__Streptococcaceae|g__Streptococcus、o__Coriobacteriales|f__Coriobacteriaceae、f__Porphyromonadaceae|g__Parabacteroides、f__Tissierellaceae|g__Finegoldia、f__Campylobacteraceae|g__Campylobacter、f__Lachnospiraceae|g__Dorea、f__Eubacteriaceae|g__Pseudoramibacter_Eubacterium、f__Tissierellaceae|g__Peptoniphilus。
表1为微生物菌各物种在人群中的富集情况：
表1、不同微生物在人群中的富集情况
表2、不同微生物对应的OTU序列情况
上述OUT序列依次为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15。
健康指数
为了开发利用微生物群进行疾病鉴别的潜力，发明人基于确定的基因标志物开发了疾病分类系统。为了利用这些肠道微生物基因标志物对患病风险进行直观地评估，发明人计算了健康指数。
健康指数Ij的计算公式为：
其中Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，而M是与肥胖相关富集菌群的子集。|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。其中|N|为8而|M|为7。
健康指数的受试者工作特征(ROC)分析如图2所示。可见在阈值为-5.015959--5.807885。时分类较好。
表3具体样本的健康指数
健康指数在肥胖与健康人的分布如图3所示。从图中可以看出，健康指数在肥胖人群与健康人群中的分布显著不同，具备良好的区分能力。
为了验证利用微生物菌群进行肥胖分类器的潜在能力，基于公共数据库数据开发出基于14个基因标记物的疾病分类系统，该基因标记物被Lasso回归法为最佳基因集。
分类器的效果验证：
数据来源：数据为前期收集的健康人与肥胖者粪便进行16S V3-V4测序获得，通过Usearch进行数据的前处理包括去除引物，去掉低质量reads，OTU聚类等，使用QIIME进行OTU比对。
影响微生物分布的因素分析
发明人利用置换多元方差分析(PERMANOVA)方法评估不同特征对菌群的影响，这些特征包括年龄，性别，肥胖状态。发明人利用R软件(https://www.r-project.org/)中的“vegan”工具包进行分析，经过10000次置换，得到置换P值。发明人还利用R中的“p.adjust”工具包对多重检验进行校正，利用FDR方法得到每个物种的p值。置换多元方差分析结果如表4所示，结果显示肥胖与BMI对菌群有显著影响。
表4、置换多元方差分析结果
自由度 SumOfSqs R2 F Pr(>F) p.adjust
状态 1 0.282645 0.007169 2.319947 0.032897 0.032897
BMI 160 31.83091 0.807409 1.632923 1.00E-04 0.0002
采用训练队列的丰度谱，对Lasso模型(R glmnt 2.0-16)进行训练，选择物种标志物，并在一个测试集进行测试，并计算预测误差。
采用Lasso模型(R glmnt 2.0-16)进行预测，输入为疾病状态、物种丰度，分成训练集和测试集。发明人使用R软件中的glmnt包来来构建分类，并且使用预测函数来预测测试集，输出的是预测结果(疾病概率：默认临界值为0.5，大于0.5则认为该受试者为肥胖)。按照7:3的比例来划分训练集与测试集，其中训练集156例，测试集为66例。
基于本发明的微生物群，在进行lasso回归计算后，对训练集(156例)绘制ROC曲线(图4)，训练集AUC曲线下面积为0.870。测试集(66例)的ROC曲线如图5所示，测试集在总体的AUC下面积为0.678。
从图中可以知，不管是训练集还是测试集，利用LASSO回归挑选出来的变量建立的模型的区分度均较为良好。
<110> 人和未来生物科技(长沙)有限公司
<120> 一种检测肥胖风险的试剂盒和用途
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<212>DNA
<213>Lactobacillaceae
<400>13
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc 60
cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag aacatatctg 120
agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 180
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 240
gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga 300
aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 360
tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag 420
gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gatacccgag tagtc 465
<210>14
<211>461
<212>DNA
<213>coprophilus
<400>14
cctacgggtg gctgcagtga ggaatattgg tcaatgggcg agagcctgaa ccagccaagt 60
agcgtgaagg atgacggccc tacgggttgt aaacttcttt tgtgcgggaa taaaggagcc 120
tacgtgtagg cttttgcatg taccgtaacg aataagcatc ggctaactcc gtgccagcag 180
ccgcggtaat acggaggatg cgagcgttat ccggatttat tgggtttaaa gggagcgtag 240
acgggttttt aagtcagctg tgaaagtttg gggctcaacc ttaaaattgc agttgaaact 300
ggagaccttg agtacggttg aggcaggcgg aattcgtggt gtagcggtga aatgcttaga 360
tatcacgaag aaccccgatt gcgaaggcag cctgctaagc cgccactgac gttgaggctc 420
