MX2014004998A - Biochip de adn para la deteccion de secuencias de virus de papiloma humano en tejido infectado. - Google Patents

Abstract

A nivel mundial, los tumores genitales femeninos (sin incluir el cáncer de mama) abarcan a la gran mayoría de los tumores de la mujer. De estos tumores el cáncer cervical (CC) es el más frecuentemente reportado (12%) donde la mitad de los casos fallecen a consecuencia de la enfermedad Debido a la importancia de los sistemas de diagnóstico para un buen tratamiento del CC, la presente invención es relativa a Biochips de ADN para la detección y tipificación molecular del virus del papiloma humano y a una metodología para la detección del virus del papiloma humano en tejido infectado por el mismo mediante la utilización de Biochips de ADN.

Description

BIOCHIP DE ADN PARA LA DETECCION DE SECUENCIAS DE VIRUS DE PAPILOMA HUMANO EN TEJIDO INFECTADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un método para la detección de secuencias del virus del papiloma humano en tejido infectado por el mismo. Más específicamente, la presente invención se relaciona a Biochips de ADN para la detección y tipificación molecular del virus del papiloma humano y a una metodología para su detección en tejido infectado mediante la utilización de Biochips de ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A nivel mundial, los tumores genitales femeninos (sin incluir el cáncer de mama) abarcan a la gran mayoría de los tumores de la mujer. De estos tumores el cáncer cervical (CC) es el más frecuentemente reportado (12%) donde la mitad de los casos fallecen a consecuencia de la enfermedad. Actualmente el CC es considerada la segunda neoplasia más común en todo el mundo con 471 000 nuevos casos y 288 000 muertes reportadas anualmente. Aproximadamente el 80% de estas muertes son registradas en países en desarrollo, donde la mayoría de las mujeres (sobretodo en los países más pobres) no tienen acceso a programas de seguimiento efectivos [Cervical cáncer screening in developing i countries: Report of a WHO consultation. World Health Organization 2002. Geneva, Switzerland].

Durante las últimas décadas diversas investigaciones clínicas y epidemiológicas confirman la relación etiológica entre la infección por ciertos tipos de virus de papiloma humano (VPH) y el desarrollo de cáncer cervical (CC) y sus lesiones precursoras [World Health Organization, 2002; Bosh FX et al., 1992, Int. J. Cáncer. 52: 171 -173; Bosh FX, 2003, SPM 45(3): S326-S339; Shiffman y Castle, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. 95(6): ppE2]. Se ha estimado que entre un 2 y un 20 % de la población femenina mundial es portadora oculta de VPH en el cuello uterino [Documentos de consenso: La infección por papilomavirus. Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia S. E. G. O. 2002. España]. Además, bajo ciertas condiciones estas infecciones pueden convertirse en persistentes con capacidad de inducir e incrementar el riesgo de CC [Wallboomers et al., 1999, J. Pathol. 189: 12-9]. Estos antecedentes colocan al CC como prioridad dentro de los principales programas de control de cáncer a nivel mundial al ser considerado un problema de salud pública que potencialmente puede ser evitado mediante estrategias de detección temprana de la enfermedad y tratamientos mas adecuados.

Aunque la infección por VPH es muy común entre la población, la mayoría de ellas son benignas y los individuos afectados son capaces de eliminarlas por si solos en periodos que pueden ir de seis meses a un año; solo una pequeña fracción de las personas infectadas, conocidas como portadores crónicos o persistentes pueden retener el virus durante largos periodos de tiempo (incluso por décadas) y desarrollar posteriormente algún tipo de lesión [Baseman y Koutsky, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S16-S24]. 5 En un principio las infecciones por VPH pueden dar origen a lesiones de bajo grado o LGSIL (Low Grade Squamous Intraepithelial Lesión) llamadas displasias (término usado para describir células anormales) las cuales al no poder ser eliminadas por el sistema inmunológico del hospedero pueden progresar a lesiones de alto grado o HGSIL (High Grade Squamous Intraepithelial Lesión) o í o CC (en su mayoría carcinomas de células escamosas, ya que los adenocarcinomas suelen ser menos frecuentes). También pueden surgir alteraciones denominadas ASCUS (Atypical Squamous Cell Undetermined Significance) donde las células no parecen completamente normales y los especialistas están inciertos sobre el significado de los cambios observados los i 5 cuales en ocasiones están relacionados con infecciones por VPH. Según datos actuales, se ha podido detectar ADN de VPH en más del 95 % de los casos con CC comparado con el 5 al 20 % de los casos identificados como grupos control [Burd EM, 2003, Clin. Microbiol. Reviews 16(1 ): 1 -17; Bosh y de San José, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. Monogr. 31 : 3-13; Muñoz et al., 2003, N. Engl. J. Med. 348: 0 518-527]. Entre los factores bien establecidos que pueden explicar diferencias en el riesgo de desarrollar o no CC se encuentra el tipo de VPH con el que un individuo es infectado [Muñoz et al., 2003, N. Engl. J. Med. 348: 518-527].

Desde su descripción los virus de papiloma se han identificado por las siglas PV (del ingles papillomaviruses) y una o dos letras que indican la especie hospedera, así los que infectan al humano se designan como VPH (en ingles human papillomaviruses ó HPV). Cuando un VPH es identificado se le asigna un número en la secuencia histórica de su descripción (ejemplo HPV-1 , HPV-2, etc.), proceso que durante los últimos 20 años ha integrado el Reference Center for Papillomaviruses del Germán Cáncer Research Center. Actualmente, un "nuevo" tipo viral es considerado cuando se confirma la totalidad del genoma aislado y se demuestra al menos ef 10 % de diversidad en la secuencia de nucleótidos de su gen L1 con respecto a todos los tipos de VPH ya conocidos. También se pueden incluir subtipos y variantes virales cuando existe una variación menor al 0 % en la secuencia del gen L1 con respecto a un tipo viral ya conocido. En un principio el término "subtipo" fue usado para identificar aislados específicos de un tipo viral con divergentes patrones de restricción, actualmente hace referencia a aislados cuya variación en el gen L1 difiere entre un 2 y un 10 % con respecto a algún tipo viral conocido. Una "variante" es reconocida cuando existe una variación en su secuencia menor al 2 % con respecto al aislado original conocido como prototipo o secuencia de referencia, estos cambios pueden ser tan sutiles como la sustitución de un simple nucleótido en una región particular del genoma por ejemplo en el gen E6 o en el LCR (long control región). La gran divergencia identificada a la fecha entre los tipos y variantes virales en las diferentes poblaciones estudiadas sugiere diferencias en sus propiedades biológicas y de patogenicidad [de Villiers et al., 2004, Virol. 324: 17-27; Bernard HU, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S1 -S6].

Después de las primeras investigaciones realizadas por Harold Zur Hausen en 1976 y 1981 las cuales establecen una clara asociación entre VPH y CC, cerca de 200 tipos virales han sido identificados, 1 18 han sido aislados, completamente secuenciados y clasificados de acuerdo con su nicho biológico, su potencial oncogénico y su posición filogenética, el resto solo han sido parcialmente caracterizados [Bernard et al., 2006, Int. J. Cáncer 1 18: 1071 -1076].

Esta diversidad llevó al International Council on Taxonomy of Viruses (ICTV) a una nueva reclasificación taxonómica que actualmente agrupa a estos virus dentro de la gran familia papillomaviridae, un taxa separado de la familia papovaviridae donde previamente eran incluidos. La familia papillomaviridae incluye al género Alfa-papilomavirus considerado el de mayor relevancia clínica por incluir todos los VPH asociados a lesiones genitales y mucosas. Según datos derivados de estudios de casos y controles donde se ha evaluado la asociación entre infecciones por VPH y CC, al menos 40 VPH son capaces de infectar el tracto genital humano. De ellos, los tipos 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82 son considerados como "tipos oncogénicos o de alto riesgo" por su fuerte asociación con la progresión hacia HGSIL y CC, otros más como los tipos 26, 53 y 66 son considerados como probables tipos oncogénicos. Los tipos 6, 1 1 , 40, 42, 43, 44, 54, 61 , 70, 72 y 81 son considerados como de "bajo riesgo" debido a que generalmente son relacionados con lesiones benignas de epitelios y mucosas ó LGSIL, solo los tipos 34, 57 y 83 son considerados como de riesgo aún no determinado [Doorbar J, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S7-S15; Molijn et al., 2005, J. Clin. Virol. 32S: S43-S51].

El genoma de los papilomavirus abarca cerca de 8 kb de ADN circular de doble cadena que comprende varios genes u "open reading frames" (ORF): 8 genes de expresión temprana o "early" (E1 , E2, E4, E5, E6, E7 y E8) cuya expresión se traduce en proteínas implicadas en la regulación, replicación, transcripción y transformación viral y 2 genes de expresión tardía o "late" (L1 y L2) cuya expresión genera las proteínas responsables de la formación de la cápside y la maduración viral. También incluye una región de control denominada LCR o "long control región" encargada de controlar la expresión de los genes tempranos E6 y E7 [Molijn et al., 2005, J. Clin. Virol. 32S: S43-S51 ]. Los genes de expresión temprana difieren notablemente en su secuencia entre los diferentes tipos de VPH, mientras que los genes de expresión tardía presentan notables similitudes entre ellos.

La baja replicación del genoma del VPH siempre en sincronía con la replicación de las células epiteliales del hospedero (más o menos 10-100 por año) y la ausencia de recombinación entre- e intra-tipo, limitan su diversificación y aunque cierta variabilidad en su genoma a sido reportada a consecuencia de mutaciones puntuales, deleciones e inserciones, justo como aquellas de sus hospederos, estos cambios pueden ocurrir fortuitamente y pueden llegar a ser establecidos en una población si favorecen positivamente algún mecanismo viral o cuando son funcionalmente neutrales. Esta inherente estabilidad del genoma del VPH los convierte en un modelo ideal para el análisis de sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos [Bernard et al., 2006, Int. J. Cáncer 1 18: 1071 -1076].

Los análisis realizados a las primeras bases de datos disponibles con las secuencias de los VPH mostraron que el gen L1 , el cual codifica para la proteína mayor de la cápside, es de los más conservados y por ello el más adecuado para construir la taxonomía de la familia. Otros genes como E6 y el LCR también han 5 sido usados para su clasificación llevando a asociaciones taxonómicas similares pero no idénticas. Esta característica convierte a estos genes, especialmente a L1 , en la diana principal de la detección de ADNs virales por métodos "consenso" al contrario de la detección "tipo específica" que utilizará genes con alta variabilidad intratipo como E6 y E7 [Molijn et al., 2005, J. Clin. Virol. 32S: S43-S51]. í o Actualmente, la taxonomía oficial del VPH solo es aceptada si se realiza sobre la base de la comparación de la secuencia de nucleótidos del gen L1 [Bernard et al., 2006, Int. J. Cáncer 1 18: 1071-1076; Doorbar J, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S7-S15].

Se ha documentado una prevalencía del 2 al 44% de infecciones por VPH 1 5 en poblaciones de mujeres alrededor del mundo, una variación que puede ser explicada por diferencias en los rangos de edad de la población analizada y en la sensibilidad de los métodos de detección viral utilizados [Bosh y de San José, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. Monogr. 31 : 3-13], En pacientes con CC, los estudios epidemiológicos indican una prevalencía global de infecciones por VPH superior al 0 96 %. Estos datos son apoyados por estudios basados en análisis de ADN viral y anticuerpos específicos contra antígenos de la cápside que reportan que la mayoría de las mujeres sexualmente activas (>50 %) han sido infectadas con uno o más tipos de VPH en algún momento de sus vidas [Muñoz et al., 2004, Int. J. Cáncer. 1 1 , 278-285], La mayoría de los estudios indican que la relación entre la edad de las pacientes y la prevalencia de infecciones por VPH es alta en edades jóvenes y baja en edades adultas, mientras que la tasa de incidencia de cáncer de cérvix parece ser baja en edades jóvenes y creciente a partir de los 30-35 años de edad [Baseman y Koutsky, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S16-S24], El patrón prevalencia de VPH/incidencia de cáncer sugiere que, a nivel poblacional, el período de inducción entre la exposición al VPH y el cáncer de cérvix es de aproximadamente unos 10 ó 15 años, y que son las portadoras crónicas de una infección por VPH (adquirida probablemente en la juventud) las que constituyen el grupo de alto riesgo para desarrollar cáncer [Baseman y Koutsky, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S16-S24], Al parecer, la frecuencia de infecciones con tipos de VPH de alto riesgo entre mujeres sexualmente activas parece ser mayor a la reportada con tipos de bajo riesgo [Baseman y Koutsky, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S16-S24]. En general, una infección por VPH de alto riesgo registra una duración media de 8 a 16 meses, mientras que para los VPH de bajo riesgo es alrededor de 5 meses [Longworth y Laimins, 2004, Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 68(2): 362-372].

Para evaluar la distribución geográfica de los tipos de VPH asociados al CC se han realizado grandes estudios epidemiológicos coordinados por la International Agency for Research on Cáncer (IARC) los cuales incluyen la participación de varios países en todo el mundo abarcando un gran número de casos. Según estas investigaciones al menos 30 diferentes tipos de VPH fueron identificados, la infección con un simple VPH fue detectada hasta en el 92.2 % de los casos, mientras que las infecciones con más de un tipo viral fue identificada en el 7.8 %, los tipos de VPH identificados con mayor frecuencia fueron en orden descendente los tipos 16, 18, 45, 31 , 33, 52, 58, 35, 59, 56, 39, 51 , 73, 68 y 66, en el caso de infecciones múltiples el 71 % reportó la presencia de los tipos 16 y 8, [Muñoz et al., 2004, Int. J. Cáncer. 1 1 1 , 278-285; Clifford et al., 2003, British J. Cáncer 88: 63-73]. Según las estadísticas al menos el 88 % de los casos con CC en todo el mundo (con más de 10 000 muestras analizadas) puede ser atribuible a la presencia de al menos 8 tipos de VPH (16, 18, 45, 31 , 33, 52, 58 y 35) [Muñoz et al., 2004, Int. J. Cáncer. 1 1 , 278-285; Clifford et al., 2003, British J. Cáncer 88: 63-73].

En los últimos años el CC ha ocupado los primeros lugares en incidencia y mortalidad en muchas partes del mundo llegando a ocupar el primer lugar en la mayoría de los países en desarrollo donde se han registrado hasta el 80 % del total de los casos [Parkin et al., 2001 , Int. J. Cáncer 94: 53-156; Ferlay et al., 2001 , IARC press]. En países desarrollados la incidencia de esta enfermedad ha disminuido debido a la impiementación de efectivos programas de detección oportuna de lesiones precancerosas (hasta en un 80 % durante los últimos 50 años) [Parkin et al., 2001 , Int. J. Cáncer 94: 153-156; Ferlay et al., 2001 , IARC press]. De acuerdo con los últimos registros la incidencia global estimada para el CC es de 470 000 casos por año y aproximadamente 233 000 muertes (1 1 casos por cada 100 000 mujeres en países desarrollados, 44 casos por cada 100 000 mujeres en países en desarrollo [Parkin et al., 2001 , Int. J. Cáncer 94: 153-156; Ferlay et al., 2001 , IARC press]. México es considerado uno de los países con la mayor incidencia de CC (40 a 50 casos por cada 100 000 mujeres) en comparación con países como EUA o Europa cuya incidencia es relativamente baja (1 1 casos por cada 100 000 mujeres) [Hernández-Hernández et al., 2003, Oncol. 90: 310-317; Hildesheim et al., 2001 , J. Nati. Cáncer Inst. 93(4):315-317], Datos epidemiológicos a nivel mundial sugieren que variaciones en el genoma de los VPH representan un factor que puede modificar su potencial oncogénico y tener un impacto directo en la incidencia de CC [Bosh et al., 1992, Int. J. Cáncer. 52: 171 -173; Bosh FX, 2003, SPM 45(3): S326-S339; Shiffman y Castle, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. 95(6): ppE2; Wallboomers et al., 1999, J. Pathol. 189:12-9]. Entre los aspectos que pueden favorecer la transformación viral maligna se encuentran variaciones en la secuencia de las proteínas virales E6 y E7 capaces de interaccionar con proteínas reguladoras del ciclo celular como p53 y pRb y alterar sus funciones.

La mayor variabilidad genómica que ha sido reportada, es para el VPH 16 y el VPH 18 a la cual es factible atribuir su elevado potencial oncogénico [Hildesheim et al., 2001 , J. Nati. Cáncer Inst. 93(4):315-317]. Al menos cinco variantes virales son bien reconocidas para el VPH 16; la asiático americana (AA), la europea (E), la africana (Af), la asiática (As) y la norteamericana (NA), mientras que para el VPH tipo 18 son tres las reportadas; la asiático americana (AA), la europea (E) y la africana (Af). Interesantemente, regiones geográficas con una alta prevalencia de las variantes AA y Af de los VPH 16 y 18 coincide con países con un incremento en la incidencia de cáncer anogenital, en su mayoría países de Latinoamérica, África y algunos de Asia [Bernard et al., 2005, Int. J. Cáncer 1 18: 1071-1076]. En México también se ha relacionado la alta incidencia de CC con la frecuencia de infecciones por HPV 16 (50-70%), siendo sus variantes asiático americana (AA) y Europea (E350G) comúnmente identificadas. En la mayoría de los casos, la variante E ha sido preferencialmente detectada en HGSIL (33%) y CC (24%), mientras que la variante AA solo ha sido identificada en CC, lo que sugiere un mayor potencial oncogénico para esta vanante [Berumen et al., 2001 , J. Nat. Cáncer Inst. 93(17): 1325-1330; Casas et al., 1999, Int. J. Cáncer 83: 499-455; Gonzáles-Losa et al., 2004, J. Clin. Virol. 29:95-98].

La infección por VPH se puede expresar en forma clínica, subclínica o latente. La manifestación clínica habitual de la infección son los condilomas acuminados (CA), verrugas genitales, papilomas venéreos o verrugas venéreas. La infección subclínica por VPH es de gran importancia, ya que al no ser aparentes las lesiones, se facilita el contagio. Las lesiones pueden identificarse mediante visualizaciones colposcópicas tras la aplicación de ácido acético, siendo en general aplanadas y múltiples. La infección latente, sin evidencia clínica ni histológica, sólo es posible detectarla con métodos moleculares de determinación de su ADN o proteínas [World Health Organization, 2002].

El gran número de VPH asociados a enfermedades y al ser considerados el mayor factor de riesgo en el desarrollo de CC ha impulsado el desarrollo de estrategias que faciliten su detección. El primer método enfocado a la detección de lesiones cervicales fue la tinción de papanicolau (Pap test) introducido por el patólogo George Papanicolau en 1949 antes de que la causa del CC fuera reconocida. El Pap test ha sido de gran utilidad en la detección de anormalidades celulares que puedan indicar algún tipo de lesión cervical (en su mayoría a consecuencia de infecciones por VPH) y ha contribuido de manera importante a reducir la incidencia de CC y su tasa de mortalidad en muchas partes del mundo, aunque generalmente solo ha podido ser aplicada con éxito en países desarrollados donde se cuenta con la infraestructura, los recursos necesarios y el personal calificado para poder realizar este tipo de pruebas. De aquí la necesidad de implementar estrategias factibles de aplicar en todos los demás países donde hoy en día ocurre la mayor parte de los casos con CC.

El Pap test continua siendo aplicado en programas masivos de detección, manejo y prevención del CC, sin embargo su eficiencia ha sido ampliamente cuestionada. Aunque los cambios morfológicos asociados a infecciones por VPH son bastantes característicos, el Pap test no puede pronosticar con precisión la presencia viral en base a la morfología de una lesión, además existe una falta de consenso sobre su sensibilidad para detectar lesiones precursoras de CC la cual ha sido reportada entre un 51 y un 65 %, según investigaciones multi-céntricas realizadas a nivel mundial [Cuschieri y Cubie, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S34-S42]. La baja sensibilidad de los Pap test es considerada su mayor limitación y una consecuencia directa de la falta de objetividad en el diagnóstico, resultado de la falta de personal calificado e inadecuadas estrategias en la toma y conservación de las muestras que originan un elevado número de falsos negativos (15-45 %) y falsos positivos (5-15 %) [Lee et al., 2004, Arch. Pathol. Lab. Med. 128: 298-302]. Datos epidemiológicos indican que es posible que el 60 % de los casos de CC estén asociados con ausentes o deficientes programas de prevención y manejo [Cuschieri y Cubie, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S34-S42], La baja eficiencia de la citología en la detección de lesiones precursoras de CC y en el manejo de pacientes con ASCUS favoreció la aplicación de herramientas alternativas para la detección de VPH. En un principio, la detección inmunohistoquímica (IHQ) de antígenos vírales (proteínas estructurales L1 y L2) con anticuerpos mono o policlonales fue una herramienta de diagnóstico viable en la búsqueda de infecciones por VPH en biopsias, sin embargo se vio limitada debido a que solo el 50 % de las lesiones características de infecciones por VPH dan una señal positiva (casos donde los antígenos virales eran expresados), mientras que las infecciones latentes o subclínicas no pueden ser detectadas [Burd EM, 2003, Clin. Microbiol. Reviews 16(1 ): 1 -17], Con el auge de las técnicas de biología molecular enfocadas al diagnóstico preciso de enfermedades en las últimas décadas, surgieron novedosas estrategias de detección y tipificación de VPH. Las primeras herramientas que facilitaron la detección de VPH en exudados cervicales y biopsias fueron la hibridación in situ (ISH) y el Southern blot, basadas en la hibridación de ácidos nucleicos. Ambas metodologías involucran el uso de sondas marcadas dirigidas contra el ADN viral, solo que en la ISH es posible visualizar en el tejido cervical la presencia intracelular de secuencias vírales, mientras que el Southern blot la detección viral requiere el aislamiento previo del ADN de la muestra. Durante años estas herramientas resultaron de gran utilidad en análisis genómicos tempranos del VPH, sin embargo su baja sensibilidad, el gran consumo de tiempo y la gran cantidad de ADN que involucran ha dificultado su aplicación en investigación y en programas masivos de detección de lesiones precursoras y CC [Hubbard RA, 2003, Arch. Pathol. Lab. Med. 127: 940-945.].

Los avances tecnológicos y el potencial papel de un diagnóstico eficiente de VPH en programas de prevención, detección y manejo del CC impulsaron el desarrollo de sistemas de detección viral más sensibles y específicos. Debemos entender por sensibilidad el límite de detección o la más baja cantidad del ADN que podemos identificar en un ensayo y por especificidad el nivel de precisión del ensayo, entre menor sea el número de falsos positivos y falsos negativos mayor es la precisión de la prueba [Hubbard RA, 2003, Arch. Pathol. Lab. Med. 127: 940-945].

Entre los sistemas que lograron incrementar la sensibilidad de detección del VPH resalta la Captura de Híbridos de primera y segunda generación (HC1 y HC2) comercializadas por Digene Corporations, Gaithers-burg, Md. La HC1 fue la primer prueba de detección de VPH aprobada por la FDA (Food and Drug Administration) para la detección de HGSIL y CC pero fue rápidamente sustituida por la HC2 quien ofreció una mayor sensibilidad analítica (entre 6.6 y 17.6 pg/ml dependiendo del tipo de VPH) y un equipo de detección viral más eficiente [Burd EM, 2003, Clin. Microbiol. Reviews 16(1 ): 1 -17].

