JPH07507681A - Ｄｎａシークエンシング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ／−クエンソング 本発明はＤＮＡのシーフェンシング法に関するものである。特に、本発明はＤＮ Ａの大きい断片の自動シーフェンシング法に関するものである。 ＤＮＡ配列の分析は分子生物学者にとって最も重要なツールの一つとなった。 現在の７−クエンソング技術により、実質上いかなるＤＮＡ断片からも配列デー タを得ることが可能になった。これによって全遺伝子及びその他のゲノムの配列 の７−クエンソングばかりでなく、ＣＤＮＡのシーフェンシングによりＲＮＡ転 写物の配列の確認も可能になった。現在、全ゲノムのＤＮＡ配列を決定するため のゲノムノーフェンシングに重点が置かれている。最終的にはヒトゲノムの配列 が解読されることが望まれる。 従来のＤＮＡ／−フェンシング法は、配列決定のためのアプローチにおいて基本 的な３工程が同じである。まず、シーフェンシングしようとする１個のＤＮＡ橿 から多様なりＮＡ断片が生じる。これらの断片はシーフェンシングすべきＤＮＡ 橿の不完全なコピーである。目的は、一つ前よりもそれぞれｌ塩基づつ長いＤＮ Ａ断片のはしごを作製することである。これは、マキサム・ギルバート法のよう にシーフェンシングすべきＤＮＡ橿の複数コピーの選択的な化学分解によって行 うことができるＣＡ、Ｍａｘ＊ｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、ＰＮＡＳ　１ ４．　ｐ、ｓ６０．　Ｈ７？）。もしくはサンガー法のように、ＤＮＡ橿をＤＮ Ａポリメラーゼの鋳型として用いて多（の不完全なりローンを生じることができ る（Ｐ、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｅｋｌｅｎ　ａｎｄ＾、Ｃｏｕｌｓ−ｏｎ、 　ＰＮＡＳ　７４　ｐ、６４０．１９７７）。これらの断片はそれぞれの長さが １塩基づつ異なっており、１塩基分の大きさの差を識別することができる装置で 分離する。この方法では必然的に薄いポリアクリルアミドゲルが用いられる。第 ３工程及び最終工程は、各断片の末端部の塩基の性質の決定である。終了する断 片の大きさ順に並べると、これらの塩基は元のＤＮＡ橿の配列を表す。 各塩基の性質は、先に各断片の末端塩基を選択することによって決定される。 たとえばサンが一法では、ＤＮＡクローンの伸長を＾、Ｃ，ＧまたはＴ残基で選 択的に終わらせるために、ジデオキシヌクレオシド三燐酸（ｄｄｌｌＰＴｓ）が 用いられる。 これは、それぞれのシーフェンシング作業について、興なるｄｄＮＴＰを用いて 個別１１９１）。しかしこれらの器械は本当の意味での自動シークエンサーでは なも１゜その試験管毎に４個の独立した反応を実行する必要があることを意味す る。したがって、１本の試験管では各標識断片が＾残基で終了するが、次の試験 管ではＣ残基で終了し、以下このように進むわけである。ポリアクリルアミドゲ ル上に並んだ各グループの断片の分離は、個々の断片の相対的な大きさを用いて 鋳型の配列を示すだろう。 一方マキサム・ギルバート法では、化学分解プロセスの間に選択性が得られる。 この場合、Ａのみ、Ｃのみ、Ｇ及び＾またはＴ及びＣでＤＮＡ鎖を開裂させる化 学物質が用いられる。そのような化学物質の限界濃度を用いることにより、ＤＮ Ａ橿の部分消化が可能になる。サンが一法と同様に、４個の独立した反応を実施 しなければならず、産物をポリアクリルアミドゲル上に並べて分離しなければな らない。 このようなこれまでの技術的な方法の欠点は数限りない。それらは多くの複雑な 操作を少なくとも４本の試験管において行う必要がある。それらはＤＮＡの二次 構造の構築や、サンガー法においてＤＮＡ鋳型の忠実な複製を妨害する他の現象 、またはマキサム・ギルバート法の化学反応物質によって塩基特異性の喪失を引 き起こす他の現象のため誤差を生じやすい。しかし最も重大な問題は、ＤＮＡ断 片がポリアクリルアミドゲル上で大きさによって分離する必要があるために起こ る。このプロセスは時間を浪費し、高価な化学物質を大皿用い、ゲルの分解能が 限られているために、単一の実験でシーフェンシングできる塩基数がかなり制限 される。さらに、データを取り出すためのゲルの読み取りには労力がかかり、遅 い。 ＤＮＡ７−クエンソングの効率及びスピードを改善するために、数多くの改善が これらのシーフェンシング法に影響を及ぼしてきた。これらの改善のいくつかは 、シーフェンシング反応そのものに関連している。たとえば、セクエナーゼ１及 びタクエナーゼ１などのポリメラーゼ酵素の改善が導入され、これによってサン が一法では精度が向上した。しかし、試薬の改善は配列データ産生のスピードに 有意な影響を及ぼさず、またシーフェンシングプロセスを有意に単純化すること はなかった。 スピード及び単純化のために、多くの”自動ンークエンサー２が近年導入されて いる（Ｔ、Ｂｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｒ，Ｉａｌｓｅｒ、　Ｂ、Ｉｏｏｐ　ｓ ｎｄ　Ｌ、Ｉｏｏｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５４．　ｐA５９゜ １１８−１２２．　１９８９；　Ｐ、＾、Ｐｅｖｚｎｅｒ、Ｊ、ＢＩｏｓｏｌｅ ｃｕｌａｒ　５ｔｒｕｅｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｄｙｎａ＋５１モ香A　ヱ、、ｐｐ 。 れらは単なる自動ゲル読み取り機で、サンプルをゲルに載せるまでに標準的なシ ーフェンシング反応の実施を必要とする。しかしそれらは、ゲルの読み取り及び その後の分析のためにコンピューターの中でデータの照合を行うために、スピー ドの点ではわずかに速（なった。 多くの自動ンークエンサーが標識技術においてなされた最近の進渉を活用してい る。これまでは、各ＤＮＡ断片の標識には３″ＰまたはＩＩＳの形の放射活性標 識が用いられていた。しかし近年、フルオロフォアが標識として受け入れられた 。 これらの色素はシーフェンシングプライマーまたはヌクレオチドのｔ）ずれ力） Ｉこ結合し、ポリアクリルアミドゲル上でレーザービームによって蛍光状態１こ 励起される。したがって、自動シークエンサーは読み取り領域においてレーザー の下を通過するので、標識断片を検出することができる。興なる波長で蛍光を発 する色素の使用により、＾、ａ、Ｃ及びＴ残基の個々の標識が可能になり、それ によって４個すべてのシーフェンシング反応の産物をゲルの１本のレーンに流す ことが可能になる。 しかし、そのような改善を取り込んても、自動ンークエノサーはなお１年間ζこ １人あたりせいぜいおよそ１００ｋｂ　Ｌか分析できない。この割合では、ヒト ゲノムを解読するためには１人の人で７３．０ＯＯ年かかるだろう。 明らかに、ヒトゲノムのシーフェンシングの目的を達成しようとするなら（ｆ、 現在のシーフェンシング技術は全（不適当である。この点に関して、古ｔ１技術 の単なる改善ではない別のシーフェンシング戦略に関していくつかの提業がなさ れた。 そのような方法の１つは、〕〕〜イブリダイゼー／Ｗによるシーフェンシング（ ＳＢＩＩ）で、比較的短い（およそ１００ｋｂｐ）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の配列は、 可能なすべてのＮ−マーオリゴヌクレオチドの合成及びどのオリゴヌクレオチド をたった１個の不一致もな（断片と融合させるかを決定することによって得られ るかも知れな０、という数学的な証明に基づいている（Ｒ，Ｄｒｌａｎａｅ、　 １．ＬａｂａＬ、　１．Ｂｒｕｅｋｎｅｒ　ａｎｄ　Ｒ。 Ｃｒｋｖｅｌｊａｋｏｖ、　Ｇｅｎｏｓｉｅｓ、　Ｌ、＋１．１１４．１９８９ ：Ｒ，Ｄｒｍａｎｉｃ、　Ｚ、５ｔｖａｎｏｖｉｃ、　Ｒ，bｒｋｖｅｎ− ｊａｋｏｖ、ＤＮＡ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、９．　ｐ、ｓ２７．　＋９９ ０　；　１１．Ｂａ１ｎｓ　ａｎｄ　Ｇ、５ｗ１ｔｈ、Ｊ、sｈｅｏｒ。 Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、＾ｂｓｔｒａ ｅｔｓ、　ｐ、＋４３．１９９１）　ｏ　Ｎは、理にかなったハイブリダイゼー シーンパラメータの必要条件と処理可能なライブラリの大きさの必要条件をいず れも満たす８．９または１０となることが可能である。 技術はオリゴヌクレオチドを既知のパターンで二次元グソフド上に結合させるこ ある（Ｅ、　Ｄ、　Ｈｙｍａｎ、＾ｎｍ１．　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　１７４．　 ｐ、４２Ｌ　１９ｇｇ）。この方法は、ピａ７ｔスファターゼの放出の際のシグ ナルを生じるために、単一のヌクレオチドのプライマーへの付加をルシフェラー ゼ酵素を用いて検出しようとしている。しかし、この方法には多くの欠点があり 、その最たるものは、ｄＡＴＰがルシフェラーゼの基質で、それがＤＮＡ＠に取 り込まれる如何に関わらず、常にシグナルを発するだろうということである。加 えたヌクレオチドは標識されておらず、標識ヌクレオチドの使用を可能にするよ うな方法は発表されていない。 したがって、要約すると、上述のＤＮＡシークエンシングの新しいアプローチの それぞれが、従来の方法に関連した問題のいくつかを解決してはいるものの、そ れ自身い（つかの間層を提起している。一般にこれらの方法のほとんどがコスト が高く、現在のところ実行可能でない。 それゆえ、低コストで、速やかかつ明瞭なりＮＡのシーフェンシングを可能にす る必要がある。そのようなシステムの必要条件は以下のとおりである：ｌ　サイ ズの興なるオリゴマーのゲル解析に基づくべきではない；２　現在の方法よりも 速やかな／−フェンシングを可能にすること：３　いくつかのＤＮＡクローンの 平行処理を可能にすること；４　ハードウェアのコストが理にかなっていること ；５　現在の技術よりも配列ｌ塩基あたりのコストが低いこと；及び６、現時点 において技術的に実行可能であること。 本発明は、ＤＮＡ鋳型上でプライマーにヌクレオチドを連続付加する方法から成 ルシークエンシングシステムを規定する。 本発明の最初の局面に従って、以下の工程からなる核酸の配列決定方法が規定さ れる： ａ）　シーフェンシングすべき核酸で構成される一重鎖鋳型の作製；ｂ）　鋳型 ／プライマー複合体を形成するためにプライマーを鋳型に融合させる；Ｃ）　単 ｔ＊ｍヌクレオチドを加えてプライマーを伸長させる；ｄ）　プライマー上に加 えた標識ヌクレオチドのタイプを決定する；ｅ）　標識を除去または中和する； 及びｆ）　工程（ｃ）から（ｅ）を連続して繰り返し、４１ｍヌクレオチドの取 り込み順を記録する。 発明の方法において、−重鎖鋳型はシーフェンシングしようとする核酸断片から 得られる。核酸はＤＮＡであることが好ましい。この断片の配列の一部は既知で あってもよく、それ故特異的なプライマーを構築して鋳型に融合させてもよい。 もしくは、プライマーのハイブリダイゼーン１ンを可能にするために、リンカ− を未知配列の断片に結合してもよい。 鋳型は直線状または環状であってもよい。鋳型は固体支持体に結合していること が好ましい。たとえば、鋳型はピン、ガラスプレート、またはシークエンシング チツブに結合してもよい。固体鋳型の規定は、特に発明の方法が自動化されてい る場合には、試薬の速やかかつ効率のよい添加及び除去を可能にする。さらに、 多くのサンプルを別々のままで同じ管の中で平行処理してもよい。 鋳型は結合リンカ−によって固体支持体に結合していることが望ましい。たとえ ば、市販の一般的プライマーの１個を鋳型の５°末端に結合したり、ポリメラー ゼ鎖反応によって鋳型の末端の１個に容易に取り込ませることができる。 結合リンカ−は、ビオチン／ストレプトアビジンカップリングシステムを用いて 固体支持体に結合させてもよい。たとえば、固体支持体の表面は、ビオチンの次 にストレプトアビジンを適用することによって変更してもよい。ビオチン化した 結合リンカ−を次に鋳型に結合させて固体支持体に、またはＰＣＨによって生じ たビオチン化鋳型に結合させる。 別の態様において、ビオチン／ストレプトアビジンシステムを用いて、未結合の 結合リンカ−を固体支持体に結合させる。次に鋳型を結合リンカ−に融合させる 。結合リンカ−はシーフェンシングプライマーではない別の結合リンカ−でもよ い。もしくは結合リンカ−はシーフェンシングプライマーとして機能してもよい 。 明らかに、後者の態様において、鋳型は支持体に結合した結合リンカ−と相補領 域を持っていなければならないことが必須である。鋳型をリンカ−に結合させる 場合には、相補性はそのリンカ−が規定してもよい。もしくは、結合リンカ−は 鋳型そのものの中にある独自の配列に相補的であってもよい。 固体支持体は、支持体上での鋳型の解析度の高い圧縮を可能にするためにマスク を用いて変更することが好ましい。一連の鋳梨接看領域は、それによってガラス プレートまたはンークエンシングチブブ上に生じることができ、多数の異なる鋳 型の平行処理が可能になる。ピンを固体支持体として用いる場合には、各鋳型に ついて１本のピンを必要とする。１本のピンは一列にしてもよい。１０’　クロ ーンの同時処理を可能にするためには、一連の１００Ｘ　１０Ｇのピンまたは接 着領域を用いることができると予想される。 プライマーは単標識ヌクレオチド、＾、Ｃ，ＣまたはＴのいずれかの存在下でＤ ＮＡポリメラーゼによって伸長する。たとえば、適したＤＮＡポリメラーゼは、 タクボリメラーゼ（たとえば、タクエナーゼ１）及びベントポリメラーゼなどの 熱安定ポリメラーゼと同様、セクエナーゼ２０″、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまた はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片である。 単一の鋳型を用いる手動操作の方法では、そのヌクレオチドをプライマーに加え るつもりで標識ヌクレオチドが単独で連続して用いられる。ヌクレオチドが鋳型 の次のヌクレオチドと相補的である場合には、これはプライマー上に付加される 。適当な標識ヌクレオチドを用いるまで１．　２．３、または４工程要してもよ い。しかし、標識ヌクレオチドがプライマー上に付加されたことが明らかになり 次第、工程（ｅ）を実行することができる。 自動化手順では、特に多数の鋳型を同時にシーフェンシングしようとする場合に は、工程（Ｃ）において、４個すべての標識ヌクレオチドを連続して用い、どの 標識ヌクレオチドが付加されるのかを単に記す、すなわち、どれが最初、２番目 、３番目、または４番目に付加される標識ヌクレオチドであるかが決定される。 取り込み工程を何回も繰り返す場合には、非特異的な最終付加及びヌクレオチド の誤取り込みが背景問題につながり得ることがわかった。このれらの副反応は、 ４個すべてのヌクレオシド三燐酸のかわりに、１個のヌクレオチドが存在すると いう事実に単によるものである。実際、他の３個の非存在下では、１個のヌクレ オチドの連続付加によって特定の鋳型のシーフェンシングが可能な場合は、重要 な問題が他の鋳型、特に複数の塩基繰り返しを持つ鋳型について生じることが認 められるが、これは非相補的な塩基の上を効率よくジャンプするポリメラーゼに よって引き起こされるヌクレオチドの非特異的な取り込みによるものである。 プライマー伸長工程の間の操作の高い正確さを保証するためには、鎖伸長阻害剤 の存在下で工程（ｅ）を実行することが有利であることがわかった。 鎖伸長阻害剤はヌクレオチドの類似体で、これは鎖そのものに取り込まれること によって、ポリメラーゼによる鎖の３末端へのヌクレオチドのさらなる付加を阻 害する鎖終了剤、または実際に取り込まれることなく取り込みを競合するものの いずれかである。鎖伸長阻害剤はジデオキシヌクレオチドであることが好ましい 。鎖伸長阻害剤が伸長しつつあるポリヌクレオチド鎖に取り込まれる場合には、 異なる標本ヌクレオチドを用いてシーフェンシング反応を進めるために、標識ヌ クレオチドの取り込みが検出された後それらを除去することが必須である。下記 のように、たとえば二手ンヌクレアーゼｍのような３°から５゛エキソヌクレア ーゼはジデオキシヌクレオチドを除去できることがわかった。この発見により、 発明のシークエンノング法におけるポリメラーゼの正確さを推進するために、鎖 伸長阻害剤としてのジデオキシヌクレオチドの使用が可能になる。１０’　クロ ーンを同時に処理する場合には、４個の独立した反応としてではなくて、単一の 鋳型上でのンークエン／ング反応の実行を可能にするのはポリメラーゼの高い正 確さであるため、ポリメラーゼの正確さは不可欠である。 もしくは、鎖伸長阻害剤はデオキシヌクレオシド５−［α、β−メチレン］三燐 酸であってもよい。これらの化合物は鎖の中に取り込まれない。たとえば、これ も鎖の中に取り込まれないデオキシヌクレオシドニ燐酸またはデオキシヌクレオ シド−燐酸のようなその他のヌクレオチド誘導体を用いてもよい。 さらに、非特異的な取り込みを防ぐために、標識ヌクレオチドのデオキシリボー ス基の３°部分にある保護基を用いてもよいと予想される。したがって、標識ヌ クレオチドは蛍光色素基がデオキシリボース基の３°部分に接着して標識され、 蛍光色素をヌクレオチドから開裂させて標識を除去し、３°ヒドロキシル基を生 成することが好ましい。蛍光色素は化学的または酵素的手段によって容易に開裂 できるリンカ−アームによって、デオキシリボースに結合していることが好まし い。 明らかに、ヌクレオチド類似体の鎖伸長阻害剤を用いる場合には、標識ヌクレオ チドに反応しない類似体のみを加えるべきである。そのような類似体をこれがら 不均一な鎖伸長阻害剤として呼ぶ。 ＩＩ’ｍｌは、反応に加えられる４ＩＩＩｍヌクレオチドがプライマーの３°末 端に隣ｔｉ　する鋳型のヌクレオチドに相補的である場合は、理想的には鋳型／ プライマー複合体の中にのみ取り込まれる。鋳型をその後洗浄して、取り込まれ なかった１ｍを除去し、取り込まれた標識量を定置する。放射活性標識は、計数 によって、または技術的に知られているその他の方法によってめてもよいが、こ れに対し蛍光標識はたとえばレーザーによる励起によって蛍光を発するように誘 発することができる。 明らかに、核酸の標識に遇していると技術的に知られている標識はいずれも本発 明において用いてもよい。しかし、放射性物質の使用を含まない標識について現 在利用できる検出システムの感度のため、蛍光標識の使用が現在のところ好まし い。 現在利用できる蛍光標識ヌクレオチドの例は、フルオレセイン−１２−ｄＵＤＰ 、フルオレセイン−Ｉｓ−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ及びフル オレセイン−１５−ｄｌＴＰである。適した蛍光グアノシン化合物を合成するこ とは非常に難しいことがわかっているため、イノノン化合物で代用する。もし蛍 光グアノシン化合物が利用できるようになれば、本発明においてその使用が予想 される。 付加工程において、非標識及び４ｊＡ識ヌクレオチドの混合液の使用は有利であ ることがわかった。 蛍光Ｉｌｌを用いる場合には、特定のヌクレオチドの配列を有する一つの鋳型上 で可能なすべての伸長産物を得るために、以下の比がおよそ至適であることがわ かった： フルオレセイ／−１５−ｄＡＴＰ／ｄＡＴＰ　５００　：　１ｙル＊し４ｘ４　 ン−１５−ｄｌＴＰ／ｄＧＴＰ　５００：　１フルオＬ／セイ７−１２−ｄＬＩ ＴＰ／ｄＴＴＰ　Ｉｓ：　１フルオレセイ７−１２−ｄｃＴＰ／ｄＣＴＰ　Ｉｓ 　：　１したがって、上記の比は蛍光標識ヌクレオチドに関連して用いることが 好ましい。 取り込みが検出されるまで取り込み及び標識検出工程を繰り返すことによって５ プライマーの３゛末端に隣接する鋳型上のヌクレオチドを識別してもよい。いっ たんこれが得られれば、次のヌクレオチドが何であるかを発見するプロセスを繰 り返す前に、標識を除去しなければならない。標識の除去は、３’−５’エキソ ヌクレアーゼを用いる標識ヌクレオチドの除去によって、及びその後の非標識ヌ クレオチドの入れ替えによって影響を受けることがある。もしくは、標識基をヌ クレオチドから除去することができる。さらに別の方法は、標識が蛍光標識の場 合、レーザー照射でそれを漂白してＩ識を中和することが可能である。 鎖終了剤または３°保護基を用いる場合には、次のサイクルを行う前にこれらを 除去すべきである。鎖終了剤は３°−５°エキソヌクレアーゼとともに除去する ことが好ましい。エキソヌクレアーゼｍを用いることが好ましい。３゛保護基は 、保護基のヌクレオチドからの化学的または酵素的開裂によって除去してもよい 。 鎖終了剤の除去のためにエキソヌクレアーゼ■を用いる場合には、すでに取り込 まれたヌクレオチドまたはプライマーそのものを除去するために、エキソヌクレ アーゼ■が伸長しつつある鎖に沿って戻らないようにすることが必須である。 したがって、ｔｌＩ識ヌクレオチドの入れ替えには、エキソヌクレアーゼによる 除去にも抵抗性があるヌクレオシド銹導体が用いられる。チオキ／ヌクレオシド フォスフォロチオエート三燐酸（ｄ、ＮＴＰ＊）を用いるのが有利である。同様 に、プライマーは、プライマー合成または特別な酵素的キャッピング工程の際に 取り込まれ、その３°末端が７オスフオロチオエートヌクレオシド塩基で構成さ れていることが好ましい。 チオキシヌクレオシドフォスフ者ロチオエート誘導体はエキソヌクレアーゼ■に よる消化に抵抗性があることは知られている（Ｓ、Ｌａｂｅｌｌ　ｅｊ　ａｌ、 、　Ｄに＾、　ｓ、　ｐ。 ＋７３．　ＩＩＩｎ）。しかしこの抵抗性は完全ではなく、過剰な消化及びフォ スフォロチオエート塙基の除去が起こらないように条件を調節すべきである。 たとえば、用いたｅｘｏｌｌ＜フ７　ｙ　−（Ｓｏｄ　）　！Ｊ　Ｘ／ＢＣ１， ５ａｉｌ　ＭｇＣｌ５）　ＩＤｐＨ＋１、起コル逆戻すノ程度に影響を及Ｉｆｆ 、ｐｌ＋　６．０．７．（１，７，５、ｓ、　ｏ、　ａ、　ｓ、　＊、　ｏ及び １０．０　（３？”Ｃ）で行また実験により、反応の速度及びａｔｏｍの特異性 の点から、ｐＨ１Ｏ００が至適であることが明らかである。このｐＲでは、検出 可能な逆戻りもな（反応は１分以内に終了することが示された。 標識及び終了剤／保護基を除去すれば、次のヌクレオチドが何であるかを発見す るためにサイクルを繰り返す。 本発明の別の態様において、本発明の最初の局面の工程（ｃ）及び（ｄ）は、標 識の除去または中和の前に何回も連続して繰り返される。 工程（Ｃ）及び（ｄ）を繰り返すことができる回数は、標識ヌクレオチドをプラ イマー上に付加した場合の検出に用いた装置の感度に依存する。たとえば、各ヌ クレオチドが興なる蛍光ｍｇａで標識されている場合には、検出装置はそれぞれ の標識の識別が可能な感度が必要とされ、理想的には各タイプの蛍光標識の数を 計数することができる。もしくは、各ヌクレオチドが放射活性標識されていたり 、同し：蛍光色素で標識されている場合には、装置はプライマーに加えた標識の 総数を計数できる感度が必要である。 発明の最初の態様に関して、単一の鋳型を用いた手動手順において、標識ヌクレ オチドは４９１ｍヌクレオチドが付加されるまでそれのみを連続して用いる。自 動　。 化手順においては、４個の標識ヌクレオチドすべてが連続して用いられ、装置は どのヌクレオチドがプライマーのどの配列に加えられたかを検出するようにプロ グラムされる。 付加した標識の数が検出装置の解像力に達したら、標識の除去または中和を１工 程で実施する。このようにすれば、標識除去の工程の数は有意に減少する。 この別の態様において、発明の最初の面の工程（ｅ）及び（ｄ）は以下からなる ことが好ましい： １）　［２！ヌクレオチドを、５°−［α、β−メチレン］三燐酸のような鎖に 取り込まれない３つの不均一な鎖伸長阻害剤とともに付加する；１ｉ）　過剰な 試薬を洗浄して除去する；ＩＩＩ）標識が取り込まれたかどうかを明らかにする ；及びＩｖ）　４ｊＡＴＡヌクレオチドが取り込まれるまで、または４個すべて の標識ヌクレオチドを用いるまで、工程（１）から（Ｉｉｌ）までを異なる標識 ヌクレオチドを用いて繰り返す。 この技法は、より洗練されたカウンターまたは標識測定装置の使用を必要とする 。繰り返しヌクレオチドを流すことを可能にしながら、標識測定装置は４標識か ら１６標識ヌクレオチドの存在を正確に検出することができなければならない。 繰り返しヌクレオチドの長い伸長を測定するためには、より能力の大きい装置を 必要とするかも知れない。 スキム１ 発明の好ましい局面によれば、ＤＮＡ断片を以下のスキムに従ってシーフェンシ ングする： ｌ）　フォスフ看ロチオエートヌクレオシド誘導体を含むキャッププライマーを 鋳型に融合させて鋳型／プライマー複合体を形成する；２）　標識したデオキシ ヌクレオシド三燐酸（ｄＮＴＰ）を不均一な鎖終了剤及び適したポリメラーゼと ともに鋳型／プライマー複合体に加える；３）　過剰な試薬を洗浄して除去する ：４）　取り込まれた標識量を測定する；５）　鋳型／プライマー複合体をエキ ソヌクレアーゼで処理して標識及びジデオキシヌクレオチドを除去する； ６）　エキソヌクレアーゼを洗浄して除去する；７）　工程２において付加され た標識デオキシヌクレオシド三燐酸に対応するフォスフォロチオエートチオ牛ジ ヌクレオシド三燐酸を不均一な鎖終了剤とともに加える； ８）　過剰な試薬を洗浄して除去する；９）　鋳型／プライマー複合体をエキソ ヌクレアーゼで処理して鎖終了剤を除去する； １Ｇ）　エキソヌクレアーゼを洗浄して除去する；及び１１）　工程２）から１ ０）を４回繰り返す。それぞれの場合について興なる標識ヌクレオチドを、適当 な不均一な鎖終了剤とともに用いる。 たとえば、上述の工程２において、ｔａｌｌしたヌクレオチドはｄＡＴＰであっ てもよい。この場合、不均一な鎖終了剤はｄｄＧＴＰ、　ｄｄＴＴＰ及びｄｄＣ ＴＰとなる。工程７において、フォスフォロチオエートｄＡＴＰは、工程６にお いてエキソヌクレアーゼで除去した標識ｄＡＴＰと入れ替えるために加えられる 。次にサイクルを別の標識ヌクレオチド、たとえばｄＧＴＰについて、不均一な ジデオキシヌクレオチドｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰの鎖に４１！ｌが取り込まれ る。これは今度は標識ｄＴＴＰ及び標１１ｄｃＴＰにつ（１て行（１、再度ｄＡ ＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰについて続け、以下同様に行う。 スキム２ 発明の二番目に好ましい局面によれば、ＤＮＡ断片は以下のスキム１こ従ってソ ークエンノングされる： ｌ）　フ呼スフをロチオエートヌクレオシド誘導体を含むキャッププライマーを 鋳型に融合させ、鋳型／プライマー複合体を形成する；２）　標識したチオキ７ ヌクレオシド三燐酸（ｄＮＴＰ）を不均一な鎖終了剤及び適したポリメラーゼと ともに鋳型／プライマー複合体に加える；３）　過剰な試薬を洗浄して除去する ；４）　取り込まれた標識量を測定する；５）　標識したヌクレオチド及び鎖終 了剤をエキソヌクレアーゼとともむこ除去する： ６〉　エキソヌクレアーゼを洗浄して除去する；７）　フォスフオロチオエート チオキシヌクレオチドを鎖に取り込まれなＬＸ不均一な鎖伸長阻害剤とともに加 える； ８）　過剰な試薬を洗浄して除去する：及び９）　工程２）から８）を４回、そ れぞれについて異なる標識ヌクレオチドを用いて繰り返す。 このスキムは基本的にはスキムｌのサブスキムである。大きな違０１よ牛ヤブピ ング工程７の間、ジデオキシヌクレオチドを対応する５°−［α、β−メチレン ］三燗酸誘導体と入れ替えることである。しかしデオキシヌクレオシドニ燐酸ま た１１デオキシヌクレオシド−燐酸のようなその他の鎖伸長阻害因子もまた、用 ｔ１てもよい。これらの誘導体は伸長しつつあるポリヌクレオチド鎖１こ取り込 まれることができないため、それらを除去する必要はない。したがって、スキム ２で１１スキムｌでの最後のエキソヌクレアーゼ処理工程及びその後の洗浄工程 ｂｔ完全（ニなくフェンシングされる： ｌ）　フォスフォロチオエートチオキ７ｙＬクレオチドを含むキャッププライマ ーを鋳型に融合させ、鋳型／プライマー複合体を形成する：２）　標識したヌク レオチド三燐酸を鎖に取り込まれない不均一な鎖伸長阻害剤とともに加える； ３）　過剰な試薬を洗浄して除去する；４）　取り込まれた標識量を測定する： ５）　工程２から４を、鎖に取り込まれない対応する不均一な鎖伸長阻害剤の存 在下で異なる標識ヌクレオチドを加えながら、４１１１！すべての標識ヌクレオ チドが付加されるまで繰り返す； ６）　すべての標識ヌクレオチドをエキソヌクレアーゼで除去する；７）　エキ ソヌクレアーゼを洗浄して除去する；８）　工程２において反応に加えた最初の 標識チオキンヌクレオチドに対応するフォスフォ口チオエートチオキ７ヌクレオ チドを、鎖に取り込まれない不均一な鎖伸長阻害剤及び適したポリメラーゼとと もに加える；９）　過剰な試薬を洗浄して除去する；及び１Ｇ）　残りの３つの フ堵スフォロチオヱートチオキシヌクレオシド誘導体について工程８及び９を繰 り返す。 このスキムにはエキソヌクレアーゼ工程の総数を減らすという際だった長所があ る。４個すべてのｖ！Ａ識ヌジヌクレオチド続して鎖に付加され、個々に検出さ れて初めて、取り込まれたすべてのヌクレオチドを１回のエキソヌクレアーゼ消 化工程で除去する。次に、適当なフォスフｔロチオエートヌクレオシド誘導体に ついて連続して追跡反応を実施する。 スキム４ 発明の４番目に好ましい局面において、ＤＮＡ断片は以下のスキムに従ってソー フェンシングされる： ｌ）　手中ツブプライマーを鋳型に融合させて、鋳型／プライマー複合体を形成 する； ２）　蛍光ヌクレオシド三燐酸を、鎖に取り込まれない３つの不均一な鎖伸長阻 害剤及び適したポリメラーゼとともに加える；３）　過剰な試薬を洗浄して除去 する；４）　取り込まれた標識量を測定する；５）　３個の翼なるヌクレオシド 三燐酸をすべて用いて、鎖に取り込まれないそれぞれの不均一な鎖伸長阻害剤の 存在下で、それぞれについて蛍光標識を用いて工程２から４を繰り返す； ６）　蛍光標識をレーザーで漂白、または適した化学反応によって破壊するか、 または蛍光標識を化学開裂工程によって除去する。 このスキムは、取り込まれた標識のエキソヌクレアーゼ反応による酵素的除去を 必要としない、またフォスフォロチオエートヌクレオチド銹導体による追跡反応 も必要としないという長所がある。そのかわりに、取り込まれたすべてのフルオ ロフォアを、レーザー漂白技術または色素を破壊またはヌクレオチドから色素を 開裂させる適当な化学反応のいずれかを用いて、化学的に破壊する。 用いた検出器で取り込まれた標識量の定量的測定が可能ならば、漂白または開裂 工程は、それぞれの連続付加後よりはむしろ時間毎に実施する必要があるのみで あることが好ましい。 スキム５ 発明の５番目に好ましい局面によれば、ＤＮＡ断片は以下のスキムに従って７− クエン／フグされる： ｌ）　キャッププライマーを鋳型と融合させる；２）　蛍光色素基をチオ牛ンリ ボースの糖の３°部分のリンカ−アームを通じて結合させて標識したヌクレオシ ド三燐酸を加える；３）　過剰な試薬を洗浄して除去する：４）　取り込まれた 標識量を測定する；５）　蛍光色素基を酵素的に開裂させて除去する；及び６） 　過剰な試薬を洗浄して除去する。 