KR102231342B1 - 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법 - Google Patents

낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102231342B1
KR102231342B1 KR1020190034474A KR20190034474A KR102231342B1 KR 102231342 B1 KR102231342 B1 KR 102231342B1 KR 1020190034474 A KR1020190034474 A KR 1020190034474A KR 20190034474 A KR20190034474 A KR 20190034474A KR 102231342 B1 KR102231342 B1 KR 102231342B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
disease
seq
buzz
nucleotide sequence
primer
Prior art date
Application number
KR1020190034474A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200115794A (ko
Inventor
남용석
김보선
임지수
김효령
Original Assignee
주식회사 코젠바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 코젠바이오텍 filed Critical 주식회사 코젠바이오텍
Priority to KR1020190034474A priority Critical patent/KR102231342B1/ko
Publication of KR20200115794A publication Critical patent/KR20200115794A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102231342B1 publication Critical patent/KR102231342B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 공지된 프라이머 세트에 비하여 민감도가 우수하므로, 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 병원체에 대한 효과적인 방역 대책 마련에 도움이 될 수 있다.

Description

낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법{Primers and probes for detection of sacbrood virus, Paenibacillus larvae and Melissococcus plutonius, and method for detecting sacbrood virus, Paenibacillus larvae and Melissococcus plutonius using the same}
본 발명은 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
일반적으로, 꿀벌의 감염성 전염병은 병원체에 따라 크게 세균성, 진균성, 바이러스성 그리고 원생 동물성 전염병으로 나눌 수 있다. 세균성 전염병으로 미국부저병(American foulbrood, AFB) 및 유럽부저병 (European Foulbrood, EFB)등이 있으며, 진균성 전염병으로 백묵병(chalkbrood)등이 있으며, 바이러스성 전염병은 마비병(paralysis), 낭충봉아부패병(sacbrood)등을 들 수 있으며, 원생동물성 전염병은 노제마병(nosema disease)이 있다.
낭충봉아부패병은 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 유충의 초기 모습이 물집이 생긴 모습과 비슷하여 낭충병(sacbrood)이라 부르기도 한다. 병에 걸린 유충은 처음에는 백색에서 회황색으로 변하고 병세가 진행됨에 따라 머리에서부터 갈색 내지 회갈색으로 변하며 맨 나중에는 암갈색으로 되어 차차 건조해 간다. 처음에 병에 걸려 죽은 유충은 마치 물주머니와 같이 되어 부패해 가기 때문에 낭충봉아부패병이라 칭해진 것으로 알려져 있다. 부패한 유충의 체액은 점조성이 없으며 소방 벽에 부패하여 마른 조각은 일벌들에 의하여 쉽게 제거할 수 있다.
낭충봉아부패병은 오염된 화분(꽃가루)과 화밀(꽃꿀) 등을 통해 감염되는 것으로 알려져 있으며, 그 외에도 병든 유충들이 들어 있는 벌방과 말라 죽은 유충들을 제거하는 과정에서 일벌들도 감염되며, 양봉기구와 벌의 교환 등을 통해 전염이 확산될 수 있다. 낭충봉아부패병은 2007년 유럽 및 아메리카대륙에서 유행하여 전체꿀벌의 75%를 폐사시켜 양봉산업에 커다란 피해를 주었으며, 한국에서는 2010년 봄부터 발생하기 시작하여 전국적으로 확산되어 90%이상을 폐사시킴에 따라 그 피해가 심각한 실정이다. 낭충봉아부패병에 대한 치료제는 현재까지 없으며 단지 소극적인 방법인 예방요법만이 최선의 수단이다. 감염된 경우 꿀벌 및 벌집을 격리 및 소각처리하고, 건강한 꿀벌들에 대한 질병확산 방지를 위하여 꿀벌 사육 상자 및 양봉기구와 벌통주변에 소독약을 분무, 살포하는 수준이다.
꿀벌 부저병은 세균에 의한 꿀벌의 질병 중 가장 많이 발생되고 가장 심각한 피해를 입히는 질병이기에 국내에서는 현재 법률 제6379호에 의거 제 2종 가축전염병으로 분류 관리되고 있다.
꿀벌 부저병에는 미국부저병과 유럽부저병 2종류가 있다. 미국부저병(AFB)의 원인균은 페니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae)로, 그람양성의 간균(2.5~5.0㎛×0.7~0.8㎛)으로 편모에 의한 운동성이 있으며, 내생포자(endospore; 간단히 포자, spore)를 만들기에 내열성 및 화학살균제에 대한 저항성이 강하여 건조상태에서 35년간 감염력을 보유하는 것으로 알려졌다.
미국 부저병의 전염은 감염 봉군에서 채밀한 오염된 꿀의 재사용, 오염된 기구의 사용이나 교환, 또는 도봉들에 의하여 유충에서 유충으로, 한 봉군에서 다른 봉군으로 또한 한 양봉장에서 다른 양봉장으로 옮겨간다. 페니바실러스 라바에 내생포자의 감염력은 꿀벌(Apis mellifera) 1종에만 국한되며, 다른 생명체에서는 감염, 증식되지 않는다. 또한 성봉의 경우 많은 포자가 존재하는 환경에서도 거의 발병되지 않으며, 유충의 경우도 부화 후 1일 정도 된 유충은 평균 35개의 포자에 의해 감염, 발병되나, 2일 또는 그 이상 경과된 유충은 수천 개 이상의 내생포자가 감염되어야 발병되며, 부화된 지 53시간이 지난 유충은 거의 감염되지 않는다. 감염된 내생포자는 유충의 경구를 통하여 중장관(midgut)에 도착한 후 24시간 내에 활성형 세포(영양세포)로 부화되며 급속히 증식한다. 유충의 온몸에 퍼져 증식된 활성형 세포들은 유충이 치사됨에 따라 내생포자의 형태로 변환되며, 1개 사체에 들어 있는 페니바실러스 라바에의 내생포자의 수는 500만~1,000만개 수준으로 알려져 있다.
미국부저병의 초기 증상은 병에 걸린 유충은 체색이 유백색을 나타내다가 시간이 경과함에 따라 점차 갈색으로 변하면서 물러 터지는데, 이 때에 시큼한 냄새가 난다. 죽은 유충 또는 번데기의 시체는 점주성이 있다가 나중에는 벌방 밑에 딱지로 말라 붙는다.
유럽부저병의 원인균은 그람양성의 멜리소코커스 플루토니우스(Melissococcus plutonius)로 미국 부저병과는 다르나, 유충벌이 썩어 죽는 과정이나 전염경로는 미국부저병과 유사하다. 유럽부저병은 주로 일벌이 어린 유충에게 먹이를 주는 과정에서 감염된다. 유충의 먹이에 오염된 유럽부저병 균(Melissococcus plutonius)은 유충의 중장관에서 빠르게 증식하며, 감염 후 체색이 유백색에서 황갈색을 띠다가 점차 갈색으로 변하며 치사한다. 죽은 유충은 미국부저병과 같이 시큼한 생선 썩은 냄새를 내나, 유럽부저병의 경우가 조금 더 생선 냄새에 가깝고, 미국부저병과는 달리 체액이 아교와 같은 점착력을 나타내지 않는다. 또한, 감염된 유충은 강군(强群)의 경우 치사 후 바로 제거되며 벌방에 흔적을 남기지 않기에 쉽게 눈에 띄지 않으며, 미국부저병의 경우와 달리 벌방의 변색 또는 사체에서 나오는 인분(鱗粉, scale)을 관찰할 수 없다는 점에 차이가 있다.
현재 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병의 진단은 유충의 육안관찰, 즉 유충의 색(고동색에서 흑색) 또는 특유의 냄새(썩은 냄새)등에 주로 의존하고 있으나, 이러한 진단방법은 중요한 질병에서 조기 치료시기를 놓치게 하고, 또한 오진에 의한 항생제 과다사용 등의 문제를 야기하고 있다. 최근, 면역학적 방법을 이용한 미국부저병 및 유럽부저병의 병원균 검출방법 등이 개발되고 있으나, 상당한 시간과 비용이 요구된다는 단점이 있어 상기 질환에 대한 감염 여부를 신속하게 진단하면서 민감도 및 특이도가 높은 방법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1600983호 대한민국 등록특허 제10-1658377호 대한민국 등록특허 제10-1230975호
본 발명의 목적은 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 실시간(real-time) 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 공지된 프라이머 세트에 비하여 민감도가 우수하므로, 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 병원체에 대한 효과적인 방역 대책 마련에 도움이 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 농도 최적화 전과 후의 증폭 플롯(amplification plot)을 나타낸 도이다.
