KR102142134B1 - 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 - Google Patents

광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(vaccinia rabies glycoprotein, V-RG; genetically modified rabies vaccine, ERAGS; 또는 recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies, Ad-0910G)를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 광견병 바이러스(RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G)를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 광견병 바이러스 및 백신주의 감별에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법{Primers and probes for differentiation between Rabies virus and vaccine strains and differentiating method between Rabies virus and vaccine strains using the same}
본 발명은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(vaccinia rabies glycoprotein, V-RG; genetically modified rabies vaccine, ERAGS; 또는 recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies, Ad-0910G)를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법에 관한 것이다.
광견병 바이러스는 Rhabdoviridae과, Lyssavirus속에 속하는 신경친화성 바이러스로, 단일 가닥의 음성 RNA를 핵산으로 가지고 있다. 광견병 바이러스의 RNA는 nucleoprotein(N), non-structural protein(NS), matrix protein(M), glycoprotein(G), 또는 RNA polymerase(L)를 발현하는 5개의 유전자로 구성 되어있다. N, NS, 및 L 단백질은 핵단백질 코어(nucleoprotein core)를 형성하는데 관여하고, M 단백질은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)의 응축에 관여하며, G 단백질은 바이러스가 타겟 세포와 결합하는데 관여한다.
광견병 바이러스는 주로 온혈동물에 감염되어 광견병을 유발한다. 광견병은 인수공통전염병으로 세계적으로 매년 2만 5천~7만 5천명의 사람에게 감염되고, 그 중 2만 9천건 이상이 아시아 지역에서 발생한다. 광견병의 초기 증상으로는 발열, 두통, 전신쇠약감, 불안감, 발열, 권태감, 물린 부위의 감각이상 등이 나타나고, 후기 증상으로는 불면증, 불안, 혼돈, 흥분, 부분적인 마비, 환청, 흥분, 타액, 땀, 눈물 등 과다분비, 연하곤란, 물을 두려워하는 증세가 나타나며, 이후 수일 내에 섬망, 경련, 혼미, 혼수에 이르며 호흡근 마비 또는 합병증으로 사망하게 된다. 광견병은 박쥐, 붉은 여우, 스컹크, 너구리, 개, 늑대, 몽구스 등의 숙주동물에 의해 전파되는데, 우리나라에서는 1993년 이후 개에 의한 전파는 사라지고 너구리 또는 오소리에 의해 전파되고 있고, 1907년 처음으로 광견병이 발견된 이후 꾸준히 발생하여 1993년부터 2016년까지 총 444건이 보고되었다.
광견병 발생을 감소시키기 위해, 우리나라는 2000년부터 미끼 백신을 지속적으로 살포하고 있다. 미끼 백신은 주사용 백신을 접종하기 어려운 야생동물(여우, 너구리, 코요태 등)에게 적용하기 위한 경구용 백신으로서, 야생동물이 좋아하는 썩은 고기 안에 백신을 넣어 야생동물이 섭취하도록 유도하여 면역을 형성시킨다. 강원도와 경기도 북부지역의 광견병 발생지역을 중심으로 너구리가 서식하는 산간지역에 매년 미끼백신을 살포해 광견병 전파를 사전에 차단하고 있다.
현재 미끼백신으로 사용되는 V-RG(vaccinia rabies glycoprotein) 백신주는스컹크, 개 및 고양이에 경구투여 시 항체형성이 미비하여 야생 너구리와 여우에만 적용 되고, 사람에게 접촉시 감염사례가 보고되어 안전성이 문제되고 있다. 이에, 경구투여 시 목적동물(너구리, 개, 고양이)뿐 아니라 비목적동물(사람, 멧돼지, 조류 등)에도 안전한 새로운 광견병 백신 후보주가 연구되고 있다. 이와 관련하여, 광견병 백신 후보주로서 대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호는 광견병 바이러스 G 단백질의 333번째 아미노산이 글루탐산으로, 194번째 아미노산이 세린으로 치환된 재조합 광견병 바이러스(ERAGS, genetically modified rabies vaccine)를, 'Jiyoung Choi et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 4: 189-194 (2015)'는 광견병 바이러스의 G 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad-0910G, recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies)를 개시하고 있다.