スキム５では、標識ヌクレオチドの非特異的な付加は３゛修飾によって妨害され ているため、３１ｍヌクレオチドは鎖終了剤として有効に作用する。次に鎖伸長 の継続を可能にするために必要なことは、３°保護基を除去するだけである。 発明のさらに別の局面において、以下の少なくとも３個から成るシークエンシン グキアトが規定される： １）　ＤＮＡ鋳型を固体マトリクスに結合させるリンカ−１このリンカ−はその ３゛末端にチオキシヌクレオシドフォスフォロチオエート基を持つプライマーか ら成る： １ｉ）　鎖伸長阻害剤； 目ｉ）蛍光Ｉｌ識ヌクレオシド三燐酸；ｉｖ）　チオキ７ヌクレオシドフォスフ ォロチオエート三燐酸；ｖ）　５°−〉３°ＤＮＡポリメラーゼ８ｖｉ）　３° −〉５゛工牛ソヌクレアーゼ。 さらに、そのようなキットは、リンカ−を固体支持体にカフプリングさせるため にビオチン化プライマーまたはリンカ−及びビオチン／ストレプトアビジン試薬 とともに、反応を実行するための固体支持体を含んでもよい。３−５°エキンヌ クレアーゼはエキソヌクレアーゼ■であってもよい。さらに、３°−デオキシリ ボース保護標識ヌクレオチドのような代わりの鎖伸長阻害剤を含めてもよい。キ ットは１−ｉｖの成分のすべてで構成されることが好ましい。 発明はまた、基本的に発明に従った方法の工程を実施することによって、核酸の 配列決定が可能な自動シークエンノング器を含む。 器械は、鋳型を有する固体支持体を必要なすべての試薬及び洗浄溶液の中または 外に移動させるために、または固体支持体の上に連続して試薬及び洗浄溶液を汲 み上げるためのいずれかのために採用される。最初の手順ではビン配列型の支持 体が適しているが、ガラスプレート及びシークエンシングチツブは２番目の手順 により遺している。 各試薬の付加の間には、試薬の残存を最少にするためにいくつかの洗浄工程があ る。 チップ配列の場合には、検出器の上の列の位置に相対的な標識量を記録する固定 検出器の上にチップの列を通すことによって、標識の存在量を定量してもよい。 固定ガラスプレートまたはシークエンシングチツブ列の場合には、列の上に位置 する固定検出器によって放射活性または蛍光画像を得てもよい。もしくはガラス プレートまたはノークエンノングチブブの列及び／または検出器が移動可能であ ってもよい。二次元画像が検出器から得られ、コンピューターが分析する。 もしくは、蛍光標識とともに用いる場合には、データをデータ処理器に送るため に、ン−クエン７ングチフブまたは一連のビンの中のビンに直接連結した光ファ イバーを用いてもよい。 発明は現在、記述中であり、図示のみの目的のために以下の図を参照する：図１ は、ｄｌｌＴＰ−１２−フルオレセインを用いて、放出された蛍光と取り込まれ たヌクレオチド数との関係を示すグラフである；及び図２は、ｄＣＰＴ−１２− フルオレセインを用いた場合を除く図１である。 餞 例ｌ ＤＮＡ鋳型／プライマー複合体の調製 鋳型の産生及び固体　特休への１合 この例では、既知の方法（Ｔ、ｌｌｕｌｔｍａｎ　ｅｔ　ｓｌ、　Ｎｕｅｌｅｌ ｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｉ７゜（１９８９）、４９３７−４９４６　ＨＤ、 Ｓ、Ｃ，Ｊｏｎｅｉ　ａｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　ｉ　（１ ９９１）　、２V９− ２８３）から得られた固定−重鎮ＰＣＲ産物を用いた。簡潔に述べると、鋳型は ビオチン化プライマー１個及び正常なプライマー１個を用いるポリメラーゼ鎖反 応（ＰＣＲ）によって産生され、続いて産物をストレプトアビジンコーティング 磁石ビーズに結合させた。固定二重鎖ＰＣＲ産物をアルカリで処理することによ って、非固定鎖が除去される。すべての工程は以下のように実施した：ＰＣＲは ０．５１の試験管を用いて５０μｌで行った。これに次のものを加えた：３０μ ｌの水、ｌ０ＸＰＣＲバ、１７７−（シータス）を５　ｐ　＋、　２．５ｗ＋Ｍ 　ｄｌｌＴＰ’　Ｓを５μｍ、５゛−ビオＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３ °の配列を有する５゛−ビオチン化一般用後退プライマー１０川を２５μｍ、５ °ＧＴ＾＾＾ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３′の配列を有する（−２０）一般用前 進プライマーｌＯμＭを２．５μｌ、ブルースクリプトＩｓプラスミドＤＮＡ１ ｎｇ／μｌを１μｍ、天然のタフポリメラーゼ（シータス）を０．５μｌ（２， ５単位）。軽鉱油を重ねた後、以下のサイクルを行りた：９５℃９０秒、　【９ ５℃３０秒、ｓｓ”ｃａｏ秒、７２℃６０秒］ｘ３５．７２℃１８０秒。すべて のサイクルは、テクネＰＢＣ−１またはＰＩＩＣ−２について可能な最大の加熱 速度及び冷却速度を用いて行つた。 およそ２ＳＤｂｐの長さのビオチン化ＰＣＲＩＩＥ物のストレプトアビジンコー ティング磁石ビーズ（ダイナル）への結合は、鉱物油の下で１００μｌのビーズ を室温で５分間インキュベートすると得られる。強い磁石を用いて磁石を沈澱さ せ、鉱物油を含む上清を除去する。ビーズを１００μｍの水て洗浄して、未使用 のヌクレオチド、プライマー及びバフファーの残存物を除去する。非ビオチン化 ＤＮＡ鎖は、５０ｕ１のＯ，ＩＳＭ　Ｎａ０ＩＩで５分間インキュベートして除 去する。ビーズを沈澱させ上清を除去し、さらに５０μｍのＯＩＳＭ　ＮａＯＲ で処理し、１００μｍの水で３回洗浄する。最後にビーズを１０μｍの水に再懸 濁した。 ンークエンシングプライフ−の　−ＤＮＡ　型へのアニー酵ング固定−重鎖ＤＮ Ａ鋳型（およそ２ｐ■ｏｆ）とともに１０μｌの再懸濁したビーズ１こ、５ｘセ クエナーゼアニーリング／イ’ｙフｙ−４μｍ（２ＧＧｍＭ）リス塩酸ｐｌ＋　 ７．Ｓ　１００＋＊ＭＭｇＣ１＋、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ＵＳＢ）、及び配列 ５°＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’を持−）Ｔ７プライマー４μｍ（ ４２−０１）を加える。混合液を６５℃で３分間加熱し、氷上で冷却する。 鋳！！２／プライマー複合体はこれでシーフェンシング準備力ｆ整った。以下の 図１１その構造の一部を示す： 複合体ｌ：　ポリマー−ストレプトアビジン−ビオチン−５°−ＤＮＡ−ｃ−ｃ −＾−＾−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−＾−Ｇ−７−［１−Ａ− Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−＾−Ｔ−７−−|−−−−３’ ３−Ｇ−＾−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｃ−＾−■−＾−＾− −−−−−−Ｓ。 チオヌクレオチドによるプライマーのキャッピング１８μｍのアニーリング混合 液に＋００μＭ　ｄ、ＧＴＰＳｄ、ＣＴＰ、　ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰを１０ μ１１及び希釈セクエナーゼ２．０（ｔｌｓＢ）を４μ＋（５単位）加え、混合 液を室温で２分間インキュベートする。相補鎖に従って、これは以下の５つのヌ クレオチドをプライマーに連続して付加する：　ｄ、Ｇ、　ｄ、Ｇ、　ｄ、Ｃ， ｄ、Ｇ、及びｓｓ＾。磁石を用ｔ１てビーズを沈澱させ、上清を除去した。次に ビーズを５０μｍの水で２回洗浄した。 キャッププライマーからのジデオキシヌクレオチドの５、去ヒ゛−ズにエキソヌ クレアーゼの５０曽Ｍトリス塙酸ｐＨ７，５，５謹Ｍ　ＮａＣｌ、、５ｍＭＤＴ Ｔ溶液を１０μｍ（２０川位）加え、混合液を３７”Ｃで２分間インキュベート した。ヒ゛−ズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌ の水で３回洗浄した。この工程により、プライマーの３°末端からジチオキ／Ａ −ヌクレオチドカ（除去された。 単標識ヌクレオチドの連続付加による／−クエンンノグ：９工程力）ら成る第一 完全サイクル エ、ＬＩＬ区立 ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を１３μｌの水に再懸濁した。次のも のを加えた＝５×セクエナーゼバフファーを５μ１１比活性４００Ｃｉ／ｍｏｌ のα−Ｉ″ＰｄＡＴＰｌｏμＣ１，４μＭのコールドｄＡＴＰ、　１００μＭ　 ｄｄＣＴＰ、１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１００μ關混合液を３７”Ｃで２分間イ ンキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、 ５０μｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従って、２個 の＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシニーヌクレオチドがキャッププライマ ーの３゛末端に付加された。 ｌ１土 標識をハンドカウンターで計数する。 工１１及旦立 エキソヌクレアーゼ■の５０ｍＭ　）リス塩酸ｐｉｆフ、５．５■Ｍ　ＭｇＣ１ ，，５８Ｍ　ＤＴＴ溶液を１０μ１（２０川位）加えて、！？”Ｃで２分間混合 液をインキュベートしてジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去し た。磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍの水 で３回洗浄した。標識の除去は、ハンドカウンターで混合液を測定してチェック した。 工程７及び８ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｌの水に再懸濁させた。次の ものを加えた：５×セクエナーゼバッファー５μ＋、１００μＭ　ｄ、＾ＴＰ％ １００μ賛ｄｄＧＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＣＴＰ を含むヌクレオチド混合液ｌＯμｍ、及び希釈したセクエナーゼ２０を４ＩＩ０ 混合液を３７℃で２分間インキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上演を除 去して反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程におい て、２個のチオール化＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシニーヌクレオチド がシークエンジングプライマーに付加された。 １災１入延胆 前述の二手ンヌクレアーゼ■溶液１０μＩ（２ｏ単位）を、ジデオキシヌクレオ チドに加えて、３７℃で２分間混合液をインキュベートして除去した。磁石でビ ーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３回洗浄し た。 単一のヌクレオチドの連続付加によるシークエンノング＝９工程の第２完全サイ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体ｌ）を１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた＝５×セクエナーゼバフファー５μｍ、比活性４００Ｃｉ／園ｍｏｌ のα−１ａｐｄＴＴＰＩＯｕ　Ｃｉ、　４　μＭのコールドｄＴＴＰ、　１００ μｌｉ　ｄｄＧＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＡＴＰ、　１００μＭ　ｄｄｅsＰ を含むヌクレオチド混合液ｌＯμ！、及び希釈したセクエナーゼ２．０４μ１０ 混合液を３７℃で２分間インキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除 去して反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程におい て、相補鎖に従って、２個のＴ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＣ−ヌクレ オチドがキャッププライマーの３゛末端に付加された。 Ｌ１土 標識をハンドカウンターで計数する。 工扱１及亙見 前述のエキソヌクレアーゼ■の５０■關トリス塩酸溶液を１０μ１（２０単位） 加えて、３７”Ｃで２分間混合液をインキユベートしてジデオキシヌクレオチド 及び標識ヌクレオチドを除去した。磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反 応を停止した後、５０μｍの水で３回洗浄した。標識の除去は、ハンドカウンタ ーで混合液を測定してチェックした。 Ｌ１１及グエ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｍの水に再懸濁させた。次の ものを加えた＝５×セクエナーゼバブファー５μｍ、１００μＭ　ｄ、ＴＴＰ、 　１００μ關ｄｄＧＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＡＴＰ、　１００μＭ　ｄｄｅＴ Ｐを含むヌクレオチド混合液１０μｌ、及び希釈したセクエナーゼ２．０４μｍ ０混合液を３７℃で２分間インキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上演を 除去して反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程にお いて、２個のチオール化Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＣ−ヌクレオチ ドがンークエンシングプライマーに付加された。 Ｉ　ＩＭ　９又延胆 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液の１０ｕｌ　（２０単位）を加え、混合液を３ ７”Ｃで２分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。ビーズ を磁石で沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５Ｏｔ１１の水でさらに ３回洗浄した。 例２ この実験は例１に記述したすべての反応が分解産物とともに正しく伸長したこと を確認するために実施された。これを証明するために、ＩＩ　ｐ　４３１１９プ ライマーをコールドのヌクレオチドと併せ用いて、例１に記述した実験を繰り返 した。以下の修正を行った： １　アニーリング工程では配列５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３°を 持っＳ−”Ｐ標識シークエンノングプライマーを４ｐ■ｏ１用いた；２　第一サ イクルの工程２では、標識化合物α−”　Ｐ−ｄＡＴＰがヌクレオチド混合液か ら脱落しており、またコールドｄＡＴＰの濃度を１００μ誠に増加した；３　第 二サイクルの工程２において、標識化合物α−”　”　Ｐ−ｄＴＴＰがヌクレオ チド混合液から脱落しており、またコールドｄＴＴＰの濃度をＩＧＯｇＭに増加 した：４　両サイクルにおける工程４は不必要であった；５、各酵素反応及びそ れに続く洗浄の後、ビーズの１／１００置を採り、別々のｏ、５１試験管に入れ た。 例１に記述したすべての工程を実施した後、９０％ホルムアミド色素混合液の５ μｌを個々のビーズアリフットのすべてに加えた。混合液を９５℃で３分間加熱 し、＋３．０００ｇで５秒間遠心して氷上で冷却した。各サンプルの少量（ｌμ りを、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドの個々のウェルに加え、）００ ヂルトで３から４時間電気泳動した。電気泳動後、上部のガラスプレートを除去 し、ＸｖＡフィルムにおよそ２から４時間露出した。得られたバンドパターンは 、すべてのプライマーの伸長及び分解産物の予測された長さと完全に一致した。 例３ 固定ＤＮＡ鋳盟鋳型ライマー複合体２のＩｌ製鋳型　プライマー複合体の　体　 体へのアニーリング及び１合この例において、ビオチン化ンークエンシングプラ イマーをまず一重鎖Ｍ１３鋳型の相補領域にアニーリングし、複合体はその後プ ライマーの５゛ビオチン分を通して固体支持体（ストレプトアビジンビーズ）に 結合させた。Ｍ１３謳ｐ１ｇＤＮＡの２１１　ｇ　（１ｐｗ＋ｏｌ）を配列５° Ｇτ＾＾＾＾Ｃ０ＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’を持ツＳ’ビオチン化（−２０）　一 般前進プライマーの２μｍｏ１に、４０ｍＭ）リス塩酸ｐｌ＋７．５．２０ｓｌ ｌｌ　ＭｇＣｌ”、５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液の全量１０μｍに結合させた。混合 液を６５℃で３分間加熱し、１０分間かけて室温までゆっくりと冷却した。３０ μ凰のストレプトアビジンコーティング磁石ビーズ（ダイナル）を加え、混合液 を室温で５分間イノキュベートした。ビーズを沈澱させ、上演を除去し、ビーズ を１０μｍの水に再懸濁した。 チオヌクレオチドによるプライマーのキャッピング１８μ！のアニーリング混合 液に１００μＭ　ｄ’ＧＴＰ、　ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰ、　ｄｄＣＴＰを１ ０μ１１及び希釈セクエナーゼ２．０　（ＵＳＢ）を４μ＋（５単位）加え、混 合液を室温で２分間インキュベートする。相補鎖に従って、これは以下の２つの ヌクレオチドをプライマーに連続的に付加する：　ｄ、ｆｌｉ及びｄｄＡ、磁石 を用いてビーズを沈澱させ上清を除去した。次にビーズを５０μｌの水で２回洗 浄した。 キャッププライマーからのジデオキシヌクレオチドの除去ビーズにエキソヌクレ アーゼのＳＯ閤１１リス塩酸ｐＨ７、ｓ、５　ｍＭ　ＭｇＣＬ、５　ｍＭＤＴＴ 溶液ＩＯμ１（２０単位）を加え、混合液を３７”Ｃで２分間インキュベートし た。磁石でビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０μｍの水 で３回洗浄した。この工程によりプライマーの３°末端からジデオキシＣ−ヌク レオチドが除去された。 １１１識ヌクレオチドの連続付加によるンークエンシング：９工程の最初の完全 な工区ｌ及旦立 ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体ｌ）を１３μｌの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５Ｘセクエナーゼバッファー５μｍ、比活性４００Ｃ１−■Ｏ１の １０μＣｉのα−”　Ｐ　ｄＡＴＰ、４μ輩のコールドｄＡＴＰ、１１００ｔＩ 　ｄｄＧＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１００μＭｄｄＣＴＰを含むヌクレ オチド混合液１０μｌ、及び希釈セクエナーゼ２゜０４μ１０混合液を３７℃で ２分インキュベートして、ビーズを磁石で沈澱させて上演を除去して反応を停止 した後、５０μｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従っ て２個の＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＣ−ヌクレオチドがキャッププ ライマーの３“末端に付加された。 五五土 標識をハンドカウンターで計数する。 二１１及旦見 エキソヌクレアーゼ■の５０ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７、ｓ、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ ＋、５８Ｍ　ＤＴＴ溶液を１０μ１（２０単位）加え、３７℃で２分間インキュ ベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した。磁石で ビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍの水で３回洗浄 した。標識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェックした。 工程７及び８ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｌの水に再懸濁した。以下の 項目を加えた＝５×セクエナーゼバフファー５μ１．　ｔｏｏμＭｄ、＾ＴＰ、 １００μＭｄｄＧＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＣＴＰ を含む１０μｌのヌクレオチド混合液、及び希釈セクエナーセ２．ｏを４μｍ。 混合液を３７℃で２分インキュベートして、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除 去して反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程におい て、２個の＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＣ−ヌクレオチドがシーフェ ンシングプライマーに付加された。 Ｌ１１入瑳烈 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液１０μｍ（２０単位）を加え、混合液を３７℃ で２分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビー ズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後ＳＯμｌの水で３回洗浄した。 単一のヌクレオチドの連続付加によるシーフェンシング：９工程の第２完全サイ クル ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を１３μｌの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５Ｘセクエナーゼバフファー５μｌ、比活性４００Ｃｉ／ｍ■ｏｌ の１０μＣＩのα−”ＰｄＴＴＰ、４　μＭのコールドｄＴＴＰ、　１１００ｕ 　ｄｄＧＴＰ、　１００ｇＭ　ｄｄＡＴＰ、１（１０μＭｄｄＣＴＰを含む１０ ｕ１のヌクレオチド混合液、及び希釈セクエナーゼ２．０４μ１０混合液を３７ ”Ｃで２分インキュベートして、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応 を停止した後、ＳＯμｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖 に従って２個のＴ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＣ−ヌクレオチドがキヤ 、ププライマーの３゛末端に付加された。 二援工 標識をハンドカウンターで計数する。 五１１及旦且 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液１０μｍ（２Ｇ単位）を加え、混合液を３１℃ で２分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを 除去した。磁石でビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０μ ｌの水で３回洗浄した。標識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェ ックした。 盃Ｗ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５×セクエナーゼバｙ７ｙ−５μｌ、１００μＭ　ｄ、ＴＴＰ、　 １００μＭ　ｄｄＧＴＰ。 １００μＭ　ｄｄＡＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＣＴＰを含む１０ｕｌのヌクレオ チド混合液、及び希釈セクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７℃で２分イン キュベートして、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、 ５０μｌの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、２個のチオール化トヌクレオチド及び１個のジテオキシＣ− ヌクレオチドがノーフェンシングブライマーに付加された。 ｍ叉止■ 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液１ｏｔＩｌ（２Ｇ単位）を加え、混合液を３７ ”Ｃで２分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石で ビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０μｍの水で３回洗浄 した。 例４ ＤＮＡ鋳型／プライマー複合体２の調製鋳型のＩｉ＆？、　＃型の固体支持体へ の結合、及びシーフェンシングプライマーの７−Ｌ−リングは、７二−リングエ 程において、配列”　Ｐ−５’ＡＡ丁ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’を持つ 放射標識Ｔ７プライマー４μｌ　（４ｐｍｏｌ）を用いることを除いては、例１ で記述したように実施した。 型　プライマー複合　２： ポリマー−ストレプトアビジン−ビオチン−Ｓ’　−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−丁− Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ− Ａ−Ｔ−Ｔ−−−−−−R゜ ３°−Ｇ−Ａ−Ｔ−＾−Ｔ−Ｃ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｇ−Ｃ−＾−■−＾−＾ −＠Ｉｐ−ｓ。 チオヌクレオチドによるプライマーの牛ヤブビング１８μｍのアニーリング混合 液に、１００μＭ　ｄ、［ｉＴＰ、　ｄｄＡＴＰＳｄｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰ をＩＯｕ１１及び希釈したセクエナーゼ２．０　（ＩＩＳＢ）を４μｍ（６単位 ）加え、室温で２分間混合液をインキコベートする。相補鎖に従って、これによ って以下の３個のヌクレオチド、ｄ、Ｃ，ｄ、Ｇ、　ｄｄｅがプライマーに連続 して付加される。次にビーズを５０μｌの水で２回洗浄した。 キャッププライマーからのジデオキシヌクレオチドの　去ビーズにエキソヌクレ アーゼのＳＧＩＭ　トリス塩酸ｐ１７．ｓ、５ｍＭＭ区Ｃ１ｌ、５■關ＤＴＴ溶 液を１０μ１（２０単位）加えて、混合液を３７”Ｃで２分間インキュベートし た。 磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３ 回洗浄する。この工程によりプライマーの３°末端からジテオキシＣ−ヌクレオ チドが除去された。 第一ンークエノンングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ２）を１３μｌの水に再懸濁した。次のものを加えた：５×セクエナーゼバブフ ァー５μ１１１０μＭ　ｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＧＴＦ。 １１００ｕ　ｄｄＡＴＰ、１００７７　Ｍ　ｄｄＴＴＰを含むヌクレオチド混合 液を１０μｍ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７℃で２ 分インキュベートし、磁石てビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した 後、５０μ夏の水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従って、 １個のＣ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＧ−ヌクレオチドがキャッププラ イマーの３°末端に付加された。 １投土 ［１がプライマーに位置するため、この工程は省略する。 Ｉ［５且旦立 エキソヌクレア−ゼｍの５０８Ｍ　）リス塩酸ｐＨフＳ　ｍＭ　ＭｇＣｌ＊、５ 　ｍＭ　ＤＴＴｆａ液を１０μｍ（２０単位）加え、混合液を３７℃で２分間イ ンキュベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識したヌクレオチドを除去し た。磁石でビーズを沈澱させて反応を止めて上演を除去した後、５Ｑｕｌの水で ３回洗浄した。ｙＡ識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェックし た。 二艮工及旦ニ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μＩの水に再懸濁した。次のも のを加えた＝５×セクエナーゼバフフ１−５μｍ、１００μＭ　ｄ、ＣＴＰ、　 １００μＭ　ｄｄＧ丁Ｐ１１００μＭ　ｄｄＡＴＰ、１００μＭ　ｄｄＴＴＰを 含むヌクレオチド混合液１０μｍ及び希釈したセクエナーセ２．０を４８ｍ０混 合液を３７℃で２分インキユベートシ、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去し て反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、１個のチオール化Ｃ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＧ −ヌクレオチドがシーフェンシングプライマーに付加された。 ｉ入延胆 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液のｌＯμ！（２０単位）を加えて３７℃で２分 間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビーズを沈 澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３回洗浄した。 第二ンークエンシングサイクル（９）工程スキム１ １５」」（Ｌｌ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体２）を１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５×セクエナーゼバッファー５μｌ、　１００μＭ　ｄＧＴＰ、　 １００μＭ　ｄｄＡＴＰ。 １００μＭ　ｄｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合液 １０μｍ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７℃で２分イ ンキュベートし、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、 ５０μｍの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、相補鎖に従って、１個のＧ−ヌクレオチド及び１個のジチオ キシ＾−ヌクレオチドがキャッププライマーの３°末端に付加された。 五里土 ４１識がプライマー上に位置するため、この工程は省略する。 二１１及旦互 エキソヌクレアーゼ■の５０ｍＭ　トリス塩酸ｐｌ＋　７．５５６Ｍ　ＭｇＣＬ 、　５　ｓＭ　ＤＴＴｉＩＩ液を１０μｍ（２０単位）加え、混合液を３７”Ｃ で２分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識したヌクレオチ ドを除去した。磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５ ０μｍの水で３回洗浄した。ｌｊｌ識の除去はハンドカウンターで混合液を測定 してチェックした。 １里ユｊ１］− プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた＝５×セクエナーゼバフ７　ｙ　−５μｌ、ｔｏｏμＭｄ、ＧＴＰ％ ｔｏｏμＭｄｄＡＴＰ。 ＋００μＭ　ｄｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合液 をｌＯμｌ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７’Ｃで２ 分インキュベートし、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した 後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程において、１個のチオール化 Ｇ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシルーヌクレオチドが７−クニンシングプ ライマーに付加された。 工１１叉区旦 前述のエキソヌクレアーゼ■溶液の１０μ！（２０単位）を加えて３７”Ｃで２ 分間インキ、ベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビーズを 沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５ｏｕｌの水で３回洗浄した。 第３７−クニンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ２）を１３μｍの水に再懸濁した。次のものを加えた：５×セクエナーゼバ１フ ｙ−５　ｇＬ　ＩＱＯμＭ　ｄ＾τＰ、　ｔｏｏｇ　Ｍ　ｄｄＧＴＰ、１００μ Ｍ　ｄｄＴＴＰ、　１００μＭ　ｄｄｃＴＰを含むヌクレオチド混合液をＩＯｕ 　Ｉ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ０混合液を３７℃で２分インキ ュベートシ、磁石でビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０ μｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従って、２個の＾ −ヌクレオチド及び１ｍのジチオキシＴ−ヌクレオチドがキャッププライマーの ３°末端に付加された。 二里土 標識がプライマー上に位置するため、この工程は省略する。 盈１旦及旦互 エキソヌクレアーゼ■のＳＯＩＩＭ　トリス塩酸ｐＨ７，５５ｗＭ　ＭｇＣＬ、 ５飄Ｍ　ＤＴＴｍ液を１０μ＋（２０単位）加え、混合液を３７℃で２分間イン キュベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識したヌクレオチドを除去した 。磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍの水で ３回洗浄した。標識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェックした 。 １１７叉旦盈 プライマーをキヤツジするために、ビーズを１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた・５×セクエナーゼバッファ−５μｍ、　１００μＭ　ｄ、ＡＴＰ、 　１００μＭ　ｄｄＧＴＰ。 ＋００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１００μＭ　ｄｄｅＴＦを含むヌクレオチド混合液１ ０μｌ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７℃で２分イン キユベートシ、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５ ０μｌの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、１個のチオール化＾−ヌクレオチド及び１個のジチオキ７丁 −ヌクレオチドがンークエンノングプライマーに付加された。 ＸＪＬＬ叉嵐旦 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液の１０μＩ（２０単位）を加えて３７”Ｃで２ 分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビーズを 沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３回洗浄した。 第４ノ−クエンノングサイクル（９工程）スキムｌ 工５」」ＩＬｌ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体２）を１３μｌの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５Ｘセクエナーゼバフファーを５μ１１１０μＭ　ｄＴＴＰ、１０ ０ｔｔ　Ｍ　ｄｄＣＴＰ。 １００μＭ　ｄｄＡＴＰ％１００μＭ　ｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合液１ ０μｌ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を４μｍ。混合液を３７℃で２分イン キュベートし、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５ ０μｌの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、相補鎖に従って、２個のＴ−ヌクレオチド及び１個のジチオ キ７Ｇ−ヌクレオチドがキヤツジプライマーの３°末端に付加された。 工１」− Ｉｎがプライマー上に位置するため、この工程は省略する。 二１Ｌ＾旦且 エキソヌクレアーゼｍの５０ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７，５５ｓＭ　ＭｇＣ１，、 Ｓ　ｍＭ　ＤＴＴｆａ液を１０μｍ（２０単位）加え、混合液を３７”Ｃで２分 間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチド及び標識したヌクレオチドを除 去した。磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍ の水で３回洗浄した。標識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェッ クした。 １ｉ叉旦ｌ プライマーをキャップするために、ビーズを１３μｍの水に再懸濁した。次のも のを加えた：５×セクエナーゼバフファー５μ＋、　１００μＭ　ｄ、ＴＴＰ、 　＋００μＭ　ｄｄＣＴＰ。 １００μＭ　ｄｄＡＴＰ、１００μＭ　ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合液１ ０μｍ、及び希釈したセクエナーゼ２０を４μｍ。混合液を３７”Ｃで２分イン キュベートし、磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５ ０μｍの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、１個のチオール化Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジチオキシＧ −ヌクレオチドがシーフェンシングプライマーに付加された。 工程９及びｌＯ 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液の１０μｍ（２０単位）を加えて３７℃で２分 間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビーズを沈 澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍの水で３回洗浄した。 例５ ４個すべてのデオキシヌクレオチドに取り付ける一つのタグとして、フルオレセ インを用いた。特に、我々は以下のフルオレセイン標識デオキシヌクレオチド三 燐酸を用いた：フルオレセインー１２−ｄＵＤＰ、　フルオレセイン−１５−ｄ ＡＴＰ、フルオレ４ｘ　イｙ−１５−ｄＣＴＰ、　７　ｋオレセイ：／−１５− ｄｌＴＰ。 鋳型の産生 モデル鋳型として、我々はブルースクリプト■【Ｓの多クローニング部位に由来 した２個の一重鎖ＰＣＲＩＩ物を用いた。ピオチン化Ｍ１３　（−２１）前進プ ライマー及び非ビオチン化Ｍ１３逆進プライマーを用いたブルースクリプトＩＩ 　ＩｓベクターＤＮＡの増幅によって、例１に記述したように、ピオチン部分を 通じてストレプトアビノンコーティングビーズに固定されたｐｃａｔｉ物が得ら れた。ビーズを０．１５１１　Ｎａ０Ｉ＋で５分間インキュベートして非ビオチ ン化＜＋＞　ｔａを除去し、Ｏ，ｌＳＭ　ｌ１ａＯ１で１回及び水で３回洗浄し た。ブルースフリブ）ＩＩＫＳベクターの多クローニング部位の（−）鎖で構成 される鋳型をＰＣＲ鋳型ｌと名付けた。ビオチン化Ｍ１３逆進プライマーを用い たブルースクリプト■ｘＳベクターの増幅によって、例１に記述したように、ピ オチン部分を通じてストレプトアビジンコーティングビーズに固定されたＰＣＲ 産物が得られた。ビーズをＯ，ＩＳＭ　ｌｌ１ｏ［Ｉと５分間インキュベートし て非ビオチン化（−）鎖を除去した後、Ｏ，ＩＳＭ　ＮａＯＨで１回及び水で３ 回洗浄した。この鋳型はブルースクリプトｕｇｓベクターの多クローニング部位 の（＋）鎖で構成され、ＰＣＲ鋳型２と名付けられた。 ５°−ＴＡＭＲＡ標議特異的オリゴヌクレオチドブライマーの合成各賞光標識ヌ クレオチドについて、ＰＣＲ鋳型ｌ及び２のブルースクリプト配列を用いて、４ 個の異なるプライマーをデザインした。プライマーは、同じ種類の１．２．３． ４または５つのヌクレオチドの取り込みを可能にする単一のヌクレオチドの流れ の前に位置した。 フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰの取り込みに　して、以下のプライマーを合成 した二取り込まれた 名称　配列　蛍光１クレｆｆ）’の数　ｊｆし瀘ｆドの混合　鋳型Ａ　Ｓ’−Ｔ ＡＭＲＡ−＾ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣ，Ｉ　ｄＵＴＰ−Ｆ＋ｄ ｄＣＴＰ　１に　５−ＴＡＭＲＡ−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＾丁＾ＧＧＧＣＧ＾　２ 　ｑＡＴＰ、ｄＬＩＴＰ−Ｆ、ｄｄＧＴＰ　ＩＧ　Ｓ’−ＴＡＭＲＡ−ＧＧＴＡ ＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣ３ｄＣＴＰ、ｄｔｌＴＰ−Ｆ％ｄｄＡＴＰ　Ｉ Ｌ　Ｓ’−ＴＡＭＲＡ−ＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧ　４　ｄｃＴＰ＋ ｄＬＩＴＰ−Ｆ％ｄｄＧＴＰ　１フルオレセイン−Ｉｓ−ｄＣＴＰの取　みに　 して、ｐ下のプライマーを合　した：取り込まれた 名称　配列　蛍光１５しｊｆ）’の数　Ｎしｆｆ）’の混合　鋳型Ｇ５°ＴＡＭ Ｒ＾−ＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣ１ｄＴＴＰ＋ｄＣＴＰ、　Ｆ、 　ｄｄＡＴＰ　１＾　Ｓ’　ＴＡＭＲＡ−＾ＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧ ＡＧＣ２ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ−Ｆ、　ｄｄＡＴＰ　ＩＣＳ’ＴＡＭＲＡ−ＴＡ ＣＧＣＣ＾＾ＧＣＧＣＧＣ＾＾ＴＴ　３　ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ−Ｆ＋ｄｄＴＴＰ 　２Ｄ　Ｓ’ＴＡＭＲ＾−ＣＧＣＴＣＴＡＧ＾＾ＣＴＡＧＴＧＧ＾　５　ｄＴＴ Ｐ＋ｄｃＴＰ、ｄｄＧＴＰ　１フルオレセイン−１５−ｄＡＴＦの取　”みに　 して、以下のプライマーを合　した：取り込まれた 名称　配列　蛍光Ｊ？しｊｆ）’の数　ｍｉｎ’の混合　鋳型Ｇ　Ｓ−ＴＡＭＲ Ａ−ＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（ｉＴＴｃｃ　１　ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ ＡＴＰ−Ｆ、１ｄＧＴＰ Ｔ３　Ｓｏ−ＴＡＭＲＡ−＾Ｔ丁＾＾ＣＣＣＴＣＡＣＴＡ＾＾Ｑ　２　ｄＧＴＰ ％　ｄＡＴＰ−ＦＳ　ｄｄＣＴＰ　２Ｅ　５−ＴＡＭＲＡ−ＧＣＧＣ＾訂ＴＡＡ ＣＣＣＴＣＡＣＴ　Ｓ　ｄＡＴＦ−Ｆ、ｄｄＧＴＰ　２Ｆ　Ｓ’−ＴＡＭＲＡ− ＾ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡ＾＾ＯＧＧ＾＾　４　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ−Ｆ、　ｄ ｄＧＴＰ　１フルオレセイン−１５−ｄｌＴＰの取り込みに関して　以下のプラ イマーを合　した：取り込まれた 名称　配列　蛍光ｊ＋しｆｆ）’の数　１９νオテドの混合　鋳型Ｂ５°−ＴＡ ＭＲ＾−ＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ１ｄｌＴＰ−Ｆ、ｄｄＣＴＰ　２ Ｔ３　Ｓｏ−ＴＡＭＲＡ−ＡＴ丁ＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴ＾＾＾Ｇ　２　ｄｌＴＰ −Ｆ、ｄｄＡＴＰ　２Ｍ　Ｓ−ＴＡＭＲＡ−ＣＧＣＧＴ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡ ＣＴＡＴ　３　ｄＡＴＰ、　ｄｌＴＰ−Ｆ、　ｄｄＣＴＰ　ＩＩＩ　Ｓ−ＴＡＭ ＲＡ−ＧＡＴＡＴＣＧ＾＾ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ−４ｄＣＴＰ−ｄｌＴＰ−Ｆ ＋ｄｄＡＴＰ　１アニーリング １６の興なるアニーリング反応において、２μｌの水、適当な一重鎖ＰＣＲ鋳型 ｌまたは２（表参照）を５μＬ５Ｘセクエナーゼバフファ−２μｍ及び１μｍ（ ０５ｐｍｏｌ）の適当なＴＡＭＲＡ標識プライマー（表参照）を−緒にして、６ ５℃で３分間加熱して水上でインキュベートした。 