(sacbrood virus: 낭충봉아부패병 바이러스; P. larvae: 미국부저병 균; M. plutonius: 유럽부저병균;
D1: 106; D2: 105; D3: 104; D4: 103; D5: 102; D6: 101 (단위: 카피수/㎕)).
도 2는 낭충봉아부패병 바이러스(sacbrood virus) RNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 및 프로브, 또는 공지된 프라이머 세트로 PCR 수행한 결과를 나타낸 도이다
(D1: RNA 원액; D2: 10-1 희석; D3: 10-2 희석; D4: 10-3 희석;
M: 마커; N: 대조군(No template control)).
도 3은 미국부저병 균(P. larvae) DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 및 프로브, 또는 공지된 프라이머 세트로 PCR 수행한 결과를 나타낸 도이다
(D1: DNA 원액; D2: 10-1 희석; D3: 10-2 희석; D4: 10-3 희석;
M: 마커; N: 대조군(No template control)).
도 4는 유럽부저병 균(M. plutonius) DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 및 프로브, 또는 공지된 프라이머 세트로 PCR 수행한 결과를 나타낸 도이다
(D1: DNA 원액; D2: 10-1 희석; D3: 10-2 희석; D4: 10-3 희석; D5: 10-4 희석; D6: 10-5 희석;
M: 마커; N: 대조군(No template control)).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자를 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자를 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 세트일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 조성물은 서열번호 3, 6 및 9의 염기서열로 각각 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), VIC(2′-chloro-7′phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein), 시아닌(Cyanine) 계열 염료, 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 및 Cy5로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, JOE 또는 Cy5일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(non-fluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 및 MGBNFQ(minor groove binder non-fluorescent quencher)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 MGBNFQ(minor groove binder non-fluorescent quencher) 또는 BHQ일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머와 서열번호 3, 6 및 9의 염기서열로 각각 기재되는 프로브를 제작하였다 (표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 프라이머 및 프로브 세트의 농도를 최적화한 결과, 최적화 전보다 민감도가 향상되었고, 3가지 병원체에 대한 증폭 플롯의 ΔRn이 균등하게 상승되어 병원체들이 동시 감염된 상황에서 감염 여부를 용이하게 확인할 수 있음을 확인하였다 (도 1).
또한, 본 발명자들은 상기 프라이머 및 프로브 세트가 공지된 프라이머 세트에 비하여 민감도가 우수함을 확인하였다 (도 2 내지 도 4).
또한, 본 발명자들은 상기 프라이머 및 프로브 세트는 다른 병원체 및 동물종의 DNA 시료에서는 증폭 반응이 검출되지 않아, 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다 (표 8).
또한, 본 발명은 본 발명의 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 조성물을 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 3, 6 및 9의 염기서열로 각각 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자에 대한 특이적인 프라이머 세트 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출 방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자를 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리단백질(poly protein) 유전자, 미국부저병 균의 16S rRNA 유전자 및 유럽부저병 균의 sodA 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 세트일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머; 서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 낭충봉아부패병 , 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브 제작
낭충봉아부패병(Sacbrood virus), 미국부저병(Paenibacillus larvae) 및 유럽부저병(Melissococcus plutonius)의 병원체를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제작하고자 하였다.
구체적으로, 각 병원체의 타겟 유전자인 poly protein, 16S rRNA 및 sodA의 염기서열을 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST search를 통해서 수집한 후, 데이터베이스 내 다른 염기서열과의 상동성(homology)을 분석하여 가장 특이적인 부위에 대한 프라이머 및 프로브를 설계하였다 (표 1). 멀티플렉스를 위한 프로브의 리포터(reporter dye)는 낭충봉아부패병 프로브의 경우 FAM, 미국부저병은 JOE 및 유럽부저병은 Cy5를 이용하였고 (표 2), 소광자는 MGBNFQ 또는 Black hole quencher(BHQ)를 이용하였다. 프라이머 디자인 소프트웨어 (Primer Express, USA)를 이용하여 프라이머 및 프로브의 Tm(melting temperaure)값이 각각 58~60℃ 및 68~70℃ 범위에 해당되도록 디자인하였다.
질병명 병원체 프라이머
또는 프로브		 서열(5'→3') 서열번호
낭충봉아부패병 Sacbrood virus 제1 정방향 프라이머 GTAAGAAGACATTTGATACAGTGGACTCTT 1
제1 역방향 프라이머 GTCTAACATTCCAGATTCTTCGTCC 2
제1 프로브 TAATGGTTGGGTTTCTGGTATG 3
미국
부저병		 Paenibacillus larvae 제2 정방향 프라이머 GGCAACCTGCCTGTAAGACC 4
제2 역방향 프라이머 CATGCGAAGAAACCAGCTATCC 5
제2 프로브 TTAGCTCACGTTTCCGCAAGTTATCCCG 6
유럽
부저병		 Melissococcus plutonius 제3 정방향 프라이머 TGAATGCGATTCCCGAAGATAT 7
제3 역방향 프라이머 AGAAAAATGAATGATTCACATGCC 8
제3 프로브 TCGTTTAGCTGTTCGCAATAATGGTGGG 9
질병명 검출 타겟 형광물질
낭충봉아부패병 Sacbrood virus FAM
미국부저병 Paenibacillus larvae JOE
유럽부저병 Melissococcus plutonius Cy5
< 실험예 1> 낭충봉아부패병 , 미국부저병 및 유럽부저병의 병원체를 동시 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 농도 최적화
실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 및 프로브가 타겟으로 하는 병원체에 대해 최상의 성능을 나타내면서, 다른 프라이머 또는 프로브와 반응하여 PCR 반응에 영향을 주지 않는 프라이머 및 프로브의 농도를 확인하고자 하였다.
<1-1> 최적화 전 농도 조건
RNA/DNA 자동화 추출장비(Nextractor NX-48, Genolution, Korea)를 사용하여 꿀벌 시료를 PBS 버퍼에 균질화한 유제액으로부터 낭충봉아부패병의 주형(template) RNA, 미국부저병 및 유럽부저병의 주형(template) DNA를 수득하였다. 수득한 주형 DNA 또는 RNA를 표 3에 기재된 반응액 조성 및 표 4에 기재된 반응 조건에 따라, 실시간(real-time) PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system, Life technologies, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
반응액 조성물 첨가량 (㎕)
제1 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제1 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제1 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제2 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제2 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제2 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제3 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제3 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제3 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
2X 실시간(Real-time) RT-PCR 버퍼 10
25X RT-Enzyme 믹스* 0.8
주형 DNA 또는 RNA 5
TE 버퍼 2.4
합계 20
*25X RT-Enzyme 믹스: PowerAmpTM One Step RT-PCR 키트, 코젠바이오텍
온도 (℃) 시간 사이클 수
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 40
60 1분
동일한 농도의 프라이머 및 프로브를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 표 1의 프라이머 및 프로브 세트는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병의 병원체를 감별하여 검출할 수 있으며, 낭충봉아부패병 바이러스는 101 카피수(copies)/㎕ 미국부저병 균(Paenibacillus larvae)의 경우 102 카피수/㎕, 및 유럽부저병 균(Melissococcus plutonius)의 경우 102 카피수/㎕까지 검출이 가능함을 확인하였다.
<1-2> 최적화 후 농도 조건
실험예 1-1의 결과를 토대로, 각 타겟 병원체별 증폭 플롯(amplification plot)의 ΔRn 및 기울기를 유사하게 조절하여 각 타겟 프라이머 및 프로브의 증폭 효율을 유사하게 맞추고, 비특이적인 증폭산물이 생성되지 않으며 타겟 병원체에 대한 증폭 효율을 유지하는 선에서 프라이머의 농도를 최소화할 수 있는 조건을 찾고자 하였다.
표 3의 반응액 조성물에서 프라이머 및 프로브의 최종농도가 표 5의 농도 조건이 되도록 첨가한 것을 제외하고, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
검출타겟 프라이머 또는 프로브 최종농도
Sacbrood virus 정방향 프라이머 250 nM
역방향 프라이머 250 nM
프로브 100 nM
Paenibacillus larvae 정방향 프라이머 250 nM
역방향 프라이머 250 nM
프로브 100 nM
Melissococcus plutonius 정방향 프라이머 250 nM
역방향 프라이머 250 nM
프로브 100 nM
그 결과, 상기 농도 조건(표 5)에서 3가지 타겟 병원체 모두 101 카피수/㎕까지 검출이 가능하여 프라이머 및 프로브의 농도 최적화 전보다 민감도가 향상된 것으로 나타났다. 또한 3가지 타겟 병원체에 대한 증폭 플롯의 ΔRn이 균등하게 상승되었다. 증폭 플롯의 ΔRn과 기울기가 유사하게 형성될 경우, 병원체들이 동시 감염된 상황에서 감염 여부를 용이하게 확인할 수 있고, 낮은 카피수의 감염 상황에서 프라이머 및 프로브들의 경쟁 반응을 최소화할 수 있다 (도 1).
< 실험예 2> 공지된 프라이머 세트와 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 검출 효율 비교
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR를 수행하였을 때, 공지된 프라이머 세트 대비 우수한 민감도를 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트, 및 각 병원체의 공지된 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
<2-1> 낭충봉아부패병
먼저, 낭충봉아부패병 양성으로 확인된 시료에서 RNA를 추출하고 이를 단계적으로 희석한 후, 표 6에 기재된 반응액 조성 및 표 4에 기재된 반응 조건에 따라, 실시간(real-time) PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system, Life technologies, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때, 낭충봉아부패병 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 최적화된 농도(표 5)의 것을 이용하였다. 한편, 공지된 낭충봉아부패병의 프라이머 세트로는 하기 표 7에 기재된 프라이머 세트를 이용하였으며, 해당 문헌에 기재된 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 완료되면, PCR 반응물을 정제하고 전기영동하여 본 발명의 결과와 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하였을 때, 낭충봉아부패병 원인 바이러스는 1,000배 희석한 시료까지 검출되었으나, 공지된 프라이머 세트는 시료 원액만 검출 가능한 것으로 나타나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 우수함을 확인하였다 (도 2).
<2-2> 미국부저병
미국부저병 양성으로 확인된 시료에서 DNA를 추출하고 이를 단계적으로 희석한 후, 상기 표 1의 미국부저병 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 최적화된 표 5의 농도 조건으로 하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 한편, 공지된 미국부저병의 프라이머 세트로는 하기 표 7에 기재된 프라이머 세트를 이용하였으며, 해당 문헌에 기재된 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 완료되면, PCR 반응물을 정제하고 전기영동하여 본 발명의 결과와 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하였을 때, 미국부저병 원인 바이러스는 1,000배 희석한 시료까지 검출되었으나, 공지된 프라이머 세트는 시료 원액도 검출할 수 없는 것으로 나타나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 우수함을 확인하였다 (도 3).
<2-3> 유럽부저병
유럽부저병 양성으로 확인된 시료에서 DNA를 추출하고 이를 단계적으로 희석한 후, 상기 표 1의 유럽부저병 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 최적화된 표 5의 농도 조건으로 하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 한편, 공지된 유럽부저병의 프라이머 세트로는 하기 표 7에 기재된 프라이머 세트를 이용하였으며, 해당 문헌에 기재된 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 완료되면, PCR 반응물을 정제하고 전기영동하여 본 발명의 결과와 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하였을 때, 유럽부저병 원인 바이러스는 100,000배 희석한 시료까지 검출되었으나, 공지된 프라이머 세트는 시료 원액만 검출 가능한 것으로 나타나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 우수함을 확인하였다 (도 4).
상기 결과를 통해, 본원발명의 프라이머 및 프로브 세트는 종래에 알려진 꿀벌의 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 검출용 프라이머 세트보다 민감도가 우수하고, 한 번의 반응으로 3가지의 꿀벌 질병을 동시에 검출할 수 있으므로 효율적인 진단이 가능함을 확인하였다.