En la HC2 el ADN proveniente de los pacientes es primero desnaturalizado y mezclado con un grupo de sondas de RNA contenidas en un tubo con solución de hibridación. Este sistema de detección viral incluye dos grupos de sondas de 5 RNA que pueden ser utilizadas ya sea juntas o separadas. El primero o grupo A reconoce tipos virales de bajo riesgo (6, 1 1 , 42, 43 y 44) y el segundo o grupo B reconoce tipos de alto riesgo (16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58 y 68). Si la muestra es positiva para VPH, el ADN viral y el grupo de sondas de RNA producen híbridos ADN-ARN. Estos complejos ADN-ARN son posteriormente í o inmovilizados dentro de viales cargados con anticuerpos que reconocen específicamente a estos híbridos. Los híbridos inmovilizados son reconocidos por un segundo grupo de anticuerpos anti-ADN/ARN marcados con moléculas de fosfatasa alcalina, como múltiples moléculas son conjugadas a cada anticuerpo y múltiples anticuerpos reconocen a cada híbrido se da una substancial I 5 amplificación de señal. Después de una serie de reacciones se produce un producto luminiscente que puede ser cuantrficado como unidades relativas de luz por un luminómetro, estas unidades de luz son proporcionales a la cantidad de ADN viral presente en la muestra [Longworth y Laimins, 2004, Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 68(2): 362-372; Lorincz AT, 1996, J. Obstet. Gynecol. Res. 22: 629-36]. 0 En diversos estudios se resalta la gran sensibilidad (68-95 %) y reproducibilidad de la HC2 comparada con herramientas como la citología, sin embargo las hibridaciones inespecíficas reportadas entre el grupo de sondas de RNA y los VPH contemplados (16, 31 , 33, 35, 6, 11 , 44, etc.) y no contemplados (53, 66, 67) le restan especificidad a la prueba y aunque la HC2 es capaz de detectar infecciones por VPH de alto y bajo riesgo, no permite diferenciar entre ellos a un tipo viral en específico lo que hace necesaria la aplicación otras herramientas de tipificación viral, como secuenciación [Hubbard RA, 2003, Arch. 5 Pathol. Lab. Med. 127: 940-945]. También es importante señalar que aunque esta prueba es capaz de cuantificar la carga viral, esta no se puede corregir en función del número de células existentes en la muestra y dado que solo detecta un grupo de genotipos virales y no el genotipo exacto, la detección de cargas virales altas puede ser el resultado de una infección con participación de múltiples tipos de lo VPH presentes en la muestra. En la actualidad este tipo de proceso exige equipo, que comprende desde suministros básicos de laboratorio hasta equipo tecnológicamente avanzado, como computadoras especiales, condiciones que hacen que el uso de la HCII sea demasiado costoso y difícil de aplicar en muchos establecimientos de bajos recursos. \ 5 Recientemente fue introducida la HC3 y virtualmente promete incrementar la especificidad de detección y discriminación de secuencias virales [Iftner y Villa, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. Monographs 31 : 80-88; Lorincz AT, 2003, SPM 45(3): S376-S387]. Este sistema, al igual que su antecesor la HC2, involucra la 0 formación de híbridos entre ADN del VPH y sondas de ARN que reconocen la secuencia de 13 diferentes genotipos de VPH (16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59 y 68) durante la etapa de hibridación y una detección quimioluminiscente. Una de las diferencias técnicas entre la HC3 y la HC2, es que la HC3 emplea un oligonucleótido de ADN biotinilado y específico para seleccionar secuencias de VPH para la captura de los complejos ADN-ARN en viales cargados con estreptavidina, mientras que la HC2 emplea viales cargados con anticuerpos monoclonales para capturar estos híbridos. El uso de oligonucleótidos de captura en lugar de un anticuerpo inmovilizado disminuye la posibilidad de reconocer híbridos ADN-ARN no específicos que pueden resultar de inadecuados procesos de desnaturalización de las muestras, disminuyéndose el número de falsos positivos. Un estudio preliminar donde se compara el desempeño de la HC3 frente a la HC2 en la detección de HGSIL y CC se sugiere que la HC3 puede ser ligeramente mas sensible e igualmente específica que la HC2 en la detección de HGSIL en mujeres mayores de 30 años con antecedentes de citología negativa por pruebas de papanicolau convencionales, sin embargo es necesario un mayor número de estudios para validar la prueba [Castle et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 (9): 4022-4030].

Una de las herramientas que revolucionó el análisis de los ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa ó PCR (del ingles Polymerase Chain Reaction) considerado el método de amplificación selectiva más sensible, específico y flexible que ha sido desarrollado. Este tipo de tecnología puede ser usada para detección simple y múltiple, cuantificación de la carga viral, secuenciación de ADN y análisis de mutaciones. La PCR logró incrementar la sensibilidad y especificidad de detección de VPH ofrecida por pruebas de diagnóstico anteriores. Un simple ensayo de PCR es capaz de detectar de 10 a 200 copias de VPH por muestra (aunque depende del tipo viral) y amplificar fragmentos específicos de manera exponencial y reproducible.

Esta versatilidad le ha permitido experimentar diversas modificaciones enfocadas a mejorar su potencial de detección. La PCR-tipo especifica fue la primer herramienta de amplificación capaz de identificar con precisión un solo tipo de VPH, sin embargo su eficiencia se vio limitada en muestras con infecciones múltiples donde es necesario realizar varias amplificaciones, hecho que podrían resultar en una labor exhaustiva y cara. Una alternativa a esta limitante fue la aparición de la PCR-general ó consenso la cual facilita la detección simultanea de un amplio número de VPH en una misma reacción de amplificación mediante el uso de iniciadores modificados. La PCR-General ha sido usada durante años para amplificar una región muy conservada dentro del gen L1 que generalmente es usada para identificar diferentes tipos de VPH, entre los primeros iniciadores utilizados con este fin destacan los MY09/1 1 y su versión mejorada los PGMY09/1 1 que identifican y reproducen de manera eficiente un fragmento de 450 pares de bases, posteriormente surgieron los iniciadores GP5/GP6 y su versión mejorada los GP5+/GP6+ que han demostrado ser muy sensibles en la detección de un fragmento viral de 150 pares de bases también dentro del gen L1 comprendido dentro del fragmento de amplificación de los MY09/1 1 [Sotlar et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7): 3176-3184; Kleter et al., 1998, Am. J. Pathol. 153(6): 1731 -1739]. Entre otras modificaciones descritas a la PCR para el diagnóstico del VPH están la PCR en Tiempo Real que permite detectar y determinar la carga viral, aspectos que facilitan la correlación entre el número de copias de ciertos tipos virales y el riesgo de desarrollar lesiones cervicales asociadas a ellos y la PCR de Transcripción Reversa ó RT-PCR que hace posible identificar la expresión de oncogenes vírales de relevancia clínica.

La versatilidad de la PCR en la detección sensible y específica de secuencias genéticas esta bien documentada, sin embargo también se ha reportado que su eficiencia puede verse afectada por procedimientos inadecuados de extracción de ADN, contaminación de la muestra, uso de diferentes ADN polímerasas, el diseño inadecuado de iniciadores o al modificar el tamaño del producto de amplificación, entre otros y aunque la versatilidad de la PCR en general es muy amplia, todos los productos amplificados tienen que ser posteriormente analizados por técnicas adicionales como secuenciación, análisis de polimorfismos a lo largo de fragmentos de restricción e hibridación con sondas específicas incrementando los tiempos y los costos de procesamientos de las muestras [Castle et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 (9): 4022-4030; Sotlar et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7): 3176-3184].

Como podemos observar el uso de técnicas moleculares en la detección de VPH aun con sus limitaciones ofrecen un enorme potencial sin son adecuadamente aplicadas en programas de prevención y control del CC, pues las evidencias documentadas hasta el momento sugieren que la detección viral por técnicas moleculares facilita la identificación de mujeres con un mayor riesgo de CC. La identificación de pacientes en riesgo y su oportuna intervención puede muy probablemente tener un impacto en la reducción de la incidencia y mortalidad por CC. Además se evitarían tratamientos e intervenciones innecesarias que tendrían ! 9 un impacto directo en la calidad de los sen/icios de salud. Todo esto hace necesaria la generación de nuevas estrategias de detección molecular del VPH que incrementen la calidad y la eficiencia de las estrategias de diagnóstico actuales.

El éxito de proyectos como la secuenciación del genoma humano es el resultado de una constante innovación tecnológica, capaz de generar una enorme cantidad de información y novedosas herramientas para procesarla. En este contexto el desarrollo de la genómica, la proteómica, la bioinformática y las técnicas moleculares han experimentado un impulso tecnológico determinante en la investigación del cáncer con importantes consecuencias clínicas en cuanto al diagnóstico, pronóstico y tratamiento de los pacientes. En apenas una década se ha pasado de trabajos basados en el estudio de uno o pocos genes al análisis de genomas en su totalidad. La aplicación más conocida y probablemente la que está generando más datos en estos momentos es la técnica de hibridación mediante arreglos (arrays), Microarreglos {ADN Microarrays) o Biochips de ADN (ADN Biochips), una herramienta que permite realizar diversos análisis genéticos basados en la miniaturización de procesos biológicos.

En biología molecular el término "biochip" describe dispositivos pequeños (chip) que contienen material biológico (bio) y que son empleados para la obtención de una gran cantidad de información biológica en un simple ensayo. En general, el término biochips se emplea para referirse a los dispositivos en los que se alcanza una elevada densidad de integración de material biológico inmovilizado sobre una superficie sólida, por analogía con la elevada densidad de circuitos electrónicos presentes en un chip microelectrónico. En estos dispositivos se dispone el material biológico de una forma regular, ordenada y conocida sobre la superficie. Esta disposición permite el establecimiento de una matriz formada por un conjunto de filas y columnas en el que cada posición es inequívoca y esta identificad como en una matriz matemática. Este tipo de disposición permite el conocimiento del material biológico depositado en cada posición.

En la actualidad se ha producido una explosión de este tipo de tecnología lo que ha llevado a una gran diversificación en las soluciones tecnológicas y en la aparición de numerosas compañías en el sector. Esta diversidad ha permitido el desarrollo de chips que inmovilizan desde ácidos nucleicos, que es lo mas común, hasta tejidos (tissue chip) y proteínas (protein chip).

Un Biochip de ADN consiste en un gran número de moléculas de ADN denominadas "sondas" sobre un sustrato sólido de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones. Las sondas representan material genético de una sola hebra las cuales pueden ser cortas como los oligonucleotidos, o de mayor tamaño como el ADNc (ADN complementario, sintetizado a partir de ARNm) y los productos de PCR (replicación in vitro de secuencias de ADN mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa). Actualmente las sondas también pueden ser anticuerpos los cuales son utilizados en las técnicas de detección de proteínas específicas. Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar (ADN para genotipificación) o ARN para análisis de expresión génica) se marcan por diversos métodos (enzimáticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre la matriz de sondas permitiendo la hibridación (reconocimiento y unión entre moléculas complementarias) de secuencias homologas. Durante la hibridación, las muestras de material genético marcadas, se unirán a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del biochip, permitiendo la identificación y cuantificación del ADN presente en la muestra. El ADN de la muestra que no híbrida o que híbrida inespecíficamente es eliminado en las etapas de lavados. Después del proceso de hibridación, cada imagen es captada con ayuda de un escáner y sometida a procesos de digitalización, normalización y cuantificación con la ayuda de herramientas bioinformáticas que facilitan la interpretación y análisis de la gran cantidad de datos obtenidos a partir de un solo experimento [Bachman y Pluskal, 2004, Drug Discovery Today. 9(2): 61-63; Campas y Katakis, 2004, Trends in Anaytical Chemistry. 23(1 ): 49-62].

Al momento de fabricar un biochip existen determinados elementos que tendrán una importancia crucial en función de las aplicaciones deseadas como: la elección de las sondas, la elección del soporte, la tecnología de inmovilización de las sondas, la técnica de fabricación del arreglo, la estrategia de detección de la hibridación, los sistemas de amplificación de la señal y las herramientas de análisis e interpretación de los datos obtenidos [Cheung et al., 1999, Nature Genetics. 21 : 15- 9].

Entre el tipo de material inmovilizado o "sondas" que son utilizadas en la fabricación de los Biochips de ADN resaltan: a) sondas de oligonucleotidos, suelen ser lineales y de tamaño limitado (entre 11 y 50 nucleótidos para el análisis de expresión diferencial y hasta 100 bases para análisis de expresión génica); b) sondas de PNAs, los ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) son moléculas artificiales con características híbridas de ácidos nucleicos y peptídicos, donde las bases nucleotídicas están unidas a un esqueleto de tipo peptídico en lugar del típico esqueleto de fosforibosas del ADN; c) sondas de ADNc, estos fragmentos de ADN copia se obtienen por transcripción inversa del ARNm de genes concretos; y d) productos de PCR, este tipo de sondas se generan mediante técnicas de PCR donde fragmentos de genes son amplificados de manera exponencial y altamente específica. El tamaño de las sondas obtenidas mediante PCR para fabricar Biochips de ADN suele ser de un tamaño entre 200 y 500 bases.

La deposición de las sondas es un paso fundamental a la hora de diseñar el biochip y esta directamente relacionado con el tipo de soporte y la técnica de fabricación del array. El tipo de soporte en el cual se inmovilizan las sondas suele ser de diferente naturaleza, pero básicamente se pueden dividir en porosos y no porosos.

En los chips "porosos" las interacciones entre el material a inmovilizar y el soporte sólido de inmovilización no tienen por lo general un carácter covalente. Los soportes más comúnmente empleados son pequeñas porciones de geles, o membranas porosas de nylon o nitrocelulosa presentes sobre portaobjetos de cristal.

Los chips lisos o "no porosos" son aquellos en los que el material se encuentra por lo general inmovilizado covalentemente a la superficie sólida que le sirve de soporte, la cual puede ser de cristal o cualquier otra superficie como silicio, plástico u oro.

