CN101407836B - 检测性传播疾病病原体的基因芯片及检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于性传播疾病常见病原体检测的基因芯片和检测用试剂盒。其中该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针主要包含从淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体及人型支原体的16S rRNA基因、沙眼衣原体的外膜蛋白基因(ompA基因)、单纯疱疹病毒(HSV)的糖蛋白B基因(gB基因)以及乳头瘤病毒(HPV)的L1基因中选取的DNA片段或其互补的DNA片段。利用本发明的基因芯片及试剂盒可以达到检测性传播疾病常见病原体的目的，操作简便，高通量，准确性高，重复性强，可用于医疗卫生机构的临床检测、流行病学分析等。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种检测性传播疾病病原体的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术
性传播疾病(Sexually transmitted diseases，以下简称STD)是指主要经性行为而传播的一组疾病，是全球范围内最受公众关注的疾病之一，尤其是对妇女而言，STD危害程度仅次于癌症。世界卫生组织把20多种疾病归为性传播疾病，常见的有：淋病、尖锐湿疣、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、梅毒、艾滋病等。我国仍习惯于把艾滋病以外的其它几种常见的性传播疾病统称为性病。据世界卫生组织统计资料显示，1999年全球新增淋病、衣原体、梅毒和阴道滴虫感染的病例达3.4亿，如果加上单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒(HPV)感染的病例，这个数字可能要高出三倍甚至更高。我国在1964年已宣布消灭了STD，但自1979年以来，STD又在我国重新出现。目前，我国目前性病的流行呈上升趋势，性传播疾病患者为数不少。据有关报道，仅1997年，我国30个省市报告性病约50万，实际性病患者远不止此数。
引起STD的病原体总类较多，主要有淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、HSV、HPV、等。世界卫生组织1999年统计数据显示，由淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体引起的STD病例分别到达9200万例和6200万例。HSV亚型2是导致发展中国家人口秘尿生殖道感染的重要原因。HPV也是一种严重的STD病原体，每年导致50万子宫颈癌病例的发生。解脲脲原体、人型支原体是引起尿路感染和细菌性阴道炎症的主要病原体。
尽管其中大多数病种不属于致死性疾病，但它们传染性很强，引起生殖器官、附属淋巴结病变甚至全身皮肤和重要器官的病变，并能引起各种并发症与后遗症，由病毒感染所致STD有可能诱发癌症。STD患者若得不到及时治疗，将可能导致并发症和诸多后遗症的发生，包括不孕不育、宫外孕、子宫颈癌及新生儿感染等，严重影响健康。
目前医院用于诊断和检测STD病原体所采用的方法(包括金标准)主要是镜检、生化培养、抗血清反应、免疫荧光以及real time PCR等，具体分为以下几种：
(1)染色的显微镜及暗视野显微镜检测该方法适用于淋病奈瑟氏菌等病原体。此类方法的优点主要为简便，快速，但往往敏感性和特异性较差。
(2)致病菌培养：用于淋病奈瑟菌、支原体等病原体的检测。该方法是致病菌感染诊断的“金标准”，特异性较高，但费时较长，通常为2～3天，且灵敏性较PCR方法低。
(3)免疫学方法检测抗原：主要有ELISA方法、免疫荧光和免疫金标法，常用于沙眼衣原体和HSV的检测，方法特异性好，快速，但需要一定的抗原量，特殊的设备，专业的技术人员，费用比较昂贵。
(4)免疫组织化学法：主要用于HPV的诊断。该法特异性和灵敏性均较差，开展的医院较少，对其诊断和治疗主要依据临床医生的依据临床症状。有相当多的症状不典型患者，将会漏诊。70-80％宫颈癌患者可检测到乳头瘤病毒16或18型感染。所以，对乳头瘤病毒感染的诊断应引起足够的重视。
(5)聚合酶链反应(PCR)技术：敏感性和特异性均高，一般不分型，realtime PCR技术具有灵敏度高等特点，但费用较高。
由此可见，目前用于检测STD病原体的诊断技术有的耗时长，有的费用高，且均不能进行多种病原体的同时检测，因此难以达到快速、准确、高通量的目的，而这些正是芯片技术所具有的特点。
基因芯片又叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)，是在面积不大的基片表面上以点阵的方式有序排列一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子(DNA或RNA片段)，并以此作为探针，在一定条件下与样品中待测的靶基因片段进行结合或反应，反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄影技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读信息，最终实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。检测芯片集集约化、微型化、自动化于一体，拥有简单、快速、准确、灵敏、高通量的特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测STD病原体的基因芯片，以弥补传统检测STD常见病原体技术存在的费时、耗力、不能分型的缺陷，扩展病原体检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
本发明所述的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：
①从淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体、人型支原体的16S rRNA基因、沙眼衣原体的ompA基因、HSV的gB基因以及HPV的L1基因中所选取的DNA片段；
②从人类Homo sapiens)的β珠蛋白(beta globin protein)基因(以下简称BGP基因)中选取的DNA片段；
③①或②中选取的DNA片段的互补DNA片段。
其中上述的所选取的DNA片段具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：31核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：31的核苷酸序列但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：31所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列，具体的优选序列及功能如下所示：
SEQ ID NO：1CGTCATCGGCCGCCGATATTGGCAA用于检测淋病奈瑟氏菌；
SEQ ID NO：2 TGCTTTCCCTCTCAAGACGTATGCG用于检测淋病奈瑟氏菌；
SEQ ID NO：3 CGAAAACAAAGTCWCCRTAGTAACC用于检测沙眼衣原体；
SEQ ID NO：4 CATGCTGATAGCGTCAMMCCAAGTGG用于检测沙眼衣原体；
SEQ ID NO：5 ACCTAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGG用于检测解脲脲原体；
SEQ ID NO：6 TAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGGGAA用于检测解脲脲原体；
SEQ ID NO：7 GCTCGAACGAGTCGGTGTTGTAGCT用于检测解脲脲原体；
SEQ ID NO：8 TTAAATGATGTGCCTGGGTAGTACA用于检测解脲脲原体和人型支原体；
SEQ ID NO：9 TTGGATACTAGCAAACTAGAGTTAG用于检测人型支原体；
SEQ ID NO：10 AGTCTGGAGTTAAATCCCGGGGCTCAAC用于检测人型支原体；
SEQ ID NO：11 TGAAGATACACGGAAAACCTTACCCAC用于检测人型支原体和解脲脲原体；
SEQ ID NO：12 GCGGCTCTGCTCTCGGAGGTGTTCC用于检测HSV-1；
SEQ ID NO：13 CGATGGCAACGCGGCCCAACATATC用于检测HSV-1；
SEQ ID NO：14 GCGCCCCAGCATGTCGTTCACGTGG用于检测HSV-2；
SEQ ID NO：15 CGACGGCGATGCGCCCCAGCATGTC用于检测HSV-2；
SEQ ID NO：16 CTACAGACGTKCGATTTCCACTACCC用于检测HPV-6；
SEQ ID NO：17 TTAACATATATACTACTCCCTACAG用于检测HPV-6；
SEQ ID NO：18 TATTACCCCCTTTTACCAACAGGTC用于检测HPV-11；
SEQ ID NO：19 GTACATAAATACTACTAGCTACAGA用于检测HPV-11；
SEQ ID NO：20 TGTATAAATCGTCTGGTACATTTTC用于检测HPV-16；
SEQ ID NO：21 GGCTAAATTTGCAGTAGRCCCAGAG用于检测HPV-16；
SEQ ID NO：22 ATAAGGATTGAGGCACAGTGTCACC用于检测HPV-18；
SEQ ID NO：23 GCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCT用于检测HPV-18；
SEQ ID NO：24 CAGTAGGGACCGATTCACCAACCGT用于检测HPV-31；
SEQ ID NO：25 AGTATGTACTGTTAGCTAAAGTAGC用于检测HPV-31；
SEQ ID NO：26 AGGTCTGCAGGTACTGTTTCACCTA用于检测HPV-35；
SEQ ID NO：27 AGTACTAGGCAATGTGCCAGTGGTA用于检测HPV-35；
SEQ ID NO：28 CAGAACTACCGGGGTTTGCACGTAT用于检测HPV-39；
SEQ ID NO：29 ACTGTCARGGTTACCTGAGGATTTC用于检测HPV-54；
SEQ ID NO：30 AAATGCACTACTTTGGATAACTGCA用于检测HPV-58；
SEQ ID NO：31 CTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGA用于检测BGP基因；
其中的M表示A或C；R表示A或G；W表示A或T。
本发明的基因芯片，可用于包括淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、HSV-1型和HSV-2型以及HPV中的6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、54型、58型病原体的至少一种的检测，其检测方法主要包括以下步骤：
(1)根据淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体、人型支原体的16S rRNA基因、沙眼衣原体的ompA基因、HSV的gB基因以及HPV的L1基因及人β珠蛋白基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与上述的基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
其中所述步骤(1)中使用的引物为包括SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：43的核苷酸序列的至少一种，本发明中的优选探针序列如下，共12条，各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：
P1CGGAACGTACCGGGTAGC用于扩增淋病奈瑟氏菌的上游引物(SEQ ID NO：32)；
P2GCTACCCACGCTTTCGGA用于扩增淋病奈瑟氏菌的下游引物(SEQ ID NO：33)；
P3ATCCTGCTGAACCAAGCCTTATGA用于扩增沙眼衣原体的上游引物(SEQ ID NO：34)；
P4CAYTCATGGTARTCAATAGAGGCA用于扩增沙眼衣原体的下游引物(SEQ ID NO：35)；
P5GTAATACATAGGWYGCAAGCGTTATC用于扩增支原体的通用上游引物(SEQ ID NO：36)；
P6CACCAYCTGTCAYWYBGWTAACCTC用于扩增支原体的通用下游引物(SEQ ID NO：37)；
P7GCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTC用于扩增HSV的通用上游引物(SEQ ID NO：38)；
P8CGAGTTYTGSACGATCACGTTGTCC用于扩增HSV的通用下游引物(SEQ ID NO：39)；
P9AYHTGYAAATATCCWGATTA用于扩增HPV的通用上游引物(SEQ ID NO：40)；
P10TGYARCCAATAWGGYTTATT用于扩增HPV的通用下游引物(SEQ ID NO：41)；
P11ACACAACTGTGTTCACTAGC用于扩增BGP的上游引物(SEQID NO：42)；
P12CATCAGGAGTGGACAGATCC用于扩增BGP的下游引物(SEQID NO：43)；
其中的B表示C或G或T；R表示A或G；S表示C或G；W表示A或T；Y表示C或T。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片来检测STD病原体的试剂盒，该试剂盒包括上述的基因芯片，还包括SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：31的探针序列或其互补核苷酸序列的至少一种。其中，用于淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体(也称解脲支原体)及人型支原体PCR扩增的引物序列分别根据其16S rRNA基因序列设计，用于沙眼衣原体PCR扩增的引物序列根据沙眼衣原体ompA基因序列设计，用于HSV PCR扩增的引物序列根据HSV gB基因序列设计，用于HPV PCR扩增的引物序列根据HPVL1基因序列设计，用于人(Homo sapiens)BGP基因PCR扩增的引物序列根据人(Homo sapiens)BGP基因序列设计。本发明中的优选引物序列为SEQ IDNO：32-SEQ ID NO：43的核苷酸序列。
所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件如Bactarray Analyzer，以及使用说明书等。
所述的试剂盒，可用于包括淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、HSV-1型和HSV-2型以及HPV中的6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、54型、58型病原体的至少一种的检测。
由上述的技术方案可见，本发明将芯片技术引入到STD常见病原体的检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的STD常见病原体检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对STD常见病原体进行检测的目的，由于操作简便，准确性高，能一次完成多种病原体的检测，重复性强，因此对于医院等医疗卫生机构对患者进行临床检测有重要的应用价值，利于对患者病情进行及时诊断，以便及时治疗。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图。
图2为本发明芯片的单一点阵结构示意图。
图3为利用本发明的基因芯片检测STD病原体淋病奈瑟氏菌的一个实施例的杂交结果示意图。
图4为利用本发明的基因芯片检测STD病原体解脲脲原体的一个实施例的杂交结果示意图。
图5为利用本发明的基因芯片检测STD病原体人型支原体杂交结果示意图
图6为利用本发明的基因芯片检测STD病原体沙眼衣原体的杂交结果示意图。
图7为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HSV-1的杂交结果示意图。
图8为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HSV-2的杂交结果示意图。
图9为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-6型的杂交结果示意图。
图10为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-11型的杂交结果示意图。
图11为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-16型的杂交结果示意图。
图12为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-18型的杂交结果示意图。
图13为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-31型的杂交结果示意图。
图14为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-35型的杂交结果示意图。
图15为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-39型的杂交结果示意图。
图16为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-54型的杂交结果示意图。
图17为利用本发明的基因芯片检测STD病原体HPV-58型的杂交结果示意图。
具体实施方式
实施例一 探针的设计和制备
1.序列获得：
(1)淋病奈瑟氏菌：从GenBank公共数据库下载得到淋病奈瑟氏菌全部16s rRNA基因序列及其近缘菌的全部16S rRNA基因序列。
(2)解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体的16S rRNA基因序列，沙眼衣原体ompA基因序列，HSV gB基因序列，HPVL1基因序列以及人BGP基因中序列的获得方法与(1)相同。
2.探针设计举例：
(1)淋病奈瑟氏菌探针：将淋病奈瑟氏菌16S rRNA基因序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray2.0软件中。参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。
(2)HPV探针：将HPV6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、54型、58型等9种型别的L1基因序列导入Glustal X软件中，每种型别选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray2.0软件中。按(1)所示参数运行程序设计探针。
3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长16T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。
本发明通过多次杂交实验进行探针筛选，得到的优选的探针如表1所示：
表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的病原体
| SEQID | 探针编号 | 序列(5′-3′) | 检测作用 |
| NO：1 | NO.1 | CGTCATCGGCCGCCGATATTGGCAA | 淋病奈瑟氏菌 |
| NO：2 | NO.2 | TGCTTTCCCTCTCAAGACGTATGCG | 淋病奈瑟氏菌 |
| NO：3 | NO.3 | CGAAAACAAAGTCWCCRTAGTAACC | 沙眼衣原体 |
| NO：4 | NO.4 | CATGCTGATAGCGTCAMMCCAAGTGG | 沙眼衣原体 |
| NO：5 | NO.5 | ACCTAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGG | 解脲脲原体 |
| NO：6 | NO.6 | TAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGGGAA | 解脲脲原体 |
| NO：7 | NO.7 | GCTCGAACGAGTCGGTGTTGTAGCT | 解脲脲原体 |
| NO：8 | NO.8 | TTAAATGATGTGCCTGGGTAGTACA | 解脲脲原体和人型支原体 |
| NO：9 | NO.9 | TTGGATACTAGCAAACTAGAGTTAG | 人型支原体 |
| NO：10 | NO.10 | AGTCTGGAGTTAAATCCCGGGGCTCAAC | 人型支原体 |
| NO：11 | NO.11 | TGAAGATACACGGAAAACCTTACCCAC | 人型支原体和解脲脲原体 |
| NO：12 | NO.12 | GCGGCTCTGCTCTCGGAGGTGTTCC | HSV-1 |
| NO：13 | NO.13 | CGATGGCAACGCGGCCCAACATATC | HSV-1 |
| NO：14 | NO.14 | GCGCCCCAGCATGTCGTTCACGTGG | HSV-2 |
| NO：15 | NO.15 | CGACGGCGATGCGCCCCAGCATGTC | HSV-2 |
| NO：16 | NO.16 | CTACAGACGTKCGATTTCCACTACCC | HPV-6 |
| NO：17 | NO.17 | TTAACATATATACTACTCCCTACAG | HPV-6 |
| NO：18 | NO.18 | TATTACCCCCTTTTACCAACAGGTC | HPV-11 |
| NO：19 | NO.19 | GTACATAAATACTACTAGCTACAGA | HPV-11 |
| NO：20 | NO.20 | TGTATAAATCGTCTGGTACATTTTC | HPV-16 |
| NO：21 | NO.21 | GGCTAAATTTGCAGTAGRCCCAGAG | HPV-16 |
| NO：22 | NO.22 | ATAAGGATTGAGGCACAGTGTCACC | HPV-18 |
| NO：23 | NO.23 | GCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCT | HPV-18 |
| NO：24 | NO.24 | CAGTAGGGACCGATTCACCAACCGT | HPV-31 |
| NO：25 | NO.25 | AGTATGTACTGTTAGCTAAAGTAGC | HPV-31 |
| NO：26 | NO.26 | AGGTCTGCAGGTACTGTTTCACCTA | HPV-35 |
| NO：27 | NO.27 | AGTACTAGGCAATGTGCCAGTGGTA | HPV-35 |
| NO：28 | NO.28 | CAGAACTACCGGGGTTTGCACGTAT | HPV-39 |
| NO：29 | NO.29 | ACTGTCARGGTTACCTGAGGATTTC | HPV-54 |
| NO：30 | NO.30 | AAATGCACTACTTTGGATAACTGCA | HPV-58 |
| NO：31 | NO.31 | CTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGA | BGP基因 |
参照图1，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为：第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的距离为13.5mm(均从左侧点阵区和右侧点阵区的最左端起算)，第一横点阵区的最上端和第二横点阵区的最上端的距离是13.5mm，第二横排点阵区的最上端和第三横排点阵区的最上端的距离是19.5mm。
参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图，其中的Cy3表示荧光探针，其中的NO对应的数字表示的核苷酸序列与本发明中所述的SEQID NO对应的数字表示的核苷酸序列一致。
实施例二 引物的设计和制备
1.引物设计举例：
(1)淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因扩增引物：淋病奈瑟氏菌全部的16srDNA序列导入Glustal X软件中，从中选取一条有代表性的序列导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度70bp～10bp，G+C％值40％～60％，Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE。
(2)解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体的16S rRNA基因序列，沙眼衣原体ompA基因序列，HSV gB基因序列，HPVL1基因序列以及人BGP基因中的引物设计方法与(1)相同。
2.引物合成：将表2中的引物序列委托探针合成公司(北京奥科公司)合成(PAGE纯化)，备用。
3.引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别用单对引物扩增相应模拟样品以检验引物的灵敏性，另一方面，将六对引物按一定比例混合扩增单个模拟样品及混合模拟样品，以检验引物的特异性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。
在本发明的优选实施例中，为适应同时六对引物的多重PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物：
表2 用于STD常见病原体检测的PCR扩增引物序列
| 编号 | SEQID | 序列(5’-3’) | 引物作用 |
| P1 | NO：32 | CGGAACGTACCGGGTAGC | 用于扩增淋病奈瑟氏菌的上游引物 |
| P2 | NO：33 | GCTACCCACGCTTTCGGA | 用于扩增淋病奈瑟氏菌的下游引物 |
| P3 | NO：34 | ATCCTGCTGAACCAAGCCTTATGA | 用于扩增沙眼衣原体的上游引物 |
| P4 | NO：35 | CAYTCATGGTARTCAATAGAGGCA | 用于扩增沙眼衣原体的下游引物 |
| P5 | NO：36 | GTAATACATAGGWYGCAAGCGTTATC | 用于扩增支原体的通用上游引物 |
| P6 | NO：37 | CACCAYCTGTCAYWYBGWTAACCTC | 用于扩增支原体的通用下游引物 |
| P7 | NO：38 | GCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTC | 用于扩增HSV的通用上游引物 |
| P8 | NO：39 | CGAGTTYTGSACGATCACGTTGTCC | 用于扩增HSV的通用下游引物 |
| P9 | NO：40 | AYHTGYAAATATCCWGATTA | 用于扩增HPV的通用上游引物 |
| P10 | NO：41 | TGYARCCAATAWGGYTTATT | 用于扩增HPV的通用下游引物 |
| P11 | NO：41 | ACACAACTGTGTTCACTAG C | 用于扩增BGP的上游引物 |
| P12 | NO：43 | CATCAGGAGTGGACAGATCC | 用于扩增BGP的下游引物 |
实施例三 利用基因芯片快速检测STD常见病原体及试剂盒的制备
1.样品处理：
(1)将收集得到的临床样品15000g离心10分钟；
(2)弃上清，加入100μl裂解液，混匀，100℃水浴10分钟；
(3)上一步得到的裂解产物15000g离心5分钟；
(4)收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于检测或-20℃保存。
附：裂解液配方：
50m molL-1NaOH
10m molL-1Tris-HCl(pH8.0)
0.5％Tween-20
0.5％NP-40
0.5m molL-1EDTA(pH8.0)
5％chelex-100
2.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的3ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)
表3 Multiplex PCR反应混合液配方
| 成分 | 浓度 | 加样量(μl) |
| ddH2O10×PCR缓冲液MgCl2dNTP混合物BSA①引物混合物ITaq酶总体积 | -10×25mM10mM1％②5U/μl | 8.73.52.50.51.550.325 |
注：①BSA即小牛血清蛋白②引物混合物I中各引物的浓度为：P9，P10为0.9μmolL-1；P5，P6，P11，P12为0.2μmolL-1；P1，P2，P3，P4，P7，P8为0.3μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
80℃ 10分钟
95℃ 5分钟
94℃ 30秒
53℃ 2分钟
68℃ 1分钟 回到第三步，共35个循环
72℃ 10分钟
4℃ 20分钟
3.荧光标记靶序列：取3μl扩增产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。
表4标记反应混合液配方
| 成分 | 浓度 | 加样量(μl) |
| ddH2O10×PCR缓冲液MgCl2dNTP混合物BSA引物混合物II荧光素Cy5-dUTPTaq酶 | -10×25mM10mM1％注释①25nM5U/μl | 8.43.52.50.51.550.30.3 |
注：①引物混合物II中所含各引物浓度为：P9为0.9μmolL-1；P6，P12为0.2μmolL-1；P1，P3，P7为0.3μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
80℃ 10分钟
95℃ 5分钟
94℃ 30秒
53℃ 2分钟
68℃ 1分钟 回到第三步，共35个循环
72℃ 1O分钟
4℃ 20分钟
4.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。取10μl2×杂交液与10μl标记产物混合均匀，并加在实施例三中制备的STD常见病原体检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，50℃水浴锅中杂交1.5小时。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS；6×SSPE。
5.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测常见的STD病原体(淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体、沙眼衣原体、HSV、HPV)时的杂交扫描结果分别如图3-17所示。
7.杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中BGP探针(NO.31)为阳性对照探针，有两方面作用：1显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；2临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测的病原体至少包括淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、HSV-1型和HSV-2型以及HPV中的6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、54型、58型病原体，其中该试剂盒还带有使用此试剂盒的说明书等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>检测性传播疾病病原体的基因芯片及检测用试剂盒
<130>7P13004-CN
<160>43
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>检测淋病奈瑟氏菌的探针
<400>1
cgtcatcggc cgccgatatt ggcaa 25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>检测淋病奈瑟氏菌的探针
<400>2
tgctttccct ctcaagacgt atgcg 25
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>检测沙眼衣原体的探针
<400>3
cgaaaacaaa gtcwccrtag taacc 25
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>检测沙眼衣原体的探针
<400>4
catgctgata gcgtcammcc aagtgg 26
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>检测解脲脲原体的探针
<400>5
acctagagtg tagtagggag ttggg 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>检测解脲脲原体的探针
<400>6
tagagtgtag tagggagttg gggaa 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>检测解脲脲原体的探针
<400>7
gctcgaacga gtcggtgttg tagct 25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>检测解脲脲原体和人型支原体的探针
<400>8
ttaaatgatg tgcctgggta gtaca 25
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>检测人型支原体的探针
<400>9
ttggatacta gcaaactaga gttag 25
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>检测人型支原体的探针
<400>10
agtctggagt taaatcccgg ggctcaac 28
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>检测人型支原体和解脲脲原体的探针
<400>11
tgaagataca cggaaaacct tacccac 27
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>检测HSV-1的探针
<400>12
gcggctctgc tctcggaggt gttcc 25
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>检测HSV-1的探针
<400>13
cgatggcaac gcggcccaac atatc 25
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>检测HSV-2的探针
<400>14
gcgccccagc atgtcgttca cgtgg 25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>检测HSV-2的探针
<400>15
cgacggcgat gcgccccagc atgtc 25
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>检测HPV-6的探针
<400>16
ctacagacgt kcgatttcca ctaccc 26
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-6的探针
<400>17
ttaacatata tactactccc tacag 25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-11的探针
<400>18
tattaccccc ttttaccaac aggtc 25
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-11的探针
<400>19
gtacataaat actactagct acaga 25
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-16的探针
<400>20
tgtataaatc gtctggtaca ttttc 25
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-16的探针
<400>21
ggctaaattt gcagtagrcc cagag 25
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-18的探针
<400>22
ataaggattg aggcacagtg tcacc 25
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-18的探针
<400>23
gctgccaggt gaagcacgca tacct 25
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-31的探针
<400>24
cagtagggac cgattcacca accgt 25
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-31的探针
<400>25
agtatgtact gttagctaaa gtagc 25
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-35的探针
<400>26
aggtctgcag gtactgtttc accta 25
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-35的探针
<400>27
agtactaggc aatgtgccag tggta 25
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-39的探针
<400>28
cagaactacc ggggtttgca cgtat 25
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-54的探针
<400>29
actgtcargg ttacctgagg atttc 25
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>检测HPV-58的探针
<400>30
aaatgcacta ctttggataa ctgca 25
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>检测BGP基因的探针
<400>31
ctcttgggtt tctgataggc actga 25
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>扩增淋病奈瑟氏菌的上游引物
<400>32
cggaacgtac cgggtagc 18
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>扩增淋病奈瑟氏菌的下游引物
<400>33
gctacccacg ctttcgga 18
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>扩增沙眼衣原体的上游引物
<400>34
atcctgctga accaagcctt atga 24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>扩增沙眼衣原体的下游引物
<400>35
caytcatggt artcaataga ggca 24
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>扩增支原体的通用上游引物
<400>36
gtaatacata ggwygcaagc gttatc 26
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>扩增支原体的通用下游引物
<400>37
caccayctgt caywybgwta acctc 25
<210>38
<211>25
<212>DNA
<213>扩增HSV的通用上游引物
<400>38
gcacgtagtt agccggtgct tattc 25
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>扩增HSV的通用下游引物
<400>39
cgagttytgs acgatcacgt tgtcc 25
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>扩增HPV的通用上游引物
<400>40
ayhtgyaaat atccwgatta 20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>扩增HPV的通用下游引物
<400>41
tgyarccaat awggyttatt 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>扩增BGP的上游引物
<400>42
acacaactgt gttcactagc 20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>扩增BGP的下游引物
<400>43
catcaggagt ggacagatcc 20
Claims (4)
1.一种用于检测性传播疾病病原体的基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-NO：31所示。
2.一种检测性传播疾病病原体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：32-43所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及使用说明书。
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