JP2002537858A - 核酸の配列を直接決定するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、同時に並行して、多くの単一核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために使用される新規な配列決定装置および方法を提供する。本発明の方法および装置は、迅速な、効率的な費用の、高生産性方法を提供し、それにより、任意の供給源に由来する核酸分子が、前のサンプルの増幅または前の任意の配列情報の知識を伴わずに、容易に配列決定され得る。 本発明は、核酸サンプルを配列決定するための方法に関する。より詳細には、本発明は、増幅；配列決定プライマーを生成するためのいくつかのヌクレオチド配列に関する先行知識；および労働集約的な電気泳動技術、の必要性なしに、配列決定するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、核酸サンプルを配列決定するための方法に関する。より詳細には、
本発明は、増幅；配列決定プライマーを生成するためのいくつかのヌクレオチド
配列に関する先行知識；および労働集約的な電気泳動技術、の必要性なしに、配
列決定するための方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 核酸サンプルの配列決定は、近代の分子生物学技術において重要な分析技術で
ある。ＤＮＡ配列決定のための信頼性のある方法の開発は、遺伝子の機能および
制御の理解のために、ならびに分子生物学の多くの基本的技術の適用のために重
要であった。これらの方法はまた、ゲノム分析および多くの非研究適用（例えば
、遺伝子同定、法医学分析、遺伝子カウンセリング、医学的診断など）における
ツールとしてますます重要になっている。これらの後者の適用において、部分的
な配列情報を提供する技術（例えば、フィンガープリンティングおよび配列比較
）、ならびに完全配列決定を提供する技術の両方が、用いられている。例えば、
Ｇｉｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１９１
９〜１９２３（１９８９）；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７６５２〜７６５６（１９８８）；Ｃａｒｒａ
ｎｏら、，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４；１２９〜１３６（１９８９）；Ｃａｅｔａｎ
ｏ−Ａｎｎｏｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３５：１５７〜１６５
（１９９２）；ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｉｖａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９０２〜８９０６（１９８９）；Ｇｒｅｅｎら，
ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：７７〜９０
（１９９１）；ならびにＶｅｒｓａｌｏｖｉｃら、，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１９：６８２３〜６８３１（１９９１）を参照のこと。

【０００３】 最も現在利用されているＤＮＡ配列決定方法は、ヌクレオチド組成に従って長
さで注文されるＤＮＡフラグメントのセットの生成を必要とする。注文されたフ
ラグメントのこのセットの作製は、２つ様式のうちの一方で生じる：（１）Ｍａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｖｅｒｔ法を使用する、特定のヌクレオチドでの化学分解、また
は（２）Ｓａｎｇｅｒ法を使用する、ジデオキシヌクレオチドの取り込み。Ｍａ
ｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４：５６０〜５６４（１９７７）；Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７（１９７７）を参照のこ
と。必要とされる工程の型および数は、並行して配列決定され得るＤＮＡセグメ
ントの数、および所定の部位から決定され得る配列の量の両方を固有に制限する
。さらに、両方の方法は、変性ゲルでのＤＮＡフラグメントの特異な移動に起因
して誤りがちである。これらのゲルベースの方法に固有な時間および空間の限界
は、代替方法についての探索を促す。

【０００４】 現在の大規模配列決定の需要を満たす試みにおいて、Ｓａｎｇｅｒ法に対して
、改良がなされている。例えば、蛍光鎖ターミネータの使用は、ヌクレオチドの
検出を簡単にする。より長いＤＮＡフラグメントの合成およびフラグメント解像
度の改良は、各実験からより多くの配列情報を生成する。ゲルまたはキャピラリ
ーでのフラグメントの自動化分析は、配列情報の収集および処理に関与する労働
を大幅に低減した。例えば、Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６
〜３４１（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４〜６７９
（１９８６）；Ｌｕｃｋｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：
４４１７〜４４２１（１９９０）；Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ １８：２３９３〜２３９９（１９９７）を参照のこと。

【０００５】 しかし、現在のＤＮＡ配列決定技術はなお、３つの主な限界に苦しんでいる。
第１に、それらは、一般に、ＤＮＡ配列の分子クローニング、またはＤＮＡ配列
のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のいずれかによって得られる、大量の同
一なＤＮＡ分子を必要とする。現在の検出方法は、感度が悪く、従って、最小限
必要な数の標識されたオリゴヌクレオチドを必要とする。また、オリゴヌクレオ
チドの多くの同一のコピーが、配列ラダーを生成するために必要とされる。第２
の限界は、現在の配列決定技術が、配列手順を開始する前に合成されなければな
らない配列特異的オリゴデオキシヌクレオチドからのプライミングに依存すると
いうことである。ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９４：４４１〜４４８（１９７５）。複数の同一鋳型の必要性は、同じ所定部位
からの各コピーの同調的なプライミングを必要とする。第３に、現在のスクリー
ニング技術は、フラグメントが分離され得る速度によって制限され、そしてまた
ゲル上で入手可能な分解能による所定の実験にて配列決定され得る塩基の数によ
り制限される、長期の労働集約型の電気泳動技術に依存している。

【０００６】 電気泳動技術に対する必要性を免除する試みにおいて、さらなる伸長のために
拘束されない（ｕｎｃａｇｅｄ）または脱保護され得る鎖ターミネータを使用す
る配列決定方法が、開発された。米国特許第５，３０２，５０９号；Ｍｅｔｚｋ
ｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４２５９〜４２６７（１
９９４）を参照のこと。この方法は、塩基取り込み、取り込みの検出、および鎖
ターミネータを再活性化してＤＮＡ合成の次のサイクルを可能にするという反復
サイクルを含む。従って、ＤＮＡ鎖が生長している間に、各々付加された塩基を
検出することによって、サイズ分画に対する必要性がなくなった。それにもかか
わらず、この方法はなお、配列決定される大量の核酸および鎖の生長の開始をプ
ライムするための既知の配列の使用に高度に依存する。さらに、この技術は、取
り込みおよび脱保護の任意の非効率性によって悩まされる。取り込みおよび３’
−ＯＨ再生は、完全に効率的ではないことから、最初に同一の伸長鎖のプールは
、迅速に非同調的になり、そして配列は、少数の制限された初期の付加を超えて
は分解され得ない。

【０００７】 従って、増幅；配列決定プライマーを生成するためのいくつかのヌクレオチド
配列の先行知識；および労働集約型の電気泳動技術、の必要性を排除する、未知
の核酸サンプルを配列決定するための迅速で経済的なハイスループット方法につ
いて当該分野での必要性がなお、存在する。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、増幅；配列決定プライマーを生成するためのいくつかのヌクレオチ
ド配列の先行知識；および労働集約型の電気泳動技術の必要性を排除する、未知
の核酸サンプルを配列決定するための迅速で経済的なハイスループット方法を提
供する。本発明の方法は、単一の核酸分子の直接的核酸配列決定（ＤＮＡＳ）を
可能にする。

【０００９】 本発明の方法に従って、複数のポリメラーゼ分子が、共有結合または非共有結
合の相互作用を通じて、固体支持体上に固定化される。核酸サンプルおよびオリ
ゴヌクレオチドプライマーは、４つ全てが標識ケージ化ヌクレオシドトリホスフ
ェートターミネータを含む緩衝液中で、反応チャンバ（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｈ
ａｍｂｅｒ）内に導入される。核酸の鋳型駆動伸長は、標識ケージ化ヌクレオシ
ドトリホスフェートターミネータを使用して、付着されたポリメラーゼによって
媒介される。反応中心は、部位の大部分が、単一の取り込まれた標識ケージ化ヌ
クレオチドターミネータを有する核酸鋳型に結合した固定化ポリメラーゼを含む
まで、顕微鏡システムによってモニターされる。次いで、この反応チャンバは、
洗浄緩衝液で洗浄される。次いで、特定のヌクレオチドの取り込みが、各活性反
応中心について決定される。検出後に、反応チャンバは、取り込まれたヌクレオ
チドを脱拘束するために照射され、そして洗浄緩衝液で再度洗浄される。標識ケ
ージ化ヌクレオチドの存在は、再度、新鮮な試薬を添加して合成を再び開始する
前にモニターされ、反応中心が首尾よく脱拘束されることを確認する。しかし、
放出または取り込みの持続的な失敗は、反応中心の失敗を示す。放出または取り
込みの持続的な失敗は、２〜２０サイクル、好ましくは３〜１０サイクル、より
好ましくは３〜５サイクルからなり、ここで標識ケージ化ヌクレオチドの存在は
、第２の検出工程の間に検出される。このことは、反応中心が首尾よく脱拘束さ
れなかったことを示す。上記に概略された配列決定サイクルは、多くの割合の反
応中心が失敗するまで繰り返される。本発明の配列決定方法に使用された差示的
に標識されたヌクレオチドは、検出可能な標識基を有し、そして分離可能なブロ
ッキング基で３’部分でブロックされる。好ましい実施形態において、この標識
基は、分離可能な３’ブロッキング基に直接結合される。ヌクレオチドの脱拘束
は、標識基および３’ブロッキング基をヌクレオチドに連結するために使用され
る分離可能なリンカーに依存して、酵素的、科学的、または好ましくは光分解的
に達成され得る。

【００１０】 別の好ましい実施形態において、標識基は、分離可能な３’ブロッキング基で
はなく、分離可能なリンカーを有する各ヌクレオチドの塩基に結合される。この
標識基および３’ブロッキング基は、酵素的、化学的、または光分解的に除去さ
れ得る。あるいは、この標識基は、３’ブロッキング基とは異なる方法によって
除去され得る。例えば、この標識基は、酵素的に除去され得、一方、３’ブロッ
キング基は、化学的または光化学活性化によって除去される。

【００１１】 多くの独立した反応が、反応チャンバ内で同時に生じ、各個々の反応中心は、
数百または数千の塩基対を生成する。この装置は、特定の配列点または無作為の
配列点のいずれかから、数千およびおそらくは数百万の別々の鋳型を、並行して
配列決定する能力を有する。各実行からの組み合わされた配列は、配列の数百万
のオーダーの塩基対であり、そして増幅、標的配列の一部の先行知識、またはゲ
ルまたはキャピラリーでのフラグメントの分解を必要としない。任意の供給源か
らの簡単なＤＮＡ調製物が、本発明の装置および方法を使用して配列決定され得
る。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、新規な配列決定装置および新規な配列決定方法を提供する。本発明
の方法（本明細書中で直接的核酸配列決定（ＤＮＡＳ）といわれる）は、任意の
供給源由来の核酸分子が先行して増幅する必要なく容易に配列決定され得る、迅
速で経済的なハイスループット方法を提供する。ＤＮＡＳは、並行して、多くの
単一の核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。

【００１３】 （１．ＤＮＡＳ反応中心アレイ） ポリメラーゼは、顕微鏡システムの光学解像力よりも広く周期的に存在する反
応中心のアレイにおいて、規則的な間隔で隔てられた固体支持体に結合される。
好ましくは、たった１つのポリメラーゼ分子が、各反応中心に存在し、そして各
反応中心は、他の反応中心から光学的に分解可能な距離で配置される。配列決定
反応は、好ましくは、密封されたカバーガラスおよび光学的に透明な固体支持体
を備える、薄い水性反応チャンバで生じる。

【００１４】 核酸配列決定における使用のためのポリメラーゼ分子の固定化は、ＰＣＴ出願
ＷＯ９９／０５３１５においてＤｅｎｓｈａｍによって開示されている。Ｄｅｎ
ｓｈａｍは、ポリメラーゼ内の選択されたアミノ基の、デキストランまたはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化表面への結合を記載している。ＷＯ９
９／０５３１５；ＥＰ−Ａ−０５８９８６７；Ｌｏｆａｓら，Ｂｉｏｓｅｎｓ．
Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １０：８１３〜８２２（１９９５）。立体障害がアレ
イ中の任意の所定のスポットでの１よりも多くのポリメラーゼの結合を妨げる程
度に活性化領域が十分に小さいことを保障するために、これらの技術が、本発明
において改変され得る。

【００１５】 単一のポリメラーゼ分子を含む反応中心のアレイは、電子制御回路の構築に使
用されているリソグラフィック技術を使用して構築される。この方法論は、オリ
ゴデオキシヌクレオチドの顕微鏡アレイおよび単一のタンパク質モーター（ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｍｏｔｏｒ）のアレイを構築するために、当該分野において使用さ
れている。例えば、Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０〜６１４（１
９９６）；Ｆｏｄｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６（１９９３）
；Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７〜７７３（１９９１）；Ｇｕ
ｓｈｉｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３〜２１１（１９９７）
；Ｋｉｎｏｓｉｔａら，Ｃｅｌｌ ９３：２１〜２４（１９９８）；Ｋａｔｏ−
Ｙａｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９３７５〜１９３７７（
１９９８）；およびＹａｓｕｄａら，Ｃｅｌｌ ９３：１１１７〜１１２４（１
９９８）を参照のこと。写真平版および／または電子ビームリソグラフィーのよ
うな技術［Ｒａｊ−Ｃｈｏｕｄｈｕｕｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒ
ｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｉｃｒ
ｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，第Ｉ巻：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，ＰＭ
３９巻、ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８３：２７〜２８（１９９９）］を使用して、基板は、単一の改変されたタ
ンパク質の結合を可能にする連結基を用いて感作される。あるいは、感作された
部位のアレイが、薄膜技術（例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）を
使用して生成され得る。例えば、Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６３：１７２６〜１７３３（１９９４）を参照のこと。

【００１６】 タンパク質の規則的な間隔は、基板上のこれらの感作部位へのタンパク質の結
合によって達成される。適切なタグを含有するポリメラーゼは、単一のポリメラ
ーゼ分子が各感作部位に結合するように感作された基板とともにインキュベート
される。ポリメラーゼの結合は、共有結合または非共有結合の相互作用を通じて
達成され得る。当該分野で一般的なこのような結合の例としては、Ｎｉ²⁺／ヘキ
サヒスチジン、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、グルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、モノクローナル抗体／
抗原、およびマルトース結合タンパク質／マルトースが挙げられる。

【００１７】 反応中心の模式図は、図３に示される。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来）は、ガラス顕微鏡スライドに結合される。
結合は、ポリメラーゼ上のヘキサヒスチジンタグによって媒介され、このタグは
、強力な非共有結合相互作用によってＮｉ²⁺原子に結合され、次いでこのＮｉ²⁺ 原子は、ニトリロトリ酢酸およびリンカー分子によってガラスに保持される。ニ
トリロトリ酢酸は、シラン化学によって結合されたリンカーによってガラスに共
有結合される。シラン化学は、電子ビームリソグラフィーまたは写真平版によっ
てガラス上に均等に空けられた間隔でエッチングされた小さな直径のスポットに
限定される。結合されたポリメラーゼに加えて、反応中心は、鋳型ＤＮＡ分子お
よびオリゴヌクレオチドプライマー（両方がポリメラーゼに結合している）を含
む。このガラススライドは、ＤＮＡＳ反応チャンバの下のスライドを構成する。

【００１８】 反応チャンバアセンブリは、ＤＮＡＳ反応中心のアレイを収容し、そして試薬
と緩衝液との交換を媒介する。ＤＮＡＳ反応チャンバアセンブリの例は、図４に
示される。この反応チャンバは、透明な上のスライドおよび下のスライドを備え
る密封された区画である。このスライドは、スライドの交換を可能にするように
構築されそして分解され得る、金属またはプラスチックハウジングによって、適
所に保持される。容器へのアクセスを可能にする２つのポートが存在する。一方
のポートは、緩衝液（および試薬）の投入を可能にし、そして他方のポートは、
容器から緩衝液（および反応生成物）が引き抜かれることを可能にする。下のス
ライドは、反応中心アレイを運ぶ。さらに、プリズムが、下のスライドに取り付
けられて、下のスライド内にレーザー光の全反射を生成するような角度で、下の
スライドにレーザー光を指向する。この配置は、消失波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ
ｗａｖｅ）が反応中心アレイに対して生成されることを可能にする。高数（ｈ
ｉｇｈ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ）絞り対物レンズが、反応中心アレイの画像をデジ
タルカメラシステム上に焦点を合わせるために使用される。反応チャンバハウジ
ングは、反応の温度を調節するために、発熱体および冷却体（ｃｏｏｌｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、ペルチエデバイス）を取り付けられ得る。

【００１９】 光学システム内にヌクレオチド取り込み部位を固定することによって、配列情
報が、多くの異なる核酸分子から同時に得られ得る。ＤＮＡＳ反応中心アレイの
図は、図５に示される。上記のように、各反応中心は、反応チャンバの下方のス
ライドに結合される。４つの連続する検出事象（別々の蛍光色素の各々に対して
１つ）により記録されるように、アレイ全体の表示が左側のパネル（顕微鏡の視
野）に示される。中心パネルは、個々の反応中心の空間を示す、視野の一部の拡
大図である。最終的には、最も右のパネルは、単一の反応中心のカメラの図を示
す。各反応中心は、それが真に孤立することを保障するように１００ピクセルを
割り当てられる。各反応中心に割り当てられた１μｍ Ｘ １μｍの領域に対す
る１ピクセルの画像領域が、示される。反応中心の密度は、顕微鏡システムの光
学解像度によって制限される。実際的には、これは、反応中心が異なる部位とし
て検出されるように、少なくとも０．２μｍ分離されなければならないことを意
味する。

【００２０】 （２．酵素の選択） 一般的に、ポリヌクレオチド配列の形成を触媒する任意の高分子は、ポリメラ
ーゼとして使用され得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、以下
：１）活性部位における相補的な鋳型ヌクレオチドと、タグ（例えば、通常のヌ
クレオチドもしくは改変ヌクレオチド、または相補的な鋳型ヌクレオチドと特異
的に会合し得る任意の化合物）との会合（例えば、水素結合または塩基対合によ
る）を促進し；２）タグと合成鎖またはプライマーとの間の共有結合の形成を触
媒し；そして３）活性部位を次の鋳型ヌクレオチドに移す、酵素複合体であり得
る。

【００２１】 ポリメラーゼは、代表的には、タンパク質様酵素であるが、ポリメラーゼ活性
がタンパク質様酵素と関連する必要性がないことは、当業者に自明である。例え
ば、ポリメラーゼは、リボザイムまたはＤＮＡベースの酵素の場合には、それ自
体核酸であり得る。

【００２２】 タンパク質様酵素の多数の選択が、本発明における使用のために利用可能であ
る。例えば、ポリメラーゼは、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向性Ｒ
ＮＡポリメラーゼのような酵素であり得る。いくつかのポリメラーゼは、コア酵
素、およびコアの活性を増強する付随する因子（例えば、それらは、コアサブユ
ニットの処理能（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）または信頼性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ
）を増大させる）から構成される、マルチサブユニット複製系である。この酵素
は、この酵素を支持体に連結するために、改変されなければならない。この酵素
は、適切な連結タグを有する組換えタンパク質を生成するために、当該分野に周
知の技術によってクローニングされ得る。好ましい実施形態において、この連結
は、固体支持体上のニッケルイオンへの強力な結合を可能にする、ヘキサヒスチ
ジンタグである。好ましい酵素は、高度に処理能がある。すなわち、それらは、
連続的なヌクレオチド付加のために鋳型ヌクレオチド配列と会合したままであり
、そして活発に合成されない場合でさえも、ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複
合体を維持し得る。さらに、好ましいポリメラーゼは、３’−改変ヌクレオチド
を取り込み得る。十分な量の酵素は、当該分野で公知の標準的な組換え技術を使
用して得られる。例えば、ＤａｂｒｏｗｓｋｉおよびＫｕｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４：１３１〜１３８（１９９８）を参照のこと。

【００２３】 （２．１ ＤＮＡポリメラーゼ） 好ましい実施形態において、配列決定は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを
用いて行われる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、プライムされたＤＮＡ鋳
型の相補鎖を形成するように、デオキシヌクレオチドのポリマー化を触媒する。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメント、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩホロ酵素、バクテリオファージＴ４およびＴ７ ＤＮＡポリメラー
ゼ、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓ（Ｖｅｎｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに
限定されない。Ｔ７遺伝子５由来のポリメラーゼもまた、チオレドキシンと複合
体化される場合には使用され得る。Ｔａｂｏｒら、Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
２６２；１６１２〜１６２３（１９８７）。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、生
長しているＤＮＡ鎖に３’−Ｏ−（２−ニトロベンジル）−ｄＡＴＰを効率良く
取り込み、高度な処理能があり、非常に安定であり、そして３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を欠損することが示されているので、好ましい。この酵素のコー
ド鎖は、決定されている。米国特許第５，８３０，７１４号および同第５，８１
４，５０６号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【００２４】 別の好ましい実施形態において、ＲＮＡが鋳型として使用される場合、選択さ
れたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（す
なわち、逆転写酵素）として機能する。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）由来のＤＮＡポリメラーゼは、特定の条件下で、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、逆転写酵素）として機能することが報告
されている。ＭｅｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：７６
６１〜７６６６（１９９１）を参照のこと。従って、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー
ゼは、基板に結合され、そして配列決定反応は、この酵素がＲＮＡ鋳型の配列を
読み取り、それによって、相補ＤＮＡ鎖を生成する場合に特定の条件下で行わる
。

【００２５】 いくつかの実施形態において、ポリメラーゼサブユニットまたはフラグメント
は、支持体に結合され、そして他の必要なサブユニットまたはフラグメントは、
配列決定されるサンプルとともに複合体の一部として添加される。このアプロー
チは、多数の異なる複製因子が関与するポリメラーゼ系に有用である。例えば、
ＤＮＡＳ配列決定についてバクテリオファージＴ４複製系を使用するために、ｇ
ｐ４３ポリメラーゼが、支持体に結合され得る。他の複製因子（例えば、クラン
プローダー（ｃｌａｍｐ ｌｏａｄｅｒ）（ｇｐ４４／６２）およびスライディ
ングクランプ（ｓｌｉｄｉｎｇ ｃｌａｍｐ）（ｇｐ４５））が、複製系の処理
能を増大するために、核酸鋳型とともに添加される。同様のアプローチが、Ｅ．
ｃｏｌｉポリメラーゼＩＩＩ系で使用され得る。ここでは、ポリメラーゼコアが
、アレイに固定化され、そしてβダイマーサブユニット（スライディングクラン
プ）ならびにτおよびγサブアセンブリ（クランプローダー）が、ＤＮＡＳ配列
決定の前に核酸サンプルに添加される。さらに、このアプローチは、真核生物Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（例えば、αまたはσ）および対応するＰＣＮＡ（増殖細胞核
抗原）とともに使用され得る。いくつかの実施形態において、スライディングク
ランプは、アレイに結合された複製因子であり、そしてポリメラーゼ部分は、核
酸サンプルとともに添加される。

【００２６】 （２．２ 逆転写酵素） 逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮ
Ａ鎖を生成する酵素）である。別の好ましい実施形態において、逆転写酵素は、
ＲＮＡ分子の配列決定における使用のために支持体に結合される。これは、ＲＮ
Ａを組織から直接的に採取して予め逆転写することなく配列決定することを可能
にする。逆転写酵素の例としては、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、モロニ
ーマウス白血病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）が挙げ
られるがこれらに限定されない。ＨＩＶ−１逆転写酵素が特に好ましい。なぜな
ら、これは、構造的または生化学的の両方で十分に特徴付けられているからであ
る。例えば、Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１６６９〜１６７５（１
９９８）を参照のこと。