En la actualidad, debido a su adaptación al mareaje fluorescente, su alta sensibilidad, la posibilidad de realizar distintas reacciones químicas y a su fácil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantado a las membranas como soporte para Biochips de ADN.

Existe un gran número de alternativas a estos soportes todavía en desarrollo, como la inmovilización de ADN sobre geles de archilamida ( h tt : //www .motorola.com), sobre matrices de oro (http://www.interactiva.de) o sobre soportes totalmente diferente a las plataformas de membrana o cristal comercializados por Nanogen (http://www.nanoqen.com) que consisten en conjuntos de electrodos cubiertos por una fina capa de agarosa, los microelectrodos generan un campo eléctrico que controla la deposición de las sondas y la hibridación con las secuencias blanco.

La emergencia global de enfermedades infecciosas ha impulsado el desarrollo de herramientas que faciliten la identificación de un gran número de microorganismos patógenos con relevancia clínica. Dentro de este grupo el VPH ha tenido un gran impacto en el ámbito de salud pública e investigación al ser considerado el mayor factor de riesgo en el desarrollo del CC, una de las neoplasias más frecuentes en mujeres de todo el mundo.

Estudios clínicos, epidemiológicos y moleculares han detectado ADN de VPH tanto en tejido cervical normal como en CC, demostrándose en la mayoría de los casos que un diagnóstico preciso de VPH puede ser de gran utilidad en la detección de lesiones malignas y premalignas del cervix (CC, HGSIL, LGSIL, ASCUS) con un enorme potencial dentro de programas de prevención y manejo adecuado de pacientes [Saslow et al., 2002, J. Clin. 52: 342-362; Manos et al., 1999, JAMA 281 : 1605-1610; Solomon et al., 2001 , J. Nati. Cáncer Inst. 93.293-299].

Como hemos visto un gran número de estrategias clínicas y moleculares han sido descritas para la detección de alteraciones cervicales asociadas a infecciones virales, sin embargo en la mayoría de los casos la plena identificación del VPH en las muestras clínicas depende del método de detección usado ya que algunos como los de hibridación directa han reportado bajos niveles de detección viral y otros como los de amplificación disminuyen su sensibilidad al hacer uso de iniciadores universales con distintas afinidades por diferentes tipos de VPH lo que puede llevar a la obtención de datos incompletos o no precisos en estudios clínicos y epidemiológicos [Manos et al., 1999, JAMA 281 :1605-1610, Solomon et al., 2001 , J. Nati. Cáncer Inst. 93:293-299; Doorbar J, 2005, J. Clin. Virol. 32S: S7-S15], Con el surgimiento de novedosas tecnologías de alto rendimiento como los Biochips de ADN enfocados al análisis preciso de secuencias genéticas con una alta sensibilidad y especificidad se pretende mejorar la calidad en el diagnóstico clínico no solo de infecciones por VPH, sino de un gran número de patógenos de importancia médica.

Aunque los Biochips de ADN fueron introducidos a finales de la década de los 80's por un grupo de científicos como Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y Lubert Stryer, los primeros trabajos que evaluaron el potencial de los Biochips de ADN en la detección y tipificación del VPH en CC y lesiones precursora surgieron casi una década más tarde. El primer Biochip de ADN dirigido a la detección y tipificación del VPH fue denominado HPV Oligonucleotide Microarray, HPV ADN Chip o HPV ADN Microarray desarrollado por la compañía coreana Biomedlab (Seúl, Korea). Este sistema se compone de sondas de oligonucleótidos sobre soportes de vidrio que reconocen a 22 tipos de VPH, 15 de alto riesgo (16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69) y 7 de bajo riesgo (6, 1 , 34, 40, 42, 43, 44), además de un grupo control (la ß-globina). En este tipo de tecnología el ADN de la muestras es sometido a una PCR estándar en presencia de los iniciadores PC03/PC04 y GP5+/GP6+ y de nucleótidos marcados con Cy3 o Cy5 que facilitan la amplificación de fragmentos específicos tanto de la ß-globina como del gen L1 en un amplio número de VPH. Ambos productos de amplificación son sometidos a hibridación sobre el HPV ADN Microarray durante un periodo de 2 horas a 40 °C, cada biochip es posteriormente lavado con 3X SSCP por 2 minutos y 1X SSCP por 2 minutos y secado a temperatura ambiente. Las señales de hibridación pueden ser visualizadas con ayuda de scanners de fluorescencia como el ADN Chip scanner (GSI Lumonics, Ottawa, Canadá). En este tipo de sistemas además de tipificar con una alta precisión un grupo de VPH es posible discriminar ciertos tipos de VPH, detectar infecciones con más de un tipo viral y determinar la carga viral mediante una serie de análisis cuantitativos. En el caso de infecciones con más de un tipo viral, múltiples señales de hibridación pueden ser visualizadas. Aunque la fabricación y procesamiento del dispositivo requiere equipo sofisticado se confía en un gran potencial de desarrollo a futuro. Actualmente la utilidad y practicidad del método continua siendo demostrada, aunque datos preliminares demuestran alta sensibilidad y un amplio rango de detección para muestras con más de un tipo viral [Iftner y Villa, 2003, J. Nati. Cáncer Inst. Monographs 31 : 80-88].

A la fecha son pocos los estudios donde se ha valorado la eficiencia de los HPV ADN microarray en la detección de VPH y por lo general los resultados obtenidos solo han sido comparados frente al ya bien establecido método de detección viral, la HC2. Las primeras investigaciones que evalúan el potencial de los HPV ADN Microarrays en la detección de VPH registran entre otras cosas: una sensibilidad del 94.9 %, comparable con el 93.7 % que ofreció la HC2 y significativamente mayor a la reportada por la citología convencional (77.1 - 83.6 %), una mayor prevalencia de infecciones por HPV en LGSIL (73 - 92 %), HGSIL (83 - 98 %) y CC (91 - 96 %) que en los grupos control (17.6 - 32.4 %), donde el mayor factor de riesgo para CC esta dado por infecciones con los tipos 16 (32 - 54 %), 58 (6.5 - 17.5 %) o 18 (7 - 12.5%) comúnmente identificados, facilito la detección de infecciones múltiples reportadas con menos frecuencia en CC (2.2 -13.7 %) que en las muestras control (7.9 - 24.2 %), LGSIL (16 %) y HGSIL (18 %), pero muy frecuentes en mujeres jóvenes (<40 años de edad), permitió la detección de ADN de VPH de alto riesgo hasta en el 84.8 % de pacientes con ASCUS con una sensibilidad entre el 80 y el 100 %, evalúo la proporción de infecciones por VPH de alto riesgo (64 %) y bajo riesgo (9 %) comparable a la reportada por la HC2 (60 y 12 % respectivamente). En algunos casos los datos derivados de los HPV ADN Microarray también han servido de base para calcular el riesgo relativo de desarrollar algún tipo de lesión cervical con ayuda de análisis de regresión logística múltiple estimando que casos positivos para el VPH 16 podrían tener de 3.6 a 5.8 veces mayor riesgo de desarrollar LGSIL y HGSIL que aquellos casos infectados con otros tipos virales, mientras que los tipos 18 y 58 podrían representar un riesgo de 16.2 y 15.4 respectivamente pero asociado al desarrollo de CC [Kim et al., 2003, Ginecol. Oncol. 89:210-217; Cho et al., 2003, Am. J. Obstet. GynecoL 188: 56-62; An et al., 2003, Cáncer 97: 1672-80; Choi et al., 2003, J. Med. Virol. 71 : 440-445; Liu et al., 2003, J. Biochem. Mol. Biol. 36(4): 349-53; Hwang et al., 2003, Gynecol. Oncol. 90: 51 -56; Park et al., 2004, DNA and Cell Biol 23(2): 1 19-125; Hwang et al., 2004, Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13(12): 2153-2156; Oh et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(7): 3272-3280; Klaassen et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(5): 2152-2160]. En el caso de la estimación del riesgo relativo de desarrollar CC en casos con infecciones simples e infecciones múltiples se reporto que mujeres infectadas con varios tipos de VPH tienen 31 .8 veces mayor riesgo de desarrollar CC que aquellas con infecciones simples cuyo riesgo es solo 19.9 veces mayor, estos datos también revelan que el riesgo de desarrollar CC es mayor para aquellas mujeres con historias de familiares con CC (2.3 veces) y en fumadores (3.2 veces) [Solomon et al., 2001 , J. Nati. Cáncer Inst. 93:293-299].

En la actualidad el HPV ADN Microarray es el único biochip comercialmente viable para detección y tipificación simultanea de VPH y aunque en ninguno de los trabajos analizados con anterioridad se proporciona alguna información no favorable sobre la eficiencia de este tipo de sistemas en la detección del VPH, si esta documentada una baja sensibilidad en la detección directa de secuencias (a no ser que incorpore un paso previo de amplificación génica) y una gran variabilidad en los ensayos (aunque se están realizando grandes esfuerzos en la estandarización de protocolos como paso previo y necesario para obtener procedimientos y dispositivos clínicos viables) [Doménech-Sánchez y Vila, 2004, Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 22(1): 46-54]. También se han detectado inconvenientes durante el análisis de los datos que se generan y su interpretación, los gastos derivados de la adquisición directa de un arrayer y todos los gastos adicionales asociados a las infraestructuras y materiales, además de que su diseño y manejo puede resultar laborioso y consumir gran cantidad de tiempo y recursos (económicos y humanos) [Doménech-Sánchez y Vila, 2004, Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22(1 ): 46-54]. Por el momento el HPV ADN Microarray se utiliza fundamentalmente en investigación, pero gracias al potencial que ofrecen pronto podrán ser aplicados en la clínica como herramientas de diagnóstico o en las evaluaciones de riesgo.

La versatilidad de los HPV ADN Microarrays esta generando que muchos 5 laboratorios de investigación exploren la posibilidad de aplicar esta tecnología al diagnóstico molecular pero a través de la generación de sus propios arreglos. Una de las opciones implementadas con esta finalidad es un estudio piloto en la preparación de sondas para Biochips de ADN dirigido a la detección de tipos y subtipos de VPH tomando como modelos a los virus 6, 1 1 , 16 y 18 [Liu et al., í o 2003, J. Biochem. Mol. Biol. 36(4): 349-5]. La implementación de este dispositivo mostró una alta especificidad y reproducibílidad, sin embargo para garantizar su eficiencia es necesario mantener condiciones particulares de hibridación y lavado sino se desean deformaciones en el biochip o variaciones en las señales de hibridación. 1 5 Otro interesante trabajo que propone el desarrollo y evaluación clínica de un Biochip de ADN capaz de discriminar al menos 15 tipos de alto riesgo y 12 tipos de bajo riesgo [Oh et al., 2004, J. Clin. Microbiol. , 42(7): 3272-3280]. La aplicación clínica de este sistema ha mostrado ser muy específica y reproducible (hasta 100 0 veces más sensible que la PCR para detectar VPH presentes en muestras de pacientes con carcinomas de garganta). La funcionalidad de este sistema fue validada en las líneas celulares Hela, Caski y SiHa positivas para VPH y dos líneas celulares C33A y A549, negativas para VPH. Un dato interesante es que con el conocimiento previo del número de copias virales en las líneas celulares, fue posible calcular la carga viral relativa de acuerdo con diferencias registradas en la intensidad de la señal.

Otra de las alternativas reportadas es un Biochip de ADN (high-density ADN Microarray) fabricado a partir de oligonucleótidos tipo específicos inmovilizados sobre ADN Microarrays de alta densidad y mediante estrategias de detección inmunohistoquímica. Según sus resultados, este dispositivo permitió detectar un total de 53 diferentes tipos de VPH, 45 tipos mediante el uso de una simple sonda y 8 tipos a partir de una combinación de ellas, sin embargo en algunos casos no fue posible la discriminación de tipos virales filogenéticamente relacionados, al menos con el uso de un solo tipo de sonda tipo-específica [Klaassen et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(5): 2152-2160].

El más reciente Biochip de ADN aplicado a la detección y tipificación de VPH fue capaz de reconocer 14 VPH de alto riesgo (16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68) mediante el uso de 24 sondas que reconocen un fragmento del gen L1 ubicada dentro de la región de los MY09/1 1 el cual fue amplificado con iniciadores previamente marcados con Cy3 mediante reacciones de PCR asimétrica [Albrecht et al., 2006, J. Viral. Methods, in press]. Este dispositivo fue probado en un amplio rango de anormalidades citológicas como HGSIL, LGSIL y ASCUS demostrando una alta sensibilidad y especificidad. El uso de iniciadores marcados con Cy3 en lugar de los comúnmente utilizados dNTP-Cy3 simplifico enormemente los protocolos de mareaje. En manos de los autores el Biochip de ADN parece ser una técnica reproducible y rentable, sin embargo todavía es necesario validar adecuadamente su funcionalidad.

Finalmente otra de las opciones propuestas en la detección viral sobre Biochips de ADN es la detección bioelectrónica del VPH mediante el sistema eSensor™ que se perfila como una plataforma eficiente en la detección de múltiples patógenos [Vernon et al., BMC Infect Diseases 3(12): 1-9]. El principio básico de la detección bioelectrónica de ADN involucra la formación de un circuito electrónico capaz de identificar hibridación de ácidos nucleicos. Este sistema fue concebido como un Biochip de ADN de baja densidad, contiene 36 electrodos de oro cargados con sondas de captura de ADN que reconocen secuencias específicas del gen L1 en diversos tipos de VPH. El ADN del VPH en las muestras es reconocido por las sondas de captura sobre la superficie del eSensor™ y por otras sondas específicas marcadas con moléculas de ferroceno quienes al formar híbridos generan una corriente eléctrica que puede ser identificada con un medidor de voltaje. Este sistema ha mostrado una sensibilidad del 86% en la detección viral la cual es comparable a la que brindan la HCII y los Biochips de ADN, aunque resultar ser muy costosa. El potencial de los Biochips de ADN también ha sido aplicado a la detección molecular de variantes específicas del VPH tipo 16, a la detección de genes diferencialmente expresados en CC y en la determinación de genes celulares que son regulados por oncoproteinas codificadas por estos virus [Germignani et al., 2004, J. Virologic Methods 19: 95-102; Shim et al., 1998, Clin. Cáncer Res., 4: 3045-3050; Duffy et al., 2003, Virol. 314: 196-205; Hudelist et al., 2005, Cáncer Genet. and Citogenet, 158: 35-42; Ahn et al., 2004, Gynecol. Oncol. 93: 41-48].

Es claro que los HPV ADN Microarrays representa el método de detección y tipificación del VPH más eficiente que ha sido desarrollado, pero su casi nula aplicabilidad en los sistemas de salud actuales sugiere la implementación de nuevas alternativas que en términos de sensibilidad, especificidad, practicidad y economía aseguren su aplicación clínica y un diagnóstico preciso. En consecuencia, es necesario concentrar grandes esfuerzos al desarrollo y validación de nuevos métodos que cubran estas necesidades.

En México desde hace 20 años, la mortalidad por esta neoplasia se mantiene constante a pesar de la existencia de un programa poblacional de detección oportuna de CC. Entre los factores identificados como responsables del escaso efecto del programa de prevención de CC resalta su baja cobertura a nivel poblacional (que es alrededor del 15%), su eficiencia ya que se estima que el programa sólo previene el 13% de los casos potencialmente prevenibles y la deficiente calidad de las muestras clínicas procesadas (http://www.insp.mx). De aquí la importancia de generar herramientas diagnósticas que nos permitan mejorar la calidad de los programa de Diagnóstico Oportuno de CC, una de las neoplasia con el mayor potencial demostrado de prevención secundaria.

El CC es una enfermedad que puede ser totalmente prevenible y curable si se cuenta con métodos de seguimiento adecuado en mujeres y un diagnóstico, tratamiento y seguimiento apropiados. Sería sumamente útil poder realizar un tamizaje adecuado y diagnosticar a las mujeres infectadas por tipos de VPH de alto riesgo, ya que ello facilitaría una vigilancia más estrecha de aquellas persistentemente infectadas y con mayor riesgo de desarrollar CC.

Por todos estos aspectos y tomando en cuenta el notable incremento de infecciones por VPH en los últimos años, así como la asociación etiológica de VPH de alto riesgo en el desarrollo de CC, el objetivo de este trabajo fue aplicar la tecnología de los Biochips de ADN a la detección y tipificación molecular de VPH considerados de alto riesgo en el desarrollo de CC aplicando novedosas herramientas en el diseño y detección específica de secuencias que de manera confiable faciliten la identificación de infecciones por VPH de mayor riesgo en CC, además de proporcionar novedosas alternativas al diagnóstico molecular de enfermedades como el CC cuya aplicación resulta factible tanto en el campo de la investigación básica como en los servicios de salud.

En este sentido nuestro grupo de trabajo ha venido desarrollando una novedosa estrategia para la detección de señales de hibridación sobre microarreglos de oligonucleótidos conocidos como sistemas genesensor (genosensor array). El sistema genesensor aplica técnicas de hibridación múltiple conocidas como "hibridación en tándem" o "hibridación con alineamiento contiguo" como una alternativa muy eficiente en la identificación de mutaciones.

Mientras que en los microarreglos de oligonucleótidos convencionales la secuencia interrogada o DNA blanco es sometido directamente a hibridación sobre un conjunto de sondas inmovilizadas sobre la superficie del array, en el sistema genesensor el DNA blanco primero es pre-alineado con un par de secuencias complementarias previamente marcadas denominadas oligonucleótidos estabilizadores (hibridación en tándem). Los oligonucleótidos estabilizadores reconocen una región contigua al sitio de reconocimiento de la sonda en el DNA blanco formando lo que se conoce un dúplex parcial, donde solo el espacio que corresponde al tamaño de la sonda de captura es libre para poder hibridar con ellas sobre la superficie del array. Algunas de las ventajas de proporciona la hibridación en tándem sobre la hibridación tradicional son: el uso de secuencias cortas favorece la discriminación de mutaciones puntuales, el uso de oligonucleótidos estabilizadores evitan la formación de estructuras secundarias en el DNA blanco que pudieran interferir con el sitio de reconocimiento de la sonda, incrementando su estabilidad y la posibilidad de hibridar de manera específica con su secuencia complementaria, además brinda la posibilidad de detectar la hibridación ya sea mediante el mareaje del DNA blanco o bien, de los oligonucleótidos estabilizadores con la posibilidad de incrementar el potencial de detección sobre los microarreglos.

Nosotros proponemos una novedosa alternativa para la detección molecular de los VPH de alto riesgo en CC que incluye el uso de ambas herramientas moleculares. De acuerdo con nuestra estrategia, el diagnóstico molecular del VPH sobre Biochips de DNA, requirió la selección de pequeñas sondas con la suficiente variabilidad genética para distinguir específicamente un tipo viral de otro. Cada una de las sondas fue seleccionada con la ayuda de diversas herramientas bioinformáticas con la finalidad de garantizar el reconocimiento específico de su secuencia complementaria primero en sistemas de hibridación virtual (in silico), después en secuencias de DNA blanco de origen sintético que simularon la región viral de interés y finalmente en secuencias de DNA proveniente de líneas celulares positivas para VPH de alto riesgo y de muestras clínicas con CC. Las sondas seleccionadas fueron inmovilizadas sobre laminillas de portaobjetos convencionales representando el Biochip de DNA donde se realizó el diagnóstico molecular de los VPH. La detección de las señales de hibridación entre las sondas inmovilizadas y las secuencias de DNA blanco viral sobre la superficie del Biochip se efectuaron en base al uso de oligonucleótidos estabilizadores cuya secuencia reconoce de manera específica dos regiones, la primera corresponde a su secuencia complementaria en el DNA blanco viral de interés que es contigua al sitio de reconocimiento de las sondas y la segunda es una secuencia complementaria a un pequeño fragmento de DNA marcado con Cy3 denominado reportero universal, responsable final de proporcionar las señales de hibridación. En nuestro caso el uso de oligonucleótidos estabilizadores con estas características representa una novedosa innovación a los sistemas convencionales de detección y tipificación de VPH sobre Biochips de DNA, ya que mientras el oligonucleótido estabilizador contenga la secuencia de reconocimiento del reportero universal marcado prácticamente permite la detección de cualquier tipo viral sobre este tipo de plataformas, con la ventaja adicional que resulta de usar solo una secuencia marcada con Cy3 para la detección de cualquier tipo de VPH, que marcar un número indeterminado de secuencias de DNA blanco viral o iniciadores específicos para VPH, esto sin considerar que además, el uso del oligonucleótido estabilizador favorece la detección y tipificación específica de los VPH al proporcionar una mayor estabilidad a la secuencia de DNA blanco e incrementar la posibilidad de que este dúplex parcial encuentre su sonda complementaria en la superficie del Biochip de DNA. Todas estas ventajas que ofrece el Biochip de DNA aplicadas a la detección y tipificación de VPH pueden representar una herramienta diagnóstica muy eficiente en la práctica clínica y en investigación ya que demostró ser muy específica en la identificación viral, con costo accesible y fácil de desarrollar.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la presente invención, se proporcionan Biochips de ADN para la detección y tipificación molecular del virus del papiloma humano.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una metodología para la detección de cáncer cervical mediante la utilización de Biochips de ADN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 . Hibridación del DNA blanco sintético DNAbs-L1/18, su correspondiente oligonucleótido estabilizador ONEST/18 y el REP/UNI-Cy3 sobre los Biochips de DNA. A la izquierda se muestra el patrón de inmovilización de las sondas sobre la superficie del Biochip de DNA, a continuación, diferentes concentraciones del DNAbs-L1/18, fueron evaluadas sobre los Biochips de DNA. Estas señales fueron registradas después de 4 horas de hibridación en una solución con SSC 3X a 37 °C.

Figura 2. Hibridación del DNA blanco sintético DNAbs-L1/16, su correspondiente oligonucleótido estabilizador ONEST/16 y el REP/UNI-Cy3 sobre los Biochips de DNA. A la izquierda se muestra el patrón de inmovilización de las sondas sobre la superficie del Biochip de DNA, a continuación, diferentes concentraciones del DNAbs-L1/16, fueron evaluadas sobre los Biochips de DNA. Estas señales fueron registradas después de 4 horas de hibridación en una solución con SSC 3X a 37 °C.

Figura 3. Hibridación del DNA blanco sintético DNAbs-L1/58, su correspondiente oligonucleótido estabilizador ONEST/58 y el REP/UNI-Cy3 sobre los Biochips de DNA. A la izquierda se muestra el patrón de inmovilización de las sondas sobre la superficie del Biochip de DNA, a continuación, diferentes concentraciones del DNAbs-L1/58, fueron evaluadas sobre los Biochips de DNA. Estas señales fueron registradas después de 4 horas de hibridación en una solución con SSC 3X a 37 °C.

Figura 4. Hibridación de las secuencias de DNA blanco sintético DNAbs-L1/16, DNAbs-L1/18 y DNAbs-L1/58, sus respectivos oligonucleótidos estabilizadores ONEST/16, ONEST/18 y ONEST/58 y el reportero universal marcado REP/UNI-Cy3 sobre los Biochips de DNA. A la izquierda se muestra el patrón de inmovilización de las sondas sobre la superficie del Biochip de DNA, a continuación podemos observar las señales de hibridación obtenidas a partir de tres diferentes combinaciones entre las secuencias de DNA blanco sintético con sus respectivos oligonucleótidos estabilizadores y el reportero universal marcado. Estas señales fueron registradas después de 4 horas de hibridación en una solución con SSC 3X a 37 °C.

Figura 5. Amplificación de fragmentos del gen L1 a partir de las líneas celulares Caski y SiHa positivas para VPH 16 y de un DNA de VPH 18 clonado en el vector pUC 8 por PCR convencional modificando algunas condiciones de temperatura.

Figura 6. Detección y tipificación específica de fragmentos del gen L1 de los VPH 16 y 18 obtenidos a partir de las líneas celulares Caski, SiHa y un DNA de VPH 8 sobre los Biochips de DNA.

Figura 7. Detección y tipificación de fragmentos del gen L1 de los VPH 16 y 18 amplificados a partir de diferentes concentraciones de DNA molde en muestras clínicas con CC sobre los Biochips de DNA.

Figura 8. Validación del Biochip de DNA en la detección y tipificación del VPH 16 presente en muestras clínicas con CC. Se muestra las señales de hibridación obtenidas a partir de la hibridación de amplificados positivos para el VPH 16 sobre los Biochips de ADN con la respectiva secuencia del fragmento de amplificación que fue analizado.

Figura 9. Validación del Biochip de DNA en la detección y tipificación del VPH 18 presente en muestras clínicas con CC. Se muestra las señales de hibridación obtenidas a partir de la hibridación de amplificados positivos para el VPH 18 sobre los Biochips de ADN con la respectiva secuencia del fragmento de amplificación que fue analizado.