gaaagtgcgg gtatcaaaca ggattagata cccgagtagt c 461
<210>15
<211>443
<212>DNA
<213>somerae
<400>15
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgg acaatgggcc acaagcctga tccagcaatt 60
ctgtgtgcac gatgaaggtc ttcggattgt aaagtgcttt cagttgggaa gaagaaagtg 120
acggtaccaa cagaagaagc gacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg 180
tcgcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgcgtc taggcggaaa aataagtctg 240
atgttaaaat gcggggctca actccgtatt gcgttggaaa ctgtttttct agagtactgg 300
agaggtgggc ggaactacaa gtgtagaggt gaaattcgta gatatttgta ggaatgccga 360
tggagaagtc agctcactgg acagatactg acgctaaagc gcgaaagcgt ggggagcaaa 420
caggattaga taccctagta gtc 443

Claims (8)

1.一种检测肥胖风险的试剂盒，其特征是，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQIDNO：15所示。
2.如权利要求1所述的检测肥胖风险的试剂盒，其特征是，所述试剂盒检测的目标菌群包括健康人富集菌群和肥胖人群富集菌群，健康人群富集菌群至少含有：
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Lachnospiraceae|g__Blautia，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Gammaproteobacteria|o__Pasteurellales|f__Pasteurellaceae|g__Haemophilus|s__parainfluenzae，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Deltaproteobacteria|o__Desulfovibrionales|f__Desulfovibrionaceae|g__Desulfovibrio，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Ruminococcaceae|g__Ruminococcus，
k__Bacteria|p__Bacteroidetes|c__Bacteroidia|o__Bacteroidales|f__Bacteroidaceae|g__Bacteroides|s__ovatus，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Ruminococcaceae；
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales，
k__Bacteria|p__Bacteroidetes|c__Bacteroidia|o__Bacteroidales|f__Bacteroidaceae|g__Bacteroides|s__coprophilus。
3.如权利要求2所述的检测肥胖风险的试剂盒，其特征是，所述肥胖人富集菌群至少含有：
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Gammaproteobacteria|o__Enterobacteriales|f__Enterobacteriaceae|g__Klebsiella，
k__Bacteria|p__Proteobacteria|c__Betaproteobacteria|o__Burkholderiales|f__Oxalobacteraceae|g__Ralstonia，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Tissierellaceae|g__Finegoldia，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Clostridia|o__Clostridiales|f__Veillonellaceae|g__Veillonella，
k__Bacteria|p__Actinobacteria|c__Actinobacteria|o__Actinomycetales|f__Nocardiaceae|g__Rhodococcus，
k__Bacteria|p__Firmicutes|c__Bacilli|o__Lactobacillales|f__Lactobacillaceae，
k__Bacteria|p__Fusobacteria|c__Fusobacteriia|o__Fusobacteriales|f__Fusobacteriaceae|g__Cetobacterium|s__somerae。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征是，含有定量检测目标菌群的试剂。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的非医疗目的用于检测肥胖风险的用途，其特征是，所述肥胖风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：
式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与肥胖相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。
6.如权利要求5所述的用途，其特征是，|N|＝8。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征是，|M|＝7。
8.如权利要求5或6所述的用途，其特征是，Ij的临界值为-5.015959—-5.807885。
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