【００２７】 別の好ましい実施形態において、固定化された逆転写酵素は、ＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼとして機能して、それによってサンプルまたは標的ＤＮＡ鋳型
鎖のＤＮＡコピーを生成する。

【００２８】 （２．３ ＲＮＡポリメラーゼ） なお別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、支
持体に結合され、そして標識ケージ化リボヌクレオチドを使用して、サンプルお
よび配列決定されているＤＮＡ鎖のＲＮＡコピーを生成する。これらの酵素の好
ましい例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＮＡポリメラーゼ［Ｙｉｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７０：１６５３〜１６５７（１９９５）］、ならびにバクテリオフ
ァージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれら
に限定されない。別の好ましい実施形態において、改変されたＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして機能する。このＲＮＡポリ
メラーゼは、支持体に結合され、そして標識ケージ化デオキシリボヌクレオチド
を使用して、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを生成する。例えば、Ｉｚａｗａら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４２４２〜１４２４６（１９９８）を参照の
こと。

【００２９】 （２．４ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ） 多くのウイルスは、それらの複製周期においてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼを用いる。好ましい実施形態において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、
支持体に結合され、そして標識ケージ化リボヌクレオチドを使用して、配列決定
されているサンプルＲＮＡ鎖のＲＮＡコピーを生成する。これらの酵素の好まし
い例としては、ウイルス科（ブロモウイルス（ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ト
バモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トンブウイルス（ｔｏｍｂｕｓ
ｖｉｒｕｓ）、レビウイルス（ｌｅｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｃ型肝炎様ウイルス
およびピコマウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ））由来のＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｈｕａｎｇら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１６６８〜１６７５（１９９８）；Ｌｏｈｍａｎｎ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４１６〜８４２８（１９９７）；Ｌｏｈｍａｎｎ
ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９：１０８〜１１８（１９９８）、ならびにＯ’Ｒ
ｅｉｌｌｙおよびＫａｏ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５２：２８７〜３０３（１９９
８）を参照のこと。

【００３０】 （３．サンプルの調製） 配列決定される核酸は、任意の供給源から入手され得る。配列決定される核酸
サンプルの例としては、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミド由来のＤＮＡ
、第１鎖ｃＤＮＡ、総ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、切断／末端−改変ＤＮＡ（例えば
、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いる）、インビトロトランスポゾン（タ
グ化）（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのランダムインサーション）
が挙げられる。配列決定されるべき標的核酸またはサンプル核酸は、好ましくは
、特定のサイズに剪断（または切断）され、当該分野で周知の技術を用いてオリ
ゴヌクレオチドプライマーとアニーリングされる。好ましくは、サンプル核酸は
変成され、中和され、そして沈殿され、次いで適切な濃度に稀釈され、オリゴヌ
クレオチドプライマーと混合され、６５℃に加熱され、次いで適切な緩衝液中で
室温に冷却される。次いで、ポリメラーゼが支持体上に固定された後、核酸は、
反応チャンバに添加されるか、あるいは固定工程の前に核酸はポリメラーゼと合
わされる。

【００３１】 （３．１ 鋳型ＤＮＡのインビトロトランスポゾンタグ化） 別の好ましい実施形態において、精製されたトランスポゾンおよび転移因子（
ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）タグを用いて、鋳型二本鎖ＤＮＡ
中に特定の配列をランダムに挿入する。１つの構成において、転移因子は、特定
のＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターを含む。あるいは、転移因子の逆方
向反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ）は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤ
ＮＡＳのための相補オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズされ得る。
これらのトランスポゾンおよび転移因子の好ましい例としては、ＴＣ１およびＴ
Ｃ３Ａ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来）、ならびに操作された硬骨魚系Ｓｌｅｅｐｉ
ｎｇ Ｂｅａｕｔｙが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｉｖｉｃｓ
ら、Ｃｅｌｌ ９１：５０１〜５１０（１９９７）；Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｃｕｒ
ｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１２５〜１４３（
１９９６）；ｖａｎ Ｌｕｅｎｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５１３〜２５２
０（１９９３）、およびＶｏｓら、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１０：７５５〜７６１（
１９９６）。

【００３２】 （３．２ 二本鎖鋳型ＤＮＡ） なお別の実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、プライマーアニーリングの必要
なしに、Ｂｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼによって配列決定される。例えば、Ｌｕ
ら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：２９〜３２（１９９２）を参照
のこと。

【００３３】 （３．３ プライマー） 種々のプライマーおよびプロモーターが当該分野で公知であり、そしてＤＮＡ
Ｓにおける配列伸長（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）に適切であり得
る。例としては、ランダムプライマー、アンカーポイントプライマーライブラリ
ー、一本鎖結合タンパク質マスキング／プライマーライブラリー、およびプライ
マーゼが挙げられる。

【００３４】 好ましい実施形態において、アンカーされたプライマーが、ランダムプライマ
ーの代わりに用いられる。アンカープライマーは、以前に同定された配列に対す
るオリゴヌクレオチドプライマーである。アンカープライマーは、ゲノムＤＮＡ
全体、ｃＤＮＡまたはＲＮＡに由来する特定の配列の迅速な決定のために用いら
れ得る。これは、迅速な遺伝子型決定のため、および／または以前に同定された
疾患関連遺伝子もしくは目的の他の遺伝子における多型性もしくは変異を検出す
るための臨床的スクリーニングのための特有の用途である。一旦、ゲノムプロジ
ェクトおよび他の研究が、特定の目的の配列を同定すれば、次いで、その配列中
およびその配列のまわりの多くの位置に対応するオリゴヌクレオチドがＤＮＡＳ
における使用のために設計され得る。これは、一回の配列決定泳動から得られ得
る有用なデータの量を最大化し、複合ＤＮＡサンプルが用いられる場合、特に有
用である。変異したかまたは多型性の疾患遺伝子の同定のために、この技術は、
現行の任意の他の手段（一本鎖コンフォメーション多形性（ＳＳＣＰ）の使用［
Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４〜８７９（１９８９）］、ＰＣＲ
配列決定またはＤＮＡアレイハイブリダイゼーション技術［Ｈａｃｉａ，Ｎａｔ
．Ｇｅｎｅｔ．２１：４２〜４７（１９９９）］の使用を含む）によって遺伝子
決定を実行する必要性を取り除く。疾患遺伝子の直接配列決定は、ＳＳＣＰおよ
びハイブリダイゼーション技術より優れる。なぜなら、これらは比較的鈍感であ
り、そして頻繁に、変異を陽性にまたは陰性に同定し得るからである。多くのア
ンカーオリゴヌクレオチドは、一緒に混合され得、その結果、数百数千の遺伝子
または配列が同時に同定され得る。本質的に、すべての公知の疾患関連遺伝子ま
たはその可能性のある遺伝子が所定のサンプルから同時に配列決定され得る。

【００３５】 （４．標識ケージ化停止（ｌａｂｅｌｅｄ−ｃａｇｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｎｇ）停止ヌクレオチド） 本発明の方法のための鎖停止（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）基質と
して有用であるために、ヌクレオチドは、他の３つのヌクレオチドからそれを識
別する検出可能な標識を含まなければならない。さらに、鎖停止ヌクレオチドは
、塩基取り込みが可能でなければならない。取り込みの際、伸長は終止されなけ
ればならず、そして解放され得、さらなる連鎖伸長を可能にし、それにより取り
込みの反復サイクルを可能にし、組み込まれた塩基の同一性をモニタリングし、
そして次のサイクルの連鎖伸長を可能にするように解放されなければならない。

【００３６】 塩基性分子は３’−ＯＨ（Ｒ）、２’−ＯＨ（Ｒ’）または塩基（Ｒ”）で改
変を有するＮＴＰである。標準的なジデオキシＮＴＰ、Ｒ＝Ｈ、Ｒ’＝Ｈおよび
Ｒ”＝Ｈにおいて、Ｒ＝Ｈ、Ｒ’＝ＯＨおよびＲ”＝Ｈが、ＲＮＡポリメラーゼ
に関する連鎖ターミネーターである。

【００３７】 本発明の方法のために有用な鎖停止ヌクレオチドのセットの１つは、Ｒ＝ケー
ジ／標識、Ｒ’＝（ＨまたはＯＨ）、およびＲ”＝Ｈである。好ましい実施形態
において、改変されたヌクレオチドは３’−Ｏ−（−２−ニトロベンジル）基に
より糖部分に連結された標識（例えば、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ））
である。改変された３’−Ｏ−（−２−ニトロベンジル）−ｄＮＴＰは、支持体
に連結されたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼにより生長しているＤＮＡ鎖に取り込
まれる。連鎖伸長を再開するために、適切な周波数の光への曝露による２−ニト
ロベンジル基（その対応する検出可能標識を有する）の除去によりヌクレオチド
を解放する。改変されたヌクレオチド３’−Ｏ−（−２−ニトロベンジル）−ｄ
ＡＴＰは、一回のヌクレオチド取り込みおよび解放において、以前に使用された
。Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４２５９〜
４２６７（１９９４）。また、Ｃｈｅｅｓｍａｎ、米国特許第５，３０２，５０
９号（本明細書において参考として援用される）を参照のこと。

【００３８】 有用な鎖停止ヌクレオチドの別のセットは、以下の構成：Ｒ＝ケージ、Ｒ’＝
（ＨまたはＯＨ）、およびＲ”＝ケージ／標識を有する。好ましい実施形態にお
いて、検出可能な標識基は２−ニトロベンジル基によりヌクレオチドの基に連結
された標識（例えば、発蛍光団）であり、そして離脱可能ブロッキング基は、３
’−Ｏ−（−２−ニトロベンジル）基である。改変されたヌクレオチドは、支持
体に連結されたＢｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼにより成長しているＤＮＡ鎖に取
り込まれる。鎖の伸長を再開するために、適切な周波数の光への曝露による標識
基およびブロッキング基の両方の除去によりヌクレオチドを解放する。

【００３９】 これらの構成のいずれかにおいて、ＷＯ９８／３３９３９に記載されているよ
うに、各ケージに２つの標識（例えば、２つの蛍光色素）を配置することが有利
であることが証明され得る。

【００４０】 合成鎖がＲＮＡである場合、配列決定のためには、標識したケージ化リボヌク
レオチド（すなわち、Ｒ’＝ＯＨ）が、支持体連結ＲＮＡポリメラーゼによる取
り込みのために設計された改変ヌクレオチドとして、合成される。

【００４１】 （４．１ 蛍光標識） 核酸配列決定においてヌクレオチドを同定するための蛍光タグの使用は、当該
分野で周知である。例えば、米国特許第４，８１１，２１８号；同第５，４０５
，７４７号；同第５，５４７，８３９号および同第５，８２１，０５８号（それ
ぞれ、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。Ｍｅｔｚｋｅｒ
およびＧｉｂｂｓは、改善されたスペクトル特性を有するＣｙ発蛍光団に基づい
て蛍光的にタグ化されたヌクレオチドのファミリーを最近、開示している。米国
特許第５，７２８，５２９号（参考として、本明細書において援用される）。発
蛍光団の別のセットとしては以下が挙げられる：ローダミンベースの発蛍光団、
ＴＡＲＡＭ、ＲＯＸ、ＪＯＥおよびＦＡＭ；ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）発蛍光団
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；およびＢＯＤＩＰＹ（ 登録商標）発蛍光団（米国特許第５，７２８，５２９号）。

【００４２】 本発明の好ましい実施形態において、蛍光標識は、感光性３’ブロッキング基
（すなわち、ケージ）に結合される。ＤＮＡＳについて改変されたヌクレオチド
の例は、図１（パネルＡ〜Ｃ）に模式的に例示される。パネルＡは、リボースの
３’炭素への感光性リンカー蛍光色素結合体の付着により改変されたデオキシア
デノシン三リン酸を示す。３６０ｎｍ未満の光によるリンカーの光分解により、
蛍光色素を解離させ、ヌクレオチドインタクトの３’−ＯＨ基を解離する。パネ
ルＢは別の構成を示す。ここでは、蛍光色素が感光性リンカーの手段によりヌク
レオチドの塩基に付着されている。３’−ＯＨは、別の感光性基によりブロック
される。パネルＡおよびＢに示されるような改変ヌクレオチドは、ＤＮＡＳにお
ける使用のための標識ケージ化（ｌａｂｅｌｅｄ−ｃａｇｅｄ）デオキシリボヌ
クレオチドの例である。種々の蛍光色素および感光性の基は、標識ケージ化デオ
キシリボヌクレオチドの合成に用いられ得る。あるいは、リボヌクレオチドはま
た、ＲＮＡポリメラーゼとともに用いるために合成され得る。異なるスペクトル
特性を有する４つの蛍光色素は、ＤＮＡＳ反応サイクルの検出期の間に、４つの
ヌクレオチドが識別されることを可能にする。図１（パネルＣ）は、直接核酸配
列決定における使用のための４つの異なる標識ケージ化ターミネーターヌクレオ
チドの模式的な提示である。

【００４３】 固定されたポリメラーゼ分子による標識ケージ化ターミネーターヌクレオチド
の取り込み後、発蛍光団を照射し、それぞれ４つの種の発蛍光団において蛍光を
励起させる。アレイにおける各ポイントでの発光を、光学的に検出し、そして記
録する。一旦、配列情報が得られれば、解離波長の光（＜３６０ｎｍ））を用い
て感光性リンカーを照射により取り除く。

【００４４】 図２において示されるのは、以下の１回の反応サイクルである：すなわち、（
１）標識ケージ化ヌクレオチドの取り込み；（２）標識ヌクレオチドの検出；お
よび（３）のケージ化ヌクレオチドの離脱（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）。これは、
最初の配列情報が推論されるＤＮＡＳ反応サイクルの首尾良い回にわたっている
。第１のパネル（工程１）は、一本鎖鋳型ＤＮＡ（３’−ＡＧＣＡＧＴＣＡＧ−
５’）の例であり、左側は、短いプライマー配列（５’−ＴＣ−３’）および標
識ケージ化ｄＧＴＰ（取り込みを受けている）である。真ん中のパネル（工程２
）では、蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ⁵⁶⁴／₅₇₀が５３２ｎｍのＹＡＧレーザー照
射により励起されている。蛍光色素は、５７０ｎｍの波長に集中した光を発光し
、これは顕微鏡システムにより検出される。最後に、工程３において、３６０ｎ
ｍ未満の光を用いる照射によるリンカーの光分解は、蛍光色素を同時に解離し、
そして３’ブロックをはずす。結果として、プライマーは１塩基伸長され（５’
−ＴＣＧ−３’）、そして３’−ＯＨは回復され、その結果別のヌクレオチドが
次回のサイクルに取り込まれ得る。

【００４５】 （４．２ 量子ドット標識（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｌａｂｅｌ）） 本発明の別の好ましい実施形態において、それぞれのケージ化ターミネーター
は異なるタイプの量子ドットで標識される。近年、高度に発光性の半導体量子ド
ット（ＱＤｓ）は、生体分子に共有結合されている。ＣｈａｎおよびＮｉｅ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６〜２０１８（１９９８）。これらの発光性標識
は、従来の有機色素を上回る改善されたスペクトル特性を示し、そして単一のド
ットレベルで共焦点蛍光顕微鏡を用いた鋭敏な検出を可能にすることが示されて
いる。この実施形態において、ケージ化量子ドットターミネーターは、蛍光ケー
ジ化ターミネーターについて上記されたのと同じ様式で、取り込まれ、検出され
、そして解放される。

【００４６】 （４．３ プラスモン共鳴粒子（ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｐａ
ｒｔｉｃｌｅ） 好ましい実施形態において、それぞれのケージ化ターミネーターをコロイド銀
プラスモン−共鳴粒子（ＰＲＰ）で標識する。Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ ２２：２１４〜２１６（１９９９）；Ｓｃｈｕｌ
ｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：９９６〜１００１（２
０００）。ＰＲＰは、代表的には４０〜１００ｎｍの直径の金属のナノ粒子（ｎ
ａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）であり、可視範囲のスペクトルのいずれにおいても効
率的に光を散乱するように操作され得る。これらの粒子は、単一分子検出に用い
るのに十分明るい。ＰＲＰは、５百万のフルオレセイン分子に由来する散乱束（
ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｌｕｘ）に等しく、代表的な量子ドット由来のものよ
り１０⁵倍大きい散乱束を生じることが示された。Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：９９６〜１００１（２０００）。さらに
、標準的なＣＣＤにより画像化した場合、空間的なピークは、１０Åの精度に配
置され得る。これは、金のナノ粒子上に画像化する単一の発蛍光団で観察された
精度と同様である。ＤｅｎｋおよびＷｅｂｂ，Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．２９：２３８
２〜２３９１（１９９０）。検出を容易にするため、特定の実施形態において、
それぞれ異なる型のヌクレオチドを異なる色のＰＲＰで改変する。隣接する反応
中心でサンプルに取り込まれる２つのＰＲＰ由来のシグナルを分解するため、反
応中心を少なくともコヒーレンス長（ほぼ照射光の波長）まで分離しなければな
らない。さらに、ラマン散乱が、ＰＲＰを検出するために用いられ得る。Ｎｉｅ
およびＥｍｏｒｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１１０２〜１１０６（１９９７）
。

【００４７】 （５．取り込まれたヌクレオチドの検出） 顕微鏡的技術における進歩は、単一分子の分光光学的検出を可能にした。Ｎｉ
ｅおよびＺａｒｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒ
ｕｃｔ．２６：５６７〜５９６（１９９７）、ならびにＫｅｌｌｅｒら、Ａｐｐ
ｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．５０：１２Ａ〜３２Ａ（１９９６）を参照のこと。例
えば、水溶液中の単一の蛍光分子は、全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）、共焦点
顕微鏡、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）、または表面プラスモ
ン共鳴分光法（ＳＰＲ）のもとで可視化され得る。Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３８８：３５５〜３５８（１９９７）；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７４：９６６〜９６９（１９９６）；Ｉｓｈｉｊｉｍａら、Ｃｅｌｌ ９
２：１６１〜１７１（１９９８）；Ｉｗａｎｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４０７
：２３５〜２３８（１９９７）；Ｎｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０１８
〜１０２１（１９９４）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：３３８（１
９９７）；Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６
２６４〜６２６８（１９９６）、およびＧｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．
７４：２７０２〜２７１３（１９９８）、Ｙｏｋｏｔａら、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．
Ｌｅｔｔｓ．８０：４６０６〜４６０９（１９９８）を参照のこと。単一の分子
は分光高度的に検出され得るので、配列決定には、クローニングされた核酸サン
プルは、もはや必要でない。反応中心内に含まれる鋳型の単一コピーは十分なサ
ンプルサイズである。本発明の装置および方法は、光学平面内の単一のヌクレオ
チドタグ由来のシグナルの分解、およびそれらのデジタル情報への引き続く変換
を可能にする。光子は、酵素および新たに合成された塩基残基の容積におおよそ
等しい薄層平面から収集される。

【００４８】 （５．１ ＴＩＲＦＭ） 光が所定の幅の屈折媒体（例えば、ガラススライド）中に特定の角度で指向さ
れる場合、全反射（ＴＩＲ）が得られる。屈折媒体の平面上には、消失波（ｅｖ
ａｎｅｓｃｅｎｔ ｗａｖｅ）として公知の電磁的な事象が生じる。消失波の原
理は図６に示す。消失波は、表面から光の波長のオーダーの距離まで伸びる。重
要なことに、消失波も用いて、この距離内で蛍光色素を励起し得る。この現象が
顕微鏡に用いられる場合、これは全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）と呼ばれる。
この図に示される顕微鏡スライド、プリズムおよびレーザービームの配列は、下
部のスライド内にＴＩＲをもたらし、従って、消失波は下部のスライドの上部表
面の約１５０ｎｍ内で生成される。蛍光色素分子（例えば、ＤＮＡＳ反応中心内
のもの）は、励起され、そして対物レンズ、顕微鏡およびカメラシステムを用い
て光学的に検出され得る。消失波励起を用いて、高いシグナル対ノイズの比が得
られる。なぜなら消失波内のそれらの蛍光色素分子のみが刺激されるからである
。

【００４９】 好ましい実施形態において、ＴＩＲＦＭが、検出のために使用される。図７に
おいて、ＴＩＲＦＭを使用してＤＮＡＳを行うために必要とされる装置の配置を
示す。標準的な実験用顕微鏡スタンドは、反応チャンバアセンブリ、対物レンズ
、フィルターホイール、マイクロチャネルプレート増幅器、および冷却式ＣＣＤ
カメラを備える。レーザー光は、二色性ミラーおよびコンピューター制御された
シャッターによって、プリズム内に指向される。消失波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ
ｗａｖｅ）励起を使用して、サンプルを刺激する。消失波励起は、ガラス−液
体界面での全反射によって達成される。この界面において、光学的電磁界は、急
激に０に降下しないが、この液体相内に指数的減衰する。この急速に減衰する電
磁界（消失波）を用いて、この界面に直ぐ隣接する約１５０ｎｍの薄層中の蛍光
分子を励起し得る。ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３３９３９（本明細書中に参考と
して援用される）を参照のこと。単一分子の検出を可能にする感度は、走査され
るサンプル量が少ないことに起因する。ＴＩＲＦＭの１つの利点は、反応中心ア
レイ全体が、同時に画像化され得ることである。この反応中心アレイの画像は、
フィルターホイール上で保持されるバリアフィルターを通して、マイクロチャネ
ルプレート増幅器の面上にフォーカスされる。このマイクロチャネルプレート増
幅器は、画像を増幅し、そしてその画像を冷却式ＣＣＤカメラの面に転送する。
画像データは、このＣＣＤチップから読み取られ、そしてマイクロコンピュータ
ー上で処理される。刺激レーザー、または刺激レーザーのセットは、光学テーブ
ルによって試料に指向される。別のレーザーは、３’−ＯＨ保護基をアンゲージ
する。さらなるレーザーは、光学的蛍光色素の刺激に必要とされ得る。フィルタ
ーホイールもまた、本発明に含まれ、その４つの異なる蛍光色素（それぞれ、異
なる型の標識ケージ化ヌクレオチドに対応する）が、明確に区別されるように、
バリアフィルターを変化させる。

【００５０】 図７に示されるように、プリズムは、顕微鏡スライド上に設けられ、この顕微
鏡の外側からスライド内にレーザーを指向する。Ｉｓｈｉｊｉｍａら、Ｃｅｌｌ
９２；１６１−１７１（１９９８）。あるいは、対物型ＴＩＲＦＭが、蛍光検
出に使用され得る。レーザー光は、対物レンズオフセンターを通して指向され、
その結果、限界角が、この対物レンズ自体を使用して達成される。Ｔｏｋｕｎａ
ｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３５：４７−
５３（１９９７）を参照のこと。

【００５１】 （５．２ 共焦点顕微鏡） 代替的な好ましい実施形態において、共焦点顕微鏡が、検出に使用される。共
焦点顕微鏡において、レーザービームが、油浸系の高開口数（ＮＡ）対物レンズ
を使用して、サンプル内側のその回折限界焦点に導かれる。単一分子は、多光子
共焦点蛍光によって、溶液中に検出されている。Ｍｅｒｔｚら、Ｏｐｔ．Ｌｅｔ
ｔ．２０：２５３２−２５３４（１９９５）。本発明の１つの実施形態において
、ヌクレオチド標識は、多光子共焦点顕微鏡を走査することによって検出される
。Ｎｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０１８−１０２１（１９９４）。

【００５２】 （５．３ 蛍光共鳴エネルギー転移） 代替的な好ましい実施形態において、ＦＲＥＴ技術が、検出に使用される。蛍
光共鳴エネルギー転移は、２つの色素分子の電子励起状態間の、距離依存性相互
作用であり、ここで、励起は、光子の放出を伴わずにドナー分子からアクセプタ
ー分子に転移される。ＦＲＥＴは、分子間距離の逆６乗則（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓ
ｉｘｔｈ ｐｏｗｅｒ）に依存し、これが、ＦＲＥＴを種々の生物学的高分子の
寸法に匹敵する距離にわたって有用にする。従って、ＦＲＥＴは、分子の近接性
に変化を生じる、種々の生物学的減少を調べるための重要な技術である。

【００５３】 この技術は、色素分子のいくつかの独特な特性を使用する。蛍光色素を使用す
る実験において、この色素分子は、代表的に、ある波長の光で励起され、データ
は、より長い波長で収集される。しかし、２つの異なる色素分子が、互いに非常
に近接して配置される場合、光は、一方の分子（ドナー）によって吸収され得、
次いで、その放出が、隣接する分子（アクセプター）によって直ぐに捕捉され得
る。次いで、さらにより長い波長の光が、アクセプターから放出される。多くの
適用において、ドナーおよびアクセプター色素は異なり、この場合、ＦＲＥＴは
、アクセプターの増感蛍光の出現またはドナー蛍光の消光によって検出され得る
。ドナーおよびアクセプターが同じ場合、ＦＲＥＴは、その生じた蛍光の脱分極
（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって検出され得る。ドナーおよびアクセ
プター分子は、近接（代表的に、１０〜１００Å）しなければならない。アクセ
プターの吸収スペクトルは、ドナーの蛍光放出スペクトルと重複しなければなら
ず、そしてドナーおよびアクセプターの遷移双極子の方向は、ほぼ平行でなけら
ばならない。

【００５４】 ＦＲＥＴは、ＳＮ比を増加するために使用され得る。さらに、ＦＲＥＴは、Ｄ
ＮＡＳにおいて、蛍光色素上の感光性リンカーの必要性を回避するために、使用
され得る。ＦＲＥＴは、一般に、分子間または分子の部分間の距離を測定するた
めに、または遷移分子相互作用を検出するために使用される。実際には、候補分
子または同分子の異なる部分が、２つの異なる蛍光基で修飾される。次いで、溶
液は、この２つの蛍光色素のより短い励起波長に対応する光によって励起される
。第２の蛍光色素が、第１の蛍光色素に近接する場合、これは、その前者の放出
エネルギーによって励起され、それ自体の固有の波長で放出する。変換効率（量
子収量）は、この２つの蛍光色素間の物理的距離に直接的に関連する。ＤＮＡＳ
に対する特定の適用のために、ポリメラーゼ分子が、蛍光色素でタグ化され、こ
の蛍光色素は、その修飾ヌクレオチドに対する光子ドナーとして挙動する。これ
は、そのヌクレオチドの励起を、ポリメラーゼの活性部位またはポリメラーゼの
任意の他の適切な部分に制限する。このような配置は、ヌクレオチド検出のＳＮ
比を有意に増加する。さらに、ポリメラーゼ内のヌクレオチドのみが励起可能で
あるので、ＤＮＡＳに適用されるようなＦＲＥＴは、先に取り込まれた蛍光部分
の除去を不必要にする。ＦＲＥＴは、ＤＮＡＳに必要とされるような単一分子レ
ベルで行われ［Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３
：６２６４−６２６８（１９９６）］、そして蛍光顕微鏡における定量化に適切
であった。Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：２７０２−２７１３（
１９９８）。最適には、このポリメラーゼは、組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）融合タンパク質として合成される。なぜなら、これは、ポリメラーゼを誘導
体化する必要性を排除し、そして多くの一般的に使用される蛍光色素ＧＦＰとは
異なり、光退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）に実質的に耐性であるからで
ある。しかし、本発明者らは、最適な配置が、合成蛍光色素または量子のドット
が結合されてない化学修飾されたポリメラーゼであることを見出し得る。

【００５５】 （５．４ 表面プラスモン共鳴） １つの実施形態において、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分光法を使用して、
核酸サンプル内の標識の取り込みを検出する。ＳＰＲは、溶液のバルク相と消失
波領域との間の屈折率における変化を検出することによって、溶液の特性を測定
する。ＳＰＲは、最近、水溶液中の表面プラスモンによって、金属上での蛍光標
識されたタンパク質の単一分子画像化に使用されている。Ｙｏｋｏｔａら、Ｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔｓ．８０：４６０６−４６０９（１９９８）。この技術
は、蛍光標識化ヌクレオチドからのシグナルを増強するために、反応チャンバ表
面を金属の薄層でコーティングする工程を包含する。

【００５６】 （５．５ ＤＮＡＳ検出器） 検出器は、マイクロチャネルプレート増幅器を取り付けられた冷却式ＣＣＤカ
メラである。この機器のセットアップのブロック図を、図７に示す。近年利用可
能な増幅型冷却式ＣＣＤカメラは、少なくとも１０００×１０００画素の解像度
を有する。本発明の好ましい実施形態において、アレイは、１００×１００の反
応中心からなる。従って、このアレイが、カメラの面上に画像化されるとき、各
々の反応中心は、約１０×１０画素に分配される。図５に示されるように、ＤＮ
ＡＳは、６３×１．４ ＮＡレンズを使用して、規則的に間隔を開けて配置され
た反応中心のアレイ（１００×１００μｍ四方）を画像化する。情報は、１０，
０００個の反応中心から同時に記録され得る。この予測される解像度は、ＴＩＲ
ＦＭを使用して、ナイルレッド蛍光体（ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏ
ｒｅ）のサンプルを画像化し、そして多くの単一分子の画像が得られた、最近の
報告において達成されている解像度に匹敵する。単一のナイルレッド分子は、８
×８画素四方に明確に画像化された。Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８
：３５５−３５８（１９９７）。

【００５７】 （６．配列決定サイクル） この反応チャンバアセンブリは、ＤＮＡＳ反応中心のアレイを収容し、そして
試薬および緩衝液の交換を媒介する。この反応チャンバは、透明な上方スライド
および下方スライドで密閉された区画である。これらのスライドは、金属ハウジ
ングまたはプラスチックハウジングによって静置され、このハウジングは、取り
付けおよび取り外しされて、これらのスライドの交換を可能にする。チャンバへ
のアクセスを可能にする２つのポートが存在する。一方のポートは、緩衝液（お
よび試薬）の注入を可能にし、もう一方のポートは、緩衝液（および反応生成物
）がチャンバから取り出されるのを可能にする。下方スライドは、反応中心アレ
イを保持する。さらに、プリズムが、下方スライドに装着され、下方スライド内
でレーザー光の全反射を生じるような角度で、下方スライド内にレーザー光を指
向する。この配置は、消失波が、反応中心アレイにわたって発生されるのを可能
にする。高開口数対物レンズは、反応中心アレイの画像をデジタルカメラシステ
ム上にフォーカスするために使用される。反応チャンバハウジングには、加熱お
よび冷却要素（例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒデバイス）が取り付けられ、反応温度を
調節する。核酸サンプルは、４つの全ての標識されたヌクレオシド三リン酸ター
ミネーターを含む緩衝液中で、反応チャンバに導入される。

【００５８】 反応チャンバアセンブリの模式図を、図４に示す。大部分の反応中心が、それ
が含む固定されたポリメラーゼが、テンプレートに単一の取り込み標識ケージ化
ターミネーターヌクレオチドを結合させるまで、反応中心が、この顕微鏡システ
ムによってモニターされる。次いで、反応チャンバに、洗浄緩衝液が流される。
次いで、特定のヌクレオチドの取り込みを、各反応中心について決定する。検出
後、この反応チャンバは、その取り込まれたヌクレオチドをアンケージするよう
に照射され、そして再度、洗浄緩衝液が流される。標識されたヌクレオチドの存
在が、再度モニターされ、その後、新しい試薬が添加されて、合成を再開する。
この第２の検出は、反応中心が首尾よくアンケージされていることを確認する。
この工程の間のチャンバ中の標識されたヌクレオチドの存在は、この反応中心が
アンケージされていないことを示す。従って、このサイクルの次の検出工程の間
の、この反応中心からのその後の読み取りは、無視される。従って、首尾よくア
ンケージされていない反応中心からのシグナルを無視することによって、本発明
の方法は、先行技術の配列決定方法における不完全なアンケージによって引き起
こされる問題を回避する。上記に概略された配列決定サイクルは、大部分の反応
中心が、さらなるヌクレオチドを、その後、取り込まなくなるか、またはアンケ
ージしなくなるまで繰り返される。

【００５９】 反応中心への試薬の供給（および除去）、ならびに反応チャンバの環境（例え
ば、温度、および酸化的環境）を調節するための方法は、当該分野での通常の技
術を使用して、反応チャンバ内に組み込まれる。この技術の例は、Ｋｒｉｃｋａ
，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４４：２００８−２０１４（１９９８）に概略
される；米国特許第５，８４６，７２７もまた参照のこと。

【００６０】 （７．配列収集ソフトウェア） 配列収集ソフトウェアは、配列決定サイクル間に画像データを取得および分析
する。配列決定実験の開始時に、各反応中心を含む画素のビン（ｂｉｎ）を、決
定する。各配列決定サイクル間に、アレイ全体の４つの画像が生成され、そして
各画像は、４つの蛍光標識されたヌクレオチド塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ（Ｕ）の
うちの１つの励起に対応する。各反応中心ビンについて、４つの画像の全てが分
析され、どのヌクレオチド種が、そのサイクル中のその反応中心で取り込まれた
かを決定する。上記のように、特定の反応中心に対応する反応中心ビンは、１０
×１０アレイの画素を含む。この反応中心において、単一の蛍光体によって生じ
る光子の総数は、そのアレイ中の各画素値の合計によって決定される。代表的に
、顕微鏡スライドの表面に５ｋＷ／ｃｍ²の強度で生じるレーザーで１００ミリ
秒間励起された場合、５００〜１５００個の光子が放出される。Ｄｉｃｋｓｏｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９６６−９６９（１９９６）。各４つの画像から
の反応中心ビンの合計が比較され、そして有意な合計を生じる画像は、その反応
中心で新たに取り込まれた塩基に対応する。これらの画像が、各々の反応中心に
ついて処理され、そして取り込まれたヌクレオチドの配列が、記録される。デー
タ収集アルゴリズムの例を、図８に提供する。このような処理は、近年の画像処
理コンピューターを用いて低コストでリアルタイムで行われる。

【００６１】 反応中心アレイの複数の読み取りが、その４つのヌクレオチドが正確に区別さ
れることを確実にするために、検出工程間で必要とされ得る。露光時間は、１０
０ｍ秒程度の短さであり得、そしてＣＣＤチップの読み出し時間は、２５０ｍ秒
程度の長さであり得る。従って、そのアレイの４つの完全な読み取りに必要とさ
れる最大時間は、１．５秒である。試薬の添加、除去および洗浄を含む、所定の
サイクルの間の全時間は、確実に１０秒未満である。従って、１０，０００の反
応中心のアレイからなる配列決定装置は、控えめに見積もって、少なくとも３６
０塩基／部位／時間、すなわち、全配列で３．６メガ塩基／時間で検出可能であ
る。この速度は、従来の配列決定方法の速度より、有意に速い。

【００６２】 短い配列決定時間に加えて、本発明の方法は、サンプル増幅（クローニングま
たはＰＣＲ）、およびゲル電気泳動の、時間消費的プロセスを必要としない。少
ない試薬容量（反応チャンバ容量は、１０μｌオーダーである）および手動操作
の必要性の減少と共に、このサンプル増幅および電気泳動についての消費必要性
の欠失は、従来の配列決定技術と比較して、配列決定されるヌクレオチドあたり
のコストを劇的に減少する。

【００６３】 （８．配列決定分析ソフトウェア） 図８に、３×３アレイの反応中心を使用するＤＮＡＳデータ収集の例を示す。
しかし、代表的な構成では、ＤＮＡＳは、１００×１００の反応中心のアレイを
利用する。この例において、４サイクルのＤＮＡＳが示される。各サイクルにつ
いて、このアレイの４つの画像が、生成される。各画像は、特定の励起波長およ
びバリアフィルターの組み合わせに対応し、従って、特定の修飾ヌクレオチドの
取り込みに対応する。左上のアレイ（サイクル１．Ａ）を考察のこと。この場合
において、ＢＯＤＩＰＹセットの修飾ヌクレオチドを使用する場合、「Ａ」は、
３’−Ｏ−（ＤＭＮＰＥ−（ＢＯＤＩＰＹ⁴⁹³／₅₀₃））−２’デオキシＡＴＰで
ある。従って、この反応中心アレイは、Ａｒレーザーからの４８８ｎｍ光で照射
され、そして画像が、５０３ｎｍのバリアフィルターを通してフォーカスされる
。３×３行列中の９個の各要素は、ＣＣＤカメラアウトプットの１０×１０画素
領域に対応する。この４つの画像の各々について、各反応中心画素群が分析され
て、所定のヌクレオチドが取り込まれたか否かを決定する。従って、本発明者ら
は、その例において、サイクル１．Ａ中で、修飾デオキシＡＴＰが、反応中心Ｘ
１およびＺ１で取り込まれたことを理解する。それゆえ、この表において、反応
中心Ｘ１およびＺ１について記録された第１ヌクレオチドが、「Ａ」である。本
発明者らが、ＤＮＡＳの４サイクルにわたって、所定の反応中心（例えば、反応
中心Ｘ１）を考慮する場合、本発明者らは、この反応中心が、第１のサイクルで
「Ａ」、第２のサイクルで「Ｃ」、第３のサイクル「Ｃ」、そして第４のサイク
ルで「Ｔ」を取り込んだことを理解する。それゆえ、反応中心Ｙ３に結合された
テンプレートＤＮＡの配列フラグメントは、５’−ＡＣＣＴ−３’の逆相補体、
５’−ＴＧＧＡ−３’である。その主要配列は、各々単一反応中心に由来する配
列の集合体（ａｒｒａｙ）として存在する。各反応中心配列の長さは、所定の反
応中心が実験中に活性な状態であるサイクル数に依存する。当該分野で報告され
たクローン化されたポリメラーゼの進化性に基づいて、数百から数千塩基の配列
長が期待される。

【００６４】 本発明の１つの実施形態において、核酸サンプルは、反応中心中での封入前に
せん断される。一旦、これらのフラグメントが配列決定されると、配列分析ソフ
トウェアを使用して、それらの配列を連続性のストレッチにアセンブルする。配
列を比較し、それらの正確な重複を推定し得る多くのアルゴリズムが、当該分野
に存在する。最近、新しいアルゴリズムが、ショットガン（ランダム）配列決定
アプローチからの多量の配列データを処理するために設計されている。

【００６５】 １つの好ましい実施形態において、アルゴリズムは、最初に、所定の実験にお
いて単一の反応中心から推測された配列のいずれかの末端から誘導された、わず
か２つのより小さい配列を使用することによって、処理されるべきデータ量を減
少する。このアプローチは、ヒトゲノムのショットガン配列決定における使用の
ために提唱された。Ｒａｗｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８８３３−
８８４９（１９９６）；Ｖｅｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１５４０−
１５４２（１９９８）。これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）で開発されたアルゴリズムを使用する。Ｓｕｔｔ
ｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：９（１９９５）。

【００６６】 代替的な好ましい実施形態において、生データが、より小さいワード（例えば
、ヘキサヌクレオチド制限酵素部位）のフィンガープリントに圧縮され、そして
これらのフィンガープリントが、比較され、そしてより大きい連続性の配列ブロ
ック（コンティグ）にアセンブルされ得る。この技術は、オリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーション後に重複配列を推定するために使用される技術に類似する
。ＩｄｕｒｙおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２：２９
１−３０６（１９９５）。なお別の実施形態は、遺伝マップまたは物理的連鎖マ
ップからの既存の配列データを使用して、ゲノム全体または大きいゲノム片から
の新しい配列データのアセンブリを補助する。

【００６７】 （９．ＤＮＡＳの有用性） （ａ）臨床的用途 医学における遺伝子診断の重要性を、控えめにいうことはできない。出生前診
断および新生児診断について有害な遺伝的特性のキャリアを同定し得る技術の使
用が最も明白である。現在、生化学試験および核型分析が、最も一般的に使用さ
れる技術であるが、これらは明らかな制限を有する。生化学試験は、疾患状態に
関連する酵素またはタンパク質の活性またはレベルにおける変化が存在する場合
においてのみ、有用であり、そしてその酵素またはタンパク質についての特定の
試験が決定されてきた。タンパク質が疾患状態に起因している場合でさえも、そ
のような試薬の開発は困難であり、高価であり、そして時間がかかり得る。核型
分析は、ひどい遺伝子障害（例えば、倍数性、転座および大きな欠失）を同定す
るためにのみ、有用である。現在のＤＮＡ技術によって、個体が、所定の遺伝子
の不完全な対立遺伝子を所有するか否かを決定することは、理論的には可能であ
るが、有効なスクリーニングプログラムは、共通の変異がその疾患に関連し、そ
してその存在が非配列決定技術によって決定され得る場合においてのみ、現在実
施可能である。

【００６８】 本発明の方法は、ほとんど技術的努力を伴わずに、そして患者ＤＮＡをクロー
ン化する必要性またはＰＣＲによる特定配列を増幅する必要性を伴わずに、個々
の患者に由来する、大量のＤＮＡ配列データが決定されることを可能にする。単
一分子は、患者の血液、組織サンプルまたは羊水に由来する単純なＤＮＡ調製物
から直接配列決定され得る。従って、ＤＮＡＳは、遺伝子障害、特性または一次
ＤＮＡ配列情報（例えば、先天性障害の出生前、新生児、出生後診断もしくは検
出；遺伝子組換えおよび／または変異によって引き起こされる身体上の疾患の病
理学的分析；ヘテロ接合性の欠損、点変異もしくは癌に関連する他の遺伝子変化
または前癌性状態にあるということの同定）から予測可能な他の特徴の臨床的診
断のために使用され得る。

【００６９】 本発明の方法はまた、病気に冒された組織の直接的配列決定によって疾患を引
き起こす病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）を同定するために使用され得
る。

【００７０】 （ｂ）機能的遺伝子の同定 特定のプロセスに関与する遺伝子についての大量遺伝子スクリーニングは、例
えば発生の間、現在共通であり、そして大きなゲノムを有する脊椎動物（例えば
、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）および両性類Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）に適用される。マウスおよびヒトにおける変異体遺伝子
をクローン化する試みは長期に渡っており、かつ困難であり、そして遺伝学的に
より分析可能である生物体（例えばゼブラフィッシュのような）においてさえも
、それは時間がかかり、かつ困難である。

【００７１】 本発明の方法は、短期間で哺乳動物のゲノムサイズ全体の配列決定を可能にす
るので、変異体遺伝子の同定は、大量配列スクリーニングによって達成され得る
（すなわち、キャリアのゲノム全体もしくは大きなゲノムセグメントを配列決定
することおよび所定の種の異なるメンバーのゲノム全体もしくは大きなゲノムセ
グメントの配列と比較すること）。

【００７２】 同様に、本発明の方法は、細菌ゲノム全体の容易な配列決定を可能にする。こ
の様式で生成された配列情報は、広範に種々の生物体（イクストリモフィリック
（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）細菌を含む）に由来する新規な酵素をコード
する遺伝子の迅速な同定のために使用され得る。

【００７３】 さらに、本発明の方法はまた、任意の組織または細胞型において、変異誘発物
質および放射に応じた変異割合の評価のために使用され得る。この技術は、将来
の変異体スクリーニングのためのプロトコルの最適化のために有用である。

【００７４】 （ｃ）腫瘍における遺伝子改変の分析 多くの癌、おそらく全ての癌は、１つの細胞または少しの細胞のゲノムにおけ
る特定の改変とともに始まり、ついでこれらの細胞は、正常増殖の制御によるチ
ェックを受けずに増殖する。癌の処置の多くは、特定の薬剤に対するこれらの異
常細胞の特定の生理学的応答に依存する。

【００７５】 本発明の方法は、個々の腫瘍に由来する遺伝子プロフィールの迅速な生成を可
能にし、研究者が、どのような遺伝子変化が腫瘍の発達の種々の段階で同時に起
こるかを正確に理解することを可能にする。この情報はまた、個々の腫瘍に対す
るあつらえむきの襲撃のための標的癌細胞に対する特異的薬剤の設計を可能にす
る。

【００７６】 （ｄ）遺伝子バリエーションの分析 多くの重要な生理学的特性（例えば、血圧の制御）は、遺伝子座の多重度によ
って制御される。現在、これらの特性は、量的特性連鎖（ＱＴＬ）分析によって
、分析される。一般に、ＱＴＬ分析において、多型遺伝子連鎖マーカーのセット
が特定の特性（例えば、家族性慢性高血圧）を有する被験体の群に対して利用さ
れる。その特性を有するマーカーの連鎖の分析を介して、特定の遺伝子座のセッ
トとその特性との間の相関が得られる。通常、少数の遺伝子座が、大多数の特性
に寄与し、そしてより大きな群の遺伝子座が、その特性に対してより小さい効果
を有する。

【００７７】 本発明の方法は、ゲノム全体の迅速な配列決定を可能にする。従って、本発明
の方法を使用して、ＱＴＬ分析は、非常に微細なスケールにて実行され、そして
大きな群の被験体について、所定の特性に寄与する全ての主要な遺伝子座、およ
び重要でないほとんどの遺伝子座が容易に同定される。

【００７８】 さらに、本発明の方法は、先のゲノム組換え（例えば、逆位、転座、欠失、点
変異）の評価もしくは多型マーカーの分布に影響を及ぼす先の減数分裂組換え事
象によって、系統樹および／または血縁関係を構築するために使用され得る。本
発明の方法を使用して、遺伝子型と表現型とを関連付ける目的で、変異または多
型を同定し得る。また、本発明の方法を使用して、特定の表現型において生じる
か、または多遺伝子特性に寄与するそれらの変異体または多型遺伝子の配列を同
定し得る。

【００７９】 （ｅ）農業的用途 農業的有用性および生産性は、最適な遺伝子特徴を有する植物および動物の品
種改良を生成することによって増加する。本発明の方法を使用して、例えば、農
業的に重要な植物および動物における所望の特性および不用の特性の両方を強調
する遺伝子バリエーションを明らかにし得る。さらに、本発明の方法を使用して
、植物および動物の病原体を同定し得、そして病原体と戦うための方法を示す。

【００８０】 （ｆ）法医学的用途 本発明の方法は、犯罪の調査および法医学的調査において使用され得る。すな
わち疑わしい個体と法医学的に関連するサンプルとの間の結びつけを明白に確立
するために、血液、髪の毛、皮膚および他の組織のサンプルを遺伝的に同定する
ことによって父性／母性決定のために使用され得る。得られた結果は、現在の遺
伝子フィンガープリント法技術を用いて得られた結果と類似しているが、かなり
より詳細な情報を提供し、そしておそらく偽陽性同定を提供しない。さらに、混
合されたサンプルからの個体の同一性が決定され得る。

【００８１】 （ｇ）研究用途 本発明の方法は、いくつかの研究用途、例えば、一次配列を確認／顕在化させ
るための人工的ＤＮＡ構築物の配列決定、および／または無作為変異誘発スクリ
ーニングから特定の変異体クローンを単離するため：試料に由来する遺伝子発現
プロフィールを決定するために、任意の発生段階もしくは環境的状況に由来する
単一細胞、組織全体もしくは生物体に由来するｃＤＮＡの配列決定；任意の供給
源から単離された任意のサイズのＰＣＲ産物および／またはクローン化されたＤ
ＮＡフラグメントの配列決定のために使用され得る。

【００８２】 本発明の方法はまた、酵素、放射または化学的処理（例えば、クロマチンの部
分的なＤＮａｓｅ処理）に対する異なる感受性によってより高次のＤＮＡ構造を
精査する分析技術によって生成されるＤＮＡフラグメントの配列決定のためか、
あるいは、ポリメラーゼにより認識される効果的な塩基としてメチルシトシンを
チミン（または他のヌクレオチド）に変える化学を用いる前処理を伴うか、もし
くは伴わずに所定の組織から生成される配列を比較することによってＤＮＡのメ
チル化状態を決定するために使用され得る。さらに、本発明の方法を使用して、
発生または老化の間に生じる細胞性の生理学的変化を、一次配列のレベルにおい
てアッセイし得る。

【００８３】 本発明の方法はまた、所望の組込み状態を有する個体を選択するために、形質
転換細胞のゲノム全体または大きなゲノムセグメントの配列決定のために使用さ
れ得る。例えば、ＤＮＡＳは、特定の構築物の正確な組込みについて、トランス
フェクトされた胚性幹細胞のスクリーニングをするためか、あるいは、特定の組
込み事象について、生物体（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ゼブラフィッシュ
、マウス、またはヒト組織）のスクリーニングのために使用され得る。

【００８４】 さらに、本発明の方法を使用して、進化的に分岐した生物体に由来する配列も
しくはモチーフの保存されたブロックの同定を介して新規な遺伝子を同定し得る
。本発明の方法はまた、配列保存および相対的遺伝子位置によって、他の遺伝子
要素（例えば、調節配列およびタンパク質結合部位）を同定するために使用され
得る。

【００８５】 本発明の一つ以上の実施形態の詳細が、付随の上記の説明において述べられて
きた。本明細書中に記載される方法および材料と類似しているか、または等価で
ある任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが
、好ましい方法および材料が現在記載される。本発明の他の特徴、目的および利
点は、発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。明細書および
添付の特許請求の範囲において、単数の形態は、その文脈が明確に他のものを示
さないかぎり複数の対象を含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用され
る全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般
的に理解される場合と同じ意味を有する。本明細書中で引用された全ての特許お
よび出版物は、参考として援用される。

【００８６】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより充分に例示するために提示
される。これらの実施例は、上記特許請求の範囲に規定される本発明を限定する
とは決して解釈すべきではない。

【００８７】 （実施例１：反応チャンバ基層調製、ニッケル／キレート剤結合体） ＤＮＡ方法論の基本単位は、反応中心である（図３）。この反応中心は、テン
プレート核酸分子に結合し、そしてそれぞれそのポリメラーゼに付着した基と基
板との間の高親和性相互作用を介して透明の基板における固定された位置にテザ
ーされたポリメラーゼ分子を備える。１つの構成において、ＤＮＡＳ反応は、そ
の基底である基板が、ポリメラーゼ分子が規則的なアレイに付着し得るように改
変されたガラス（ＳｉＯ₂）から作製される反応チャンバ中で生じる。電子ビー
ムリソグラフィーを用いて、寸法が１００μｍ×１００μｍの正方形のアレイを
作製する。Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｉｃｒｏ
ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ．−Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐ
ｈｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ＰＭ３９，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）。小さなス
ポット（５０μｍ未満の直径）をスライドガラスを覆うレジスト材料中で１μｍ
間隔でエッチングする。このエッチングは、そのガラスを、引き続く誘導体化の
ために露出させる。誘導体化においてニトリロ三酢酸基をシラン化学で共有結合
させる。Ｓｃｈｍｉｄら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｒｌ ６９：１９７９−１９８５（
１９９７）。各々のニトリロ三酢酸基は、Ｎｉ²⁺イオンに対するキレート剤とし
て機能する。次いで、配位されたＮｉ²⁺イオンは、種々のポリメラーゼ分子へと
操作されたヘキサヒスチジン部分によって結合され得る。従って、１０，０００
ポリメラーゼ分子のアレイを、１００μｍ×１００μｍプのアレイにおいて作製
する。これを、光学顕微鏡系で観察する。代替の構成では、ビオチンを各々のス
ポットにシラン化学により共有結合させる。次いで、このビオチンは、そのポリ
メラーゼ分子に連結または操作されたストレプトアビジン部分によって結合され
得る。

【００８８】 （実施例２：微小流動化反応チャンバは、反応体、緩衝剤および生成物の迅速
な交換を可能にする） その反応チャンバは、反応中心のアレイを収容するデバイスであり、そしてそ
の環境を調節する。実施例１に記載されるように、その基板は、共有結合的部分
の規則的な顕微鏡アレイを用いて調製される顕微鏡スライドガラスである。プリ
ズムを、そのアレイの反対の表面上のそのスライドに付着させる。そのプリズム
は、そのスライドへレーザー光を、そのレーザ光の内部反射の合計がそのスライ
ド内に達するような角度でそのスライドへと向けられる。この条件で、消失波は
、配列決定反応サイクルの間に、そのアレイにわたって生成する。そのスライド
およびプリズムをアセンブリに固定する。このアセンブリは、１〜１０μｌ（図
４）の容量を有する封入チャンバを生成する。試薬および緩衝剤を、そのチャン
バから、そのチャンバのいずれかの側における微小流体ポートを通ってそのチャ
ンバへ、およびそこからポンピングする。容量の完全な交換は、１秒以内かかり
、そして電気的に制御されるバルブおよびポンプによって媒介される。

【００８９】 （実施例３：標識されたケージされた鎖を終結させるヌクレオチドの調製） （蛍光色素−光不安定性リンカー結合体の調製） 蛍光色素連結した２−ニトロベンジル誘導体は、まず、Ａｎａｓａｗａら、Ｗ
Ｏ ９８／３３９３９によって記載されるとおりに生成させる。あるいは、感受
性にした光不安定性リンカー（例えば、ＤＭＮＰＥケージングキット、カタログ
番号Ｄ−２５１６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を使用する）
は、以下に詳述するようにｄＮＴＰの３’基にまず付着させ得、次いで、スクシ
ンイミド化学または他の方法を用いて蛍光色素へと連結し得る。蛍光色素とケー
ジング基との間が可変長のリンカーを使用して、大きな化学基によって生じる可
能な立体障害を減少させることが最適であることが証明され得る。Ｂｒａｎｄｉ
ｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２１８９−２２００（１９９６）。

【００９０】 （３’−Ｏ−改変−２’−デオキシヌクレオチドアナログの調製） ３’−Ｏ−改変−２’−デオキシヌクレオチドは、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧ
ＴＰおよびｄＴＴＰの３’−ＯＨ基のエステル化によって合成する。これは、い
くつかの一般的な方法により達成される。Ｍｅｔｚｋｅｒら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４２５９−４２６７（１９９４）。

【００９１】 （方法１） まず、２’−デオキシ−５’−ヒドロキシ−ｄＮＴＰを、イミダゾールおよび
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下でｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
（ＴＢＤＰＳ）と反応させ、５’保護デオキシヌクレオチドを生成する。次いで
、得られる２’−デオキシ−５’−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルｄＮＴＰ
を、ベンゼン中に溶解し、そして水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）
（およびいくつかの場合にはさらにＮａＯＨ）の存在下で蛍光色素不安定性リン
カー結合体のそのハライド誘導体と混合し、２５℃で１６時間攪拌する。有機相
を、エチル酢酸で抽出し、そして脱イオン水で洗浄し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、
Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして段階勾配（１０％メタノール／酢酸エチルから５％
メタノール／酢酸エチルを２％間隔で）フラッシュクロマトグラフィーにより精
製する。

【００９２】 （方法２） 上記に詳述したように調製した９’−デオキシ−５’−ｔｅｒｔ−ブチルジフ
ェニルシリルｄＮＴＰを直接、蛍光色素光安定化リンカー結合体の酸無水物と、
乾燥ピリジン中で、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で２５℃
で６時間反応させる。次いで、そのピリジンを減圧下で除去し、その残渣を脱イ
オン水中に溶解し、クロロホルム中で抽出し、脱イオン水で洗浄し、１０％ Ｈ
Ｃｌで洗浄し、ＮａＨＣＯ₃で飽和差異、飽和ＮａＣｌで飽和させ、Ｎａ₂ＳＯ₄
で乾燥させ、そしてフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。

【００９３】 （方法３） ２’−デオキシ−５’−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルｄＮＴＰを、反復
したピリジンとの共エバポレーションによって乾燥し、熱ＤＭＦ中に溶解し、そ
して氷浴中で０℃まで冷却する。ＮａＯＨを、乾燥ベンゼンで洗浄した後にＤＭ
Ｆ中に溶解し、次いで溶解した２’−デオキシ−５’−ｔｅｒｔ−ブチルジフェ
ニルシリルに添加し、そして４５分間攪拌する。ＤＭＦ中の蛍光色素光安定化リ
ンカー結合体のハロゲン化誘導体を添加し、そしてその反応を数時間にわたり攪
拌する。次いで、その反応を、冷脱イオン水でクエンチし、そして一晩攪拌する
。得られた個体を濾過し、乾燥し、そしてエタノール中で再結晶化させる。

【００９４】 （方法４） ３’−ケージ化ＮＴＰを、Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ａｃｔａ ７４２：４９６−５０８（１９８３）に従ってトリホスフェ
ートから直接調製し得る。

【００９５】 方法１〜３の場合において、得られる化合物を、１．０当量のテトラブチルア
ンモニウムフルオリド（Ｂｕ₄ＮＦ）の添加により次に脱シリル化する。この反
応を、薄層クロマトグラフィーによってモニターし、そして完了（約１５分）後
、その反応を、１等量の氷酢酸でクエンチする。その溶媒を除去し、そしてその
残渣をシリカカラムクロマトグラフィーにより精製する。方法１〜３によってそ
の化合物の５’−トリホスフェート誘導体を、以下のプロトコルによって合成す
る。３’−改変されたヌクレオシド（１．０当量）を、トリメチルホスフェート
中に、窒素雰囲気下で溶解する。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ₃）（３．０当量）
を添加し、そしてその反応を−１０℃で４時間にわたって攪拌する。その反応を
、ＤＭＦ中のトリブチルアンモニウムトリホスフェート（５．０当量）およびト
リブチルアミンを用いてクエンチする。１０分間激しく攪拌した後、その反応を
、ＴＥＡＢ ｐＨ７．５でクエンチする。この溶液を濃縮し、そしてＤＥＡＥセ
ルロース（ＨＣＯ₃形態）カラムを用いた線形勾配（０．０１〜０．５Ｍ ＴＥ
ＡＢ）によってそのトリホスフェート誘導体を単離する。

【００９６】 最終の合成生成物を、ＨＰＬＣによって精製し得、そして必要に応じてさらに
酵素モップアップによって精製し得る。（Ｍｅｔｚｋｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ２５：８１４−８１７（１９９８）これは、デオキシヌクレオチド
対その３’ブロックの対応物についての多くのポリメラーゼの極度の酵素的優先
性を利用する技術である。これは、おそらく、３’改変されたヌクレオチドがそ
の酵素活性部位に存在する場合にホスホジエステル結合の触媒的形成の効率が低
いことから生じ、その結果その酵素が迅速に正常な汚染デオキシヌクレオチドを
消費する傾向がある。Ｂｒａｎｄｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２
１８９−２２００（１９９６）。

【００９７】 代替的構成において、光不安定生基を、スクシンイミドまたは他の化学を使用
して３’−ＯＨへと付着させ、そして蛍光色素光不安定性リンカー結合体を、Ａ
ｎａｓａｗａら、ＷＯ ９８／３３９３９によって記載されるように、直接、そ
のヌクレオチドの塩基に付着させる。３’−付着した光安定性基は、可逆性の鎖
ターミネータとして作用し（Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ２２：４２５９−４２６７ （１９９４））、そして塩基付着した蛍光
色素−光安定化リンカーは、除去可能な標識として作用する。各サイクルを用い
たこの構成において、両方の光安定性基は、光分解によって除去され、その後、
さらに、取り込みがなされる。そのような構成は、ヌクレオチドの３’−ＯＨに
付着した大きな蛍光色素基の立体障害がそのポリメラーゼにそのヌクレオチドが
進入すること妨害することが見出される場合に好ましくあり得る。

【００９８】 （実施例４：クローニングされたヘキサヒスチジンタグ化されたＤＮＡポリメ
ラーゼ、ランダムプライムされた一本鎖ＤＮＡテンプレートおよび総合内部反射
蛍光顕微鏡を用いたＤＮＡＳ） このプロセスには、２つの相がある。

【００９９】 （相１） 第一相は、設定相である。ヘキサヒスチジンタグ化されたＤＮＡポリメラーゼ
を、反応チャンバ註へと洗浄し、そしてＮｉ²⁺ニトリロ三酢酸アレイに付着させ
る。例として、ヘキサヒスチジンタグ化されたＴｈｅｒｍｏｓ ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。Ｄａｂｒｏｗｓｋｉら、Ａｃｔａ
Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ ４５：６６１−６６７（１９９８）。テンプレート
ＤＮＡは、剪断または制限消化によって調製し、続いて、９５℃で変性およびラ
ンダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物とアニーリングする。次いで、プ
ライミングされた一本鎖ＤＮＡテンプレートをその反応チャンバへとポンピング
する。

【０１００】 （相２） そのプロセスの第二相は、主要部である配列決定サイクルである。このサイク
ルは以下のとおりである。

【０１０１】 １．標識されケージされた鎖終結デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄ
ＮＴＰ^*）を含む反応緩衝液を、その反応チャンバへとポンピングする。反応緩
衝液は、以下からなる：１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ ８．３；５０
ｍＭ ＫＣＩ；および ２．５ ｍＭ ＭｇＣ１₂。このｄＮＴＰ^*は、各々、０
．０２〜０．２ｍＭである。

【０１０２】 ２．ｄＮＴＰ^*のない反応緩衝液を反応チャンバを通してリンスする。

【０１０３】 ３．１０，０００の反応中心の各々について、新たに取り込まれたヌクレオチ
ドの同一性を、総合内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）によって決定する。反応
中心アレイの複数の記録を作成し、その結果、その４つのヌクレオチドの各々が
識別される。使用した識別色素は、蛍光について高い消光計数および／または高
い量子収率を有する。さらに、その蛍光色素は、良好に解像される励起および／
または放射極大を有する。使用されるいくつかの蛍光色素ファミリーが存在し、
例えば、ＢＯＤＩＰＹファミリーの蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）がある。ＢＯＤＩＰＹ蛍光色素および光不安定性のリンカーであ
る１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）を用
いて、ヌクレオチドアナログの追跡セットを以下のＤＮＡＳについて使用し得る
： ３’−Ｏ−（ＤＭＮＰＥ−（ＢＯＤＩＰＹ⁴⁹³／₅₀₃））−２’デオキシＡＴＰ ３’−Ｏ−（ＤＭＮＰＥ−（ＢＯＤＩＰＹ⁵³⁰／₅₅₀））−２’デオキシＣＴＰ ３’−Ｏ−（ＤＭＮＰＥ−（ＢＯＤＩＰＹ⁵⁶⁴／₅₇₀））−２’デオキシＧＴＰ ３’−Ｏ−（ＤＭＮＰＥ−（ＢＯＤＩＰＹ⁵⁸¹／₅₉₁））−２’デオキシＴＴＰ 。

【０１０４】 従って、取り込まれた「Ａ」は、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザ照射およ
び５０３ｎｍ２中心を有するバリアフィルタによって検出される。取り込まれた
「Ｃ」「Ｇ」および「Ｔ」を、５３２ｎｍのＴＡＧレーザ照射およびそれぞれ５
５０ｎｍ、５７０ｎｍ、および５９１ｎｍに中心を有するバリアフィルタを用い
て検出する。

【０１０５】 別個の照射事象の各々について、消失波を、反応中心アレイにおいて生成し、
そしてそのアレイの画像を、マイクロチャネルプレートで強化された冷却ＣＣＤ
カメラの表面に顕微鏡系によって集束される。

【０１０６】 ４．新たに取り込まれたヌクレオチドは、他のＹＡＧレーザからの＜３６０ｎ
ｍの光での照射によって光学的にケージがはずされる。これは、新生の核酸鎖か
らのＤＭＮＰＥ−ＢＯＤＩＰＹの解離を引き起こし、それをインタクトのままに
し、そして次のヌクレオチドを取り込むように調製される。

【０１０７】 ５．その蛍光部分の除去を、ＴＩＲＦＭによって確認し、そしてその反応サイ
クルを、ヌクレオチドがもはや取り込まれないまで反復する。

【０１０８】 代表的に、各々の蛍光色素についての暴露時間は、１００ｍ秒である。ＣＣＤ
チップのその読み出し時間は、０．２５秒である。従って、各々のサイクルにつ
いての検出工程は、＜１．５秒である。この反応チャンバの合計容量は、１〜１
０μｌである。１秒未満がその反応チャンバを完全にフラッシュして流すのにか
かる。従って、所定のサイクルについての合計時間は、１０秒未満である。従っ
て、１０秒／サイクルにおいて、ＤＮＡＳ機器の１０，０００反応中心の各々は
、１時間あたり少なくとも３６０塩基の配列を推定し得る。これは、全体として
ＤＮＡＳ機器によって推定される３．６Ｍ塩基／時間の配列に対応する。

【０１０９】 シャッター制御レーザ照射、バリアフィルタおよびＣＣＤカメラを有するフィ
ルターホイールはすべて、マイクロコンピュータによって制御される。画像収集
およびデータ分析はすべて、同じマイクロコンピュータにより実行される。抽出
された配列データおよびアレイの画像は、それらが収集されるときにＣＤ−ＲＯ
Ｍ上に永遠に格納される。

【０１１０】 （等価物） 本発明の特定の実施形態の上記の詳細な説明から、核酸配列決定のための特定
の方法および装置が記載されていることは明らかであるべきである。特定の実施
形態が本明細書において詳細に開示されたが、これは単なる例示の目的のみの例
であって、そして上記の特許請求の範囲の範囲に関して限定するとは意図されな
い。特に、発明者らによって、種々の置換、変更および改変が本発明に対して、
特許請求の範囲によって規定されるように本発明の趣旨および範囲から逸脱する
ことなくなされ得ることが企図される、例えば、特定のポリメラーゼ、特定のポ
リメラーゼの固体支持体への連結、または特定のヌクレオチドターミネータの選
択は、当業者にとっては、本明細書に記載される実施形態に鑑み、慣用事項であ
ると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１（パネルＡ〜Ｃ）は、直接的核酸配列決定での使用のための、標識ケージ
化ターミネータヌクレオチドの模式図である。パネルＡは、光不安定性リンカー
−蛍光色素結合体のリボース３’炭素への結合によって改変されたデオキシアデ
ノシントリホスフェートを示す。パネルＢは、代替の構成を示し、ここでは、蛍
光色素は、光不安定性リンカーによってヌクレオチドの塩基に結合されている。
パネルＣは、各々が異なるスペクトル特性を有する蛍光色素で標識されている、
４つの異なるヌクレオチドを示す。このスペクトル特性は、４つのヌクレオチド
が、直接的核酸配列決定の反応サイクルの検出段階の間に識別されることを可能
にする。

【図２】 図２は、異なる核酸配列決定の１サイクルの工程の模式図であり、ここで工程
１は、標識ケージ化ヌクレオチドの取り込みを例示しており、工程２は、標識の
検出を例示しており、そして工程３は、３’−ＯＨ拘束の脱ブロック化を例示し
ている。

【図３】 図３は、固定化されたポリメラーゼおよび配列決定されている核酸サンプルを
示す、反応中心の模式図である。

【図４】 図４は、ＤＮＡＳ反応中心のアレイを収納し、そして試薬と緩衝液との交換を
媒介する、反応チャンバアセンブリの模式図である。

【図５】 図５は、反応中心アレイの模式図である。左側のパネル（顕微鏡視野）は、４
つの連続する検出事象（別々の蛍光色素の各々について１つ）によって記録され
るような、アレイ全体の図を示す。中央のパネルは、個々の反応中心の空間を示
す視野の一部の拡大図を示す。最も右のパネルは、単一の反応中心のカメラの図
を示す。

【図６】 図６は、消失する波の原理の模式図である。

【図７】 図７は、全反射型（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）
蛍光顕微鏡を使用する、直接的核酸配列決定の設定の模式図である。

【図８】 図８は、３×３の行列から得られたデータ取得アルゴリズムの例の模式図であ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月２５日（２００１．１０．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アーメス， ニアル アントニー イギリス国 エヌ３ ２エイチエックス ロンドン， ロング レーン 140 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 HA19 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR08 QR42 QR58 QR62 QR63 QS03 QS28 QX02

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヌクレオチド塩基の配列決定をするための方法であって、該
   方法は、以下の連続工程； （ａ）ポリメラーゼを固体支持体上に固定する工程； （ｂ）核酸サンプルおよび複数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを提供
   する工程であって、ここで該核酸サンプルがオリゴヌクレオチドプライマーとハ
   イブリダイズする、工程； （ｃ）４つの異なるヌクレオチドを提供する工程であって、各ヌクレオチドは
   脱離可能な標識基を用いて差次的に標識され、そして脱離可能なブロッキング基
   を用いて３’部分にてブロックされ、ここで該ポリメラーゼが該核酸サンプルと
   ハイブリダイズした該プライマーを、該サンプル核酸と相補的である差次的に標
   識された該ヌクレオチドを用いて伸長させる、工程； （ｄ）該プライマーに組み込まれなかったヌクレオチドを除去する工程； （ｅ）伸長した該プライマーに組み込まれた標識された該ヌクレオチドを検出
   する工程であって、それによって標識された該３’−ブロック化ヌクレオチドの
   相補体を同定する工程； （ｆ）取り込まれた該ヌクレオチドから該３’ブロッキング基および該標識基
   を分離する工程； （ｇ）分離された該３’ブロッキング基および工程（ｆ）の分離された該標識
   基を除去する工程； （ｈ）該プライマーに取り込まれた該ヌクレオチドから３’ブロッキング基の
   分離および除去を確認する工程；ならびに （ｉ）工程（ｃ）において新たなヌクレオチドが取り込まれなくなるまでか、
   または３’ブロッキング基が、工程（ｆ）および（ｇ）において分離かつ除去さ
   れずに固持するまで、工程（ｃ）〜（ｇ）を繰り返す工程、 を包含し、それによって、工程（ｄ）において標識された該ヌクレオチドが検出
   される順序が、該核酸サンプルの少なくとも一部の配列の該相補体に対応する、
   方法。
2. 【請求項２】 前記３’ブロッキング基および前記標識基が、光化学的活性
   化によって、組み込まれた前記ヌクレオチドから分離される、請求項１に記載の
   方法。