伸長反応 １６の異なる伸長反応において、それぞれのアニーリング混合液の６μｌに、適 当な非標識ｄＮＴＰ（ＩｌｌμＭＬ適当な蛍光標識ｄＮＴＰ（１０μＭ）、及び 適当なｄｄＮＴＰ（１０μＭ）を含むヌクレオチド混合液（表参照）を２μｍ、 及び希釈したセクエナーゼ２０を２μｌ加え、混合液を３７℃で３分間インキュ ベートした。５μｌの８０％ホルムアミドを加えて反応を止め、８０℃で３分間 加熱した後、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去した。 検出／画像処理工程（定量） 蛍光顕微鏡上につけたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０８型、Ｈａｓａｍａｔｓｕ 　ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ　ＳＡ）を用いて、各上清の１μｍを測定した。ローダミ ン色素ＴＡＭＲ＾の放出蛍光はプライマーの５゛末端に位置し、プライマーの３ °末端でのヌクレオチドの取り込みによって導入されたフルオレセイン色素を、 それぞれのサンプルについて適当なフィルターシステムを用いて測定した。８０ ％のホルムアミドの対照サンプルもまた測定した。放出された蛍光Δ夏フルオレ セイン及びΔ１０−ダミンを記録した。Δ■フルオレセインとΔｉローダミンと の比を用いてデータを正常化した。 結果は以下のように要約してもよいニ ー５個までのフルオレセイン標識ピリミジンヌクレオチド（フルオレセイン−１ ２−υ、フルオレセイン−１５−Ｃ）の取す込みニ一定量測定は放出された蛍光 と取り込まれたフルオレセイン標識ピリミジンヌクレオチドの数との間に直線関 係を示す。蛍光の消光は認められながった（図１及び２膠照）。 −Ｈａｍａｗａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓによる上述の検出／画像システムを 用いて、我々はおよそ１０１の容量の中にＣｆｉ＆　：　１５０ｎＭ）　１０’ もの分子を検出することができ、主として、ｇｅｍｘ８ｃ■の列の１０’までの 興なる鋳型の使用が可能になった。 −２個のフルオレセイン標識プリンヌクレオチド（フルオレセイン−１５−Ａ、 フルオレセイン−１５−１）。前述の検出器システムを用いて、我々はフルオレ セイン標識プリンヌクレオチドの１個ｔｉｌＩ識と２個標識との違いを測定する ことができた。 例６ ＤＮＡ鋳型鋳型／プライマー複合体調製鋳型の産生及び固体支持体への結合、シ ーフェンシングプライマーの固定−重鎖ＤＮＡＩ型へのアニーリング、チオヌク レオチドによるプライマーのキャッピング、及び牟ヤフブプライマーがらのジデ オキシヌクレオチドの除去は、例１のように実施した。 ｊｌｆ光標識ヌクレオチドの連続付加にょるンークエンシング＝９工程の第−完 工程２及び３ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を４μｍの水に再懸濁した。次のもの を加えた：５×セクエナーゼバフファー２μｍ１１０μＭのフルオレセイン−Ｉ Ｓ−ｄＡＴＰ　（ベーリンガーマンハイム）、１０ＢＭ　ｄｄＧＴＰ、　１０Ｂ Ｍ　ｄｄＴＴＦ、　１０ＢＭ　ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合液を２μ！、 及び希釈したセクエナーゼ２．０を２μｍ。混合液を３７℃で２分間インキュベ ートし、ビーズを磁石で沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０ｕ１ の水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従って、２個のフルオ レセイン−１５−＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシチーヌクレオチドがキ ャッププライマーの３°末端に付加された。 工艮土 蛍光顕微鏡上につけたＳＩＴカメラ（４００−０８型、ｌａｍｘｓａｔｇｕ　Ｐ ｈｏｔｏｎｉｃｓ　ＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 ＩＮ５及旦立 エキソヌクレアーゼ■のＳｏ＠Ｉｌｌ　トリス塩酸、ｐＨ７，５，５■Ｍ　Ｍｇ Ｃ＋＋−５ｍＭ　ＤＴＴ溶液の１０８ｍ（２０単位）を加えて、混合液を３７” Ｃで２分間インキュベートして、デオキシヌクレオチド及び蛍光標識ヌクレオチ ドを除去した。磁石でビーズを沈澱させて上滑を除去して反応を停止した後、５ ０μｌの水で３回洗浄した。 工１Ｌ及旦ニ プライマーをキャップするために、ビーズを４μｍの水に再懸濁した。次のもの を加えた：５Ｘセクエナーゼバフフｙ−２μ＋、１０ＢＭのｄ、ＡＴＰ、　ｔｏ μＭ　ｄｄＧＴ！’。 １０ＢＭ　ｄｄＴＴＰ、１０ＢＭ　ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合液２μｍ 、及び希釈したセクエナーゼ２０を２μ！０混合液を３７℃で２分間インキュベ ートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌ の水でさらに３回洗浄した。 この工程において、２個のチオール化＾−ヌクレオチド及びｉｌｌのジチオ牛シ Ｔ−ヌクレオチドがシーフェンシングプライマーに付加された。 Ｉ［９及延烈 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液のｌＯμ１（２０単位）を加えて、混合液を３ ７℃で２分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビ ーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５Ｏａｌの水で３回洗浄し た。 単一ヌクレオチドの連続付加による／−フェンシング：９工程の第２完全サイク ル スキムｌ 二重Ｕ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を４μｌの水に再懸濁した。次のもの を加えた＝５×セクエナーゼバッファー２μｍ、１０ＢＭのフルオレセイン−１ ２−ｄＵＴＰ　（ヘ−ＩＪ　ンガーマンハイム）、ｔｏμＭ　ｄｄＧＴＰ、　Ｉ ＯｌＩＭ　ｄｄＡＴＰ、　１０Ｂ　Ｍ　ｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合液２ μｍ、及び希釈したセクエナーゼ２．０を２μｍ。混合液を３７”Ｃで２分間イ ンキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、 ５０μｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖に従って、２個 のフルオレセイン標ＷｌｉＵ−ヌクレオチド及び】個のジチオ牛シＧ−ヌクレオ チドがキャッププライマーの３゛末端に付加された。 工豊土 蛍光顕微鏡上につけたＳＩＴカメラ（４００−Ｏ１ｌ型、Ｈｍａｍｉｔｓｕ　Ｐ ｈｏｔｏｎｉｃｓ　ＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 ｌ鼠ｌ及旦見 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液の１０μｍ（２０単位）を加えて、混合液を３ ７”Ｃで２分間インキュベートして、デオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチ ドを除去した。磁石でビーズを沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５ ０μｍの水で３回洗浄した。 工１１及旦ニ プライマーをキャップするために、ビーズを４μｍの水に再懸濁した。次のもの を加えｔ−：　５　ｘ　セクｘｔ−’Ｗハッ７　ｙ−２ｕ　１％１０ＢＭノｄ、 ＴＴＰ、　１０ｇＭ　ｄｄＧＴＰ。 １０８Ｍ　ｄｄＡＴＰ、１０ＢＭ　ｄｄｃＴＦを含むヌクレオチド混合液２μ！ 、及び希釈したセクエナーゼ２．０を２μ！０混合液を３７℃で２分間インキュ ベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上演を除去して反応を停止した後、５０μ ｍの水でさらに３回洗浄した。 この工程において、２１［！ｌのチオール化Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジチオ キ７Ｇ−ヌクレオチドがシーフェンシングプライマーに付加された。 二１１叉延烈 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液の１０μ＋（２０単位）を加えて、混合液を３ ７℃で２分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石でビ ーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｍの水で３回洗浄し た。 例７ ＤＮＡ鋳壓鋳型ライマー複合体１の調製鋳型の産生及び固体支持体への結合、シ ーフェンシングプライマーのり固定−重鎖ＤＮＡ鋳型へのアニーリング、チオヌ クレオチドによるプライマーのキヤ。 ヒリグ、及びキャッププライマーからのジブオキ／ヌクレオチドの除去は、例１ 同様に実施した。 単室光ｆｆ１ｍヌクレオチドの連続付加によるシーフェンシング：９工程の第一 完全ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を４μｍの水に再懸濁した。次の ものを加えた＝５×セクエナーゼバッファー２μｌ、　５００ＭＭのフルオレセ イン−１５−ｄＡＴＰ、　１．０μＭ　ｄＡＴＰ、１０Ｂ　Ｍ　ｄｄＧＴＰ、　 １０ａ　Ｍ　ｄｄＴＴＰ、　１（１μＭ　ｄｄＣＴＰを含ムヌクレオチド混合液 ２μｍ、及び希釈したセクエナーゼ２．０２μｍ。混合液を３７℃で２分間イン キュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、ｓ Ｏμｌの水でさらに３回洗浄した。この工程において、相補鎖によって指示され て、フルオレセイン−１５−＾−ヌクレオチド及び１個のジデオキシチーヌクレ オチドがキャッププライマーの３°末端に付加された。 ＸＷ土 蛍光顕微鏡上につけたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０１１盟、Ｈｍａｍａｔｓｕ 　Ｐｈｏｔｏｎｌｃｓ　ＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 二１１１嵐立 ｚ＋７％クレ７−ゼｍのｓＯｍＭ）！ＩＸ塩酸＋１１７．ｓ、５　ｍＷ　ＭｇＣ ｌ＋−５ｍＭ　ＤＴＴ溶液の２０μ＋　（２０Ｂ１位）を加えて、混合液を３７ ℃で２分間インキュベートして、ジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチ ド及び蛍光ｔｓ！識ヌクレオチドを除去した。 磁石でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３ 回洗浄した。 工程７及び８ プライマーをキャップするために、ビーズを４μｍの水に再懸濁した。次のもの をｍした：　５Ｘ＊クエｔ−ゼバ７７ｙ−２Ｈ１，１０８Ｍ＋７）ｄ、ＡＴＰ、 　１ｏｕＭ　ｄｄＧＴＰ＋１０μＭ　ｄｄＴＴＰ、　１０βＭ　ｄｄｃＴＰを含 むヌクレオチド混合液２μＪ５及び希釈したセクエナーゼ２．０を２μ＋、混合 液を３７℃で２分間イノキュベートし、ビーズを磁石で沈澱させて上清を除去し て反応を停止した後、５０μｍの水でさらに３回洗浄した。この工程において、 ２個のチオール化＾−ヌクレオチド及び１個のジチオキシＴ−ヌクレオチドが７ −クニノンングプライマーに付加された。 互ＩＬ叉乏烈 前述の工亭ンヌクレアーゼｒｒＩｍ液の１０μＩ（２０増位ンを加えて、混合液 を３７℃で２分間インキコベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁石 でビーズを沈澱させて上清を除去して反応を停止した後、５０μｌの水で３回洗 浄した。 単一ヌクレオチドの連続付加によるシークエン／フグ：９工程の第２完全サイク ル ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を水４ｄ中に再懸濁し、次のものを加 えた・５×セクエナーセハ・ツファーを２４．１５７４１フルオレセイン−１２ −ｄＵＴＰ。 １、Ｏｍ　ｄＴＴＰ、　１（ｍ　ｄｄＧＴＰ、　１０ｓ　ｄｄＡＴＰ、　１０ｓ 　ｄｄＣＴＰ、及び希釈セクエナーゼ２゜を２ｄｌ含有するヌクレオチド混合物 ２β。この混合物を３７℃で２分間インキ、ベートシ、磁石でビーズを沈殿させ て反応を停止し、上清を除いた後、　Ｓｏｄの水でさらに３回洗浄した。この工 程において、相補鎖によって指示されて、フルオレセイン標識ｕ−ヌクレオチド 、Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジチオキシＧ−ヌクレオチドがキャッププライマ ーの３゛末端に付加された。 蛍光を蛍光顕微鏡上ニラけたＳＩＴカメ５　（Ｃ２４００−０８ｆｆｉ、Ｈａｓ ａｍａｔｓｕ　ｐｈｏｔｏｎｉ−ｃｓ　ＳＡンを用いて測定した。 工１１及旦亙 前述のエキソヌクレアーゼｍ溶液１０ｄ　（２０単位）を加えて３７℃で２分間 インキコベートしてジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、５０βの水で３回洗浄 した。 工鼠り及話見 プライマーを手中１プするためにビーズを水４β中に再懸濁し、次のものを添７ Ｎ１した：５×セクエナーゼバｙ７ｙ−２Ｊ、１０＃Ｉ　ｄ、ＴＴＰｌｌｏｊｎ 　ｄｄＧＴＰ、　１０４９１　ｄｄ−ＡＴＰ、　１０＃ＩｄｄｃＴＰ、及び希釈 セクエナーゼ２．０を２謔含むヌクレオチド混合物２バ。 混合物を３７’Ｃで２分間イノキュベートし、磁石でビーズを沈殿させ上清を除 去して反応を停止し、ビーズを水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程で２個 のチオール化Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシＧ−ヌクレオチドがシーフ ェンシングプライマーに付加された。 工１Ｌ入区ｎ 前記エキソヌクレアーゼｍ溶液１０ｍ　（２０単位）を加えて３７”Ｃで２分間 混合物をインキュベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁気てビーズ を沈殿させて上清を除去して反応を止め、ビーズを水Ｓｏｄで３回洗浄した。 ＰＩＩ８ ＤＮＡ鋳型／プライマー複合体１の調製鋳型の調製、固体支持体への鋳型の結合 、及びシーフェンシングプライマーのアニーリングは例１で記載した方法で行っ た。 チオヌクレオチドによるプライマーのキャッピングアニーリング混合液１８／Ａ に１００＄　ｄ、ＣＴＰ％ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰ及びｄｄｅＴＰの１０１１ １及び希釈セクエナーゼ２０（υＳＢ）４ｍ（５単位）を加え、混合液を室温で ２分間イノキニヘートする。相補鎖によって指示されて、ｄ、Ｇ、　ｄ、Ｇ、　 ｄｄＣの３個のヌクレオチドが順次プライマーに付加される。磁石を用いてビー ズを沈殿させ、上清を除去した。次にビーズを水５０βで３回洗浄した。 牛ヤ、ブプライマーからジデオキシヌクレオチドの除ビーズにエキソヌクレアー ゼの５０１トリス塩酸溶液（ｐ）１７．５）　ＩＯＪ　（２０単位）、５　ｔ＋ 　ＭｇＣｌ＋、及び５１１　ＭＤＴＴを加え、この混合液を３７℃、２分間イノ キュベートした。磁石でビーズを沈殿させ、上演を除去して反応を停止し、水５ ０或で３回洗浄した。この工程てジチオキシＣ−ヌクレオチドがプライマーの３ ゛末端から除去された。 ｆｆ１ｌンークエンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複 合体ｌ）を水４β中に再懸濁した。これに次のものを添加した＝５×セクエナー ゼバ、ファー２β、及び１（ｍフルオレセイン−１ｓ−ｄＣＴＰ　（ベーリンガ ーマンハイム）、１０釦ｄｄＧＴＰ、　１（ｍ　ｄｄＡＴＰ、　１０剛ｄｄＴＴ Ｐを含むヌクレオチド混合物２ｄ、及び希釈セクエナーゼ２．０を２Ｊ、この混 合液を３７’Ｃで２分間イ／手コベートし、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除 いて反応を停止し、水５ｏｔｌｌでさらに３回洗浄した。この工程で、相補鎖に よって指示されて、１個のフルオレセイン標識Ｃ−ヌクレオチド及び１個のジデ オキシＧ−ヌクレオチドがキャッププライマーの３゛末端に付加された。 二艮土 蛍光顕微鏡上にとりつけたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０８梨、Ｈａｓａｍａｔ ｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｌｅｓＳ＾）を用いて蛍光を測定した。 工ＬＬ＆区立 エキソヌクレアーゼｍの５０劇ト替ス塩酸溶液（ａｌ１７．５）ｓｏβ（２０単 位）、５１Ｍ８ＣＩｊ、　５１１　ＤＴＴを添加して混合液を３７”Ｃで２分間 イノキュベートすることによってジデオキシヌクレオチド及びフルオレ七イン標 識ヌクレオチドを除去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去することによって反応を停止し、水Ｓｏｄ で３回洗浄した。 １）ｉ＋７叉延ｌ プライマーを手中ツブするために、ビーズを水４パ中ｆこ再！ＡＲした。これに 次のものを添加したコすなわち、５×セクエナーゼバフファ−２戒、１０用ｄ、 ＣＴＰ。 １０如ｄｄＧＴＰ、　ｌＯｊ＃１　ｄｄＡＴＰ、　１０陣ｄｄＴＴｐを含むヌク レオチド混合液２越、及び希釈セクエナーゼ２．０の２βを添加した。混合液を ３７℃で２分間インキコベートし、磁石でビーズを沈殿させ上演を除去して反応 を停止し、水５ｏハでさらに３回洗浄した。この工程で１個のチオール化Ｃ−ヌ クレオチド及び１個のジチオ牛シＧ−ヌクレオチドがシーフェンシングプライマ ーに付加された。 Ｉ　ＩＮ　９入区Ｕ 荊に規定したエキソヌクレアーゼｍ溶液１０ｔｉ（２０単位）を添加して３７℃ で２分間混合液をインキュベートすることによってジデオキシヌクレオチドを除 去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、次に水ＳＯＪで３回洗 浄した。 第２シークエンンングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ｌ）を水４Ｉｉ中に再懸濁した。これに次のものを添加した・すなわち、５ｘセ クエナーゼバッファ−２β、１ｏ町フルオレセイン−１５−ｄｌＴＰ　（ヘ−’ Ｊ　７ガーマンハイム）、１０ｆｆｉ　ｄｄＡＴＰ、　１０／ｆｉ　ｄｄＴＴＰ 、　１０７４１ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合液２ρ及び希釈セクエナーゼ ２．０の２４を添加した。 混合液を３７℃、２分間イノキュベートし、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除 去して反応を停止し、水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程で、相補鎖によ って指示されて、１個のフルオレセイン標ａｌｌ−ヌクレオチド及び１個のジデ オキシＡ−ヌクレオチドがキャッププライマーの３゛末端に付加された。 五１土 蛍光顕微鏡上にとすつけりＳ　Ｉ　Ｔ　カメ５　（Ｃ２４０Ｇ−０瞠、ｌ１ｉｓ ａ＋＋１ｔｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｉｃｓＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 １１５叉正且 エキソヌクレアーゼｍの５ｏｒｌトリス塩酸溶液（ｐＨ７，５）　ｌ０ｄｉ（２ ０単位）、５劉ＭｇＣｌ＋、５ｓｎＤＴ丁を添加して３７℃で２分間インキュベ ートすることによってジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した 。磁石でビーズを沈殿させ、上演を除去して反応を停止し、次いで水５ｏβで３ 回洗浄した。 工１Ｌ１話主 プライマーをキャップするためにビーズを水４絨中に再懸濁した。これに次のも のを添加した；すなわち、５×セクエナーゼバフ７１−２パ、１（ｌ渕ｄ、ＧＴ Ｐ、　１０＃＋　ｄｄＡＴＰ＋ＩＭ１　ｄｄＴＴＰ、　ｌ（ｍ　ｄｄｃＴＰを含 むヌクレオチド混合液２謔、及び希釈セクエナーゼ２．０の２Ｉｉを添加した。 混合液を３７℃で２分間イン手エベートシ、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除 去して反応を停止し、水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程で７−クニノン ングプライマーに１個のチオール化Ｇ−ヌクレオチド及び１個のジチオキシ＾− ヌクレオチドが付加された。 １１９え乏胆 上に規定した工牛ソヌクレアーゼ■溶液１０Ｊ　（２０単位）を添加して混合液 を３７°Ｃで２分間インキュベートすることによってジデオキシヌクレオチドを 除去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、水５ｏ成で３回洗浄した 。 第３シークエンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 １）を水４Ｉｉ中に再懸濁した。次のものを添加した：すなわち、５×セクエナ ーゼバフファ−２ｉ、ＩＯ閏フルオレセイン−Ｉｓ−ｄＡＴＰ、１０ｓ　ｄｄＧ ＴＰ、ｌｏ＃１　ｄｄＴＴＰ、　１０ｓ＋　ｄｄｅＴＰを含むヌクレオチド混合 液２故及び希釈セクエナーゼ２０の２７ｄｌを添加した。混合液を３７℃で２分 間インキュベートし、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、 水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程て、相補鎖によって指示されて、２（ ｌｊｌのフルオレセイン標識Ａ−ヌクレオチド及び１個のジデオキシニーヌクレ オチドがキャッププライマーの３゛末端に付加された。 Ｌ里土 蛍光顕微鏡上に取り付けたＳＩＴ力、１１５　（Ｃ２４００−０８蟹、Ｉｌａｓ ａｍａｔｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｉｃｓＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 １１５及話旦 エキソヌクレアーゼ■の１０バ（２０単位）、５０１トリス塩酸溶液（１１Ｈ７ ，５）　５１１１ＭｇＣＩ□、５　ｖ　ＤＴＴを添加し、混合液を３１Ｃで２分 間インキュベートしてジブオキ／ヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した 。磁石を加えてビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、水５ＯＪｄ！ で３回洗浄した。 Ｌ鼠り叉ｌ互 プライマーをキヤツジするため、ビーズを水４１１１に再懸濁した。これに次の ものを添加した：すなわち、５×セクエナーゼバフ７ア−２ｄ、１０Ｒｊ　ｄ、 ＡＴＰ、　１（ｍｄｄＧＴＰ、ｌｏｍ　ｄｄＴＴＰ、　１（ｍ　ｄｄｃＴＰヲ含 ムＸ　フレｔｆ　ｌ’混合ｔｌｉ２ｊｊｌ　及ヒ希ｔＲセ９　ｘカーゼ２０の２ パを添加した。混合液を３７’Ｃで２分間インキユベートシ、磁石でビーズを沈 殿させ上演を除去して反応を停止し、水５ｏ−でさらに３回洗浄した。 この工程で、シーフェンシングプライマーに２個のチオール化＾−ヌクレオチド 及びジデオキシニーヌクレオチドが付加された。 １１９人正■ 前に規定したエキソヌクレアーゼｍＩＩＦｉｆｆ１１ｏＪ　（２０単位）を加え 、３７”Ｃで２分間混合液をインキニペートしてジデオキシヌクレオチドを除去 した。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、水Ｓｏｄで３回 洗浄した。 第４シークエンシングサイクル（９工程）水４，１１９中にビーズ（固定鋳型／ プライマー複合体ｌ）を再懸濁した。これに次のものを添加した・すなわち、５ Ｘセクエナーゼバブファ−２β、１０ＩＰフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、　 １Ｇ＃１ｄｄＧＴＰ、　１０川ｄｄＡＴＰ、　１０縮ｄｄｅＴＰを含むヌクレオ チド混合ｅ２β及び希釈セクエナーゼ２．０の２βを添加した。混合液を３７℃ で２分間インキュベートし、磁石でビーズを沈殿させ、上演を除いて反応を停止 させ、水５０βでさらに３回洗浄した。この工程で、相補鎖によって指示されて 、２個のフルオレセイン標識Ｕ−ヌクレオチド及び１個のジチオキＸ／Ｇ−ヌク レオチドが手中１ブプライマーの３°末端に付加された。 盃五土 蛍光顕微鏡上に取り付けたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−Ｏ８型、ｌｌａｍａｍａ ｔｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｉｃｓＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 工鼠ｌ瓦旦互 エキソヌクレアーゼｔ［［）ｓＯｃトリス塩酸溶液（ｐｌ＋７．５）　１０ｍ　 （２０単位）、５１１ＭｇＣｌ＊、５＋１１ＤＴＴを加え、混合液を３７℃で２ 分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチド及びＩ識ヌクレオチドを除去し た。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止させ、水Ｓｏｄで３回洗 浄した。ハンドカウンターで混合液を測定して標識物が除去されなかったかどう かを確認した。 盃里五及旦ニ プライマーをキャップするために、ビーズを水４βに再懸濁した。これに次のも のを添加した：すなわち、５Ｘセクエナーゼパフファ−２β、１（ｍ　ｄ、ＴＴ Ｐ、　１０釦ｄｄＧＴＰ、　１０釦ｄｄＡＴＰ、　１０川ｄｄＣＴＰを含むヌク レオチド混合液２パ、及び希釈セクエナーゼ２．０の２パを添加した。混合液を ３７℃で２分間イン牛エベートシ、磁石でビーズを沈殿させ上清を除いて反応を 停止し、ビーズを水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程で２個のチオール化 Ｔ−ヌクレオチド及びＩｌｌ！ｌのノチオキシＧ−ヌクレオチドがシーフェンシ ングプライマーに付加された。 Ｌ鼠１反互ユ 前に規定した工牛ソヌクレアーゼｍ溶液１０β（２０単位）を添加し、混合液を ３７℃で２分間インキュベートすることによってジデオキシヌクレオチドを除去 した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を取り除くことによって反応を停止し、水Ｓｏｄ で３回洗浄した。 例９ ＤＮＡ鋳型／プライマー複合体１の調製鋳型の調製、固体支持体への結合、及び ／−クエンノングプライマーの７二−リングは例】に示したように行った。 チオヌクレオチドでのプライマーの手中フピングアニーリング混合ｆｉ　＋ａｌ ｉに１００ＲＩ　ｄ、ＧＴＰ％ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＴＴＰ、及びｄｄｅＴＰＩＯ Ｊ、及び希釈セクエナーゼ２．０（ＵＳＢ）４ｄ　（５単位）を加え、この混合 液を室温で２分間インキニーベートする。相補鎖の指示に従って３個のヌクレオ チド即ちｄ、Ｇ。 ｄ、Ｇ、　ｄｄＣがプライマーに順次に付加される。磁石を用いてビーズを沈殿 させ、上清を除いた。次にビーズを水Ｓｏｄで２回洗浄した。 キヤ・ノブプライマーからジデオキシヌクレオチドの　去ビーズにエキソヌクレ アーゼのＳｅｃ　トリス塩酸溶液（ｐＨ１７，５）　１０バ（２０単位）、５１ ＭＭｇＣ１，，５ｒ＋ＤＴＴを加え、混合液を３７”（で２分間インキュベート した。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、水Ｓｏｄで３回洗 浄した。この工程でジテオキシＣ−ヌクレオチドがプライマーの３“末端から除 去された。 第１シークエンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ｌ）を水４バ中に再懸濁した。これに次のものを添加した：すなわち、５×セク エナーゼパッファ−２β、１５期フルオレセイン−Ｉ　５−ｄＣＴＰ、　１．０ Ｊｌｊ　ｄＣＴＰ、　１０＃ｊ　ｄｄＧＴＰ、　１０１５　ｄｄＡ丁Ｐ、　１０ ４１　ｄｄＴＴＰを含■kク レオチド混合物２ｄ及び希釈セクエナーゼ２．０の２βを添加した。混合液を３ ７℃で２分間インキュベートした後、磁石でビーズを沈殿させ、上演を除いて反 応を停止させ、水５ｏβでさらに３回洗浄した。 二星工 Ｍ光Ｂ微ｍ上ニ取す付１ｔりＳ　Ｉ　Ｔ　力／　５　（Ｃ２４ＧＧ−０８型、Ｈ ａｗｓａｍａｒｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｉｃｓＳＡ）を用いて蛍光を測定した。 二１１瓦話見 工牛ソヌクレアーゼｍノｓＯｗｑ）リス塩酸溶液（ｐ［１７，５）　ｌ０ｔｌｌ （２０単位）、５劉１１ｇｃｌ＋、５　ｔ＋　ＤＴＴを添加して混合液を３７℃ で２分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチド及びフルオレセイン標識ヌ クレオチドを除去した。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、 次いで水５０ハで３回洗浄した。 二１Ｌ叉話ニ プライマーをキャップするために、ビーズを水４β中に再懸濁した。これに次の ものを添加した：すなわち、５×セクエナーゼバッファ−２バ、ＩＯ如ｄ、ＣＴ Ｐ。 １０ｍ　ｄｄＧＴＰ、　！０５ｄｄＡＴＰ、　ｌ０ＲＸｄｄＴＴＰを含むヌクレ オチド混合液２戚、及び希釈セクエナーゼ２０の２βを添加した。混合液を３７ ℃で２分間インキュベートした後、磁石でビーズを沈殿させ上清を除去して反応 を停止し、次いで水５０越でさらに３回洗浄した。この工程で２個のチオール化 Ｃ−ヌクレオチド及び１個のジチオキシＧ−ヌクレオチドがンークエンシングプ ライマーに付加された。 工１」」ＵＬ胆 前に規定したエキソヌクレアーゼ■溶液ｔｏｍ　（２０型位）を添加して３７℃ で２分間混合液をインキユベートすることによってジデオキシヌクレオチドを除 去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、次に水５０ハで３回洗 浄した。 第２シークエンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ｌ）を水４β中に再懸濁した。これに次のものを添加した：すなわち、５×セク エナーゼバッファ−２β、ｓｏｏｍフルオレセイン−１５−ｄｌＴＰ、　１．０ 謝ｄＧＴＰ、　１０ｊ＃１　ｄｄＡＴＰ、　１０川ｄｄＴＴＰ、　１０ｓ　ｄｄ ＣＴＰを含むヌクレオチド混合液２Ｉｌｉ及び希釈セクエナーゼ２．０の２バを 添加した。混合液を３７℃、２分間インキュベートし、磁石でビーズを沈殿させ 、上清を除去して反応を停止し、水５ｏＩＡでさらに３回洗浄した。 二五玉 蛍光顕微鏡上にとりつけたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０８型、Ｈａｍａ■ａｔ ｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｌｃｓＳ＾）を用いて蛍光を測定した。 工１１叉囚エ エキソヌクレアーゼ■のＳＯ劉トリス塩酸溶液（ｐ）１７．ｓ）　１０謔（２０ 型位）、５１ＭｇＣＬ−５ｔＩ　ＤＴＴを添加して混合液を３７℃で２分間イン キュベートすることによってジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除 去した。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、次いで水５Ｏ ｔｌｌで３回洗浄した。 工１１五旦亙 プライマーをキヤツジするためにビーズを水４Ｉｉ中に再懸濁した。これに次の ものを添加した：すなわち、５×セクエナーゼバフファ−２β、ＩＯ崗ｄ、ＧＴ Ｐ、　１０ｔｔｒ＋　ｄｄＡＴＰ、　１０渕ｄｄＴＴＰ、　１０川ｄｄｃＴＰを 含むヌクレオチド混合液２バ、及び希釈セクエナーゼ２．０の２戒を添加した。 混合液を３７℃で２分間インキユベートシ、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除 去して反応を停止し、水５０Ｉｉでさらに３回洗浄した。この工程でンークエン ノングプライマーに１個のチオール化Ｇ−ヌクレオチド及び１個のジチオキ／＾ −ヌクレオチドが付加された。 １ｍ込胆 上に規定したエキソヌクレアーゼ■溶液１０４　（２０型位）を添加して混合液 を３７℃で２分間インキュベートすることによってジデオキシヌクレオチドを除 去した。 磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、水Ｓｏｄで３回洗浄した 。 箪３シークエンシングサイクル（９工程）ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体 ｌ）を水Ａｌ１１中に再懸濁した。これに次のものを添加した：すなわち、５ｘ セクエナーゼバフファ−２ｔ！ｌ、　５ｏｏｓフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ 、　１　＃ＩｄＡＴＰ、　１０＃ＩｄｄＧＴＰ、　１０釦ｄｄＴＴＰ、　１０川 ｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合液２−及び希釈セクエナーゼ２．０の２Ｉｌ ｉを添加した。混合液を３７℃で２分間インキュベートし、磁石でビーズを沈殿 させ、上清を除去して反応を停止し、水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。 五里！ 蛍光顕微鏡上に取り付けたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０８１１、ｌｌｉｓａｍ ａｔｓｕ　ＰｈｏｔｏｎｌｃｓＳ＾）を用いて蛍光を測定した。 五ｍ瑳見 エキソヌクレアーゼ■の５０１＋）リス塩酸溶液（ｐＨ７，５）　ｌ０Ｉｉ（２ ０型位）、５劉ＭｇｃＩｍ、５　ｖ　Ｄ、ＴＴを添加し、混合液を３７℃で２分 間インキュベートしてジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した 。磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、次いで水５０ハで３回 洗浄した。。 Ｌ鼠り及旦互 プライマーをキャップするためにビーズを水４謔に再懸濁した。これに次のもの を添加した：すなわち、５×セクエナーゼバッファ−２成、１０４４１　ｄ、Ａ ＴＰ、　１０ｆｆｉｄｄＧＴＰ、　ｌｏｍ　ｄｄｄＴＴＰ　１０１５　ｄｄＣＴ Ｐを含むヌクレオチド混合液２パ及び希釈セクエナーゼ２０の２４を添加した。 混合液を３７℃て２分間インキュベートした後、磁石でビーズを沈殿させ上清を 除いて反応を停止させ、次いで水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。この工程で２個 のチオール化Ａ−ヌクレオチド及び１個のジチオ牛７丁−ヌクレオチドがンーク エノンングプライマーに付加された。 工１１叉乏赳 前に規定したエキソヌクレアーゼ■溶液１０／Ａ　（２０型位）を添加し、混合 液を３７℃で２分間インキュベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁 石でビーズを沈殿させ、上清を除去して反応を停止し、次いで水５０戚で３回洗 浄した。 第４シークエンシングサイクル（９工程）スキム１ ｌ１」」ＩＬｌ ビーズ（固定鋳型／プライマー複合体１）を水４バ中に再懸濁した。これに次の ものを添加した：すなわち、５×セクエナーゼバブファ−２β、１５ｆｆｉフル オレセイ７−１２−ｄｌｌＴＰ、　１．ｃｍ　ｄＴＴＰ、　１０ｆｆｉ　ｄｄＧ ＴＰ、　１（ｍ　ｄｄＡＴＰ、　ＩＱ、５　ｄｄＣＴＰを含むヌN レオチド混合液２β及び希釈セクエナーゼ２．０の２ｄを添加した。混合液を３ ７°Ｃで２分間インキュベートした後、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて 反応を停止し、次いで水Ｓｏｄでさらに３回洗浄した。 Ｌ鼠土 蛍光顕微鏡上に取り付けたＳＩＴカメラ（Ｃ２４００−０８Ｌ”、Ｈａｓ＋ａｍ ａｔｓｕ　ＰｈｏＬｏｎｉｃｓＳ＾）を用いて蛍光を測定した。 ｌ１Ｗ エキソヌクレアーゼｍの５０１トリス塩酸溶液（ｐＨ７，５）　１０β（２０型 位）、５１ＭｇＣ１ｍ、５　ｔ＋　ＤＴＴを加え、混合液を３７℃で２分間イン キュベートしてジデオキシヌクレオチド及び標識ヌクレオチドを除去した。磁石 でビーズを沈殿させ、上演を除いて反応を停止し、次いで水Ｓａｄで３回洗浄し た。Ｉ識の除去はハンドカウンターで混合液を測定してチェックした。 工程７及び８ プライマーをキャップするために、ビーズを水４Ｉｌｌ中に再懸濁した。これに 次のものを添加した：すなわち、５×セクエナーゼバブファ−２ｄ、　１０＃１ ｄ、ＴＴＰ。 ｌＯ団ｄｄＧＴＰ＋１０＃Ｉ　ｄｄＡＴＰ、　１０釦ｄｄｃＴＰを含むヌクレオ チド混合液２パ、及び希釈セクエナーゼ２０の２Ｉｉを添加した。混合液を３７ ”Ｃで２分間インキュベートした後、磁石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反 応を停止し、次いで水５０ハでさらに３回洗浄した。この工程で、２個のチオー ル化Ｔ−ヌクレオチド及び１個のジチオキシＧ−ヌクレオチドがシークエンジン グプライマーに付加された。 ｘｐｘｓ及旦工 前に規定したエキソヌクレアーゼ■溶液１０Ｉｌｌ（２０型位）を添加し、３７ ℃で２分間混合液をインキユベートしてジデオキシヌクレオチドを除去した。磁 石でビーズを沈殿させ、上清を除いて反応を停止し、次いで水５０ハで３回洗浄 した。 本発明は上述のように例のみを用いて記述されており、そして種々の変更態様は 添付した請求項の範囲内であることは当業者によって明らかであることは理解で きると思う。 取込まれたｄＵＴＰ−１２−フルオレセインの定量図１ 取込まれたｄＣＴＰ−１２−フルオレセインの定量Ｃ−Ｆヌクレオチドの数 図２ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＧＢ　９３１００８４８ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。 ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。 ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、 ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ 、ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ。 ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の工程からなる核酸配列の決定方法：ａ）配列が決定される核酸から成る 一本鎖鋳型の形成；ｂ）鋳型にプライマーを対合させて鋳型　／プライマー複合 体の形成；ｃ）単標識ヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長；ｄ）プライ マー上に付加きれた標識ヌクレオチドのタイプの決定；ｅ）標識の除去又は中和 ；及び ｆ）（ｃ）から（ｅ）への工程を順次くり返して、標識ヌクレオチドの取込みの 順序を記録する。 ２．鋳型／プライマー複合体を固相支持体に結合させる請求項１に記載の方法。 ３．工程（ｃ）が標識及び無標識ヌクレオチドの両者の混合物を使用することか らなる請求項１又は請求項２に記載の方法。 ４．ヌクレオチド鎖延長阻害剤の存在下で、標識ヌクレオチドを鋳型／プライマ ー複合体へ付加する前記請求項の何れかに記載の方法。 ５．鎖延長阻害剤が鋳型／プライマー複合体へ取込まれた鎖ターミネーターであ り、きらに工程（ｅ）が鎖ターミネーターを除去することから成る請求項４に記 載の方法。 ６．鎖延長阻害剤が標識ヌクレオチドのデオキシリボース基の３′部分に付着し た蛍光色素基であり、また工程（ｅ）が螢光色素を又ヌクレオチドから分割して ３′水酸基を生成することから成る請求項４又は請求項５に記載の方法。 ７．鎖延長阻害剤が鋳型／プライマー複合体へ取込まれない請求項３に記載の方 法。 ８．鎖延長阻害剤がデオキシヌクレオシド５′−［α、β−ノチレン］三燐酸、 デオキシヌクレオシド−燐酸又はデオキシヌクレオシドー燐酸である請求項７に 記載の方法。 ９．鋳型／プライマー複合体が３′末端にデオキシヌクレオシドホスホロチオエ ート塩基を有するプライマーからなる前記請求項の何れかに記載の方法。 １０．工程（ｅ）が次の各項からなる請求項９に記載の方法；Ｉ）エキソヌクレ アーゼによる標識ヌクレオチドの除去；及びＩＩ）鎖延長阻害剤の存在下、相当 する無標識ホスホロチオエートヌクレオシド誘導体による標識ヌクレオチドの置 換。 １１．工程（ｃ）及び（ｄ）が標識物の除去又は中和前に続けて多数回くり返さ れろ前記請求項の何れかに記載の方法 １２．標識が蛍光標識であり、工程（ｅ）がレーザー照射による脱色又は化学的 方法、又は標識ヌクレオチドから標識物を解離することによって標識を中和する ことからなる請求項１〜８の何れかに記載の方法１３．次の各工程からなるＤＮ Ａ断片の配列決定プロセス；１）ホスホロチオエートヌクレオシド誘導体を含む キヤッププライマーを鋳型へ対合させることによる鋳型／プライマー複合体の形 成；ＩＩ）不均一鎖ターミネーター及び適当なポリメラーゼと共に標識デオキシ ヌクレオシド三燐酸の鋳型／プライマー複合体への添加；ＩＩＩ）洗浄による過 剩試薬の除去； ＩＶ）取込み標識量の測定； Ｖ）標識及び鎖ターミネーターを取り除くためのエキソヌクレアーゼによる鋳型 ／プライマー複合体の処理； ＶＩ）洗浄によるエキソヌクレアーゼの除去；ＶＩＩ）工程２において不均一鎖 ターミネーターと共に加えられた標識デオキシヌクレオシド三燐酸に相当するホ スホロチオエートデオキシヌクレオシド三燐酸の添加； ＶＩＩＩ）洗浄による過剩試薬の除去；ＩＸ）鎖ターミネーターを取り除くため のエキソヌクレアーゼによる鋳型／プライマー複合体の処理； Ｘ）洗浄によるエキソヌクレアーゼの除去；１４．次の各工程からなるＤＮＡ断 片の配列決定プロセスＩ）ホスホロチオエートヌクレオシド誘導体を含むキヤッ ププライマーを鋳型へ対合きせることによる鋳型／プライマー複合体の形成；Ｉ Ｉ）不均一鎖ターミネーター及び適当なポリメラーゼと共に標識デオキシヌクレ オチドの添加； ＩＩＩ）洗浄による過剩試薬の除去； ＩＶ）取込み標識量の測定； Ｖ）エキソヌクレアーゼによる標識ヌクレオチド及び鎖ターミネーターの除去； ＶＩ）洗浄によるエキソヌクレアーゼの除去；ＶＩＩ）鎖に取込まれない不均一 鎖延長阻害剤と共にホスホロチオエートデオキシヌクレオチドの添加；及び ＶＩＩＩ）洗浄による過剰試薬の除去；１５．次の各工程からなるＤＮＡ断片の 配列決定プロセス；Ｉ）ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドを含むキヤッ ププライマーの鋳型への対合による鋳型／プライマー複合体の形成；ＩＩ）鎖に 取込まれない不均一鎖延長阻害剤と共に標識ヌクレオチド三燐酸の添加； ＩＩＩ）洗浄による過剰試薬の除去； ＩＶ）取込み標識量の測定； Ｖ）４種の異なった標識ヌクレオチドのすべてが、鎖に取込まれないそれらに相 当る不均一鎖延長阻害剤の存在下で添加されるまで工程ＩＩ〜ＩＶのくり返し； ＶＩ）エキソヌクレアーゼによる全標識ヌクレオチドの除去；ＶＩＩ）洗浄によ るエキソヌクレアーゼの除去；ＶＩＩＩ）工程ＩＩの反応に添加された最初の標 識デオキシヌクレオチドに相当するホスホロチオエートデオキシヌクレオチドを 、鎖に取込まれない不均一値延長阻害剤及び適当なポリメラーゼと共に添加；Ｉ Ｘ）洗浄による過剰試薬の除去； Ｘ）残り３種のホスホロチオエートデオキシヌクレオシド誘導体に関して工程１ Ｘ及びＸをくり返す。 １６．次の各工程からなるＤＮＡ断片の配列決定プロセスＩ）鋳型へのキヤップ プライマーの対合による鋳型／プライマー複合体の形成； ＩＩ）鎖に取込まれない３種の不均一鎖延長阻害剤及び適当なポリメラーゼと共 に蛍光ヌクレオシド三燐酸の添加； ＩＩＩ）洗浄による過剰試薬の除去； ＩＶ）取込まれた標識量の測定； Ｖ）鎖に取り込まれないそれぞれの不均一鎖延長阻害剤の存在下で各蛍光標識を 有する３種の異なるヌクレオシド三燐酸のすべてを用いて工程ＩＩ〜ＩＶのくり 返し； ＶＩ）レーザーでの脱色又は適当な化学反応による蛍光標識破壊、又は化学的開 裂工程による蛍光標識の除去； １７．次の各工程からなるＤＮＡ断片の配列決定プロセス；Ｉ）鋳型へのキヤッ ププライマーの対合；ＩＩ）リンカーアームを介してデオキシリボース糖の３′ 部分へ蛍光色素基を付着させることによって標識したヌクレオシド三燐酸の添加 ；ＩＩＩ）洗浄による過剰試薬の除去； ＩＶ）取込まれた標識量の測定； Ｖ）酵素的開裂による蛍光色素基の除去；及びＶＩ）洗浄による過剰試薬の除去 。 １８．次の多数の試薬からなるＤＮＡ配列決定キット；Ｉ）固相マトリックスへ ＤＮＡ鋳型を付着させるリンカー、すなわち３′末端にデオキシヌクレオシドホ スホロチオエート残基を有するプライマーからなるリンカー； ＩＩ）鎖延長阻害剤； ＩＩＩ）蛍光的に標識されたヌクレオシド三燐酸；ＩＶ）デオキシヌクレオシド ホスホロチオエート三燐酸；Ｖ）５′→３′ＤＮＡポリメラーゼ。 ＶＩ）３′→５′エキソヌクレアーゼ。 １９．本質的に請求項１から１５までの何れかに記載の方法の工程を実施するこ とによって核酸の配列を決定することができる自動配列決定機。 ２０．実質的には例について上記したように、ＤＮＡ断片の配列を決定するプロ セス。