광견병을 효과적으로 방역하기 위해서는 지속적인 모니터링이 필요하다. 광견병 바이러스를 검출하기 위해 직접 형광항체 시험(direct fluorescent antibody test), 마우스 접종 시험(mouse inoculation test), 또는 광견병 조직 배양 접종 시험(rabies tissue culture inoculation test)등이 이용되고 있으나 시료 상태에 따라 감도가 떨어지는 문제점이 있어, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 검출방법이 연구되고 있다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 실험 중 오염 가능성이 적고, 민감도와 특이도가 좋으며, 정량을 할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 멀티플렉스 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR)은 검출하고자 하는 다수의 핵산 분자 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍과, 서로 다른 형광 염료로 표지된 프로브를 이용하는 방법으로, 이를 이용해 같은 시료에 포함된 상이한 다수의 핵산 분자를 동시에 검출하고 감별할 수 있다. 따라서, 광견병 미끼백신의 효과를 모니터링하기 위해, 광견병 바이러스 및 백신주를 동시에 검출하고 감별할 수 있는 멀티플렉스 실시간 중합효소 연쇄반응 방법을 개발하는 것이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호
Jiyoung Choi et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 4: 189-194 (2015)
본 발명의 목적은 광견병 바이러스(Rabies virus, RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(vaccinia rabies glycoprotein, V-RG; genetically modified rabies vaccine, ERAGS; 또는 recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies, Ad-0910G)를 감별하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 2프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG(vaccinia rabies glycoprotein) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 3프라이머 세트를 포함하는, 광견병 바이러스 및 ERAGS(genetically modified rabies vaccine) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 4프라이머 세트를 포함하는, 광견병 바이러스 및 Ad-0910G(recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 광견병 바이러스(RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G)를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 광견병 바이러스 및 백신주의 감별에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR(duplex real-time PCR) 수행 시 광견병 바이러스의 최소검출한계(limit of detection, LoD), 증폭효율(amplification efficiency, Eff%), 및 결정계수(coefficient of determination, R2)를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 V-RG 백신주의 최소검출한계, 증폭효율, 및 결정계수를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 광견병 바이러스의 최소검출한계, 증폭효율, 및 결정계수를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 ERAGS 백신주의 최소검출한계, 증폭효율, 및 결정계수를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 광견병 바이러스의 최소검출한계, 증폭효율, 및 결정계수를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주를 감별하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 Ad-0910G 백신주의 최소검출한계, 증폭효율, 및 결정계수를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 ERAGS 백신주를 검출하기 위한 이중 실시간 PCR 수행 시 검출 효율을 나타낸 도이다.
도 8은 공지된 프라이머 세트를 이용하여 ERAGS 백신주를 검출하기 위한 PCR 수행 시 검출 효율을 나타낸 도이다(N: 대조군, 1 내지 5: 105 내지 101 copies/μL 농도의 ERAGS 백신주 시료).
도 9는 공지된 프라이머 세트를 이용하여 ERAGS 백신주를 검출하기 위한 PCR 수행시 검출 효율을 나타낸 도이다(N: 대조군, 1 내지 5: 105 내지 101 copies/μL 농도의 ERAGS 백신주 시료).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 2프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG(vaccinia rabies glycoprotein) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 3프라이머 세트를 포함하는, 광견병 바이러스 및 ERAGS(genetically modified rabies vaccine) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 및 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 4프라이머 세트를 포함하는, 광견병 바이러스 및 Ad-0910G(recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies) 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 V-RG 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 35개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 ERAGS 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 35개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 6으로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
본 발명의 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 35개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 광견병 바이러스 또는 광견병 바이러스 백신주를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
상기 광견병 바이러스 백신주는 V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G 백신주일 수 있다.
상기 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 조성물 중, 제 1, 2, 3, 또는 4프라이머 세트를 포함하는 검출용 조성물은 각각 서열번호 9, 10, 11 또는 12로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 광견병 바이러스 또는 광견병 바이러스 백신주를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM 또는 JOE일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 8. 10. 11. 또는 12로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 제작하고(표 1 및 2 참조), 이를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)을 수행시 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 최소검출한계(limit of detection, LoD)가 10 copies/μL 이하, 증폭효율(amplification efficiency, Eff%)이 90% 이상, 직선성(linearity)을 나타내는 결정계수(coefficient of determination, R2)가 0.995 이상이고(도 1 내지 6 참조), 광견병 바이러스 또는 광견병 바이러스 백신주만이 특이적으로 검출되며(표 5 참조), 공지된 프라이머 세트와 비교하였을 때 검출 효율이 좋음을(도 7 내지 9 참조) 확인하였다.
따라서, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 광견병 바이러스(RABV) 및 광견병 바이러스 백신주(V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G)를 특이적으로 동시에 구분하여 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
상기 광견병 바이러스 백신주는 V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G 백신주일 수 있다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트를 포함할 수 있고, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 조성물 중, 제 1, 2, 3, 또는 4프라이머 세트를 포함하는 검출용 조성물은 각각 서열번호 9, 10, 11 또는 12로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 광견병 바이러스 백신주는 V-RG, ERAGS, 또는 Ad-0910G 백신주일 수 있다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있고, 구체적으로는 뇌조직으로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트의 프라이머는 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 광견병 바이러스(RABV), V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
1-1. 광견병 바이러스를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
한국에서 주로 발생하는 광견병 바이러스 균주(strain)를 조사하여 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 각 균주의 염기서열을 수집하였다. 수집된 염기서열의 보존부위(conserved region)를 표적으로 광견병 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였고(표 1), 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)을 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher)를 결합시켰다.
타겟 프라이머 또는 프로브 서열(5'→3') 서열번호
RABV 정방향 프라이머 GGA ATA TGT CCC GCT GAA AGA AC 1
역방향 프라이머 GAG TAA CCA TTT GGG CTA CAC ACT TTA AC 2
프로브 CAA GAA GAA CAT GAG GAA CTT TTG CAT CAA CG 9
1-2. 광견병 바이러스 백신주를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
광견병 바이러스 백신주인 V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주를 표적으로 이를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다(표 2). 구체적으로, 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 목표 유전자의 염기서열을 수집하고, 이를 NCBI에서 블라스트(BLAST)하여 유전자 은행(Genebank)에 등록된 각각의 염기서열을 획득하였다. 확보된 염기서열을 Geneious 소프트웨어를 이용해 다중-얼라인먼트(multi-alignment)한 후, 목표 유전자에서만 특이적으로 나타나는 염기서열에 해당하는 프라이머 및 프로브를 제작하였다. 프라이머는 Tm(melting temperature)이 60℃, 프로브는 Tm이 70℃가 되도록 제작하였고, 프라임 익스프레스(primer express) 소프트웨어를 이용하여 GC 비율 및 Tm 값을 계산하였다. 프로브의 5' 말단에는 리포터 JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein)를 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher)를 결합시켰다.
타겟 프라이머 또는 프로브 서열(5'→3') 서열번호
V-RG 정방향 프라이머 CGG TAA GGA AGT AGA ATC ATA AAG AAC AGT 3
역방향 프라이머 TAA ATA GGG AAT TTC CCA AAA CAC AAT 4
프로브 AGG CTC TCC TGT TTG TAC CCC TTC TGG TTT 10
ERAGS 정방향 프라이머 GGT CTA CCT ACT GCT CCA CTA ACC AC 5
역방향 프라이머 GGA TGC TCT CTT CCC TCT ACT GGA 6
프로브 ATT ACA CCA TTT GGA TGC CCG AGA ATC 11
Ad-0910G 정방향 프라이머 AAA AGC GGA GGT GAG ACC AGA CT 7
역방향 프라이머 GTT AGG GAT AGG CTT ACC TTC GAA CC 8
프로브 CTT GTA CAA AGT GGT TGA TCT AGA GGG CCC G 12
실험예 1. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 민감도 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 민감도를 표준 곡선(Standard curve)으로부터 최소검출한계(limit of detection, LoD), 증폭효율(amplification efficiency, Eff%), 및 결정계수(coefficient of determination, R2)를 측정하여 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브를 표 3의 구성 및 농도로 혼합하여 총 3개의 조성물을 준비하고, 한국수의유전자원은행에서 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주 시료를 분양받아 106, 105, 104, 103, 102, 101 또는 100 copies/μL의 농도로 정량하였다. RABV/V-RG duplex 조성물에 광견병 바이러스 또는 V-RG 백신주 시료를, RABV/ERAGS duplex 조성물에 광견병 바이러스 또는 ERAGS 백신주 시료를, RABV/Ad-0910G duplex 조성물에 광견병 바이러스 또는 Ad-0910G 백신주 시료를 각각 처리하였다. 이 때, PCR 반응액은 1 μL 당 표 3의 농도가 되도록 희석한 프라이머 및 프로브 조성물 1 μL, PowerAmpTM One Step RT Real-time PCR Kit(코젠바이오텍, 한국)의 2x RT Real-time PCR Master mix 10 μL, nuclease-free water 4 μL, 및 바이러스 또는 백신주 시료 5 μL를 혼합하여 총 부피를 20 μL로 맞추었다. 각각의 반응액에 대해 AB7500 Real-time PCR system(Life technologies, 미국)을 이용해 표 4에 기재된 반응 조건으로 이중 실시간 PCR(duplex real-time PCR)을 3회 반복수행하였다. 측정된 Ct(cycle threshold)값을 이용해 표준곡선을 그리고 이로부터 최소검출한계, 증폭효율 및 결정계수를 측정하였다.
조성물 프라이머 또는 프로브 농도(nM)
RABV/V-RG duplex RABV 정방향 프라이머 250
RABV 역방향 프라이머 250
RABV 프로브 150
V-RG 정방향 프라이머 500
V-RG 역방향 프라이머 500
V-RG 프로브 200
RABV/ERAGS duplex RABV 정방향 프라이머 500
RABV 역방향 프라이머 500
RABV 프로브 150
ERAGS 정방향 프라이머 500
ERAGS 역방향 프라이머 500
ERAGS 프로브 300
RABV/Ad-0910G duplex RABV 정방향 프라이머 500
RABV 역방향 프라이머 500
RABV 프로브 200
Ad-0910G 정방향 프라이머 500
Ad-0910G 역방향 프라이머 500
Ad-0910G 프로브 200
온도(℃) 시간 싸이클 수
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 40
60 1분
그 결과, 도 1 내지 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 최소검출한계는 광견병 바이러스 10 copies/μL, V-RG 백신주 1 copy/μL, ERAGS 백신주 1 copy/μL, 및 Ad-0910G 백신주 10 copies/μL로 측정되었고, 증폭효율은 90% 이상, 결정계수는 0.995 이상으로 측정되었다. 이로부터, 표 3의 각 조성물을 이용해 광견병 바이러스 및 백신주를 높은 민감도로 구분하여 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 특이도 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 특이도를 다른 균주에 의한 교차반응 여부로 확인하였다.
구체적으로, 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 및 Ad-0910G 백신주외에 29주의 병원체(표 5) 유전자를 사용하여 다른 균주에 의한 교차반응 여부를 확인하였다. 구체적으로, 광견병 바이러스, V-RG 백신주, ERAGS 백신주, 또는 Ad-0910G 백신주 유전자 대신 표 5의 병원체 유전자인 gDNA 또는 gRNA를 10 ng/μL의 농도로 사용한 것을 제외하고는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
번호 카테고리 균주명 RABV/V-RG duplex RABV/ERAGS duplex RABV/Ad-0910G duplex
1 Rabies virus Rabies virus + - + - + -
2 Rabies virus vaccine strain V-RG strain - + - - - -
3 ERAGS strain + - + + + -
4 Ad-0910G strain - - - - - +
5 Influenza virus Influenza A H1 - - - - - -
6 Influenza A H3 - - - - - -
7 Influenza A H5 - - - - - -
8 Respiratory virus Adenovirus - - - - - -
9 Parainfluenza 1 - - - - - -
10 Parainfluenza 2 - - - - - -
11 Parainfluenza 3 - - - - -
12 Coronavirus - - - - - -
13 Respiratory syncytial virus A - - - - - -
14 Respiratory syncytial virus B - - - - - -
15 Measles - - - - - -
16 Rubella - - - - - -
17 Mumps - - - - - -
18 Pathogenic bacteria Bacillus cereus - - - - - -
19 Bacillus subtilis - - - - - -
20 Campylobacter jejuni - - - - - -
21 E.coli O157 - - - - - -
22 Listeria monocytogenes - - - - - -
23 Yersinia enterocolitica - - - - - -
24 Clostridium perfringens - - - - - -
25 Salmonella typhi - - - - - -
26 Salmonella typhimurium - - - - - -
27 Shigella sonnei - - - - - -
28 Staphylococcus aureus - - - - - -
29 Vibrio vulnificus - - - - - -
30 Yersinia enterocolitica - - - - - -
31 Legionella pneumophila - - - - - -
32 Pseudomonas aeruginosa - - - - - -
33 Mycoplasma pneumoniae - - - - - -
34 Other species Cow - - - - - -
35 Pork - - - - - -
36 Chicken - - - - - -
37 Duck - - - - - -
38 Sheep - - - - - -
39 Goat - - - - - -
40 Turkey - - - - - -
41 Raccoon dog - - - - - -
42 Horse - - - - - -
43 Donkey - - - - - -
44 Human - - - - - -
45 Dog - - - - - -
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RABV/V-RG duplex 조성물은 광견병 바이러스 및 V-RG 백신주를, RABV/ERAGS duplex 조성물은 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주를, RABV/Ad-0910G duplex 조성물은 광견병 바이러스 및 Ad-0910G 백신주를 구별하여 검출하였다. 이로부터, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 광견병 바이러스 및 백신주 외의 다른 균주에 의해 교차반응을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
실험예 3. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 검출 효율 확인
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 민감도의 우수성을 확인하고자, 공지된 RABV 및 ERAGS 백신주의 감별을 위한 프라이머 세트(대한민국 공개특허 제10-2015-0138956호; 공지 프라이머 세트 1)와 RABV 검출용 프라이머 세트(동물질병 표준 진단요령, 농림축산검역본부, 2015; 공지 프라이머 세트 2)를 이용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제작한 광견병 바이러스 및 ERAGS 백신주를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 세트와, 공지된 두 종류의 프라이머 세트를(표 6) 준비하고, 한국수의유전자원은행에서 ERAGS 백신주 시료를 분양받아 105, 104, 103, 102, 또는 101 copies/μL의 농도로 정량하였다. 이 때, PCR 반응액은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에 대해서는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로, 공지 프라이머 세트 1에 대해서는 50 pmole/μL가 되도록 희석한 프라이머를 각각 1 μL씩, PowerAmpTM One Step RT Real-time PCR Kit(코젠바이오텍, 한국)의 2x RT Real-time PCR Master mix 12.5 μL, nuclease-free water 3.5 μL, 및 ERAGS 백신주 시료 5 μL를 혼합하여 총 부피를 25 μL로, 공지 프라이머 세트 2에 대해서는 10 pmole/μL가 되도록 희석한의 프라이머를 각각 1 μL씩, PowerAmpTM One Step RT Real-time PCR Kit(코젠바이오텍, 한국)의 2x RT Real-time PCR Master mix 10 μL, nuclease-free water 3 μL, 및 ERAGS 백신주 시료 5 μL를 혼합하여 총 부피를 20 μL로 맞추었다. 본 발명의 프라이머 및 프로프 세트에 대해서는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 이중 실시간 PCR을 수행하고, 공지 프라이머 세트 1 및 2에 대해서는 GeneAmp 9700 PCR System(Life technologies, 미국)을 이용하여 PCR을 수행한 뒤 아가로즈 젤 상에서 5μL의 PCR 산물을 전기영동하였다.
구분 타겟 프라이머 또는 프로브 서열(5'→3') 서열번호
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트 RABV 정방향 프라이머 GGA ATA TGT CCC GCT GAA AGA AC 1
역방향 프라이머 GAG TAA CCA TTT GGG CTA CAC ACT TTA AC 2
프로브 CAA GAA GAA CAT GAG GAA CTT TTG CAT CAA CG 9
ERAGS 정방향 프라이머 GGT CTA CCT ACT GCT CCA CTA ACC AC 5
역방향 프라이머 GGA TGC TCT CTT CCC TCT ACT GGA 6
프로브 ATT ACA CCA TTT GGA TGC CCG AGA ATC 11
공지 프라이머 세트 1 RABV 정방향 프라이머 AGG RAA TTG GGC TTT GAC TGG A 13
역방향 프라이머 AAA GGG GCT GTC TCG AAA AT 14
ERAGS 정방향 프라이머 TGT CTT GTG ACA TTT TTA CCT CC 15
역방향 프라이머 GGA TGA TCT CAT TCC AAG TTT C 16
공지 프라이머 세트 2 RABV 정방향 프라이머 GCA GAT AGG ATA GAG CAR A 17
역방향 프라이머 AAA GTG AAT GAG ATT GAA C 18
그 결과, 도 7 내지 9에 나타낸 바와 같이, ERAGS 백신주는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에서 RABV 프라이머 및 프로브 세트, 및 ERAGS 프라이머 및 프로브 세트에 의해 10 copies/μL의 농도까지 검출되었고, 공지 프라이머 세트 1에서 RABV 프라이머 세트에 의해 103 copies/μL의 농도까지, ERAGS 프라이머 세트에 의해 104 copies/μL의 농도까지 검출되었으며, 공지 프라이머 세트 2에서 RABV 프라이머 세트에 의해 10 copies/μL의 농도까지 검출되었다. 공지 프라이머 세트 1보다 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 더 낮은 농도의 시료까지 검출하였고, 공지 프라이머 세트 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트와 검출할 수 있는 시료의 농도는 동일하였으나, RABV 및 ERAGS 백신주를 구별하여 검출하지 못하였다. 이로부터, 공지된 프라이머와 비교하여, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용했을 때 RABV 및 ERAGS 백신주를 높은 효율로 구분하여 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> KoGene BioTech Co., LTD. <120> Primers and probes for differentiation between Rabies virus and vaccine strains and differentiating method between Rabies virus and vaccine strains using the same <130> 2018P-07-045 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Forward Primer <400> 1 ggaatatgtc ccgctgaaag aac 23 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Reverse Primer <400> 2 gagtaaccat ttgggctaca cactttaac 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-RG Forward Primer <400> 3 cggtaaggaa gtagaatcat aaagaacagt 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-RG Reverse Primer <400> 4 taaataggga atttcccaaa acacaat 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS Forward Primer <400> 5 ggtctaccta ctgctccact aaccac 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS Reverse Primer <400> 6 ggatgctctc ttccctctac tgga 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-0910G Forward Primer <400> 7 aaaagcggag gtgagaccag act 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-0910G Reverse Primer <400> 8 gttagggata ggcttacctt cgaacc 26 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Probe <400> 9 caagaagaac atgaggaact tttgcatcaa cg 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-RG Probe <400> 10 aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS Probe <400> 11 attacaccat ttggatgccc gagaatc 27 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-0910G Probe <400> 12 cttgtacaaa gtggttgatc tagagggccc g 31 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Forward Primer_known 1 <400> 13 aggraattgg gctttgactg ga 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Reverse Primer_known 1 <400> 14 aaaggggctg tctcgaaaat 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS Forward Primer_known 1 <400> 15 tgtcttgtga catttttacc tcc 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAGS Reverse Primer_known 1 <400> 16 ggatgatctc attccaagtt tc 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Forward Primer_known 2 <400> 17 gcagatagga tagagcara 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RABV Reverse Primer_known 2 <400> 18 aaagtgaatg agattgaac 19

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 2프라이머 세트 및 서열번호 9 및 10으로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 광견병 바이러스 및 V-RG(vaccinia rabies glycoprotein) 백신주를 감별할 수 있는 검출용 조성물.
  2. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 3프라이머 세트 및 서열번호 9 및 11로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 광견병 바이러스 및 ERAGS(genetically modified rabies vaccine) 백신주를 감별할 수 있는 검출용 조성물.
  3. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 1프라이머 세트, 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 제 4프라이머 세트 및 서열번호 9 및 12로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 광견병 바이러스 및 Ad-0910G(recombinant Adenoviruses expressing the glycoprotein of rabies) 백신주를 감별할 수 있는 검출용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 접합된 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자가 추가로 접합된 것인, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 검출용 키트.
  9. 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 제 1항, 제 2항, 또는 제 3항의 조성물을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 백신주를 감별할 수 있는 방법.
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KR20150138956A (ko) 2014-05-30 2015-12-11 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 재조합 광견병 바이러스, 이를 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 야외 광견병 바이러스와의 감별을 위한 멀티플렉스 rt-pcr

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Choi 등, Clin Exp Vaccine Res., Vol. 4, No. 1, 페이지 189-194 (2015.07.29.)*

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