Figura 10. Validación del Biochip de DNA en la detección y tipificación del VPH 58 presente en muestras clínicas con CC. Se muestra las señales de hibridación obtenidas a partir de la hibridación de amplificados positivos para el VPH 58 sobre los Biochips de ADN con la respectiva secuencia del fragmento de amplificación que fue analizado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A la fecha solo un Biochip de DNA dirigido a la detección y tipificación de VPH es viable a nivel comercial, el HPV Oligonucleotide Microarray también conocido HPV DNA Chip Microarray. La utilidad y practicidad de este método continua siendo evaluada, aunque datos preliminares demuestran una alta sensibilidad y un elevado potencial de detección de muestras con más de un tipo viral. Aunque en este tipo de plataforma es posible imprimir un gran número de oligonucleótidos tipo-específicos que permiten tipificar con mayor precisión a los VPH, realizar un análisis semicuantitativo de la señal y por lo tanto de la carga viral, aún se reporta la presencia de reacciones de hibridación inespecíficas por lo que las señales pueden estar sujetas a variación haciendo necesaria la aplicación de algunas estrategias de normalización, además el presente formato requiere de equipo muy costoso, lo que de entrada reduce su aplicación en laboratorios clínicos y de investigación. En estudios donde se ha comparado la eficiencia del HPV oligonucleotide microarray frente a otros métodos usados para la detección de VPH, se ha reportado que su efectividad es comparable a la que ofrece la HC2, la PCR-RFLP y la Real-Time PCR.

En un ensayo el nivel de sensibilidad se define como el límite de detección o la cantidad mínima de DNA disponible que puede ser detectada, mientras que la especificidad determina el nivel de precisión. Actualmente los HPV oligonucleotide microarrays reportan una gran sensibilidad en la detección de HGSIL y CC (entre el 78.5 y 96 %) muy similar a la HC2 (entre el 78 y 95 %) y superior a la citología (entre el 64.5 y 88 %), sin embargo la especificidad que ofrecen continua siendo baja (entre 52 y 74 %) [Kim et al., 2003, Ginecol. Oncol. 89:210-217; An et al., 2003, Cáncer 97: 1672-80].

Se ha demostrado que la detección molecular del VPH como una prueba adyuvante al Papanicolaou es un indicador más sensible para identificar HGSIL que la citología convencional y que una combinación de ambas ofrece casi el 100% de sensibilidad. Las pruebas para determinación de VPH posiblemente se conviertan en la estrategia más común de tamizaje en programas poblacionales de detección oportuna de cáncer, mientras tanto la investigación continua para mejorar la sensibilidad y costo efectividad de los métodos de detección de estos virus (Lorincz AT, 1996, J. Obstet. Gynecol. Res. 22: 629-36) Actualmente, la HC2 es capaz de detectar entre 5X104 Y 5X 07 copias de DNA viral, sin embargo su sensibilidad no cubre el rango observado en las muestras clínicas (alrededor de 102 a 109 copias) [Cavuslu et al., 1996, J. Med. Virol. 49: 319-324). En este sentido el Biochip de DNA que proponemos fue capaz de detectar de 3 400 a 204 000 copias de ADN viral en amplificados provenientes de las líneas celulares Caski y SiHa a partir de 20 ng y hasta 300 ng de DNA celular y hasta 17 000 copias virales en amplificados provenientes de 100 ng de DNA celular de muestras clínicas con CC, lo que se traduce en una sensibilidad tres veces mayor a la reportada por la HC2. Estos resultados sugieren que el Biochip de DNA que proponemos para la detección y tipificación de VPH de alto riesgo es más sensible que otros sistemas de detección viral como la HC2 y mucho más específico, con la ventaja adicional de ser una estrategia factible de aplicar en cualquier laboratorio clínico y de investigación a un costo mucho más accesible.

La utilidad clínica de la determinación molecular del VPH se ha incrementado en los últimos años siendo de gran utilidad en la vigilancia de mujeres con ASCUS y su estrategia de manejo, en la elección de tratamientos más adecuados y el más importante, como una prueba adicional a la citología en programas poblacionales de detección oportuna de CC. Actualmente existen muchos protocolos descritos para reconocer el VPH, pero aún se dispone de escasa información acerca de su sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. La aplicación de tecnología de alto rendimiento como los Biochips de DNA al diagnóstico clínico pretende implementar métodos fiables que permitan detectar la mayoría de las infecciones (incluyendo infecciones subclínicas y latentes) con una mayor sensibilidad y especificidad, con la ventaja de discriminar e identificar en un mismo ensayo ciertos VPH de alto riesgo y la presencia de infecciones con más de un tipo viral. Este Biochip de DNA representa una poderosa herramienta molecular que aplicada ai tamizaje primario de lesiones cervicales en conjunto con otras estrategias de diagnostico convencional como el papanicolaou y la colposcopía podría ser de gran utilidad para reducir la incidencia y mortalidad de CC.

La invención será ahora descrita con referencia a ejemplos específico. Ellos son meramente para propósitos ilustrativos: ellos no intentan de forma alguna limitan en cualquier sentido el propósito de la invención descrita. Dichos ejemplos constituyen hasta ahora el mejor método actualmente contemplado para la práctica de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Validación del Biochip de ADN utilizando secuencias sintéticas que simulan la secuencia de referencia para los VPH tipos 16, 18, y 58. Todos los oligonucleótidos de ADN usados en el desarrollo del Biochip de ADN (sondas, ADN blanco, oligonucleótidos estabilizadores e iniciadores específicos) fueron sintetizados por MWG-BIOTECH, Inc (Mendenhall, USA). El biochip de ADN propuesto contiene oligonucleótidos para los VPH tipos 16 (SEQ ID NO. 1 ), 18 (SEQ ID NO. 2) y 58 (SEQ ID NO. 3). Para implementar los Biochips de ADN se usaron como matriz de soporte laminillas para microscopio VWR microslides (selected, precleaned Superfrost Plus) comercializados por VWR Scientific, West Chester, Pa. Sobre estas laminillas fueron depositadas las sondas sintéticas de DNA que contenían la secuencia interrogada en los VPH de alto riesgo. Los VWR microslides (selected, precleaned Superfrost Plus) son fabricados mediante procesos que adhiere moléculas de poli-lisina sobre la superficie de la laminilla, este hecho le proporciona una carga positiva permanente lo que favorece la inmovilización de las sondas y como son resistentes al calor resultan ideales en procesos de hibridación (http.7/ http.7/uk. wr.com/app/search/Search). Para la inmovilización de las sondas sobre la matriz de soporte, las sondas 16-SN (SEQ ID NO. 1 ), y 18-SN (SEQ ID NO. 2) y 58-SN (SEQ ID NO. 3) fueron diluidas en agua inyectable a una concentración de 20 pmol/µ?. y fueron aplicadas en hileras de cuatro gotitas de 200 ??- cada una sobre un patrón previamente definido buscando garantizar la reproducibilidad de los resultados. Mediante este procedimiento se obtiene una densidad aproximada de 10 0-1011 moléculas/mm2 que corresponde a un espacio intermolecular de aproximadamente 30-100 °A. Una vez que las sondas fueron depositadas sobre las laminillas se dejaron secar al aire libre y se almacenaron en un desecador a temperatura ambiente. Previo al proceso de hibridación estas laminillas fueron puestas en contacto con un agente bloqueador (Tripolifosfato 10 mM) durante 1 hora, posteriormente se dejaron secar al aire libre y nuevamente fueron almacenados. Estos dispositivos representan los Biochips de DNA utilizados durante los procesos de hibridación.

SEQ ID NO. 1 GTTTCTGAAGTAGATATGGCA (16-SN) SEQ ID NO. 2 CCAGGTACAGGAGACTGTGTAGAA (18-SN) SEQ ID NO. 3 GTACCTTCCTTAGTTACTTCA (58-SN) Para validar la funcional del Biochip de ADN en la detección y tipificación molecular de VPH, se amplifico una región del gen L1 de los tipos de VPH 16, 18 y 58 considerados de alto riesgo en CC ubicada dentro de la región de los MY09/1 1 , también se amplifico un fragmento del gen de la ß-Globina el cual fue usado como control interno. El tamaño del amplificado para VPH corresponde a un producto de PCR de entre 181 y 188 pb (ntds 6558-6744), mientras que para la ß-Globina fue de 1 10 pb. Tres pares de iniciadores tipo-específicos de entre 20 y 24 ntd fueron utilizados para los VPH de alto riesgo; los L1 -16f (ntds 6584-6603, SEQ ID NO. 4) y L1 -16r (ntd 6767-6744, SEQ ID NO. 5), los L1-18f (ntds 6558-6578, SEQ ID NO. 6) y L1-18r (ntd 6744-6721 , SEQ ID NO. 7) y los L1 -58f (ntds 6588-6608, SEQ ID NO. 8) y L1 -58r (ntd 6768-6745, SEQ ID NO. 9), en el caso de la ß-Globina se usaron los ya reportados PC03 y PC04 (SEQ ID NO. 10, y SEQ ID NO. 1 1 , respectivamente).

SEQ ID NO. 4 GCACAGGGCCACAATAATGG (L1-16Í) SEQ ID NO. 5 GAAAAATAAACTGTAAATCATATT (L1 -16r) SEQ ID NO. 6 GGCACAGGGTCATAACAATGG (L1 -18f) SEQ ID NO. 7 G AAAAAT AA AC TG C A AATC AT ATT (L1 -18r) SEQ ID NO. 8 CGTGCACAAGGTCATAACAAT (L1 -58f) SEQ ID NO. 9 GAAAAACAAACTGTAAGTCATATT (L1 -58r) SEQ ID NO. 10 ACACAACTGTGTTCACTAGC (PC03) SEQ ID NO. 1 CAACTTCATCCACGTTCACC (PC04) Durante los procesos de PCR convencional y con ia finalidad de establecer las condiciones óptimas del producto de amplificación deseado, dos condiciones experimentales distintas denominadas PCR-1 y PCR-2 fueron inicialmente evaluadas. Tanto la PCR-1 , como la PCR-2 contenían los tres pares de iniciadores tipo-específicos previamente propuestos (L1 -16f/r, L1 -18f/r, L1 -58f/r) en la misma mezcla de reacción, pero cada una fue evaluada bajo diferentes condiciones de temperatura. La mezcla de reacción contenía: 50 pmol de cada uno de los iniciadores, al menos 100 ng de DNA molde, 50 pmol de cada uno de los iniciadores, 1.25 U Taq polimerasa (Fermentas Inc), 10 mM de dNTPs, 1 .5 mM MgCI2 y 5 pL de 10X Taq Buffer with (NH4)2S04 [750mM Tris-HCI pH 8.8, 200mM (NH4)2S04 y 0.1 % (v/v) Tween 20], todo en un volumen final de 50 µ?_. Las temperaturas programadas para la PCR-1 fueron: 94° C por 5 minutos, seguidos de 40 ciclos a 94° C por 30 segundos, 48° C por 1 minuto y 72° C por 1 minuto con una extensión final a 72° C por 5 minutos, mientras que para la PCR-2 fueron: 94° C por 5 minutos, seguidos de 40 ciclos a 94° C por 30 segundos, 55° C por 1 minuto y 72° C por 1 minuto con una extensión final a 72° C por 5 minutos.

Cada uno de los productos de amplificación obtenidos mediante técnicas de PCR convencional fue sometido nuevamente a procesos de amplificación pero usando solamente uno de los iniciadores, con la finalidad de generar un gran número de secuencias de ADN viral de cadena sencilla previo a su hibridación sobre los Biochips de ADN. Esta PCR asimétrica denominada PCR-1 cs se llevo acabo bajo las mismas condiciones experimentales que la PCR-1 solo que 4 µ?. del volumen final de reacción de la PCR convencional fue usado como DNA molde y solo los iniciadores sentido L1 -16f, L1 -18f y L1 -58f fueron utilizados.

Una vez que contamos con los Biochips de DNA lo primero que hicimos fue establecer un control de hibridación interno que nos permitiera evaluar la calidad de la hibridación. Este control interno nos permitirla saber por un lado que las condiciones de hibridación fueron adecuadas y suficientes para que el reconocimiento e hibridación entre las secuencias involucradas se realizara, así como para confirmar con mayor certeza la presencia de secuencias virales de alto riesgo sobre la superficie del Biochip de DNA.

En este caso nosotros usamos como control de hibridación interno el producto de amplificación del gen de la ß-Globina cuyos iniciadores fueron previamente marcados con Cy3. Diferentes concentraciones del producto de amplificación del gen de la ß-Globina fueron sometidas a hibridación sobre la superficie de los Biochips de DNA con rangos que fueron desde los 2.5 pmol/µ?. hasta los 200 pmol/µ?-. En este caso las hibridaciones se realizaron en una solución de hibridación con SSC, a temperatura ambiente y en ausencia de secuencias de DNA viral.

Según los patrones de hibridación obtenidos sobre la superficie del Biochips de DNA, la hibridación de las secuencias del gen de la ß-globina resulto ser muy específica y muy sensible. No se registraron hibridaciones inespecíficas aparentes y la intensidad de la señal pudo ser visualizada aún en concentraciones mínimas del producto de amplificación del gen de la ß-Globina bajo condiciones de hibridación simples. Estos resultados sugieren que este tipo de secuencias pueden ser usadas como un buen control durante los procesos de hibridación ya que la unión entre sus secuencias es posible aún cuando las condiciones de hibridación fueron mínimas. Como en este caso desde los primeros ensayos se registro una gran especificidad y estabilidad de unión entre los fragmentos de amplificación del gen de la ß-Globina y su sonda complementaria ß-Gson sobre la superficie del Biochip de DNA, no fue necesario hacer grandes modificaciones a las condiciones de hibridación ya que estas siempre pudieron ser visualizadas aún en condiciones de hibridación mínimas, un aspecto fundamental que nos fue de gran utilidad durante la estandarización y validación de nuestro sistema, siendo un indicador ideal de calidad durante los procesos de hibridación.

La detección de las señales de hibridación viral sobre los Biochips de DNA fue posible gracias al uso de oligonucleótidos de 18 bases marcados en su extremo 5' con moléculas fluorescentes Cy3 a los que denominamos REP/UNI-Cy3 y a la aplicación de estrategias de hibridación múltiple. En este sistema de detección, al mismo tiempo que las sondas reconocen e hibridan con su secuencia complementaria en el ADN blanco sintético (VPH 16: (ADNbs-U/16, SEQ ID NO. 12; VPH 18. ADNbs-L1/18, SEQ ID NO. 13; y VPH 58: ADNbs-L1/58, SEQ ID NO. 14), también lo hacen los oligonucleótidos estabilizadores tipo-específico (ONEST/16: SEQ ID NO. 15; ONEST/18: SEQ ID NO. 16; ONEST/58: SEQ ID NO. 17), quienes también son reconocidos por los REP/UNI-Cy3 (SEQ ID NO. 18), y que son los que finalmente permiten detectar la hibridación entre secuencias específicas de VPH sobre los Biochips de DNA. De esta manera, mientras se cuente con secuencias auxiliares como los oligonucleótidos estabilizadores que por un lado sean capaces de unirse a un DNA blanco de interés como a secuencias reporteras como los RE/UNI-Cy3 podrán ser identificados en procesos de hibridación múltiple sobre Biochips de DNA, evitando entre otras cosas, mareajes innecesarios en las secuencias analizadas.

SEQ ID NO. 12 GCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACT GTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTA CTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGG GGAGGAA TATGATTTACAGTTTATTTTTC (ADNbs-L1/16 ).

SEQ ID NO. 13 GGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTAC TGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACA GTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAG ACATGTTGA GGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTC (ADNbs-L1/18).

SEQ ID NO. 14 CGTGCACAAGGTCATAACAATGGCATTTGCTGGGGCAATCAGTTATTTGTT ACCGTGGTTGATACCACTCGTAGCACTAATATGACATTATGCACTGAAGTA ACTAAGGAAGGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATG TTGAAGAA TATGACTTACAGTTTGTTTTTC (ADNbs-L1/58).

SEQ ID NO. 15 GCCTTTACGAGCCAGCACCCCCATGTCGTAGGTACTCCTTAAAGTTAGTAT TTTTATATGTA (ONEST/16) SEQ ID NO. 16 GCCTTTACGAGCCAGCACCAACATGTCTGCTATACTGCTTAAATTTGGTAG CATCATATTGC (ONEST/18) SEQ ID NO. 17 GCCTTTACGAGCCAGCACCAACATGACGTACATATTCCTTAAAATTATCATT TTTATAT (ONEST/58).

SEQ ID NO. 18 GTGCTGGCTCGTAAAGGC (REP/UNI-Cy3 (marcado con Cy3)).

Las reacciones de hibridación sobre los Biochips de DNA fueron evaluadas básicamente en solución citrato salina (SSC 3X / SDS 0.1 %) bajo diferentes condiciones experimentales, sin embargo una solución de hibridación en presencia de cloruro de tetrametil amonio (TMAC) 5M (Sigma Chemical, Co) fue también evaluada. Las condiciones de hibridación evaluadas en ambos casos se enlistan en las tablas I y II.

Tabla I.

Reactivo Concentración Volumen (µ?_) TMAC t 5M 24 SDS t 10 % 0.4 Tris pH 8.0 t 1 M 1.8 EDTA t 0.5 M 0.2 PEG t 40 % 3.0 Agua ampolleta t 3 Estabilizador (ONEST/16, ONEST/18 o ONEST/58) 00 pmol / µ? 1 REP/UNI-Cy3 100 pmol / ? 1 DNAbs-L1 /16, DNAbs-L1/18, DNAbs-L1/58 o 5 - 200 pmol / 25 amplificados PCR-1 ML 60 t = Reactivos contenidos en la solución de lavado de los Biochips de DNA.

Tabla II Reactivo Concentración Volumen (µ_.) SSC / SDS t 3X / 0.1 % 10 a 30 Estabilizador (ONEST/16, ONEST/18 y ONEST/58) 100 pmol / µ? 0.5 a 2 REP/UNI-Cy3 100 pmol / µ?_ 1 a 2 DNAbs-L1/16, DNAbs-L1/18, DNAbs-L1/58 o 5 - 200 pmol / 10 a 40 amplificados PCR-1 µ?- 60 t = Reactivos contenidos en la solución de lavado de los Biochips de DNA.

Cuarenta µ? de cada solución de hibridación fue adicionada sobre el área de inmovilización de las sondas en los Biochips de DNA, posteriormente 5 un cubreobjeto fue colocado sobre su superficie evitando la formación de burbujas y cada laminilla fue depositada sobre una superficie plana e incubada 3 horas con agitación constante a 37 °C de temperatura en un ambiente húmedo. Al finalizar la incubación, cada cubreobjetos fue retirado de la superficie del Biochips de DNA mediante su inmersión y ligera agitación en la lo solución de hibridación correspondiente (en ausencia de secuencias de DNA) por periodos de 5 minutos y dos lavados posteriores de 3 minutos, el primero en SSC 1X y el segundo en SSC 0.1X. Finalmente se dejaron secar a temperatura ambiente y se almacenaron en recipientes que los protegieran de la luz hasta su análisis. ! 5 La detección de las señales de hibridación sobre los Biochips de DNA fueron visualizadas y captadas con ayuda de un escáner para microarreglos marca Scanarray™ Express (BioChip Technologies, Perkin Elmer) bajo las siguientes condiciones: longitud de onda para Cy3 de 543 nm, resolución de 30 µ??, potencia del fotomultiplicador (PMT gain) del 70 % y poder del láser entre 50 y 80 %.

Después de haber sometido a hibridación cada una de estas secuencias sobre los Biochips de DNA, se registró una alta especificidad de las sondas inmovilizadas sobre la superficie del array por su secuencia complementaria en el DNA blanco sintético en presencia de su correspondiente oligonucleótido estabilizador y el REP/UNI-Cy3, lo anterior ocurrió en ensayos de hibridación donde solo una de las secuencias de DNA blanco con su respectivo oligonucleótido estabilizador y el REP/UNI-Cy3 fue evaluada, como en aquellos casos donde dos o mas de estas secuencias fueron analizadas (Ver Figuras 1 -4).

De esta manera, después de someter a hibridación el DNAbs-L1/16 sobre los Biochips de DNA, en presencia del ONEST/16 y el REP/UNI-Cy3, se registraron señales de hibridación únicamente en los sitios de inmovilización de las sondas 16-SN, sin la presencia aparente de hibridaciones con las demás sondas presentes en el Biochip de DNA. Esto resultados indican una alta especificidad de las sondas 16-SN por su secuencia complementaria en el DNA blanco sintético (Ver Figura 2). Resultados similares fueron obtenidos durante la hibridación del DNAbs-L1 /18 con su ONEST/18 y el REP/UNI-Cy3 donde se detectaron señales de hibridación solo en aquellos sitios donde la sonda 18-SN fue inmovilizada, o como en el caso del DNAbs-L1/58 con su ONEST/58 y el REP/UNI-Cy3 cuyas señales de hibridación fueron registradas únicamente en los sitios de inmovilización de las sondas 58-SN (Ver Figuras 1 y 3).

Después de evaluar por separado la especificidad de cada una de las sondas, se llevaron a cabo algunos ensayos donde dos o incluso, las tres secuencias de DNA blanco sintético (DNAbs-L.1/16, DNAbs-L1/18 y DNAbs-L1/58) fueron analizadas de manera simultanea sobre la superficie del Biochip de DNA con la finalidad de valorar una vez mas la eficiencia de nuestro sistema pero ahora en presencia de más de una secuencia de DNA blanco viral. Las primeras secuencias de DNA blanco sintético que se analizaron simultáneamente sobre los Biochips de DNA fueron el DNAbs-L1/16 y el DNAbs-L1/18, con sus respectivos ONEST/ 6 y ONEST/18 y el REP/UNI-Cy3, que como se esperaba solo registraron señales de hibridación en aquellos sitios donde las sondas 16-SN y 18-SN fueron inmovilizadas y cuya secuencia es totalmente complementaria a regiones específicas dentro de estas secuencias. Los mismos resultados fueron obtenidos durante la hibridación simultanea del DNAbs-L1/18 y el DNAbs-L1/58, con sus respectivos ONEST/18 y ONEST/58 y el REP/UNI-Cy3 quienes solo registraron señales de hibridación en los sitios de las sondas 18-SN y 58-SN respectivamente. Durante la hibridación simultanea de las tres secuencias de DNA blanco sintético DNAbs-L1/16, DNAbs-L1/18 y DNAbs-L1/58, con sus respectivos oligonucleótidos estabilizadores ONEST/16, ONEST/18 y ONEST/58 y el REP/UNI-Cy3, también se registraron señales de hibridación en los sitios correspondientes a las sondas 16-SN, 18-SN y 58-SN. Estos resultados sugieren una alta especificidad de las sondas inmovilizadas sobre la superficie del Biochip de DNA por su secuencia complementaria en las secuencias de DNA blanco viral, aún cuando más de una de estas secuencias estuvo presente (Ver Figura 4).

Con los datos obtenidos de la hibridación de todas estas secuencias que simularon regiones específicas del genoma de VPH de alto riesgo ((DNAbs-L1/16, DNAbs-L1/18, DNAbs-L1/58 ONEST/18, ONEST/58) sobre los Biochips de DNA fue posible confirmar una vez más la factibilidad del diseño previamente propuesto para el diagnóstico molecular de estos virus, al menos en ensayos de hibridación virtual y a partir del uso de secuencias de DNA de origen sintético evaluadas sobre sistemas de hibridación real como los Biochips de DNA.

Ejemplo 2. Detección de sondas de ADN blanco en líneas celulares positivas para VPH de alto riesgo sobre los biochips de ADN. Para validar la detección específica de secuencias de VPH de alto riesgo sobre los Biochips de DNA, se recurrió al uso de dos líneas celulares positivas para VPH 16 Caski y SiHa y a un DNA de VPH 18 clonado dentro del vector pUC 8, ambas fueron usadas como controles positivos durante los procesos de hibridación. Durante los procesos de amplificación la línea celular C-33 negativa para VPH fue usada como control negativo. El DNA viral de las líneas celulares fue extraído mediante técnicas convencionales de extracción y purificación de ácidos nucleicos.

Con la finalidad de asegurar las condiciones óptimas de amplificación de un fragmento del gen L1 de los VPH 16 y 18 presente en las líneas celulares Caski y SiHa y en el DNA clonado, diferentes condiciones de PCR fueron evaluadas. Entre las condiciones que fueron modificadas durante los procesos de amplificación convencional destacan la temperatura de alineamiento de los iniciadores, la concentración del DNA templado, la concentración de los iniciadores y la concentración de Mg+2.

Inicialmente, los procesos de PCR se llevaron a cabo bajo dos temperaturas de alineamiento de los iniciadores, la primera denominada PCR-1 se llevó a cabo a 45 °C, mientras que la segunda denominada PCR-2 se realizó a 55 °C. Estas amplificaciones se llevaron a cabo con al menos 100 ng del DNA templado y en presencia de 50 pmol de cada uno de los siguientes iniciadores: L1-16f y L1-16r específicos para VPH 16, L1-18f y L1-18r específicos para VPH 18 y L1-58f y L1-58r específicos para VPH 58.

Durante el desarrollo de la PCR-1 y PCR-2, fue posible amplificar el fragmento de interés en el gen L1 de los VPH 16 y 18 a partir de las líneas celulares Caski, SiHa y la muestra de DNA positiva para VPH 18, sin embargo el proceso de amplificación resultó ser más eficiente en la PCR-1 obtenida a 45 °C, que el observado en la PCR-2 a 55 °C (Ver Figura 5).

La línea celular Caski positiva para VPH 16 y la muestra de DNA positiva para VPH 18 mostraron productos de amplificación similares durante el desarrollo de la PCR-1 y la PCR-2, sin embargo, este no fue el caso de la línea celular SiHa quien registró una mayor concentración del producto de amplificación bajo las condiciones de la PCR-1 , en comparación al obtenido durante la PCR-2.

Después de amplificar exitosamente fragmentos específicos del gen L1 a partir de líneas celulares positivas para los VPH 16 y 18, el siguiente paso fue evaluar la funcionalidad del Biochip de DNA dirigido a la detección y tipificación de VPH considerados de alto riesgo en CC. Para ello, cada uno de los productos de amplificación viral que previamente fueron obtenidos bajo diferentes concentraciones de DNA molde a partir de las líneas celulares Caski y SiHa y el DNA de VPH 18 clonado en el vector pUC18, fueron sometidos a hibridación sobre los Biochips de DNA.

De acuerdo con los resultados, señales de hibridación específica fueron registrados en los sitios esperados sobre la superficie de los Biochips en los diferentes amplificados que fueron evaluados. En el caso de las líneas celulares Caski y SiHa, señales de hibridación fueron detectadas en el área de inmovilización de las sondas que identifican al VPH 16 (16-SN), mientras que en el caso del DNA de VPH 18, señales de hibridación fueron detectadas solo en aquellos sitios donde se inmovilizaron sondas que identifican a este tipo viral (18-SN) (Ver Figura 6).

A pesar que la línea celular SiHa reporta un bajo numero de copias del VPH 16, fue posible identificar señales de hibridación específica sobre los Biochips de DNA solo en aquellos sitios donde fueron inmovilizadas las sondas 16-SN que identifican al VPH 16. Esto ocurrió en todos los amplificados provenientes de esta línea celular, aun cuando los amplificados provenían de procesos de PCR con bajas concentraciones de DNA molde (20 ng). En lo que respecta a línea celular Caski, además de registrar señales de hibridación específica para VPH 16, también fue posible identificar señales de hibridación específica en aquellos sitios donde las sondas identifican al VPH 18 ( 8-SN), aunque esto solo fue observado en aquellos casos donde el producto de amplificación provenía de altas concentraciones de DNA molde (200 ng). De acuerdo con estos resultados, fue posible confirmar la presencia de VPH 6 en las líneas celulares Caski y SiHa, pero también la presencia de VPH 18 en el caso particular de Caski y en el DNA de VPH 8 que fue analizada (Ver Figura 6)· Ejemplo 3. Detección de secuencias de ADN blanco en muestras clínicas positivas para VPH de alto riesgo sobre los biochips de ADN. Después de validar la funcionalidad del Biochip de DNA en la detección y tipificación viral a partir de amplificados provenientes de las líneas celulares Caski y SiHa positivas para VPH 16 y 18, el siguiente paso fue evaluar la eficiencia de este sistema pero ahora en amplificados provenientes de muestras clínicas positivas para VPH. El DNA viral de las líneas celulares fue extraído mediante técnicas convencionales de extracción y purificación de ácidos nucleicos. De acuerdo con ensayos de amplificación previos, un total de 72 muestras positivas para los VPH 16, 18 y 58 (79.1 %) fueron evaluadas sobre los Biochips de DNA.

Al igual que en ensayos previos, una serie de amplificados obtenidos a partir de diferentes concentraciones de DNA molde de las muestras clínicas 1 y 2 fueron ¡nicialmente analizadas sobre los Biochips de DNA. De esta manera productos de amplificación obtenidos a partir de 20 ng y hasta 1200 ng de DNA molde provenientes de una misma muestra fueron evaluadas sobre los Biochips de DNA.

Después de someter a hibridación cada uno de estos amplificados fue posible identificar señales de hibridación sobre los Biochips de DNA incluso cuando los amplificados fueron obtenidos bajo mínimas concentraciones de DNA molde (20 ng) tanto en la muestra 1 como en la muestra 2, aún cuando no se observo producto de amplificación en los geles de agarosa donde previamente fueron visualizados. De acuerdo con las señales de hibridación registradas sobre la superficie del Biochip de DNA, los amplificados provenientes de la muestra 1 resultaron ser positivos para el VPH 6 y aunque ligeras señales de hibridación fueron detectadas en sitios que reconocen al VPH 18, estas solo fueron identificadas en amplificados provenientes de grandes concentraciones de DNA molde (600 ng) y fueron fácilmente eliminadas por medio de un segundo lavado del Biochip de DNA. Los amplificados provenientes de la muestra 2 que fueron sometidos a hibridación sobre los Biochips de DNA dieron señales de hibridación positivas tanto para el VPH 16 como para el VPH 18, aunque la intensidad fue mayor en aquellos sitios que reconocen al VPH 18 a lo largo de los diferentes amplificados que fueron evaluados. La intensidad de las señales que fueron registradas se mantuvo similar a lo largo de los diferentes amplificados que fueron evaluados, solo se detectó una disminución en la intensidad de la señal cuando el amplificado provenía de concentraciones bajas de DNA molde (40 y 20 ng). Estos resultados sugieren la presencia de dos tipos de VPH en la muestra 2 donde al parecer el VPH 18 esta presente en un número mayor de copias con respecto al VPH 16 también identificado en esta muestra. Estos resultados sugieren una alta sensibilidad del Biochip de DNA en la detección de VPH presente en las muestras analizadas.

Como la intensidad de las señales de hibridación fue observada de manera satisfactoria en todos los amplificados provenientes de las muestras clínicas 1 y 2 (desde 20 ng hasta 1200 ng) se acordó que el resto de los amplificados a evaluar sobre los Biochips de DNA serian obtenidos a partir de al menos 100 ng de DNA celular de cada una de las muestras clínicas. Como se esperaba, ligeras diferencias en la intensidad de la señal fueron registradas sobre los Biochips de DNA después de someter a hibridación cada uno de estos amplificados a pesar de que todos fueron obtenidos bajo las mismas condiciones experimentales. Estas diferencias pueden ser explicadas en función del número de copias virales disponibles al momento de amplificación, que como hemos visto fue variable en las muestras analizadas, entre mayor número de copias virales, mayor es la concentración del fragmento de amplificación de interés y por lo tanto mayor probabilidad de detección sobre los Biochips de DNA.

Finalmente los amplificados obtenidos de las 72 muestras que resultaron positivas para los VPH 16, 18 o 58 fueron sometidos a hibridación sobre los Biochips de DNA. De acuerdo con las señales de hibridación identificadas sobre la superficie de los Biochips de DNA, 36 amplificados (50 %) mostraron señales de hibridación para un solo tipo viral, 28 (38.9 %) registraron señales de hibridación con más de un tipo viral y 8 (1 1.1 %) no pudieron ser identificados. El 88.9 % de las muestras clínicas que fueron analizadas sobre los Biochips de DNA resultó ser positiva para alguno de los VPH 16, 18 o 58. El VPH 16 resultó ser el más frecuentemente identificado (68%), seguido de los VPH 18 y 58. De las infecciones simples que fueron identificadas, 29 (40.3 %) resultaron ser positivas para el VPH 16, 5 (6,9 %) para VPH 18 y 2 (2.8 %) para VPH 58. En lo que respecta a las infecciones con más de un tipo viral, 13 (18.0 %) correspondieron a los VPH 16 y 18, 6 (8.3 %) a los VPH 16 y 58, 2 (2.8 %) a los VPH 18 y 58 y finalmente 7 (9.7 %) a los VPH 16, 18 y 58. De las infecciones con más de un tipo viral el 29.2 % fue positivas para 2 tipos de VPH y el 9.7 % para los 3 tipos de VPH analizados sobre los Biochips de DNA (Figura 7-10).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para la detección y determinación del genotipo del virus del papiloma humano presente en una muestra biológica caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) extracción del ADN de las células de una muestra biológica, b) amplificación de ADN obtenido en el paso a) por un método de PCR utilizando un par de oligonucleótidos iniciadores seleccionado del grupo de pares de oligonucleótidos iniciadores SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7, y SEQ ID N0.8-SEQ ID NO. 9, c) hibridación múltiple de las moléculas amplificadas obtenidas en el paso a) con al menos un oligonucleótido de SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, y SEQ ID NO. 3, en presencia de al menos un oligonucleótido estabilizador seleccionado del grupo de oligonucleótidos de SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, y SEQ ID NO. 17, y un oligonucleótido de detección de SEQ ID NO. 18 marcado en su extremo 5' con moléculas fluorescentes, d) detección y genotipificación del ADN por detectar una señal fluorescente. Un método para el diagnóstico de tejido infectado por el virus del papiloma humano porque comprende las siguientes etapas: a) amplificación de ADN de muestras biológicas utilizando un par de oligonucleótidos iniciadores seleccionado del grupo de pares de oligonucleótidos iniciadores SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7, y SEQ ID N0.8-SEQ ID NO. 9, b) hibridación múltiple de las moléculas amplificadas obtenidas en el paso a) con al menos un oligonucleótido de SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, y SEQ ID NO. 3, en presencia de al menos un oligonucleótidos estabilizador seleccionado del grupo de oligonucleótidos de SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, y SEQ ID NO. 17, y un oligonucleótido de detección de SEQ ID NO. 18 marcado en su extremo 5' con moléculas fluorescentes, c) detección de la señal de hibridación múltiple. Un equipo para la detección y determinación del genotipo del virus del papiloma humano que comprende: a) pares de oligonucleótidos iniciadores de PCR para genes del virus del papiloma humano los cuales son seleccionados del grupo de pares de oligonucleótidos iniciadores SEQ ID NO. 4- SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7, y SEQ ID NO.8- SEQ ID NO. 9, b) un chip oligonucleótido que tiene una o más sondas inmovilizadas en el chip, las cuales tienen una secuencia de nucleótidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, y SEQ ID NO. 3, en donde dichos oligonucleótidos contienen en su extremo 3' una molécula de aminopropanol, c) un sistema de hibridación de ADN que comprende al menos un oligonucleótido estabilizador seleccionado del grupo de oligonucleótidos de SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, y SEQ ID NO. 17, y un oligonucleótido de detección de SEQ ID NO. 18 marcado en su extremo 5' con moléculas fluorescentes, d) medios y reactivos para colectar, extraer y amplificar ADN a partir de una muestra biológica e hibridar el ADN amplificado con el sistema de hibridación del inciso c), e) instrucciones de manejo del equipo para detectar y determinar el genotipo presente del virus de papiloma humano presente en la muestra. Un equipo de conformidad con la reivindicación 3, en donde las sondas son inmovilizadas sobre el chip en un patrón de microarreglo predeterminado capaz de detectar uno o múltiples genotipos del virus del papiloma humano, simultáneamente. Un chip oligonucleótido para detectar y determinar e! genotipo del virus del papiloma humano presente en una muestra biológica que comprende múltiples sondas inmovilizadas sobre el chip las cuales tienen una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, y SEQ ID NO. 3, en donde dichas sondas están inmovilizadas sobre el chip en un patrón de microarreglo predeterminado capaz de detectar uno o múltiples genotipos del virus del papiloma humano, simultáneamente. Un proceso para preparar el chip oligonucleótido reclamado en la reivindicación 5, caracterizado porque comprende los pasos de i) preparar sondas de ADN que tienen una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, y SEQ ID NO. 3 ligadas en su extremo 3' a una molécula de aminopropanol, ii) fijar las sondas a la superficie de un soporte sólido en un patrón de microarreglo, y iii) secar el chip y bloquear con solución de bloqueo.