반응액 조성물 첨가량 (㎕)
제1 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제1 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제1 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제2 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제2 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제2 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
제3 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제3 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕ 용액) 0.5
제3 프로브 (10 pmol/㎕ 용액) 0.2
2X 실시간(Real-time) RT-PCR 버퍼 10
25X RT-Enzyme 믹스* 0.8
주형 DNA 또는 RNA 5
TE 버퍼 0.6
합계 20
*25X RT-Enzyme 믹스: PowerAmpTM One Step RT-PCR 키트, 코젠바이오텍
질병 문헌 프라이머 서열
유럽부저병 한국공개특허 제10-2009-0047123호 정방향: TTAGAGAAGAATAGGGGAAA
역방향: GAAGCTTTATGAGATTTGCTTAA
미국부저병 한국공개특허 제10-2010-0056238호 정방향: ACCGGGATAACTTGCGG
역방향: AATTCCGACTTCATGCAG
낭충봉아부패병 한국공개특허
제10-2017-0025453호		 정방향: CATTGCATGGTTTAAAACAGT
역방향: GCGGTAAATAAGCACTCGA
< 실험예 3> 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 특이도 확인
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 확인하기 위하여, 환경에서 흔히 검출되며 꿀벌에 감염될 수 있는 다른 병원체 및 다른 동물종의 DNA를 이용하여 교차반응 여부를 확인하였다.
구체적으로, 하기 표 8에 기재된 시료를 주형으로 사용한 것을 제외하고 상기 실험예 1-2와 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
생물명 출처 본 발명의 3종 프라이머 및 프로브 세트
Vibrio paraheamolyticus ATCC 17802 Negative
Staphylococcus aureus ATCC 27664 Negative
Staphylococcus aureus isolates Negative
Staphylococcus aureus isolates Negative
Vibrio vulnificus ATCC 27562 Negative
Listeria monocytogenes ATCC 19113 Negative
Listeria welshimeri ATCC 35897 Negative
Salmonella Dublin ATCC 15480 Negative
Salmonella Heidelberg ATCC 8326 Negative
Salmonella typhimurium ATCC 19214 Negative
Escherichia coli isolates Negative
Escherichia coli isolates Negative
Bacillus cereus ATCC 21366 Negative
Bacillus cereus ATCC 14579 Negative
Bacillus cereus KCTC 1526 Negative
Listeria inocoua KCTC 3586 Negative
Clostridium perfringens ATCC 12916 Negative
Salmonella enteritidis KCTC 12400 Negative
Campylobacter rectus KCTC 5636 Negative
소(Cattle) 게놈 DNA - Negative
돼지(Pork) 게놈 DNA - Negative
닭(Chicken) 게놈 DNA - Negative
오리(Duck) 게놈 DNA - Negative
양(Sheep) 게놈 DNA - Negative
염소(Goat) 게놈 DNA - Negative
인간(Human) 게놈 DNA - Negative
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 표 8의 병원체 및 동물종의 DNA 시료에서는 증폭 반응이 검출되지 않아, 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
<110> KOGENEBIOTECH <120> Primers and probes for detection of sacbrood virus, Paenibacillus larvae and Melissococcus plutonius, and method for detecting sacbrood virus, Paenibacillus larvae and Melissococcus plutonius using the same <130> 2019P-01-005 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sacbrood virus_forward primer <400> 1 gtaagaagac atttgataca gtggactctt 30 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sacbrood virus_reverse primer <400> 2 gtctaacatt ccagattctt cgtcc 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sacbrood virus_probe <400> 3 taatggttgg gtttctggta tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paenibacillus larvae_forward primer <400> 4 ggcaacctgc ctgtaagacc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paenibacillus larvae_reverse primer <400> 5 catgcgaaga aaccagctat cc 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paenibacillus larvae_probe <400> 6 ttagctcacg tttccgcaag ttatcccg 28 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melissococcus plutonius_forward primer <400> 7 tgaatgcgat tcccgaagat at 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melissococcus plutonius_reverse primer <400> 8 agaaaaatga atgattcaca tgcc 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melissococcus plutonius_probe <400> 9 tcgtttagct gttcgcaata atggtggg 28

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머;
    서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머;
    서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머;
    서열번호 5의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머;
    서열번호 7의 염기서열로 기재되는 제3 정방향 프라이머;
    서열번호 8의 염기서열로 기재되는 제3 역방향 프라이머; 및
    서열번호 3, 6 및 9의 염기서열로 각각 기재되는 프로브로 이루어진 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 키트.
  5. 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 조성물을 이용하여 다중(multiplex) 실시간(real-time) 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출 방법.
KR1020190034474A 2019-03-26 2019-03-26 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법 KR102231342B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190034474A KR102231342B1 (ko) 2019-03-26 2019-03-26 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190034474A KR102231342B1 (ko) 2019-03-26 2019-03-26 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200115794A KR20200115794A (ko) 2020-10-08
KR102231342B1 true KR102231342B1 (ko) 2021-03-25

Family

ID=72897398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190034474A KR102231342B1 (ko) 2019-03-26 2019-03-26 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102231342B1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101658377B1 (ko) 2010-02-08 2016-09-21 영남대학교 산학협력단 미국부저병의 원인균에 대한 항균활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 ｙｍｌ ００１, 상기 미생물을 함유하는 항균성 미생물제제 및 상기 미생물을 이용한 방제방법
KR101230975B1 (ko) 2010-10-19 2013-02-07 김권회 꿀벌 부저병 예방 및 치료용 조성물
KR101600983B1 (ko) 2014-10-15 2016-03-08 이우철 꿀벌의 낭충봉아부패병 예방 및 치료제
KR102146359B1 (ko) * 2017-09-08 2020-08-21 대한민국 꿀벌의 기생충성 및 세균성 질병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 기생충성 및 세균성 질병을 진단하는 방법 및 키트
KR20190030878A (ko) * 2017-09-15 2019-03-25 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200115794A (ko) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Løvoll et al. Quantification of piscine reovirus (PRV) at different stages of Atlantic salmon Salmo salar production
Oidtmann et al. Detection of genomic DNA of the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci (Oomycete) in clinical samples by PCR
Feronato et al. Development and evaluation of a nested-PCR assay for Senecavirus A diagnosis
KR101857685B1 (ko) 코로나바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법
CN106755494A (zh) 蜂房蜜蜂球菌荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
Nol et al. Epizootic hemorrhagic disease outbreak in a captive facility housing white-tailed deer (Odocoileus virginianus), bison (Bison bison), elk (Cervus elaphus), cattle (Bos taurus), and goats (Capra hircus) in Colorado, USA
KR102231342B1 (ko) 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 낭충봉아부패병, 미국부저병 및 유럽부저병 병원체의 검출 방법
Mishra et al. Recent advances in fish disease diagnosis, therapeutics, and vaccine development
KR101533594B1 (ko) 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트
Maazi et al. Occurrence of Chlamydophila felis, feline herpesvirus 1 and calcivirus in domestic cats of Iran
Münster et al. Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by IS900-based PCR assays from an alpaca (Vicugna pacos) kept in a German zoological garden
KR20190028274A (ko) 꿀벌의 기생충성 및 세균성 질병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 기생충성 및 세균성 질병을 진단하는 방법 및 키트
KR102149373B1 (ko) 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
Cano et al. Non‐lethal loop‐mediated isothermal amplification assay as a point‐of‐care diagnostics tool for Neoparamoeba perurans, the causative agent of amoebic gill disease
KR100843575B1 (ko) 멍게 물렁증 기생충의 유전자 및 멍게 물렁증 진단 방법
Gahlawat et al. A sensitive loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of Renibacterium salmoninarum, causative agent of bacterial kidney disease in salmonids
KR101437389B1 (ko) 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법
ES2578367B2 (es) Procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de aeromonas salmonicida spp. salmonicida
Domingo et al. Detection of Cryptosporidium parvum DNA in fecal samples of infected cattle (Bos indicus) and water buffaloes (Bubalus bubalis) in the Philippines using loop-mediated isothermal amplification method
CN104250665B (zh) 青枯菌5号小种rtq-pcr检测引物及方法
KR102405994B1 (ko) 마이코플라스마 갈리셉티쿰의 야외주와 백신주를 동시에 구별하여 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출방법
Chen et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay with high sensitivity to rapid detection of viable Salmonella in foods
KR102284243B1 (ko) 니파 및 헨드라 바이러스를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 및 헨드라 바이러스의 검출방법
KR102435209B1 (ko) 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
KR102639330B1 (ko) 병원성 에로모나스균의 종 판별을 위한 프라이머 조성물 및 이를 포함하는 진단키트

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant