CN1570136A - 一段人型支原体dna序列（3）特异性的确定及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一段人型支原体DNA序列(3)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过基因数据库资料的搜寻和分析，确定了一段人型支原体DNA序列(3)的特异性及PCR扩增引物，该序列长度为222bp。通过对人类生殖道人型支原体感染标本的PCR扩增，克隆，获得该序列，测序证明与预计序列一致。再经生物信息学方法分析，基因芯片杂交分析，结果证实了该序列对于人型支原体的特异性。本发明作为基因芯片诊断的探针及PCR扩增检测序列，用于人型支原体的诊断。用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一段人型支原体(Mycoplasma hominis)DNA序列(3)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
人型支原体是一种人类生殖器经常感染的病原物，可引发许多泌尿生殖道疾病，准确的诊断是进行即时而可靠的治疗的依据，目前只能根据临床指征进行诊断。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容：
本发明在于通过生物信息学和分子生物学技术，确定了一段人型支原体特异核苷酸序列及其PCR引物。该序列和相应的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法进行人型支原体的诊断。
本发明的技术方案为：本发明利用现有的方法确定了长度为222bp的一段人型支原体特异DNA序列(3)及其PCR引物，用引物进行PCR扩增，其序列如下：
cgacggaaaa gacactggat atgaagttaa agcaaaagac ttctgatatt catgactaag 60
aacatattca agaaacttag actatcgttt aagcaccggt ggatcaaaag aactagacga 120
tgcattaaaa tcaaaattgg ctgaagaaaa ttcaccagtt tatggtgaac aatgatcatt 180
tggtaacata tatacttatg cattgttcgg cattgatgct aa 222
引物序列为：
1.5’-cgacggaaaagacactggat-3’
2.5’-ttagcatcaatgccgaacaa-3’
上述人型支原体的特异DNA序列(3)用于诊断人型支原体的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
附图说明：
图1为临床标本的PCR扩增图谱。
图2、图2续是测序图。其中图2是测定的序列、图2续是原始测序图谱。
图3是用Blast软件对PCR扩增产物的测序结果与预计序列的比较分析。
图4、图4续(1)、图4续(2)是基因数据库中Blast搜索结果。
图5为基因芯片杂交结果。
具体实施方式：
首先以人型支原体为关键词，在基因数据库中搜索人型支原体的核苷酸序列。共获得数条关系较密切的核苷酸序列，将这些核苷酸序列用NCBI网上的Blast在线使用软件比对基因数据库中的核苷酸序列(nr)，排出非特异性的核苷酸序列，获得了1Kb特异性的核苷酸序列。以这段序列设计了20余对PCR引物，以临床标本提取DNA，进行PCR扩增，筛选到一对适合进行PCR扩增的序列及引物，PCR扩增获得的产物与预计大小一致(见图1，图中序号为：1.标准分子量DNA，分子量大小从上至下分别为：622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5临床阴性标本，没有扩增产物；3.临床阳性标本，扩增产物很纯，大小220左右，与预计大小一致。图谱结果显示用本发明中的引物能特异的扩增临床样品)，然后用T-vector进行克隆，并测序(测序报告见图2、图2续，图中从55位开始，到276位，共222bp为克隆序列，其余序列为克隆载体序列)，序列为222bp，通过Blast软件比对预计序列，显示与预计的序列一致(见图3，图中除第82位由c改变成a，第93位由g改变成a，第118位由c改变成t，第121位由t改变成a，第127位由a改变成g，第139位由g改变成a外，其余均与预计序列一致)，表明该序列可以被特异性的扩增，可用于人型支原体PCR检测。序列用NCBI网站的Blast搜索基因数据库的DNA(包含cDNA)序列，该序列只与人型支原体的序列一致，而与其它的物种序列没有同源性【见图4、图4续(1)、图4续(2)，图中搜寻结果表明，只有人型支原体的质粒DNA序列与本序列同源，并且是完全配对。而其它的序列只有40字符左右的短序列，由于这些序列没有引物与此配对，故在检测中不会被检测到】。用这一序列标记后作为探针与含有9种泌尿生殖道感染病原物的45个基因位点的基因芯片杂交，只有本发明序列与此有杂交信号，而其它所有序列与此无杂交信号(见图5，图中是四个重复，每个重复含9种泌尿生殖道感染性疾病病原物共45个不同的位点和4个对照位点。杂交结果表明只有本序列有特异信号，而其它均无杂交信号)，表明该序列为人型支原体的特异序列。
本发明可用于PCR方法或基因芯片方法进行人型支原体的临床检测。用本发明提供的序列进行PCR扩增，根据PCR方法获得产物是否出现和大小判断是否为人型支原体感染。也可用本序列为探针，作为基因芯片中的一个检测位点，然后用本发明中的PCR引物序列扩增临床标本，并标记后进行杂交检测。
说明书序列表
SEQUENCE LISTING
<110>昆明寰基生物芯片开发有限公司
<120>一段人型支原体DNA序列(3)特异性的确定及其应用
<130>
<140>02133336.X
<141>2002-06-20
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>222
<212>DNA
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(222)
<223>
<400>1
cgacggaaaa gacactggat atgaagttaa agcaaaagac ttctgatatt catgactaag 60
aacatattca agaaacttag actatcgttt aagcaccggt ggatcaaaag aactagacga 120
tgcattaaaa tcaaaattgg ctgaagaaaa ttcaccagtt tatggtgaac aatgatcatt 180
tggtaacata tatacttatg cattgttcgg cattgatgct aa 222
Claims (2)
1、一段人型支原体DNA序列(3)特异性的确定，其特征在于该序列的长度为222bp，序列及PCR引物如下：
cgacggaaaa gacactggat atgaagttaa agcaaaagac ttctgatatt catgactaag 60
aacatattca agaaacttag actatcgttt aagcaccggt ggatcaaaag aactagacga 120
tgcattaaaa tcaaaattgg ctgaagaaaa ttcaccagtt tatggtgaac aatgatcatt 180
tggtaacata tatacttatg cattgttcgg cattgatgct aa 222
引物序列为：
1.5’-cgacggaaaagacactggat-3’
2.5’-ttagcatcaatgccgaacaa-3’
2、一段人型支原体DNA序列(3)特异性的应用，其特征在于该序列用于诊断人型支原体的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 02133336 CN1570136A (zh) | 2002-06-20 | 2002-06-20 | 一段人型支原体dna序列（3）特异性的确定及其应用 |
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| CN 02133336 CN1570136A (zh) | 2002-06-20 | 2002-06-20 | 一段人型支原体dna序列（3）特异性的确定及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1570136A true CN1570136A (zh) | 2005-01-26 |
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ID=34468849
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 02133336 Pending CN1570136A (zh) | 2002-06-20 | 2002-06-20 | 一段人型支原体dna序列（3）特异性的确定及其应用 |
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|---|---|
| CN (1) | CN1570136A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101407836B (zh) * | 2007-10-12 | 2011-07-20 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 检测性传播疾病病原体的基因芯片及检测用试剂盒 |
| CN101824471B (zh) * | 2009-12-14 | 2012-12-12 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 用于同时检测解脲支原体、人型支原体和生殖器支原体的组合物和试剂盒 |
-
2002
- 2002-06-20 CN CN 02133336 patent/CN1570136A/zh active Pending
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| CN101824471B (zh) * | 2009-12-14 | 2012-12-12 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 用于同时检测解脲支原体、人型支原体和生殖器支原体的组合物和试剂盒 |
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |