KR20240032932A - 변형된 동부 말 뇌염 바이러스, 자가-복제 rna 작제물, 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 동부 말 뇌염 바이러스, 자가-복제 rna 작제물, 및 이의 용도 Download PDF

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나다니엘 스티븐 왕
시게키 조셉 미야케-스토너
파리나즈 알리아마드
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레플리케이트 바이오사이언스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 포함하는 핵산 분자, 이를 함유하는 약학적 조성물, 및 세포 배양물 또는 생체에서 요망되는 생성물의 생성을 위한 이러한 핵산 분자 및 조성물의 용도를 포함하는, 분자 바이러스학 분야에 관한 것이다. 또한, 면역 반응 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법은 물론 다양한 건강 병태를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.

Description

변형된 동부 말 뇌염 바이러스, 자가-복제 RNA 작제물, 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2021년 7월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/220,139에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 개시는 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 참조로서 본원에 명백하게 포함된다.
분야
[0002] 본 개시내용은 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것으로, 특히 변형된 바이러스 게놈 및 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 인코딩하는 핵산 분자, 이를 함유하는 약학적 조성물, 및 세포 배양물 또는 살아있는 몸체에서 원하는 생성물의 생성을 위한 이러한 핵산 분자 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 약력학적 효과의 유도를 필요로 하는 대상체에서 약력학적 효과를 유도하기 위한, 예를 들어, 면역 반응을 유도하기 위한 방법 뿐만 아니라 다양한 건강 병태를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
서열 목록의 통합
[0003] 첨부된 서열 목록의 내용은 본 출원에 참조로서 포함된다. Sequence_Listing_058462-502001WO_ST26.xml로 명명된 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2022년 7월 8일에 생성되었으며, 93 KB이다.
배경
[0004] 최근 몇 년 동안 여러 상이한 동물 바이러스 군은 동종 재조합 또는 이들의 게놈의 직접 조작에 의해 유전자 조작으로 처리되었다. DNA 및 RNA 바이러스 둘 모두에 대한 역유전학 시스템의 가용성은 재조합 바이러스의 예를 들어 백신, 발현 벡터, 항종양제, 유전자 요법 벡터 및 약물 전달 비히클로서의 용도에 대한 새로운 관점을 만들었다.
[0005] 예를 들어, 배양된 재조합 세포에서 이종 단백질의 발현을 위해 많은 바이러스-기반 발현 벡터가 배치되었다. 예를 들어, 숙주 세포에서 유전자 발현을 위한 변형된 바이러스 벡터의 적용은 계속 확장되고 있다. 이와 관련하여 최근의 발전에는 다중-서브유닛 단백질 복합체의 생성을 위한 기술 및 시스템의 추가 개발 및 이종 단백질 생성을 개선하기 위한 단백질-변형 효소의 공동-발현이 포함된다. 바이러스 발현 벡터 기술에 관한 다른 최근의 진전에는 유전자 발현 제어, 바이러스 벡터 제조, 생체 내 유전자 요법 응용 및 백신 전달 벡터 생성을 위한 많은 고급 게놈 공학 응용이 포함된다.
[0006] 그러나, 숙주 세포가 병원체 침습을 감지하고 대응하기 위해 복잡하고 강력한 메커니즘을 발생시킬 수 있다고 보고되었다. 바이러스, 특히 병원성 바이러스는 감염 및 복제에 대한 이러한 세포 방어와 싸우기 위해 숙주 세포와 함께 진화하였다고 추가로 보고되었다. 감염의 결과로, 많은 숙주 세포는 잠재적으로 추가 세포로 퍼질 수 있는 자손의 바이러스 복제 및/또는 바이러스 생성을 제어하기 위해 세포 단백질 번역 절차를 차단한다. 이러한 현상을 일반적으로 "선천적 면역 반응"이라고 한다. 감염된 세포는 또한 항바이러스 상태를 설정하고 감염을 제어하기 위해 국소 및 전신적으로 다른 세포에 위험 신호를 보낸다. 이러한 세포성 항바이러스 시스템은 숙주 세포에 도움이 되지만, 이들은 또한 유익한 백신 항원을 발현하도록 설계된 자체-증폭 RNA(레플리콘 또는 자가-복제 RNA라고 함) 또는 치료제에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 세포가 유익한 단백질을 발현하는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 감지하고 이의 선천적 면역 방어 메커니즘을 활성화하는 경우, 그러한 세포에서 유익한 단백질의 발현이 영향을 받을 수 있고, 레플리콘의 효능이 손상될 수 있다.
[0007] 따라서, RNA 레플리콘-기반 발현 플랫폼에서 관심 생성물을 발현하기 위한 보다 효율적인 방법 및 시스템이 여전히 필요하다.
개요
[0008] 본 개시내용은 일반적으로 증식성 장애 및 미생물 감염과 같은 다양한 건강 병태의 예방 및 관리에 사용하기 위한 재조합 핵산 작제물 및 이를 포함하는 약학적 조성물과 같은 면역-치료제의 개발에 관한 것이다. 특히, 하기 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 일부 구현예는 바이러스의 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 바이러스 핵산 서열의 적어도 일부가 결여된 알파바이러스 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)의 변형된 게놈 또는 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 인코딩하는 서열을 함유하는 핵산 작제물을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 중 하나 이상을 포함하도록 조작된 재조합 세포 및 트랜스제닉 동물, 관심 분자를 생성하기 위한 방법, (a) 본 개시내용의 핵산 작제물, (b) 본 개시내용의 폴리펩티드, (c) 본 개시내용의 재조합 세포 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물이 개시된다. 본 개시내용의 특정 양태에서 약력학적 효과 유도를 필요로 하는 대상체에서 약력학적 효과를 유도하기 위한, 예를 들어, 면역 반응을 유도하기 위한 및/또는 증식성 장애(예를 들어, 암) 및 만성 감염을 포함하는 다양한 건강 병태의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 방법이 추가로 제공된다.
[0009] 본 개시내용의 한 양태에서, 변형된 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV) 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA에는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여된다.
[0010] 본 개시내용의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 실질적인 부분이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 서브게놈(sg) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, sg 프로모터는 26S 서브게놈 프로모터이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 하나 이상의 비번역된 영역(UTR)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, UTR 중 적어도 하나는 이종 UTR이다.
[0011] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI는 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI는 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 더 높은 수준의 발현을 위해 최적화된다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 향상된 RNA 안정성을 위해 최적화된다.
[0012] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 벡터에 혼입된다. 일부 구현예에서, 벡터는 자가-복제 RNA(srRNA) 벡터이다.
[0013] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0014] 한 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS-7), 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, FS4 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 PER.C6 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유아세포 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 인간 내피 세포, 인간 성상세포, 인간 대식세포, 인간 RAW 264.7 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 L929 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, 관련 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 제공된다.
[0015] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 곤충 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 모기 세포이다.
[0016] 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 척추 동물 또는 무척추 동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 포유동물은 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 곤충이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 곤충은 트랜스제닉 모기이다. 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 (i) 본원에 개시된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 사육하거나, (ii) 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포가 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생성하는 조건 하에 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 배양하는 것을 포함한다.
[0017] 또 다른 양태에서, 대상체에서 관심 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 척추 동물 또는 무척추 동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 곤충이다. 일부 구현예에서, 곤충은 모기이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
[0018] 추가의 또 다른 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제 및 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; 및/또는 c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
[0019] 본 개시내용의 약학적 조성물의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP) 또는 중합체 나노입자로 제향화된 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 면역원성 조성물이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에 대해 실질적으로 비면역원성이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내 투여, 안구내, 직장 및 경구 투여 중 하나 이상의 투여를 위해 제형화된다.
[0020] 또 다른 양태에서, 대상체에서 약력학적 효과를 유도하기 위한 방법 및 특히, 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드; 및/또는 d) 본 개시내용의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
[0021] 추가의 또 다른 양태에서, 건강 병태의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 병태를 예방하고/거나 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드; 및/또는 d) 본 개시내용 중 어느 하나의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여하는 것을 포함한다.
[0022] 본 개시내용의 방법의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 병태는 증식성 장애 또는 미생물 감염이다. 일부 구현예에서, 대상체는 증식성 장애 또는 미생물 감염과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 증가된 인터페론 생성을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 조성물은 개별적으로 단일 요법(단독 요법)으로서 또는 적어도 하나의 추가 요법과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적 요법 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0023] 추가의 또 다른 양태에서, 약력학적 효과를 유도하고/거나 면역반응을 유도하고/거나 건강 병태 또는 미생물 감염을 예방하고/거나 치료하기 위한 키트가 본원에 제공되며, 키트는 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드; 및/또는 d) 본 개시내용의 약학적 조성물을 포함한다.
[0024] 본원에 기술된 각각의 양태 및 구현예는 구현예 또는 양태의 문맥으로부터 명시적으로 또는 명백하게 배제되지 않는 한 함께 사용될 수 있다.
[0025] 전술한 요약은 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 기술된 예시적인 구현예 및 특징에 더하여, 본 개시내용의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 완전히 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
[0026] 도 1은 본 개시내용의 일부 구현예에 따른 변형된 EEEV 게놈 디자인의 비제한적인 예를 그래프로 표현한 것이며, 여기서 원래의 바이러스의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 완전히 결실되었다. 이 도면에 기재된 변형된 EEEV 설계는 EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된 천연 5' UTR 및 3' UTR을 함유하고, 26S 서브게놈 프로모터의 제어하에 배치된 이종성 관심 유전자(GOI)를 추가로 함유한다. 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 제시되어 있다.
[0027] 도 2a-2b는 본 개시의 일부 구현예에 따른 비제한적인 예시적인 EEEV RNA 레플리콘-기반 설계의 그래프 예시이며, 여기서 FL93-939 균주로부터의 변형된 EEEV 게놈을 인코딩하는 서열은 플라스미드 DNA 벡터에 혼입되었으며(도 2a), 이는 또한 예시적인 관심 유전자(GOI), 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 헤마글루티닌 전구체(HA)에 대한 코딩 서열을 포함하였다(도 2b).
[0028] 도 3a-3b는 EEEV RNA 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)으로 형질전환된 BHK-21의 등고선 플롯이다. 도 3a에서, GOI가 없는 EEEV 레플리콘 RNA를 전기천공에 의해 형질전환시키고, 형질전환 후 20시간에, 세포를 고정시키고, 투과시키고, PE-컨쥬게이션된 항-dsRNA 마우스 모노클로날 항체(J2, Scicons)를 사용하여 염색하여 형광 유동 세포측정에 의한 dsRNA+ 세포의 빈도를 정량화하였다. 도 3b에서, HA에 대한 코딩 서열을 포함하는 EEEV 레플리콘 RNA를 BHK-21 세포로 유사하게 형질전환시키고, dsRNA 검출 이외에, APC-컨쥬게이션된 항-HA 마우스 모노클로날 항체(2B7, Abcam)를 사용하여 트랜스진 발현을 검출하였다. 항-dsRNA 및 항-HA 항체 둘 모두에 의한 개별 세포의 양성 염색은 본원에 기재된 변형된 EEEV 설계가 생존 가능한 합성 레플리콘이고 RNA 복제를 겪고 트랜스진을 발현할 수 있음을 입증한다.
[0029] 도 4a-4b는 본 개시내용의 일부 구현예에 따라 설계된 변형된 EEEV 벡터가 2개의 예시적인 생활성 단백질 (i) 인터루킨-1 수용체 길항제 단백질(IL-1RA) 및 (ii) 인터루킨-12(IL-12)를 발현하는데 사용될 수 있음을 입증하는 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 4a-4b는 EEEV 자가-복제 RNA(srRNA)로 형질전환된 BHK-21로부터의 분비된 단백질 생활성의 정량화를 예시하는 막대 차트이다. 도 4a-4b에 도시된 srRNA는 각각이 2개의 상이한 배열구성으로 2개의 단백질 IL-1RA 및 IL-12를 인코딩하는 EEEV srRNA(RBI305, RBI306)이다. 또한 이러한 실험에는 하기와 같은 4개의 대조군 VEEV-기반 srRNA가 포함되었다: 2개의 배열구성으로 IL-1RA 및 IL-12 둘 모두를 인코딩하는 VEEV srRNA(RBI299, RBI300) 및 대조군 트랜스진을 갖는 VEEV srRNA(RBI296, RBI298). 도 4a는 srRNA 형질전환 후 24시간 및 48시간에 세포 배양 배지에서 생활성 IL-1RA의 정량화를 보여준다. 도 4b는 srRNA 형질전환 후 24시간 및 48시간에 세포 배양 배지에서 생활성 IL-12의 정량화를 보여준다.
[0030] 도 5a-5b는 광견병 바이러스의 외피 당단백질 G(RABV-G)인 예시적인 바이러스 항원을 인코딩하는 srRNA의 패널의 생체내 면역원성을 예시하는 막대 차트이다. 패널은 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE.TC83), 치쿤구니아 바이러스 균주 S27(CHIK.S27) 및 DRDE-06(CHIK.DRDE), 신드비스 바이러스 균주 거드우드(SIN.GW), 및 AR87(SIN. AR86), 및 동부 뇌염 바이러스(EEE.FL93)로부터 유래된 srRNA를 포함하였다. 도 5a는 2회 면역화 후 ELISpot에 의해 평가된 항원-특이적 비장 T 세포 반응의 정량화를 보여준다. 도 5b는 2회 면역화 후 혈청으로부터 항-광견병 중화 항체 역가를 보여준다.
[0031] 도 6a-6c는 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 유발하기 위한 백신으로서 사용하기 위한 예시적인 종양-관련 항원을 인코딩하는 srRNA의 패널의 생체내 면역원성을 나타내는 막대 그래프이다. 패널은 동부 뇌염 바이러스(EEE.FL93) 및 5개의 다른 알파바이러스로부터 유래된 srRNA를 포함하였다: 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE.TC83), 치쿤구니야 바이러스 균주 S27(CHIK.S27) 및 DRDE-06(CHIK.DRDE), 신드비스 바이러스 균주 거드우드(SIN.GW), 및 AR87(SIN.AR86). 각각의 srRNA는 3개의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다: 에스트로겐 수용체 1(ESR1), 인간 상피 성장 인자 2(HER2) 및 인간 상피 성장 인자 2(HER3)에 대한 서열. 도 6a-6c는 2회 면역화를 받은 마우스에서 ELISpot 분석을 사용하여 결정된 이러한 3개의 항원에 대한 비장 T 세포 반응을 시험한 각 항원 사이의 통계적 비교와 함께 보여준다.
[0032] 도 7은 예시적인 바이오치료 단백질(인간 IL-12)을 인코딩하는 srRNA의 패널로부터 인터루킨-12(IL-12)의 생체내 발현 수준을 예시하는 막대 차트이다. 패널은 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE.TC83), 치쿤구니아 바이러스 균주 S27(CHIK.S27) 및 DRDE-06(CHIK.DRDE), 신드비스 바이러스 균주 거드우드(SIN.GW), 및 AR87(SIN. AR86), 및 동부 뇌염 바이러스(EEE.FL93)로부터 유래된 srRNA를 포함하였다. srRNA를 마우스에 근육내 투여하고, 7일에 혈청을 수집하여 단백질의 전신 수준을 검출하였다.
[0033] 도 8은 또 다른 예시적인 바이오치료 단백질(마우스 IL-12)을 인코딩하는 EEEV srRNA 벡터로부터 발현된 IL-12의 생체내 활성을 예시하는 막대 차트이다. IL-12의 기능성은 다운스트림 약력학적 마커로서 IFNγ의 유도를 평가함으로써 측정되었다. srRNA의 투여 후 3일에 마우스로부터의 혈청은 검출 가능한 수준의 IFNγ을 나타내었다.
발명의 상세한 설명
[0034] 본원에서는 특히, 재조합 세포에서 예를 들어, 백신 및 치료용 폴리펩티드와 같은 이종성 분자를 발현하기에 적합한 우수한 발현 가능성을 갖는 바이러스 발현 시스템이 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 구현예는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)의 변형된 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 함유하는 예를 들어, 발현 작제물 및 벡터와 같은 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서 구조 단백질을 인코딩하는 이의 원래 바이러스 서열의 적어도 일부가 결실되었다. 또한, 본 개시내용의 일부 구현예에서 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 바이러스-기반 발현 벡터가 제공된다. 본원에 개시된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 것으로 유전자 조작된 재조합 세포가 추가로 제공된다. 이러한 재조합 세포로부터 유래된 생체물질 및 재조합 생성물 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 또한, 약력학적 효과 유도를 필요로 하는 대상체에서 약력학적 효과를 유도하는데, 예를 들어, 면역 반응을 유도하는데 유용한 조성물 및 방법 뿐만 아니라 다양한 건강 병태를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
[0035] RNA 바이러스(예를 들어, 알파바이러스)를 기반으로 하는 자가-증폭 RNA(예를 들어, 레플리콘 또는 자가-복제 RNA)는 강력한 발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 발현 벡터로서 EEEV와 같은 알파바이러스를 사용하는 이점은 이들이 재조합 숙주 세포에서 다량의 이종 단백질의 합성을 지시할 수 있다는 점이라고 보고되었다. 다른 이점 중에서, 치료용 단일 사슬 항체와 같은 폴리펩티드는 생체 내에서 높은 수준으로 발현되는 경우 가장 효과적일 수 있다. 또한, (생체 외) 배양 세포로부터 정제된 재조합 항체를 생성하기 위해, 레플리콘 RNA로부터의 높은 단백질 발현은 항체 생성물의 전체 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현되는 단백질이 백신 항원인 경우, 높은 수준의 발현은 생체 내에서 가장 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
[0036] 알파바이러스는 이들의 UTR, 구조 영역 및 비-구조 영역에 함유된 모티프를 활용하여 숙주 세포에서 이들의 복제에 영향을 미친다. 이들 영역은 또한 숙주 세포의 선천성 면역을 회피하는 메커니즘을 함유한다. 그러나, 알파바이러스 종 간에 상당한 차이가 보고되었다. 예를 들어, 신세계 및 구세계 알파바이러스는 바이러스 복제 복합체의 조립을 위한 세포 내에서 스트레스 과립, JAK-STAT 신호전달, FXR 및 G3BP 단백질을 이용하기 위해 서로 다른 구성요소를 진화시켰다. 이들 구성요소를 함유하는 게놈의 어떤 부분은 또한 알파바이러스에 따라 다르다. 예를 들어, PKR의 우회 활성화 및 EIF2알파의 후속 인산화는 신드비스와 같은 일부 구세계 알파바이러스의 다운스트림 루프를 통해 수행되지만, 이 경로를 우회하는 것은 인식 가능한 DLP가 부족한 치쿤구니아의 nsP4를 통해 수행되는 것으로 생각된다. 또한, 개별적인 알파바이러스 사이의 변이를 넘어 독성과 같은 특징의 변화를 설명할 수 있는 알파바이러스 균주 내에도 종종 차이가 있다. 예를 들어, 신세계 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)의 북미와 남미 균주 사이의 서열 차이는 STAT1 경로를 조절하는 능력을 변경하여 유형 I 인터페론의 차등 유도로 이어지고, 독성의 변화를 발생시킨다.
[0037] 알파바이러스의 비-구조적 및 구조적 영역에서 숙주 세포 약독화 인자의 차별적 존재를 감안할 때, 합성 벡터에서 이종성 유전자 발현을 허용하기 위해 구조적 유전자를 삭제하면 개별 벡터에 대한 영향을 변화시킬 것이다. 비-구조적 영역에서 상이한 숙주 약독화 인자를 갖는 합성 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)은 발현되는 이종성 유전자에 대한 면역 반응의 유도에서 차별적으로 탁월할 것이다. 예를 들어, 숙주 세포 기능의 차단은 VEEV 및 EEEV와 같은 신세계 바이러스에서, 구세계 바이러스에서 nsP2와 관련이 있는 반면, 이는 주로 캡시드 단백질(C)과 관련이 있으며, 이는 합성 벡터에서 부분적으로 또는 전체적으로 결실된다. nsP3 단백질의 초가변 도메인(HVD)은 각각의 알파바이러스에 특이적인 숙주-상호작용을 갖는다. 특히, EEEV nsP3는 세포성 FXR 및 G3BP 단백질 패밀리, DDX3, S100A4, IKKβ PGAM5, 및 세포골격 재구성 및 소포 트래피킹 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다. 특히, EEEV는 알파바이러스 및 특성규명된 EEEV 균주 중에서 가장 병원체성인 것으로 간주되어 왔으며, FL93-939는 마우스에서 가장 높은 IFN 수준을 유도한다. FL939-939 및 다른 북미 균주는 높은 수준의 IFN을 유도하지만, 감염된 야생형 대 IFN-결핍 마우스에서 바이러스혈증 또는 사망률의 차이는 거의 없으며, 이는 IFN이 남미 EEEV 균주와 대조적으로 이러한 균주에 대한 보호에서 거의 역할을 하지 않는다는 것을 시사한다. 북(FL93-939) 및 남아메리카(BeAr436087) 균주의 키메라는 IFN에 대한 중간 감수성을 나타내었고, 마우스에서 신경독성 및 조직 향성의 차이를 나타내어, 구조 및 비구조 단백질 둘 모두가 표현형 변이에 기여함을 입증하였다. 일반적으로, 스트레스 과립, IFN에 대한 균주-의존적 불가지론, 및 이의 강한 병원성에 기여하는 아직 설명되지 않은 다른 메카니즘을 방해하는 EEEV의 능력은 EEEV가 백신 또는 생물요법 적용을 위한 이종성 단백질의 발현에 유리한 벡터를 만들 것임을 시사한다. 이 벡터가 부여하는 이점은 지금까지 완전히 탐구되지 않았고 예측되지 않았다.
[0038] 아래에 자세히 설명되는 바와 같이, 공개적으로 이용가능한 알파바이러스 게놈 데이터가 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 관심 유전자(GOI)로 직접 대체하여 자가-복제 RNA 및 트랜스진-발현 레플리콘을 발생시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 항상 제공하는 것은 아니라는 초기 관찰이 이루어졌다. 예를 들어, 이용가능한 공개된 서열을 사용하여 EEEV 구조 단백질을 이종성 유전자로 단순히 교체하는 것이 기능성 레플리콘 생성에 반드시 충분한 것은 아니다. 달리 말하면, 이종성 5' 및/또는 3' UTR 서열을 사용하는 것과 같은 추가 조작이 백신 및 치료제에 사용하기에 적합한 레플리콘 시스템을 생성하는 데 필요할 것이다.
[0039] 하기에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 본 개시내용의 일부 구현예는 하나 이상의 관심 이종성 유전자(GOI)를 발현하도록 조작된 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)에 관한 것이다. 예를 들어, EEV 균주 FL93-939에서 구조적 다단백질 유전자를 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 유전자의 합성 헤마글루티닌 전구체(HA)로 대체하여(예를 들어, 도 2b 참조), 형질감염된 BHK-21 세포에서 RNA 복제 및 트랜스진을 발현할 수 있는 자가-복제 벡터를 생성하는 것이 가능함이 밝혀졌다(예를 들어, 도 3b 참조). 또한, 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 일부 EEEV-기반 srRNA 작제물은 항원의 발현을 위해 사용될 수 있고, 생체내에서 측정된 약력학적 효과를 갖는 백신으로서 제형화될 수 있다(예를 들어, 도 5 및 도 6 참조). 또한, 도 4a-4b에 기재된 실험 데이터는 EEEV-기반 srRNA 벡터가 단일 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 폴리시스트론 ORF에서) 내에서 서로 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 갖는 다수의 단백질의 발현에 유용할 수 있으며, 생체내 약력학적 효과에 의해 측정된 생활성을 가짐을 입증한다(예를 들어, 도 6 참조). 또한, 본 개시내용의 EEEV-기반 srRNA 벡터는 또한 생체내에서 확인된 생활성을 갖는 바이오치료 단백질(예를 들어, 도 7 참조)의 발현에 유용하다(예를 들어, 도 8 참조). 종합하면, 이러한 연구는 치료 및 백신 적용에서 EEEV srRNA의 사용을 추가로 입증한다.
정의
[0040] 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어 또는 전문용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 의미를 갖도록 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 대한 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기술되거나 참조된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 잘 이해되고 일반적으로 사용된다.
[0041] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 본원에서 "A", "B", "A 또는 B" 및 "A 및 B"와 같은 대안을 모두 포함하는 데 사용된다.
[0042] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여" 및 "투여하는"은 비제한적으로 비강내, 경피, 정맥내, 동맥내, 근육내, 결절내, 복강내, 피하, 근육내, 경구, 질내 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하는 투여 경로에 의한 생활성 조성물 또는 제형의 전달을 나타낸다. 용어는 비제한적으로, 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여가 포함한다.
[0043] 용어 "세포", "세포 배양물" 및 "세포주"는 특정 대상 세포, 세포 배양물 또는 세포주뿐만 아니라 배양의 이동 또는 계대 수에 관계없이 그러한 세포, 세포 배양물 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 나타낸다. 모든 자손이 부모 세포와 정확히 동일하지 않다는 것을 이해해야 한다. 이는 돌연변이(예를 들어, 고의적 또는 부주의한 돌연변이) 또는 환경적 영향(예를 들어, 메틸화 또는 기타 후생적 변형)으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있으며, 따라서 자손이 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나 자손이 원래의 세포, 세포 배양물 또는 세포주의 기능과 동일한 기능을 유지하는 한 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 여전히 포함되기 때문이다.
[0044] 본 개시내용의 조성물, 예를 들어, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물의 용어 "유효량", "치료학적 유효량" 또는 "약학적 유효량"은 일반적으로 조성물의 부재와 비교하여 명시된 목적을 달성하는데 (예를 들어, 조성물이 투여되는 효과를 달성하거나, 면역 반응을 자극하거나, 질병을 예방 또는 치료하거나, 질병, 장애, 감염 또는 건강 병태의 하나 이상의 증상을 감소시키는데) 충분한 조성물의 양을 나타낸다. "유효량"의 예는 "치료적 유효량"이라고도 지칭될 수 있는 질병의 증상 또는 증상들의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이다. 증상의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소 또는 증상(들)의 제거를 의미한다. "치료학적 유효량"을 포함하는 조성물의 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌 [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
[0045] 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값과 그 명시된 범위의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값이 본 개시내용에 포함됨이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한이 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 본 개시내용에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
[0046] 특정 범위는 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값과 함께 본원에 제시되며, 본원에 사용된 바와 같은 이는 이의 대략의 통상적인 의미를 갖는다. 용어 "약"은 약 뒤에 있는 정확한 숫자를 문자 그대로 지원하는데 사용될 뿐만아니라 용어가 앞에 오는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자이다. 어떤 숫자가 구체적으로 언급된 숫자에 가깝거나 대략적인지 판단할 때, 언급되지 않은 숫자에 가깝거나 근접한 숫자는 그것이 제시된 맥락에서 구체적으로 언급된 숫자와 실질적으로 동등한 것을 제공하는 숫자일 수 있다. 근사의 정도가 문맥상 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 제공된 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이내 또는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림됨을 의미하며, 모든 경우에 제공된 값을 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 지정된 값 최대 ±10%, 최대 ±5%, 또는 최대 ±1%를 나타낸다.
[0047] 용어 "작제물"은 이종 공급원으로부터 하나 이상의 단리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 분자를 나타낸다. 예를 들어, 핵산 작제물은 기원이 다른 두 개 이상의 핵산 서열이 단일 핵산 분자로 조립된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 대표적인 핵산 작제물은 (1) 자연에서 서로 인접한 것으로 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나는 이의 다른 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나와 관련하여 이종성임) 또는 (2) 자연적으로 인접하지 않은 작용성 RNA 분자 또는 단백질의 일부를 인코딩하는 서열, 또는 (3) 자연적으로 인접되지 않은 프로모터 부분을 함유하는 임의의 작제물을 포함한다. 대표적인 핵산 작제물은 하나 이상의 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자동 복제할 수 있는, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제 폴리뉴클레오티드 분자, 파지와 같은 임의의 공급원으로부터 유래된 임의의 재조합 핵산 분자, 선형 또는 환형, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 작제물은 작제물에 또한 함유된 관심 핵산 서열의 발현을 지시하기 위해 필요한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는 관심 핵산 서열에 (전사를 지시하기 위해) 작동가능하게 연결된 프로모터와 같은 제어 요소를 포함할 수 있고, 임의적으로 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
[0048] 본 개시내용의 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 벡터 내에 혼입될 수 있다. 용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 용어 "벡터"는 DNA-기반 벡터 및 RNA-기반 벡터 둘 모두를 포함한다. 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터 뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하여, 시험관내에서, 생체외에서 및/또는 생체내에서 DNA 서열 및 단편을 발현할 수 있는 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(DNA-기반 벡터) 또는 자가-복제 RNA 벡터와 같은 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 시험관내 및/또는 생체내에서 RNA로 전사될 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포손, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 단일-가닥 벡터(예를 들어, ssDNA 또는 ssRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 이중-가닥 벡터(예를 들어, dsDNA 또는 dsRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용된다.
[0049] 작제물의 구성요소에 더하여, 벡터는 예를 들어, 하나 이상의 선별가능한 마커, 원핵 및 진핵 기원과 같은 하나 이상의 복제 기원, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위 및/또는 작제물의 세포 게놈 내로의 안정한 통합을 용이하게 하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 2개 이상의 작제물은 단일 벡터와 같은 단일 핵산 분자 내에 통합될 수 있거나, 2개 이상의 개별 벡터와 같이 2개 이상의 개별 핵산 분자 내에 함유될 수 있다. "발현 작제물"은 일반적으로 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 제어 서열을 포함한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 발현될 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터는 세포에서 발현을 위한 발현 작제물에 제공된다. 본 개시내용의 실시를 위해, 작제물 및 세포를 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
[0050] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소, 예를 들어 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 물리적 또는 작용성 연결을 의미하며, 이는 이들이 이들의 의도한 방식으로 작동하도록 허용한다. 예를 들어, 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 분자 내의 코딩 서열 및 프로모터 서열과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열 및 프로모터 서열이 프레임 내에 적절한 공간 및 거리에 있어 전사에 대한 전사 인자 또는 RNA 중합효소에 의한 각각의 결합 효과를 허용한다. 작동가능하게 연결된 요소는 연속적이거나 비연속적(예를 들어, 링커를 통해 서로 연결됨)일 수 있음을 이해해야 한다. 폴리펩티드 작제물의 맥락에서, "작동가능하게 연결된"은 작제물의 기술된 활성을 제공하기 위해 아미노산 서열(예를 들어, 상이한 분절, 부분, 영역 또는 도메인) 사이의 물리적 연결(예를 들어, 직접 또는 간접적으로 연결된)을 나타낸다. 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 작동가능하게 연결된 분절, 부분, 영역 및 도메인은 연속적이거나 비연속적(예를 들어, 링커를 통해 서로 연결됨)일 수 있다.
[0051] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "부분"은 분획을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여 용어 이의 "일부"는 상기 구조의 연속적 또는 불연속적 분획을 설계할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 일부는 상기 아미노산 서열의 아미노산의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 및 적어도 90%를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부가 불연속 분획인 경우, 상기 불연속 분획은 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 부분(예를 들어, 단백질의 도메인)으로 구성되며, 각 부분은 구조의 연속적인 요소이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속 분획은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상, 예를 들어 4개 이하의 부분으로 구성될 수 있으며, 각 부분은 아미노산 서열의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 연속 아미노산, 적어도 10개의 연속 아미노산, 적어도 20개의 연속 아미노산, 또는 적어도 30개의 연속 아미노산을 포함한다.
[0052] 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값과 그 명시된 범위의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값이 본 개시내용에 포함됨이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한이 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 본 개시내용에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
[0053] 특정 범위는 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값과 함께 본원에서 제시된다. 용어 "약"은 약 뒤에 있는 정확한 숫자를 문자 그대로 지원하는데 사용될 뿐만 아니라 용어가 앞에 있는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자이다. 어떤 숫자가 구체적으로 언급된 수에 가깝거나 대략적인지 판단할 때, 언급되지 않은 숫자에 가깝거나 근접한 숫자는 그것이 제시된 맥락에서 구체적으로 언급된 숫자와 실질적으로 동등한 것을 제공하는 숫자일 수 있다.
[0054] 2개 이상의 핵산 또는 단백질과 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "퍼센트 동일성"은 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 또는 하기 설명된 기본 매개변수를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정하는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 백분율(예를 들어, 비교창 또는 지정된 영역에 대해 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때 특정 영역에 걸쳐 약 60% 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 예를 들어, NCBI 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 참조한다. 그런 다음 이러한 서열은 "실질적으로 동일한" 것이라고 한다. 이 정의는 또한 서열의 보완을 나타내거나 이에 적용될 수 있다. 이 정의에는 결실 및/또는 추가가 있는 서열은 물론 치환이 있는 서열도 포함된다. 서열 동일성은 GCS 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)와 같은 공개된 기술 및 광범위하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 위스콘신 대학교 생명공학 센터(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 시퀀스 어날리시스 소프트웨어 패키지(Sequence Analysis Software Package)와 같은 서열 분석 소프트웨어를 이의 기본 매개변수와 함께 사용하여 측정될 수 있다.
[0055] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체에게 관심 화합물(들)을 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 희석제를 제공하는 임의의 적합한 물질을 나타낸다. 이와 같이 "약학적으로 허용되는 부형제"는 약학적으로 허용되는 희석제, 약학적으로 허용되는 첨가제 및 약학적으로 허용되는 담체라고 하는 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여에 적합한 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 항생제 및 추가 치료제)이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
[0056] 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 인간 개입을 통해 변경되거나 생성되었으며, 예컨대, 예를 들어, 실험실 방법에 의해 수정되거나 그 결과임을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 단백질 및 핵산은 실험실 방법에 의해 생산된 단백질 및 핵산을 포함한다. 재조합 단백질은 단백질의 천연(비-재조합 또는 야생형) 형태 내에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 변형된, 예를 들어, 표지된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 펩티드, 단백질, 또는 핵산 서열에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 다음을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아미노산, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 펩티드, 단백질 또는 핵산 서열의 임의의 화학적 변형; 펩티드 또는 단백질에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 및/또는 치환; 융합 단백질, 예를 들어, 항체 단편을 포함하는 융합 단백질의 생성; 및 핵산 서열에서 하나 이상의 핵산의 첨가, 결실, 및/또는 치환. 세포와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은 자연-발생 세포를 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 조작/변형되지 않는다면 세포에 존재하지 않을 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하거나 발현하지 않도록 가공/수정된 세포를 포함한다.
[0057] 본원에서 사용되는 용어 "레플리콘 RNA"는 허용 세포 내에서 그 자신의 증폭 또는 자가-복제를 지시하는데 필요한 모든 유전자 정보를 함유하는 RNA를 지칭한다. 따라서, 레플리콘 RNA는 때때로 "자가-증폭 RNA"(saRNA) 또는 "자가-복제 RNA"(srRNA)로도 지칭된다. 자체 복제를 지시하기 위해, RNA 분자는 1) RNA 증폭 과정을 촉매화하기 위해 바이러스 또는 숙주 세포-유래 단백질, 핵산 또는 리보핵단백질과 상호작용할 수 있는 중합효소, 레플리카제 또는 다른 단백질을 인코딩하고; 2) 서브게놈 레플리콘-인코딩된 RNA의 복제 및 전사에 필요한 시스-작용 RNA 서열을 함유한다. 이러한 서열은 복제 과정 동안 이의 자가-인코딩된 단백질, 또는 비-자체-인코딩된 세포-유래 단백질, 핵산 또는 리보핵단백질, 또는 이들 성분들 중 임의의 것 사이의 복합체에 결합될 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 알파바이러스 레플리콘 RNA 분자(예를 들어, srRNA 또는 saRNA 분자)는 일반적으로 하기 정렬된 요소를 함유한다: 복제를 위한 시스에 필요한 5' 바이러스 RNA 서열(들), 생물학적 활성 알파바이러스 비-구조 단백질(예를 들어, nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4)을 코딩하는 서열, 서브게놈 RNA(sgRNA)에 대한 프로모터, 복제를 위해 시스에서 필요한 3' 바이러스 서열, 및 폴리아데닐레이트 트랙트(폴리(A)). 일부 예에서, 이종성 서열의 발현을 지시하는 서브게놈 프로모터(sg)는 본 개시내용의 srRNA 작제물에 포함될 수 있다. 추가로, 용어 레플리콘 RNA(예를 들어, srRNA 또는 saRNA)는 일반적으로 양성 극성 또는 "메시지" 센스의 분자를 지칭하고, 레플리콘 RNA는 임의의 공지된 자연-발생 알파바이러스의 길이와 상이한 길이일 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 레플리콘 RNA는 구조적 바이러스 단백질의 적어도 하나의 서열을 함유하지 않는다; 구조 유전자를 인코딩하는 서열은 이종성 서열로 치환될 수 있다. 레플리콘 RNA가 재조합 알파바이러스 입자로 패키징되는 그러한 경우에, 이는 입자 형성을 초래하는 알파바이러스 구조 단백질과의 상호작용을 개시하는 역할을 하는 하나 이상의 서열, 소위 패키징 신호를 함유할 수 있다.
[0058] 본원에 사용된 바와 같은 "대상체" 또는 "개체"는 인간(예를 들어, 인간 개인) 및 인간이 아닌 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "대상체" 또는 "개체"는 의사의 진료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 있는 건강 병태(예를 들어, 암 또는 감염) 및/또는 건강 병태의 하나 이상의 증상을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 갖는 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 당시 또는 그 이후에 관심 있는 건강 병태의 위험이 있는 것으로 진단되는 개체일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류 및 다른 포유동물, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭 및 비-포유동물, 예컨대 양서류, 파충류 등을 포함한다.
[0059] 본원에 기술된 개시내용의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", "구성되는" 및 "필수적 요소로 하여 구성되는"을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용되는 바와 같은 "포함하는"은 "포함하는", "함유하는" 또는 "을 특징으로 하는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은, "구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용되는 바와 같은, "필수적 요소로 하여 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 특히, 조성물의 구성요소에 대한 설명 또는 방법의 단계의 설명에서 용어 "포함하는"의 본원의 임의의 서술은 인용된 구성요소 또는 단계로 구성되거나 이를 필수적 요소로 하여 구성되는 이들 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
[0060] 표제, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서로 수행될 필요는 없다.
[0061] 명료함을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 설명된 본 개시내용의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명된 본 개시내용의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본 개시내용에 관한 구현예의 모든 조합은 본 개시내용에 구체적으로 포함되며, 각각 및 모든 조합이 개별적이고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예의 모든 하위 조합 및 이의 요소는 또한 본 개시내용에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 및 모든 그러한 하위 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)
[0062] 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)는 토가비리대(Togaviridae) 계열의 유전적, 구조적 및 혈청학적 관련 바이러스 그룹을 포함하는 알파바이러스 속에 속하는 모기-매개 바이러스이다. 현재 알파바이러스 속에는 특히, 신드비스 바이러스(SINV), 셈리키 삼림 바이러스(Semliki Forest virus)(SFV), 로스 리버 바이러스(RRV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 및 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)가 포함되며, 이는 모두 밀접하게 관련되어 있으며, 다양한 척추동물, 예컨대 포유류, 설치류, 어류, 조류 종, 및 더 큰 포유동물, 예컨대, 인간 및 말은 물론 무척추동물, 예컨대 곤충을 감염시킬 수 있다. 특히, EEEV는 광범위하게 연구되어 왔으며, 이들 바이러스의 수명 주기, 복제 방식 등은 잘 특성규명되어 있다. 이와 관련하여 더 많은 정보는, 예를 들어, 문헌[Corrin T. et al., Vector-Borne and Zoonotic Diseases, Vol. 21, No. 5, 2021]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 알파바이러스는 동물 세포에서 매우 효율적으로 복제하는 것으로 나타났으며, 이는 그러한 세포에서 단백질 및 핵산 생산을 위한 벡터로서 가치가 있게 한다. 종과 개체 사이의 전파는 주로 모기를 통해 발생하여 알파바이러스를 아르보바이러스(Arboviruses) 또는 절지동물-매개성 바이러스에 대한 수집인자게 되게 한다.
[0063] 이들 알파바이러스 각각은 바이러스 스파이크 단백질을 함유하는 외피로 둘러싸인 뉴클레오캡시드에 봉입된 양성 극성의 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 알파바이러스 입자는 봉입되고, 구형인 경향이 있으며(비록 약간 다형적이지만), 아이소메트릭 뉴클레오캡시드를 가지고 있다. 알파바이러스 게놈은 길이가 약 11-12 kb인 양성 극성의 단일 가닥 RNA이며, 5' 캡, 3' 폴리-A 테일, 및 효소 기능을 가진 비-구조 단백질을 인코딩하는 제1 프레임 및 바이러스 구조(예를 들어, 캡시드 단백질 CP, E1 당단백질, E2 당단백질, E3 단백질 및 6K 단백질)를 인코딩하는 제2 프레임을 갖는 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예를 들어, EEEV는 5' 말단에서 캡핑되고 3' 말단에서 폴리아데닐화된 대략 11.7 kb의 단일-가닥 포지티브-센스 RNA 게놈을 보유한다. EEEV는 감염된 모기의 물림에 의해 전염되며, 대부분의 파급 전염은 모기 유충 발달에 도움이 되는 활엽수 및 늪이 있는 저지대 지역에서 발생한다. 그 이름에서 알 수 있듯이, EEEV는 말을 감염시켜 열, 행동 변화 및 뇌염의 다른 증상을 유발할 수 있다. 야생 조류는 EEEV의 주요 저장소이다. 그러나, 감염은 종종 말에게 치명적이다.
[0064] 알파바이러스 게놈의 5' 2/3은 바이러스 RNA의 전사 및 복제에 필요한 다수의 비-구조 단백질을 인코딩한다. 이들 단백질은 RNA로부터 직접 번역되며 세포 단백질과 함께 바이러스 게놈 복제 및 서브게놈 RNA의 전사에 필수적인 RNA-의존성 RNA 중합효소를 형성한다. 4개의 비구조 단백질(nsP1-4)은 바이러스의 복제 체제를 구성하는 단일 다단백질로서 생산된다. 다단백질의 프로세싱은 게놈 복제 동안 RNA 주형 사용에 영향을 미치는 P2/3 접합에서의 절단과 함께 고도로 조절된 방식으로 발생한다. 이 부위는 좁은 갈라진 틈의 바닥에 위치하며 쉽게 접근할 수 없다. 절단되면, nsP3는 nsP2를 둘러싸는 고리 구조를 형성한다. 이들 두 단백질은 광범위한 계면을 가지고 있다. 비-세포병성 바이러스 또는 온도에 민감한 표현형을 생성하는 nsP2의 돌연변이는 P2/P3 인터페이스 영역에서 클러스터된다. nsP2 비세포병성 돌연변이의 위치 반대쪽에 있는 P3 돌연변이는 P2/3의 효율적인 절단을 방지한다. 이것은 결국 바이러스 RNA 생성 수준을 변경하는 RNA 감염성에 영향을 미칠 수 있다.
[0065] 게놈의 3' 1/3은 바이러스 입자를 형성하는 데 필요한 모든 구조 단백질의 번역을 위한 주형 역할을 하는 서브게놈 RNA를 포함한다: 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 헤테로다이머로서 연합된 외피 단백질 P62 및 E1. 바이러스 막-고정된 표면 당단백질은 수용체 인식을 담당하며, 막 융합을 통해 표적 세포로 진입한다. 서브게놈 RNA는 nsP4 단백질을 인코딩하는 RNA 서열의 3' 말단에 존재하는 p26S 서브게놈 프로모터로부터 전사된다. P62의 E2 및 E3으로의 단백질 분해 성숙은 바이러스 표면의 변화를 일으킨다. E1, E2 및 때로는 E3와 함께 당단백질 "스파이크"는 E1/E2 이량체 또는 E1/E2/E3 삼량체를 형성하며, 여기서 E2는 중심에서 꼭지점으로 확장되고, E1은 꼭지점 사이의 공간을 채우고, 존재하는 경우 E3는 스파이크의 원위 말단에 있다. 바이러스가 엔도솜의 산도에 노출되면, E1은 E2로부터 해리되어 E1 동종삼량체를 형성하며, 이는 세포 막과 바이러스막을 함께 구동하기 위한 융합 단계에 필요하다. 알파바이러스 당단백질 E1은 클래스 II 바이러스 융합 단백질이며, 이는 인플루엔자 바이러스 및 HIV에서 발견되는 클래스 I 융합 단백질과 구조적으로 상이하다. E2 당단백질은 세포질 도메인을 통해 뉴클레오캡시드와 상호작용하는 기능을 하는 반면, 이의 엑토도메인은 세포 수용체 결합을 담당한다. 대부분의 알파바이러스는 말초 단백질 E3를 잃는 반면, 셈리키 바이러스에서 이는 바이러스 표면과 연결된 상태로 남아 있다.
[0066] 알파바이러스 복제는 숙주 세포 내의 막 표면에서 발생하는 것으로 보고되었다. 감염 주기의 제1 단계에서, 게놈 RNA의 5' 말단은 게놈 RNA에 상보적인 음성 가닥을 생성하는 RNA 중합효소 활성을 가진 다단백질(nsP1-4)로 번역된다. 제2 단계에서 음성 가닥은 각각 두 개의 RNA 생성을 위한 주형으로 사용된다: (1) 번역에 의해 다른 nsP 단백질을 생성하며 바이러스에 대한 게놈으로서 작용하는 제2 바이러스의 게놈에 상응하는 양성 게놈 RNA; 및 (2) 감염성 입자를 형성하는 바이러스의 구조 단백질을 인코딩하는 서브게놈 RNA. 양성 게놈 RNA/서브게놈 RNA 비율은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4에 대한 다단백질의 단백질분해 자가절단에 의해 조절된다. 실제로 바이러스 유전자 발현은 두 단계로 발생한다. 첫 번째 단계에서는 양성 게놈 가닥과 음성 가닥의 주요 합성이 있다. 두 번째 단계 동안 서브게놈 RNA의 합성이 사실상 독점적이며, 따라서 많은 양의 구조 단백질이 생성된다.
본 개시내용의 조성물
[0067] 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 한 양태는 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서 변형된 게놈 또는 레플리콘 RNA는 상응하는 변형되지 않은 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여되어 있다(예를 들어, 포함하지 않는다). 본 개시내용의 일부 구현예는 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4에 대한 코딩 서열은 존재하지만, 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 적어도 일부가 부재하는 변형된 알파바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA를 제공한다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하도록 조작된 재조합 세포 및 세포 배양물이 제공된다.
A. 핵산 작제물
[0068] 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 한 양태는 알파바이러스, 예컨대, 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)의 변형된 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 신규한 핵산 작제물에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형된 알파바이러스 게놈은 부모 알파바이러스 게놈의 게놈 영역 중 하나 이상에서 결실(들), 치환(들) 및/또는 삽입(들)을 포함할 수 있다.
[0069] 본 개시내용의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA에는 비변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여되어 있으며, 예를 들어, 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA는 EEEV 구조 단백질 CP, E1, E2, E3 및 6K 중 하나 이상에 대한 코딩 서열의 적어도 일부를 포함하지 않는다. 독성 및 비독성 EEEV 균주 둘 모두가 적합하다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 EEEV 균주의 비제한적 예는 EEEV 792138, 783372, BeAn5122, BeAr300851, BeAr436087, C-49, FL91-4679, FL93-939, GML903836, MP-9, PE6, 및 V105-00210를 포함한다. 추가의 적합한 EEEV 균주는 비제한적으로, 바이러스 병원체 리소스 웹사이트(ViPR; 공개적으로 www.viprbrc.org/brc/vipr genome search.spg?method=SubmitForm&blockId=868&decorator=toga에서 입수 가능)에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA는 EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된다.
[0070] 본 개시내용의 핵산 작제물의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)는 비변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA의 바이러스 구조 단백질 CP, E1, E2, E3 및 6K 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 CP를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 E1를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 E2를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 E3를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 6K를 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 CP, E1, E2, E3 및 6K의 조합을 인코딩하는 전체 서열 또는 이의 일부가 결여되어 있다. 본 개시내용의 일부 구현예는 비변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA의 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 존재하지만, EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질(예를 들어, CP, E1, E2, E3 및 6K)을 인코딩하는 전체 서열 또는 적어도 이의 일부는 부재하는 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA를 제공한다. 본 개시내용의 일부 구현예는 비변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA의 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4에 대한 코딩 서열이 존재하지만, EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA의 하나 이상의 구조 단백질(예를 들어, CP, E1, E2, E3 및 6K)을 인코딩하는 전체 서열 또는 적어도 이의 일부는 부재하는 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA를 제공한다.
[0071] 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 실질적인 부분이 결여되어 있다. 숙련된 기술자는 바이러스 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 실질적인 부분이 바이러스 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 충분히 포함하여 숙련된 당업자에 의한 서열의 수동 평가에 의해 또는 BLAST와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터 자동화 서열 비교 및 식별에 의해 해당 폴리펩티드를 추정적으로 식별할 수 있게 함을 이해할 것이다 (예를 들어, 문헌 ["Basic Local Alignment Search Tool"; Altschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993] 참조). 따라서, 뉴클레오티드 서열의 실질적인 부분은 서열을 포함하는 핵산 단편의 특이적 식별 및/또는 분리를 제공하기에 충분한 서열을 포함한다. 예를 들어, 핵산 서열의 실질적인 부분은 전장 핵산 서열의 적어도 약 20%, 예를 들어, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 개시내용은 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 부분적 또는 완전한 핵산 서열이 결여된 핵산 분자 및 작제물을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같은 서열의 이점을 갖는 숙련된 기술자는 본 개시내용의 조성물 및 방법에 대해 개시된 서열의 전부 또는 실질적인 부분을 용이하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 출원은 본원에 개시된 바와 같은 완전한 서열, 예를 들어 첨부된 서열 목록에 제시된 서열뿐만 아니라 상기 정의된 바와 같은 서열의 실질적인 부분을 포함한다.
[0072] 일부 구현예에서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)는 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 전체 서열이 결여되어 있으며, 예를 들어, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA는 바이러스 비변형된 게놈 또는 레플리콘 RNA의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
[0073] 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 작제물)은 일반적으로, 적어도 약 2 kb의 길이를 갖는다. 예를 들어, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 적어도 약 2 kb, 적어도 약 3 kb, 적어도 약 4 kb, 적어도 약 5 kb, 적어도 약 6 kb, 적어도 약 7 kb, 적어도 약 8 kb, 적어도 약 9 kb, 적어도 약 10 kb, 적어도 약 11 kb, 적어도 약 12 kb 또는 12 kb 초과의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 약 4 kb 내지 약 20 kb, 약 4 kb 내지 약 18 kb, 약 5 kb 내지 약 16 kb, 약 6 kb 내지 약 14 kb, 약 7 kb 내지 약 12 kb, 약 8 kb 내지 약 16 kb, 약 9 kb 내지 약 14 kb, 약 10 kb 내지 약 18 kb, 약 11 kb 내지 약 16 kb, 약 5 kb 내지 약 18 kb, 약 6 kb 내지 약 20 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 5 kb 내지 약 8 kb, 약 5 kb 내지 약 7 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 6 kb 내지 약 12 kb, 약 6 kb 내지 약 11 kb, 약 6 kb 내지 약 10 kb, 약 6 kb 내지 약 9 kb, 약 6 kb 내지 약 8 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 7 kb 내지 약 11 kb, 약 7 kb 내지 약 10 kb, 약 7 kb 내지 약 9 kb, 약 7 kb 내지 약 8 kb, 약 8 kb 내지 약 11 kb, 약 8 kb 내지 약 10 kb, 약 8 kb 내지 약 9 kb, 약 9 kb 내지 약 11 kb, 약 9 kb 내지 약 10 kb, 또는 약 10 kb 내지 약 11 kb의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 약 6 kb 내지 약 14 kb의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 약 6 kb 내지 약 16 kb의 길이를 가질 수 있다.
[0074] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함한다. 원칙적으로, 본원에 개시된 핵산 작제물은 일반적으로 임의의 수의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 당업자는 용어 "발현 카세트"가 생체내 및/또는 생체외 세포에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유하는 유전자 물질의 작제물을 나타냄을 이해할 것이다. 발현 카세트는 원하는 숙주 세포를 표적화하기 위해 벡터내에 및/또는 대상체내에 삽입될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 용어 발현 카세트는 용어 "발현 작제물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "발현 카세트"는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 및/또는 종결 신호, 및 임의적으로 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 다른 핵산 서열 중 임의의 서열 또는 이의 조합에 작동가능하게 연결된 작용성 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 작제물을 나타낸다.
[0075] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 핵산 작제물은 예를 들어, 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함하는 경우, 이종성 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 예를 들어, 발현 벡터로서의 용도를 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 서브게놈(sg) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, sg 프로모터는 26S 서브게놈 프로모터이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 하나 이상의 번역되지 않은 영역(UTR)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, UTR 중 적어도 하나는 이종 UTR이다.
[0076] 일부 구현예에서, 발현 카세트 중 적어도 하나는 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 증가된 안정성, 역가 및 발현(예를 들어, 번역 효율)과 같은 요망되는 특성을 위해 재설계되고/거나 최적화되며, 이는 결국 바이오치료제를 생성, 전달, 및 투여하는 효과를 최대화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 더 높은 수준의 발현을 위해 최적화된다. 뉴클레오티드 서열의 서열-최적화와 관련하여, 유전자 코드의 축퇴는 유전자로부터 생성된 폴리펩티드의 아미노산 서열이 변경되지 않게 하면서 유전자의 단백질 인코딩 서열의 적어도 하나의 염기를 다른 염기로 치환할 수 있는 가능성을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 또한 유전자 코드의 축퇴에 따른 치환에 의해 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 변경된 임의의 염기 서열을 가질 수 있다. 코돈 사용법을 설명하는 참조는 쉽게 공개적으로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어 특정 숙주에 대한 발현을 최적화하기 위해 (예를 들어, 알파바이러스 mRNA에서 코돈 사용을 인간, 비-인간 영장류, 햄스터, 마우스 또는 원숭이와 같은 다른 유기체에 의해 선호되는 것으로 변경) 생성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 예를 들어, 발현에 최적화된 코돈의 사용을 통해 표적 숙주 세포에서 코돈-최적화되지 않은 코딩 서열과 같은 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준의 발현을 위해 최적화된다. 일부 구현예에서, GOI의 코돈-최적화된 서열은 코돈-최적화되지 않은 참조 코딩 서열과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 증가된 발현 수준을 발생시킨다. 일부 구현예에서, GOI의 코돈-최적화된 서열은 코돈 최적화되지 않은 참조 코딩 서열과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배 증가된 발현 수준을 발생시킨다.
[0077] 숙주 세포 발현에 최적인 바람직한 코돈을 사용하여 GOI를 인코딩하는 합성 핵산 서열의 작제를 위한 기술은 숙주 세포 게놈의 천연 단백질을 인코딩하기 위한 코돈 사용의 공통성 및 그들의 상대적 존재비를 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 분석하는 전산 방법에 의해 결정될 수 있다. 코돈 사용 데이터베이스(http://www.kazusa.or.jp/codon)는 포유동물 세포 환경에서 코돈 최적화 서열의 생성에 사용될 수 있다. 또한, JCat Codon Optimization Tool(www.jcat.de), Integrated DNA Technologies(IDT) Codon Optimization Tool (https://www.idtdna.com/CodonOpt) 또는 Optimizer 온라인 코돈 최적화 도구(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)와 같은 다양한 소프트웨어 도구가 한 유기체로부터의 서열을 다른 숙주 유기체에 대한 최적 코돈 사용으로 변환시키는데 이용될 수 있다. 이러한 합성 서열은 합성 핵산 분자의 작제에 대해 당업계에 공지된 기술에 의해 작제될 수 있고, 다양한 상업적 공급업체로부터 수득될 수 있다.
[0078] 일부 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 향상된 RNA 안정성 및/또는 발현을 위해 최적화된다. RNA의 안정성은 일반적으로 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 기간에 관한 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 기간"에 영향을 미칠 수 있다. 원리, 전략 및 RNA 안정성 향상에 사용하는 방법에 관한 추가 정보는 예를 들어, 문헌 [Leppek K. et al., Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. bioRxiv. (Preprint). Mar 30, 2021. doi: 10.1101/2021.03.29.437587]에서 찾아볼 수 있다.
[0079] GOI에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 일반적으로 임의의 폴리펩티드일 수 있고, 예를 들어 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소 및 리포터 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질 또는 사이토카인일 수 있는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, GOI는 미생물 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 진균 단백질, 포유동물 단백질 및 이들의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 헤마글루티닌 전구체(HA)를 인코딩한다. GOI의 비제한적인 예는 G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-10, IL-10-유사체, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-18BP, IL-1-유사체, IL-1RA, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-20, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6-유사체, IL-7, IL-9, IL-21, IL-22, IL-33, IL-37, IL-38, LIF 및 OSM을 포함하는 상호작용 단백질 및 인터루킨을 포함한다. 추가의 적합한 GOI는 비제한적으로, 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), TNF(예를 들어, CD154, LT-β, TNF-α, TNF-β, 4-1BBL, APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, 및 TRANCE), TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3), 헤마토포이에틴(예를 들어, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF, MSP), 케모카인 및 이들의 수용체(예를 들어, XCL1, XCL2, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CXCL1, CXCL2, CX1, CLCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CX8CL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14 및 CX3CL1), 면역억제성 유전자 생성물 및 관련 전사 인자(예를 들어, PECAM1, FCGR3A, FOS, NFKB1, JUN, HIF1A, PD-L1, mTOR, STAT5B 및 STAT4)를 포함한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 추가의 GOI는 비제한적으로, 면역자극성 유전자 생성물(예를 들어, CD27/CD70, CD40, CD40L, B7.1, BTLA, MAVS, OX40, OX40L, RIG-I 및 STING), 유전자의 약물 내성 돌연변이체/변이체, 예를 들어, ABCB1, ABCC1, ABCG2, AKT1, ALK, BAFF, BCR-ABL, BRAF, CCND1, cMET, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERK2, ESR1, GRB2, KRAS, MDR1, MRP1, NTRK1, PDC4, P-gp, PI3K, PTEN, RET, ROS1, RSK1, RSK2, SHIP 및 STK11을 포함한다. 또한 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 것은 바이러스 단백질, 특히 스파이크 단백질, 섬유 단백질, 구조 단백질 및 부착 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
[0080] 일부 구현예에서, GOI는 항체 또는 항체 변이체(예를 들어, 단일 사슬 Fv, 이중특이적, 낙타과, Fab, 및 HCAb)를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 암과 관련되거나 상향조절된 표면 분자, 또는 감염성 질환과 관련된 표면 분자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 항체는 면역자극 기능을 갖거나 면역억제 기능을 갖는 표면 분자를 표적화한다.
[0081] 일부 구현예에서, GOI는 효소의 결핍 또는 돌연변이가 질병 또는 건강 병태와 관련된 효소, 예를 들어, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 이미글루세라제, 탈리글루세라제 알파, 벨라글루세라제 알파, 알글루세라제, 세벨리파제 알파, 라로니다제, 이두설파제, 엘로설파제 알파, 갈설파제, 알글루코시다제 알파 및 CTFR을 인코딩할 수 있다.
[0082] 일부 구현예에서, GOI는 항원 분자, 바이오치료 분자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 종양-관련 항원, 종양-특이적 항원, 신생항원 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 에스트로겐 수용체, 세포내 신호 변환기 효소 및 인간 상피 성장 수용체로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 면역조절제, 혈관신생의 조절제, 세포외 기질의 조절제, 대사의 조절제, 신경학적 조절제 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 바이오치료용 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자로부터 선택된 사이토카인을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, IL-35, IFNγ 및 이들의 임의의 서브유닛으로부터 선택된 인터루킨을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, GOI는 IL-12A, IL-12B, IL-1RA 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 바이오치료용 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
[0083] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 벡터 내에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 단일-가닥 벡터, 예를 들어, ssDNA 벡터 또는 ssRNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 이중-가닥 벡터, 예를 들어, dsDNA 벡터 또는 dsRNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 벡터는 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 롤링 서클 증폭(RCA), 분자 클로닝 등, 또는 화학적 합성을 이용하여 생산될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 완전 합성 벡터, 예를 들어, 완전 합성 ssDNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 완전 합성 dsDNA 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 PCR 반응의 생성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 RCA 반응의 생성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용될 수 있다.
[0084] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 15의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형된 EEEV를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
표 1: 서열 목록의 서열에 대한 간략한 설명.
SEQ ID NO 설명
1 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; Genbank 수탁 # EF151502로부터 유래됨; 관심 유전자(GOI)의 코딩 서열 없음
2 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; Genbank 수탁 # EF151502로부터 유래됨; 인플루엔자로부터의 HA 단백질의 코딩 서열을 포함
3 5' 어댑터 서열
4 3' 어댑터 서열
5 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터
6 T7 종결인자 서열
7 인간 IL-12 p35 서브유닛
8 신호 서열과 함께 인간 IL-12 p35 서브유닛
9 인간 IL-12 p40 서브유닛
10 신호 서열과 함께 인간 IL-12 p40 서브유닛; 또한 도 4b 참조
11 IL1RN 전사체 1에 의해 인코딩된 인간 IL-1RA; 또한 도 4a 참조
12 IL1RN 전사체 2에 의해 인코딩된 인간 IL-1RA
13 IL1RN 전사체 3에 의해 인코딩된 인간 IL-1RA
14 IL1RN 전사체 4에 의해 인코딩된 인간 IL-1RA
15 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; 인간 IL-12의 코딩 서열을 포함; 또한 도 7 참조
16 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; 암-관련 항원 ESR1, HER2 및 HER3의 코딩 서열을 포함; 또한 도 6 참조
17 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; 바이러스 항원 RABV-G의 코딩 서열을 포함; 또한 도 5 참조
18 균주 FL93-939로부터 유래된 EEEV 레플리콘(자가-복제 RNA)을 인코딩하는 DNA 서열; 마우스 IL-12의 코딩 서열을 포함; 또한 도 8 참조
[0085] 관심의 변형된 EEEV의 서열에 대해 높은 정도의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%)을 갖는 핵산 서열은 본원에서 확인된 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 18) 또는 당 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 것들의 사용에 의해, 게놈 서열 분석에 의해, 혼성화에 의해 및/또는 각각의 EEEV 게놈에서 확인된 서열로부터의 퇴화 프라이머 또는 유전자-특이적 프라이머로의 PCR에 의해 확인되고/거나 분리될 수 있다.
[0086] 이러한 새로운 핵산 작제물을 조립하고 특성규명하는 분자 기술 및 방법은 본 출원의 실시예에 더욱 충분히 기재되어 있다.
[0087] 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 핵산 분자이다. 상기 기재된 바와 같이, 용어 재조합 핵산 분자는 임의의 핵산 분자(예를 들어, DNA, RNA), 즉, 간접적이지만 인간 조작의 결과를 의미한다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 중합효소 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로, 재조합 DNA 분자이다. 비제한적인 예로서, 재조합 핵산 분자는: 1), 예를 들어, 화학적 또는 효소적 기술을 사용하여(예를 들어, 화학적 핵산 합성의 사용에 의해, 또는 핵산 분자의 복제, 중합, 엑소뉴클레오리틱 분해, 엔도뉴클레오리틱 분해, 결찰, 역전사, 전사, 염기 변형(예를 들어, 메틸화 포함) 또는 재조합(상동 및 부위-특이적 재조합 포함)을 위한 효소의 사용에 의해 시험관내에서 합성되거나 변형되었으며/거나; 2) 자연적으로는 결합되지 않는 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; 3) 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결여되도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되고/거나 4) 자연 발생 뉴클레오티드 서열과 관련하여 하나 이상의 서열 변화 또는 재배열을 갖도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되었다.
[0088] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝 등) 또는 화학적 합성을 사용하여 생산된다. 본원에 개시된 바와 같은 핵산 분자는 비제한적으로 천연 대립유전자 변이체 및 변형된 핵산 분자를 포함하는 천연 핵산 분자 및 이의 상동체를 포함하는데, 여기서 변형이 본원에 기재된 바와 같은 생물학적 활성을 달성하는데 있어서 요망되는 특성을 제공하는 방식으로 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기가 삽입, 결실 및/또는 치환된다.
[0089] 자연 발생 핵산 분자의 변이체를 포함하는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 많은 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 핵산 분자의 서열은 자연-발생 서열과 관련하여 변형될 수 있는데, 이는 자연-발생 서열로부터 비제한적으로, 고전적인 돌연변이유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예컨대, 비제한적으로, 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 결찰, 핵산 서열의 선택된 영역의 PCR 증폭 및/또는 돌연변이유발, 재조합 클로닝, 및 올리고뉴클레오티드 혼합물의 화학적 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "구축"하기 위한 혼합물 기의 결찰을 포함하는 화학적 합성, 및 이들의 조합을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 유래된다. 핵산 분자 상동체는 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질 또는 레플리콘(예를 들어, srRNA)의 기능에 대한 스크리닝 및/또는 야생형 유전자 또는 이의 단편과의 혼성화, 또는 표적 또는 야생형 핵산 분자 또는 서열에 대해 상동성을 갖는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 변형된 핵산 분자의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
B. 재조합 세포
[0090] 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 한 양태는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하고/하거나 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함(예를 들어, 발현)하도록 조작된 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA)은 숙주 세포 내로 도입되어 핵산 작제물 및/또는 srRNA 작제물을 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 작제물은 숙주 세포 내로 도입되어 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 EEEV 게놈을 인코딩하는 핵산 작제물을 함유하는 원핵 또는 진핵 세포는 또한 본 개시내용의 특징이다. 관련 양태에서, 본원에 개시된 일부 구현예는 동물 세포와 같은 숙주 세포 내로 본원에 제공된 바와 같은 핵산 작제물을 도입한 다음, 형질전환된 세포를 선별 또는 스크리닝하는 것을 포함하는, 세포를 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 핵산 작제물의 세포 내로의 도입은 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공법, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포솜-매개된 형질감염, 입자 총 기술, 직접 미세-주입, 나노입자-매개된 핵산 전달 등과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
[0091] 일 양태에서, 본 개시내용의 일부 구현예는 재조합 세포, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 재조합 진핵 세포, 예를 들어, 동물 세포에 관한 것이다. 핵산 작제물은 숙주 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 에피솜 복제될 수 있거나, 안정하거나 일시적인 발현을 위한 미니-환형 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 에피솜 단위로서 재조합 숙주 세포에서 유지 및 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 재조합 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 고전적 무작위 게놈 재조합 기술 또는 가이드 RNA 지시 CRISPR/Cas9 또는 TALEN 게놈 편집을 이용하는 것과 같은 보다 정확한 게놈 편집 기술을 사용하여 안정적인 통합을 완료할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 안정하거나 일시적인 발현을 위한 미니-환형 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재한다.
[0092] 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 적어도 하나의 핵산 분자로 유전적으로 공학처리(예를 들어, 형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)될 수 있다.
[0093] 본원에 기재된 바와 같은 관심 단백질의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 E. 콜라이 또는 진핵 세포, 예컨대 곤충 세포(예를 들어, 모기 세포 또는 Sf21 세포), 또는 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포 또는 HeLa 세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외이고, 예를 들어, 치료 또는 절차를 위해 개별 세포로서 또는 기관 또는 조직의 일부로서, 생체 또는 유기체로부터 추출된 후, 생체 또는 유기체로 반환된다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내이고, 예를 들어, 저장소로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 포유동물 세포이다. 글리코실화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포를 포함한다.
[0094] 척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 비-인간 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 추가적인 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS-7), 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, FS4 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 PER.C6 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유아세포 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 인간 내피 세포, 인간 성상세포, 인간 대식세포, 인간 RAW 264.7 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 L929 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포 및 토끼 신장 세포가 있다.
[0095] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유아세포, 인간 HEK-293 세포, 인간 HeLa 세포, 인간 HepG2 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0096] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 곤충 세포, 예를 들어, 곤충 세포주의 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 Sf21 세포이다. 추가의 적합한 곤충 세포주는 곤충 목 디프테리아(Diptera), 레피도프테라(Lepidoptera) 및 헤미프테라(Hemiptera)로부터 확립된 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상이한 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 나비목 곤충 세포주의 세포이다. 지난 수십 년 동안 나비목 곤충 세포주의 이용 가능성은 10년당 약 50 세포주로 증가하였다. 이용 가능한 나비목 곤충 세포주에 관한 추가 정보는 예를 들어, 문헌 [Lynn D.E., Available lepidopteran insect cell lines. Methods Mol Biol. 2007;388:117-38]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 모기 세포, 예를 들어 아노펠레스(Anopheles)(An.), 쿨렉스(Culex)(Cx.) 및 애데스(Aedes)(스테고미아(Stegomyia))(Ae.) 속 내의 모기 종의 세포이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 모기 세포주는 하기 모기 종으로부터의 세포주를 포함한다: 애데스 애집티(Aedes aegypti), 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus), 애데스 슈도스쿠텔라리스(Aedes pseudoscutellaris), 애데스 트리세리아투스(Aedes triseriatus), 애데스 벡산스(Aedes vexans), 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae), 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비마누스(Anopheles albimanus), 쿨렉스 퀸쿠에파스시아투스(Culex quinquefasciatus), 쿨렉스 테일레리(Culex theileri), 쿨렉스 트리태니오린쿠스(Culex tritaeniorhynchus), 쿨렉스 비태니오린쿠스(Culex bitaeniorhynchus) 및 톡소린키테스 암보이넨시스(Toxorhynchites amboinensis). 적합한 모기 세포주는 비제한적으로 CCL-125, Aag-2, RML-12, C6/26, C6/36, C7-10, AP-61, A.t. GRIP-1, A.t. GRIP-2, UM-AVE1, Mos.55, Sua1B, 4a-3B, Mos.43, MSQ43 및 LSB-AA695BB를 포함한다. 일부 구현예에서, 모기 세포는 C6/26 세포주의 세포이다.
[0097] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 상기 언급된 매우 다양한 숙주 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당업계에 공지되어 있고, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물의 생성 및 유지에 적합한 방법 및 시스템은 당업계에 공지되어 있다.
C. 트랜스제닉 동물
[0098] 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 척추 동물 또는 무척추 동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 곤충이다. 일부 구현예에서, 곤충은 모기이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 포유동물은 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 본원에 기술된 바와 같은 관심 단백질을 생성한다.
[0099] 본 개시내용의 트랜스제닉 비인간 숙주 동물은 외인성 핵산을 비인간 동물의 게놈에 도입하기 위한 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 비-인간 동물은 비-인간 영장류이다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 다른 동물 종은 (i) 유전자전이에 적합하고, (ii) 면역글로불린 유전자 절편을 재배열하여 항체 반응을 생성할 수 있는 동물을 포함한다. 이러한 종의 예는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 닭, 염소, 돼지, 양 및 소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트랜스제닉 비-인간 동물을 제조하기 위한 접근법 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 방법은 전핵 미세주입, DNA 미세주입, 초기 배아로의 렌티바이러스 벡터 매개된 DNA 전달 및 정자-매개된 유전자전이, 동물 정자(예를 들어, 돼지)로의 아데노바이러스 매개된 DNA 도입, 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 조류 종), 체세포 핵 전이(예를 들어, 염소에서)를 포함한다. 트랜스제닉 가축 농장 동물의 제조의 기술 상태는 문헌 [Niemann, H. et al. (2005) Rev. Sci. Tech. 24:285-298]에서 검토된다.
[0100] 일부 구현예에서, 동물은 척추 동물 또는 무척추 동물이다. 일부 구현예에서, 동물은 곤충이다. 일부 구현예에서, 곤충은 모기이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 트랜스제닉 동물은 고전적인 무작위 게놈 재조합 기술을 사용하거나 가이드 RNA-지정 CRISPR/Cas 게놈 편집, 또는 NgAgo(나트로노박테리운 그레고리 아르고나우트(Natronobacterium gregoryi Argonaute))를 사용한 DNA-가이드된 엔도뉴클레아제 게놈 편집, 또는 TALEN 게놈 편집(전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제)과 같은 보다 정확한 기술을 사용하여 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 트랜스제닉 동물은 트랜스제닉 미세주사 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 상동 재조합 기술의 사용을 필요로 하지 않으므로 상동 재조합을 사용하는 접근법보다 제조 및 선택이 더욱 용이한 것으로 간주된다. 또 다른 양태에서, 관심 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 (i) 본원에 개시된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 사육하거나, (ii) 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포가 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생성하는 조건 하에 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 배양하는 것을 포함한다.
[0101] 또 다른 양태에서, 대상체에서 관심 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 척추 동물 또는 무척추 동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 곤충이다. 일부 구현예에서, 곤충은 모기이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드도 본 개시내용의 범위 내에 있다.
[0102] 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법은 생성된 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법은 반감기를 증가시키기 위해 생성된 폴리펩티드를 구조적으로 변형시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드의 N-말단은 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 추가로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드의 C-말단은 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형된다. 본원에 기재된 방법에 적합한 화학적 및 효소적 변형의 비제한적인 예는 PEG화, XTEN화, PASylation® ELP화 및 HAP화를 포함한다. 이러한 변형에 적합한 기술, 시스템 및 시약은 당 분야에 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 폴리펩티드는 반감기를 증가시키기 위해 PEG화, XTEN화, PAS화, ELP화 및/또는 HAP화될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 폴리펩티드는 반감기를 증가시키기 위해 또 다른 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 혈청 알부민, 항체 Fc 도메인, 트랜스페린, GLK 또는 CTP 펩티드)에 컨쥬게이션된다.
D. 약학적 조성물
[0103] 본 개시내용의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드는 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에 기술되고 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 면역 질환 또는 미생물 감염(예를 들어, 바이러스 감염, 미세-진균 감염 또는 박테리아 감염)과 같은 건강 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위해 제형화된다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 예방학적 조성물, 치료학적 조성물 또는 약학적 조성물, 또는 이들의 혼합물로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 백신으로 사용하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 출원의 조성물은 애쥬번트로 사용하기 위해 제형화된다.
[0104] 따라서, 일 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제 및 a) 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자); b) 본 개시내용의 재조합 세포; 및/또는 c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
[0105] 본 개시내용의 약학적 조성물의 비제한적인 예시적 구현예는 다음 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자)은 네이키드 형태로 사용되거나 전달 비히클과 함께 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 전달 비히클은 비제한적으로, 리포솜(예를 들어, 중성 또는 음이온성 리포솜), 미소구체, 면역 자극 복합체(ISCOMS), 지질-기반 나노입자(LNP), 고체 지질 나노입자(SLN), 폴리플렉스, 중합체 나노입자, 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 또는 생활성 리간드와 컨쥬게이션된 것을 포함하며, 이는 전달을 촉진하고/거나 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 이러한 화합물은 당업자에게 용이하게 이용 가능하며; 예를 들어, 문헌[Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL press (1990)]을 참조한다. 리포솜 이외의 애쥬번트 등이 또한 사용되며, 이는 당 분야에 공지되어 있다. 애쥬번트는 항원(예를 들어, 핵산 작제물, 벡터, srRNA 분자)을 국소 침착물에 격리시킴으로써 빠른 분산으로부터 보호할 수 있거나, 이들은 숙주가 대식세포 및 면역 체계의 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 하기 기재된 것들로부터 적절한 선택을 할 수 있다.
[0106] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 생리학적 완충제, 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP), 고체 지질 나노입자(SLN), 폴리플렉스, 중합체 나노입자, 바이러스 레플리콘 입자(VRP), 미소구체, 면역 자극 복합체(ISCOM), 생활성 리간드의 컨쥬게이트, 또는 이들의 임의의 조합.
[0107] 본 개시내용의 조성물은 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP) 또는 중합체 나노입자와 같은 이의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있는 포맷으로 제형화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 리포솜으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 지질-기반 나노입자(LNP)로 제형화된다. LNP는 바이러스 입자보다 일반적으로 면역원성이 적다. 많은 인간이 바이러스 입자에 대한 기존 면역성을 가지고 있지만 LNP에 대한 기존 면역성은 없다. 또한, LNP에 대한 적응 면역 반응이 아마도 발생하지 않아 LNP를 반복 투여할 수 있다.
[0108] 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다.
[0109] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이온화 가능한 지질"은 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pKa 미만으로 낮아짐에 따라 양이온성이거나 이온화될 수 있지만(양성자화), 더 높은 pH 값에서 더 중성인 지질을 지칭한다. pKa 미만의 pH 값에서, 지질은 이후 음으로 하전된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 회합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이온화가능한 지질"은 생리학적 pH로부터 pH 감소에 대해 양전하를 나타내는 지질, 및 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 운반하는 임의의 다수의 지질 종을 포함한다. DOTMA와 같은 영구적인 양이온성 지질은 임상 사용에 너무 독성이 있는 것으로 입증되었다. 이온화 가능한 지질은 다른 구현예에 따른 지질 제형에, 바람직하게는 약 30 내지 약 70 Mol%, 일부 구현예에서, 약 30 Mol%, 다른 구현예에서, 약 40 Mol%, 다른 구현예에서, 45 Mol%, 다른 구현예에서 약 47.5 Mol%, 또 다른 구현예에서 약 50 Mol%, 및 또 다른 구현예에서 약 60 Mol%로 존재할 수 있다("Mol%"는 특정 성분의 전체 몰에 대한 백분율을 의미한다). 이 단락에서 용어 "약"은 5 Mol%의 플러스 또는 마이너스 범위를 의미한다. DODMA, 또는 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판은 DLin-MC3-DMA 또는 O-(Z,Z,Z,Z-헵타트리아콘타-6,9,26,29-테트라엔-19-일)-4-(N,N-디메틸아미노)("MC3")와 같이 이온화 가능한 지질이다.
[0110] 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 이온화 가능한 지질은 PCT 공보 WO2020252589A1 및 WO2021000041A1, 미국 특허 번호 8,450,298 및 10,844,028, 및 문헌 [Love K.T. et al., Proc Natl Acad. Sci USA, Feb. 2, 2010 107 (5) 1864-1869]에 기재된 것들을 포함하며, 상기 문헌 모두는 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 문헌 [Love KT et al. (2010 supra)]에 기재된 하나 이상의 지질 화합물, 예를 들어, C16-96, C14-110 및 C12-200을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 ALC-0315, C12-200, LN16, MC3, MD1, SM-102 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 C12-200 지질을 포함한다. C12-200 지질의 구조는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,450,298 및 10,844,028에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, C12-200은 콜레스테롤, C14-PEG2000 및 DOPE와 조합된다. 일부 구현예에서, C12-200은 DSPC 및 DMG-PEG2000과 조합된다.
[0111] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. LNP에 사용하기 위해 여러 가지 다양한 이온화 가능한 양이온성 지질이 개발되었다. 적합한 양이온성 지질은 98N12-5, C12-200, C14-PEG2000, DLin-KC2-DMA(KC2), DLin-MC3-DMA(MC3), XTC, MD1 및 7C1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 유형의 LNP에서 GalNAc 모이어티는 LNP 외부에 부착되어 아시알릴로당단백질 수용체를 통해 간으로 흡수되기 위한 리간드로서 작용한다. 임의의 이러한 양이온성 지질은 본 개시내용의 srRNA 작제물 및 핵산 작제물의 전달을 위해 LNP를 제형화하는데 사용될 수 있다.
[0112] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 하나 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 비제한적인 중성 지질은 DPSC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 PCT 공보 WO2020252589A1 및 WO2021000041A1에 기재된 하나 이상의 이온화 가능한 지질 화합물을 포함한다.
[0113] 당 분야에 공지된 다수의 다른 지질 또는 지질의 조합이 LNP를 생산하는데 사용될 수 있다. LNP를 생산하는데 사용하기에 적합한 지질의 비제한적인 예는 DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 양이온성 지질의 추가적인 비제한적인 예는 98N12-5, C12-200, C14-PEG2000, DLin-KC2-DMA(KC2), DLin-MC3-DMA(MC3), XTC, MD1, 7C1 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 중성 지질의 추가적인 비제한적인 예는 DPSC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM을 포함한다. PEG-변형된 지질의 비제한적인 예는 PEG-DMG, PEG-CerC14 및 PEG-CerC20을 포함한다.
[0114] 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 100:1 내지 약 3:1, 약 70:1 내지 10:1, 또는 16:1 내지 4:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 16:1 내지 4:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 20:1이다. 일부 구현예에서, LNP 전달 시스템에서 지질 대 핵산의 질량비는 약 8:1이다. 일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 약 1000 nm, 약 500 nm, 약 250 nm, 약 200 nm, 약 150 nm, 약 100 nm, 약 75 nm, 약 50 nm 또는 약 25 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 70 nm 내지 100 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 88 nm 내지 약 92 nm, 82 nm 내지 약 86 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 95 nm 범위의 평균 직경을 갖는다.
[0115] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 중합체 나노입자로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 면역원성 조성물, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 자극할 수 있는 조성물이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 바이오치료제, 예를 들어, 생활성을 갖는 상이한 분자의 유전자 전달을 위한 비히클로서 제형화된다. 바이오치료제의 비제한적인 예는 사이토카인, 케모카인 및 다른 가용성 면역조절제, 효소, 펩티드 및 단백질 작용제, 펩티드 및 단백질 길항제, 호르몬, 수용체, 항체 및 항체-유도체, 성장 인자, 전사 인자 및 유전자 침묵/편집 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트로서 제형화된다.
[0116] 일부 구현예에서, 면역원성 조성물 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 최소한으로 자극하는 조성물은 실질적으로 비-면역원성 또는 최소의 면역원성이다. 일부 구현예에서, 비-면역원성 또는 최소 면역원성 조성물은 바이오치료제로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내 투여 및 경구 투여 중 하나 이상의 투여를 위해 제형화된다.
[0117] 주사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여에 있어서, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 이러한 경우, 조성물은 멸균 상태여야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정적일 수 있으며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중의 등장성 제제, 예를 들어, 당, 다가 알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 및/또는 염화나트륨을 포함하는 것이 일반적일 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
[0118] 멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입하여 제조된다.
[0119] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학적 조성물은 에어로졸, 스프레이, 미스트, 액체 또는 분말과 같은 흡입용으로 제형화된다. 흡입에 의한 투여는 건조 분말 또는 에어로졸 제형의 형태일 수 있고, 이는 흡입 장치, 예를 들어, 마이크로스프레이, 가압 계량 용량 흡입기 또는 분무기의 사용을 통해 대상체(예를 들어, 환자)에 의해 흡입된다.
[0120] 일부 구현예에서, 조성물은 비강내 투여, 경피 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 질내 또는 두개내 투여 중 하나 이상의 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 증가된 인터페론 생성을 발생시킨다.
본 개시내용의 방법
[0121] 본원에 기술된 치료 조성물 중 임의의 하나, 예를 들어 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물의 투여는 증식성 장애(예를 들어, 암), 감염성 질환(예를 들어, 급성 감염, 만성 감염 또는 바이러스 감염), 희귀 질환 및/또는 자가면역 질환 및/또는 염증 질환과 같은 관련 건강 병태의 치료에 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 대상체에서 약력학적 효과를 유도하는데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 면역 반응 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는데, 예를 들어, 유도 또는 억제하는데 유용할 수 있다.
[0122] 약력학적 효과를 부여하는 능력에 대한 본원에 기재된 조성물의 분석은 생체내 및/또는 생체외에서 수행될 수 있다. 분석될 수 있는 약력학적 효과의 예는 면역원성 효과(예를 들어, 생체내 면역 반응 유도), 바이오마커 반응, 치료 효과, 예방 효과, 요망되는 효과, 요망되지 않은 효과, 부작용 및 질병 모델에서의 효과를 포함한다. 일부 구현예에서, 약력학적 효과의 평가는 생체내 면역 반응의 유도를 평가하는 것을 포함한다(예를 들어, 실시예 1-4 참조). 일부 구현예에서, 약력학적 효과의 평가는 면역 반응을 강화하고 혈관형성 및 전이를 예방할 수 있는 사이토카인 경로의 유도를 평가하는 것을 포함한다(예를 들어, 실시예 1-4 참조).
[0123] 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 하나 이상의 관련 건강 병태 또는 질병을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 치료제에 포함될 수 있다. 예시적인 건강 병태 또는 질환은 암, 면역 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 유전자 요법, 유전자 대체, 심혈관 질환, 연령 관련 병리, 희귀병, 급성 감염 및 만성 감염을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 의사의 진료를 받는 환자이다.
[0124] 본 개시내용의 방법에 적합한 자가면역 질환의 예는 비제한적으로, 류마티스 관절염, 골관절염, 스틸병, 가족성 지중해열, 전신 경화증, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 혈관병증, 당뇨병성 신경통, 췌도염, 건선, 원형 탈모증, 온냉식 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 악성 빈혈, 급성 염증성 질환, 자가면역 부신염, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 램버트-이튼 증후군, 경화태선, 라임병, 그레이브스병, 베체트병, 메니에르병, 반응성 관절염(라이터 증후군), 처그-스트라우스 증후군, 코간 증후군, CREST 증후군, 보통 천포창 및 낙엽 천포창, 수포성 천포창, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염, 원발쓸개관간경화, 췌장염, 복막염, 건선성 관절염, 류마티스 열, 사르코이드증, 쇼르겐센 증후군, 경피증, 체강 질환, 강직성 증후군, 타카야수 동맥염, 일과성 글루텐 불내증, 자가면역 포도막염, 백반증, 다발연골염, 포진 피부염(DH) 또는 뒤링병, 섬유근육통, 굿파스처 증후군, 길랭-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 자가면역 간염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 면역 복합체 장애, 사구체신염, 결절 다발동맥염, 항-인지질 증후군, 다선 자가면역 증후군, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 두드러기, 자가면역 불임, 소아 류마티스 관절염, 사르코이드증 및 자가면역 심근병증을 포함한다.
[0125] 본 개시내용의 방법에 적합한 감염의 비제한적인 예는 바이러스, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), B형 간염 바이러스(HCV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인유두종바이러스(HPV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV2), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군(MERS), 인플루엔자 바이러스, 및 에볼라 바이러스로의 감염을 포함한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 추가적인 감염은 세포내 기생충, 예컨대, 리슈마니아(Leishmania), 리케차(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia), 콕시엘라(Coxiella), 플라스모디움(Plasmodium), 브루셀라(Brucella), 마이코박테리아, 리스테리아(Listeria), 톡소플라스마(Toxoplasma) 및 트리파노소마(Trypanosoma)에 의한 감염을 포함한다.
[0126] 일부 구현예에서, 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드, 및/또는 약학적 조성물은 면역 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 질환, 예컨대, 예를 들어, 사구체신염, 염증성 장 질환, 신장염, 복막염, 건선성 관절염, 골관절염, 스틸병, 가족성 지중해열, 전신 경피증 및 경화증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 급성 폐 손상, 수막염, 뇌염, 포도막염, 다발성 골수종, 사구체신염, 신장염, 천식, 죽상동맥경화증, 백혈구 유착 결핍, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 발병 당뇨병, 라이터병, 베체트병, 면역 복합체 신염, IgA 신장병, IgM 다발신경병, 면역-매개된 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염(RA), 강직성 척추염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 소혈관 혈관염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 자가면역 갑상선 질환, 급성 감염성 단핵구증, HIV, 헤르페스 바이러스 관련 질병, 인간 바이러스 감염, 코로나바이러스, 다른 엔테로바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 아데노바이러스 감염, 박테리아 폐렴, 상처, 패혈증, 뇌졸증/뇌부종, 허혈-재관류 손상, 및 C형 간염의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다.
[0127] 본 개시내용의 방법에 적합한 염증의 비제한적인 예는 염증성 질환, 예컨대, 천식, 염증성 장 질환(IBD), 만성 대장염, 비장종대 및 류마티스 관절염을 포함한다.
[0128] 따라서, 일 양태에서, 면역 반응 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절(예를 들어, 유도)하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드; 및/또는 d) 본 개시내용의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
[0129] 또 다른 양태에서, 건강 병태의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 병태를 예방하고/거나 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 a) 본 개시내용의 핵산 작제물; b) 본 개시내용의 재조합 세포; c) 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드; 및/또는 d) 본 개시내용 중 어느 하나의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여하는 것을 포함한다.
[0130] 일부 구현예에서, 건강 병태는 증식성 장애 또는 미생물 감염(예를 들어, 박테리아 감염, 미세-진균 감염 또는 바이러스 감염)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 증식성 장애 또는 미생물 감염(예를 들어, 박테리아 감염, 미세-진균 감염 또는 바이러스 감염)과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
[0131] 일부 구현예에서, 건강 병태는 희귀 질환, 예를 들어, The Orphan Drug Act(www.fda.gov/patients/rare-diseases-fda)에 의해 정의된 바와 같이, 미국에서 200,000명 미만의 사람들에게 영향을 미치는 질환 또는 병태 및/또는 염증성 및/또는 자가면역 장애이다. 일부 구현예에서, 대상체는 염증성 및/또는 자가면역 장애 및/또는 희귀 질환(예를 들어, 가족성 지중해열 또는 성인 발병 스틸병을 포함하나 이에 제한되지 않음)과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
[0132] 일부 구현예에서, 개시된 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 작제물, 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 경구 또는 흡입에 의해 제공될 수 있지만, 비경구 경로를 통해 투여될 가능성이 더 높다. 비경구 투여 경로의 예는 예를 들어, 정맥내, 결절내, 피내, 피하, 경피(국소), 경점막, 질내 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 구성요소를 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대, 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제 예컨대, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절제 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 일염기성 및/또는 이염기성 인산나트륨, 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 (예를 들어, 약 pH 7.2-7.8, 예를 들어, 7.5로) 조정될 수 있다. 모 제조물이 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
[0133] 본 개시내용의 이러한 대상 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물의 투여량, 독성 및 치료 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)를 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 용량비는 치료지수이며, LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 일반적으로 적합하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해 이러한 화합물을 감염 조직 부위로 표적화시키는 하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.
[0134] 예를 들어, 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 용량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 일반적으로, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변화될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 IC50(예를 들어, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
[0135] 본원에 기술된 치료 조성물, 예를 들어 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 1일 1회 이상 내지 주 1회 이상 (격일로 한 번 포함)으로 투여될 수 있다. 숙련된 기술자는 비제한적으로 질병의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 현재 존재하는 다른 질병을 포함하는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 시간에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 본 개시내용의 대상 다가 폴리펩티드 및 다가 항체의 치료적 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나 일련의 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 5일 동안 8시간마다 투여된 후, 2일 내지 14일, 예를 들어 9일의 휴지 기간을 두고, 이어서 8시간마다 추가로 5일간 투여된다. 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 및 재조합 폴리펩티드와 관련하여, 본 개시내용의 핵산 작제물 또는 재조합 폴리펩티드의 치료학적 유효량(예를 들어, 유효 투여량)은 선택된 핵산 작제물 또는 재조합 폴리펩티드에 따라 달라진다. 예를 들어, 환자 체중 kg 당 약 0.001 내지 0.1 mg 범위의 단일 용량이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자 체중 kg 당 약 0.03 μg 내지 300 μg 범위의 단일 용량이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자 체중 kg 당 약 0.3 mg 내지 3 mg 범위의 단일 용량이 투여될 수 있다.
[0136] 상기 논의된 바와 같이, 치료학적 유효량은 대상체, 예컨대 건강 병태, 예를 들어, 질병 또는 감염을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 가질 위험이 있는 대상체에게 투여되는 경우 특정 효과를 증진하기에 충분한 치료학적 조성물의 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 유효량은 질병 또는 감염의 증상의 발달을 예방 또는 지연시키고, 질병 또는 감염의 증상의 과정을 변경시키거나(예를 들어, 비제한적으로 질병 또는 감염의 증상의 진행을 늦추거나) 질병 또는 감염의 증상을 반전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에 있어서, 적절한 유효량은 관례적 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있음이 이해된다.
[0137] 질병 또는 감염의 치료를 위한 개시된 치료학적 조성물을 포함하는 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 질병 또는 감염의 징후 또는 증상 중 적어도 임의의 하나 또는 전부가 개선되거나 완화되는 경우, 치료는 효과적인 치료로 간주된다. 효능은 또한 입원 또는 의학적 개입의 필요성에 의해 평가되는 개체의 악화 실페에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 질병 또는 감염의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐). 이들 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다. 치료는 대상체 또는 동물(일부 비제한적 예는 인간 또는 포유동물을 포함함)에서 질병 또는 감염의 임의의 치료를 포함하고 다음을 포함한다: (1) 질병 또는 감염의 억제, 예를 들어, 증상의 진행 저지 또는 감속; 또는 (2) 질병 또는 감염의 완화, 예를 들어, 증상의 퇴행 유발; 및 (3) 증상 발생 가능성 예방 또는 감소.
[0138] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 갖는 조성물로 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 대상체는 초기 일련의 주사(또는 아래에 설명된 다른 경로 중 하나를 통한 투여)를 통해 면역화될 수 있으며, 후속적으로 원래 일련의 투여에 의해 제공되는 보호를 증가시키기 위해 부스터를 제공받을 수 있다. 초기 일련의 주사 및 후속 부스터는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 데 필요한 용량 및 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 조성물이 투여되지 않은 대상체에서 인터페론 생산과 비교하여 예를 들어, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 대상체에서 증가된 인터페론 생성을 발생시킨다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간 대상체이다.
[0139] 상술한 바와 같이, 주사용에 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우, 조성물은 멸균 상태여야 하고, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 조성물은 추가로 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 코팅 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다.
[0140] 멸균 주사용 용액은 적절한 용매에 필요한 양의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포 및/또는 재조합 폴리펩티드를 필요에 따라 위에 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 혼입한 다음 여과 멸균하여 제조될 수 있다.
[0141] 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물이 전술한 바와 같이 적절하게 보호되는 경우, 이들은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물 및 다른 성분은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제 내로 압축되거나 개체의 식단에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
[0142] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 및 재조합 폴리펩티드는 지질-기반 나노입자(LNP)에 의해 세포 또는 대상체에 전달될 수 있다. LNP는 일반적으로 바이러스 입자보다 면역원성이 적다. 많은 인간이 바이러스 입자에 대한 기존 면역성을 가지고 있지만 LNP에 대한 기존 면역성은 없다. 또한, LNP에 대한 적응 면역 반응이 발생하지 않을 수 있어 LNP를 반복 투여할 수 있다.
[0143] LNP에 사용하기 위해 여러 가지 다양한 이온화 가능한 양이온성 지질이 개발되었다. 여기에는 특히, C12-200, MC3, LN16 및 MD1이 포함된다. 예를 들어, 한 유형의 LNP에서 GalNAc 모이어티는 LNP 외부에 부착되어 아시알릴로당단백질 수용체를 통해 간으로 흡수되기 위한 리간드로서 작용한다. 임의의 이들 양이온성 지질은 본 개시내용의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자) 및 재조합 폴리펩티드를 간으로 전달하기 위한 LNP를 제형화하는 데 사용될 수 있다.
[0144] 일부 구현예에서, LNP는 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm 또는 25 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 나타낸다. 대안적으로, 나노입자는 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm 또는 25-60 nm의 크기 범위일 수 있다.
[0145] LNP는 양이온, 음이온 또는 중성 지질로 제조될 수 있다. 중성 지질, 예컨대 융합생성 인지질 DOPE 또는 막 구성요소 콜레스테롤이 형질감염 활성 및 나노입자 안정성을 향상시키기 위해 '헬퍼 지질'로서 LNP에 포함될 수 있다. 양이온성 지질의 제한은 불량한 안정성과 빠른 제거로 인한 낮은 효능뿐만 아니라 염증 또는 항염증 반응의 생성을 포함한다. LNP는 또한 소수성 지질, 친수성 지질 또는 소수성 및 친수성 지질 둘 모두를 가질 수 있다.
[0146] 당 분야에 공지된 다수의 지질 또는 지질의 조합이 LNP를 생산하는데 사용될 수 있다. LNP를 생산하는데 사용하기에 적합한 지질의 비제한적인 예는 DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 양이온성 지질의 비제한적인 예는 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA(KC2), DLin-MC3-DMA(MC3), XTC, MD1 및 7C1을 포함한다. 중성 지질의 비제한적인 예는 DPSC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM을 포함한다. PEG-변형된 지질의 비제한적인 예는 PEG-DMG, PEG-CerC14 및 PEG-CerC20을 포함한다.
[0147] 일부 구현예에서, 지질은 LNP를 생성하기 위해 임의의 수의 몰비로 조합될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드(들)는 LNP를 생성하기 위해 광범위한 몰비로 지질(들)과 조합될 수 있다.
[0148] 일부 구현예에서, 본원에 기술된 치료학적 조성물, 예를 들어 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 암, 자가면역 질환 및/또는 감염을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나 이의 발병 위험이 높은 대상체를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 치료 조성물에 통합된다.
[0149] 일부 구현예에서, 본원에 기술된 치료학적 조성물, 예를 들어 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물은 미생물 감염을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이들이 발생할 위험이 높은 대상체를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 치료 조성물에 통합된다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 박테리아 감염이다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 진균류 감염이다. 일부 구현예에서, 미생물 감염은 바이러스 감염이다.
추가 요법
[0150] 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 단일 요법(단독 요법) 또는 적어도 하나의 추가 요법(예를 들어, 제2 요법)과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 개별적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적 요법 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 수반되어 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법과 동시에 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 순차적으로 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전에 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 후에 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전 및/또는 후에 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 회전하여 시행된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 단일 제형으로 함께 시행된다.
키트
[0151] 또한 본원에 설명된 방법을 실행하기 위한 다양한 키트는 물론 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 설명서가 본원에 제공된다. 특히, 본 개시내용의 일부 구현예는 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 키트를 제공한다. 일부 다른 구현예는 건강 병태 예방을 필요로 하는 대상체에서 건강 병태의 예방을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 다른 구현예는 이를 필요로 하는 대상체에서 건강 병태를 치료하는 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공되고 기재된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 키트는 물론, 이를 제조하고 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
[0152] 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 데 유용한 하나 이상의 수단을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 대상체에게 투여하는 데 사용되는 하나 이상의 주사기(사전 충전형 주사기 포함) 및/또는 카테터(사전 충전형 주사기 포함)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 원하는 목적을 위해, 예를 들어 병태의 진단, 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체의 병태를 진단, 예방 또는 치료하기 위한 다른 키트 구성요소와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.
[0153] 전술한 키트 중 임의의 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 추가 시약은 희석 완충액; 재구성 용액, 세척 완충액, 대조군 시약, 대조군 발현 벡터, 음성 대조군, 양성 대조군, 제공된 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자)의 시험관내 생성에 적합한 시약, 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 본 개시내용의 약학적 조성물로부터 선택될 수 있다.
[0154] 일부 구현예에서, 키트의 구성요소는 별도의 용기에 있을 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 키트의 구성요소는 단일 용기에 조합될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 구현예에서, 키트는 하나의 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본원에 제공되고 기술된 바와 같은 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포, 재조합 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물 중 하나 이상 및 또 다른 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 추가의 치료제를 포함한다.
[0155] 또 다른 구현예에서, 키트는 단일의 공통 용기에서 임의적으로 약학적 조성물에서 함께 제형화된 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합되어 본 개시내용의 하나 이상의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포 및/또는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기술된 조성물의 조합을 포함한다.
[0156] 키트가 대상체에의 비경구 투여를 위한 약학적 조성물을 포함하는 경우, 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치(예를 들어, 주입 장치 또는 카테터)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 개시내용의 하나 이상의 핵산 작제물(예를 들어, 벡터 또는 srRNA 분자), 재조합 세포 및/또는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 상기 논의된 바와 같은 하나 이상의 피하 바늘 또는 다른 주입 장치를 포함할 수 있다.
[0157] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 키트의 구성요소를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 키트에 약학적 조성물 및 투여 형태에 대한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약학적 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 데 있어서 환자 및 의사를 보조한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조합에 관한 하기 정보는 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 사용법, 금기, 경고, 주의사항, 부작용, 과다투여, 적절한 투여량 및 투여, 제공 방법, 적절한 보관 조건, 참조, 제조업체/유통자 정보 및 지적 재산권 정보.
[0158] 본 방법을 실행하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재에 인쇄될 수 있다. 설명서는 패키지 삽입물로서 키트에, 키트 또는 이의 구성요소(예를 들어, 포장 또는 하위 포장과 관련됨)의 용기 라벨링 등으로 존재할 수 있다. 설명서는 적절한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로 존재할 수 있다. 일부 예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, (예를 들어, 인터넷을 통해) 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단이 제공될 수 있다. 이 구현예의 예는 설명서를 볼 수 있고/거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 수득하기 위한 이 수단은 적절한 기재에 기록될 수 있다.
[0159] 본 개시내용에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다.
[0160] 여기에 인용된 모든 참조가 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하지 않는다. 참고문헌에 대한 논의는 이들의 저자가 주장하는 바를 진술하며, 출원인은 인용된 문서의 정확성과 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학 저널 기사, 특허 문서 및 교과서를 포함한 많은 정보 출처가 여기에서 언급되었지만; 이 참조는 임의의 이러한 문서가 해당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것으로 간주되지 않음이 분명히 이해될 것이다.
[0161] 본원에 제공된 일반적인 방법에 대한 논의는 단지 설명을 위한 것이다. 다른 대체 방법 및 대안은 본 개시내용을 검토할 때 당업자에게 자명해질 것이며, 이는 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함될 것이다.
[0162] 추가 구현예는 하기 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떤 식으로든 본 개시내용 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
[0163] 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 예컨대, 문헌 [Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (jointly referred to herein as "Sambrook"); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferr F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); and Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.]에 충분히 설명되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
[0164] 추가 구현예는 하기 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떤 식으로든 본 개시내용 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
EEEV 벡터의 작제
[0165] 본 실시예는 관심 유전자(예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 헤마글루티닌 전구체(HA))의 발현을 갖는 EEEV 벡터의 작제에 후속적으로 사용된 베이스 EEEV 벡터(예를 들어, 이종성 유전자 없이)를 작제하기 위해 수행된 실험의 결과를 설명한다.
[0166] 공개적으로 이용 가능한 알파바이러스 게놈 데이터가 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 관심 유전자(GOI)로 직접 대체하여 자가-복제 RNA 및 트랜스진-발현 레플리콘을 발생시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 항상 제공하는 것은 아니라는 초기 관찰이 이루어졌다. 하기 상세히 기술된 바와 같이, EEV 균주 FL93-939에서 구조적 다단백질 유전자를 인플루엔자 A 바이러스 H5N1으로부터의 헤마글루티닌(HA) 유전자로 대체하여(예를 들어, 도 2b 참조) BHK-21 세포에서 RNA 복제 및 트랜스진 발현이 가능한 레플리콘(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 생성하는 것이 가능하였다(예를 들어, 도 3b 참조). 베이스 EEEV 벡터(즉, 관심 이종성 유전자가 없음)를 다음과 같이 작제하였다: 베이스 EEEV 벡터(예를 들어, 도 2a 참조)를 참조 서열(Genbank EF151502)로부터 여러개 변형하면서 4개의 ~4 kb 부분(Twist Bioscience)으로 새로 합성하였다. 침묵 G301A, G4516A 및 G7399A 돌연변이는 SapI 제한 효소 절단 부위를 제거하기 위해 혼입되었다. 침묵 A3550C 돌연변이는 SpeI 제한 효소 절단 부위를 제거하기 위해 혼입되었다. 침묵 G5725A 돌연변이는 Esp3I 제한 효소 절단 부위를 제거하기 위해 혼입되었다. 고유한 제한 효소 절단 부위(SpeI, 5'-A'CTAG, T-3')는 천연 EEEV 구조 유전자의 코딩 서열 대신에 혼입되었다(여기서, 5' A는 구조적 다단백질 ATG 시작 코돈의 위치와 일치하며, 3' T는 구조적 다단백질 정지 코돈 TAA의 위치와 일치한다). 5' 어댑터 서열(5'-CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT-3'; SEQ ID NO: 3)은 SpeI 부위의 업스트림에 삽입되었고, 3' 어댑터 서열(5'-GACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC-3'; SEQ ID NO: 4)은 후속 Gibson Assembly® 절차를 위해 SpeI 부위의 다운스트림에 삽입되었다(Gibson et al., Nat. Methods 6, 343-345, 2009). 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAG-3'; SEQ ID NO: 5)는 EEEV 게놈 서열의 업스트림에 포함되었고, 다운스트림은 폴리(A) 서열에 이은 SapI 부위를 함유하였고, 이는 인식 부위의 업스트림을 절단한다. SapI 부위의 바로 다운스트림에는 T7 종결인자 서열(5'-AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT-3'; SEQ ID NO: 6)이 있고, 이어서 독특한 제한 효소 절단 부위(NotI, 5'-GC'GGCC, GC-3')가 있다. 부분을 5-피스 Gibson Assembly® 반응: 선형화된 pYL 백본 및 4개의 합성된 단편에서 조합되어 EEEV 베이스 벡터를 생성하였다.
[0167] 이종성 유전자를 함유하는 EEEV 벡터의 작제를 하기와 같이 수행하였다: 도 2b에 기재된 EEEV 벡터는 SpeI 분해에 의한 도 2a의 빈 EEEV 벡터의 선형화에 의해 작제되었다. 인플루엔자(Genbank AY651334)로부터의 헤마글루티닌(HA) 유전자를 인 실리코(in silico) 인간 발현에 대해 코돈 최적화/리팩터링하고 드 노보(IDT)로 합성하였다. HA 유전자의 말단에 5' 및 3' 어댑터 서열을 첨가한 프라이머를 사용하여 합성 생성물을 증폭시켰다. 소화 생성물 및 PCR 생성물을 Gibson Assembly® 절차에 의해 조합하여 최종 벡터를 생성하였다.
실시예 2
변형된 EEEV 벡터의 시험관내 평가
[0168] 이 실시예는 상기 실시예 1에 기재된 합성 EEEV 레플리콘 작제물(예를 들어, 자가-복제 RNA)의 발현 수준을 평가하고 이의 다양한 차등 거동(예를 들어, 복제 및 단백질 발현)을 조사하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 설명한다.
[0169] 이러한 실험에서, EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된 합성 레플리콘 작제물(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 설계하고 후속하여 평가하였다.
[0170] 시험관내 전사 : 5' ARCA 캡(HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit, NEB)을 갖는 박테리오파지 T7 중합효소를 갖는 SapI-선형 플라스미드 주형으로부터의 시험관내 전사 또는 캡핑되지 않은 전사(HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB)에 이어서 5' 캡 1(Vaccinia Capping System, mRNA 캡 2'-O-메틸트랜스퍼라제, NEB)의 첨가에 의해 srRNA를 제조하였다. 이후, srRNA를 페놀/클로로포름 추출, LiCl 침전 또는 컬럼 정제(Monarch® RNA Cleanup Kit, NEB)를 사용하여 정제하였다. srRNA 농도는 260 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었다(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific).
[0171] 복제 : BHK-21 또는 Vero 세포(예를 들어, 4D-Nucleofector™ Lonza)로의 전기천공에 의해 srRNA를 형질전환하였다. 형질전환 후 18-20시간에 세포를 고정 및 투과시키고(eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set, Invitrogen)한 후 PE-컨쥬게이션된 항-dsRNA 마우스 모노클로날 항체(J2, Scicons)를 사용하여 염색하여 형광 유동 세포측정에 의해 개별 세포에서 dsRNA의 평균 형광 강도(MFI) 및 dsRNA+ 세포의 빈도를 정량화하였다.
[0172] 단백질 발현 : BHK-21 또는 Vero 세포(예를 들어, 4D-Nucleofector™ Lonza)로의 전기천공에 의해 srRNA를 형질전환하였다. 형질전환 후 18-20시간에, 세포를 고정시키고 투과시키고(eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set, Invitrogen), APC-컨쥬게이션된 항-HA 마우스 모노클로날 항체(2B7, Abcam)를 사용하여 염색하여 형광 유동 세포측정에 의해 개별 세포에서 HA 단백질을 발현하는 세포의 빈도 및 HA 단백질의 평균 형광 강도(MFI)를 정량화하였다.
[0173] 추가 실험 : BHK-21 또는 Vero 세포는 RNA의 전기천공 전에 재조합 인터페론(IFN)의 적정 곡선으로 전처리되고, 벡터에 있어서 복제 및 단백질 발현에 대한 영향은 상기 기재된 검정을 사용하여 측정된다.
[0174] 상기 기재된 실험 결과는, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 유동 세포측정에 의해 검출된 RNA 복제를 나타내는 자가-복제 RNA(srRNA) 작제물이 약동학적 효과를 유도하기 위한 유망한 실용적인 벡터로서 고려될 수 있음을 예시한다. 또한, 트랜스진(들)의 단백질 발현을 나타내는 srRNA 작제물은 추가적인 약동학적 효과를 유도하기 위해(예를 들어, 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위해) 유망한 실질적인 벡터로서 고려될 수 있다.
실시예 3
변형된 EEEV 벡터의 시험관내 평가
[0175] 이 실시예는 합성 EEEV 자가-복제 RNA(srRNA)의 발현 수준을 평가하고 이의 다양한 차별적 거동(예를 들어, 복제 및 단백질 발현)을 조사하기 위해 수행된 시험관내 실험의 결과를 설명한다.
[0176] 이러한 실험에서, 2개의 참조 트랜스진을 발현하는 대조군 VEEV srRNA(RBI296, RBI298), 2개의 배열구성으로 IL-1RA 및 IL-12 둘 모두를 인코딩하는 VEEV srRNA(RBI299, RBI300), 및 2개의 배열구성으로 IL-1RA 및 IL-12 둘 모두를 인코딩하는 EEEV srRNA(RBI305, RBI306)를 포함하는, EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된 합성 srRNA를 설계하고, 후속하여 평가하였다.
[0177] 시험관내 전사 : 캡핑되지 않은 전사(HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB)에 이은 5' 캡 1(Vaccinia Capping System, mRNA Cap 2'-O-메틸트랜스퍼라제, NEB)의 첨가에 의해 박테리오파지 T7 중합효소를 이용하여 SapI-선형 플라스미드 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 srRNA를 제조하였다. 이후, srRNA를 LiCl 침전에 의해 정제하였다. srRNA 농도는 260 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었다(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific).
[0178] 단백질 발현 : BHK-21 또는 Vero 세포(예를 들어, 4D-Nucleofector™ Lonza)로의 전기천공에 의해 srRNA를 형질전환하였다. 형질전환 후 24 및 48시간에, 컨디셔닝된 배지를 세포로부터 수집하였다. 분비된 IL-1RA를 다양한 농도의 재조합 IL-1RA(Peprotech) 또는 컨디셔닝된 배지와 함께 HEK-Blue™ IL-1R 세포(InvivoGen)를 사전-인큐베이션함으로써 생활성 검정에서 평가하였다. 재조합 IL-1B(Invivogen)를 세포에 첨가하고, 밤새 인큐베이션한 후, SEAP 리포터를 QUANTI-Blue™ (Invivogen)를 사용하여 정량화하였다(예를 들어, 도 4a 참조).
[0179] 분비된 IL-12는 DMEM에서 밤새 IL-12 생물검정 세포(Promega) 상에서 다양한 농도의 재조합 IL-12(Peprotech) 또는 컨디셔닝된 배지를 인큐베이션함으로써 생활성 검정에서 평가한 후, 루시퍼라제 리포터를 Bio-Glo™ 루시퍼라제(Promega)(예를 들어, 도 4b 참조)를 사용하여 정량화하였다.
[0180] 상기 기술된 실험 결과는 트랜스진(들)의 단백질 발현을 나타내는 srRNA 작제물이 추가적인 약동학적 효과를 유도하기 위해(예를 들어, 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위해) 유망한 실질적인 벡터로서 고려될 수 있음을 설명한다. srRNA 벡터로부터 발현된 단백질의 활성 평가는 발현된 단백질이 약동학적 효과를 유도하기 위해 의도된 기능을 유지하는지 확인하는 데 중요하다. 벡터 사이의 상대적인 단백질 발현의 차이는 이점을 제공할 수 있다(예를 들어, 동등한 수준의 단백질 발현을 달성하기 위한 더 낮은 용량).
실시예 4
변형된 EEEV 벡터의 생체내 평가
[0181] 이 실시예는 상기 실시예 1 및 2에 기재된 합성 EEEV 레플리콘 작제물(예를 들어, 자가-복제 RNA)(예를 들어, 제형화되지 않은 벡터 및 LNP 제형화된 벡터 둘 모두)로의 백신접종 후 임의의 차등 면역 반응을 평가하기 위해 수행된 생체내 실험의 결과를 설명한다.
[0182] 이러한 실험에서, EEEV 균주 FL93-939로부터 유래된 합성 레플리콘 작제물(예를 들어, 자가-복제 RNA)을 설계하고 후속하여 평가하였다.
[0183] 마우스 및 주사. 암컷 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스는 Charles River Labs 또는 Jackson Laboratories에서 구입하였다. 투여일에, 0.1-10 μg의 물질을 두 대퇴사두근 모두로 분할되어 근육내 주사하였다. 벡터는 식염수에서 제형화되지 않거나 LNP-제형화되어 투여된다. 연구 과정 전반에 걸쳐 체중 및 다른 일반적인 관찰을 위해 동물을 모니터링하였다. 면역원성 연구에 있어서, 동물에게 0일 및 21일에 투여하였다. 비장은 14일 및/또는 35일에 수집하고, 혈청은 14일 및/또는 35일에 분리하였다. 바이러스 항원, 광견병 당단백질 G를 인코딩하는 srRNA의 생체내 면역원성은 ELISpot에 의해 항원-특이적 비장 T 세포 반응을 평가하고(도 5a), 2회 면역화 후 혈청으로부터의 항-광견병 중화 항체 역가(예를 들어, 도 5b 참조)에 의해 평가되었다. 모든 srRNA-면역화된 그룹은 염수 대조군과 비교하여 강력한 T 세포 반응을 나타내었지만(예를 들어, 도 5a 참조), srRNA 백신 간에 차별적인 반응이 관찰되었다. 유사하게, 모든 srRNA-면역화된 그룹은 srRNA 백신 사이에 일부 변동된 보호 중화 항체 역가를 나타내었다(예를 들어, 도 5b 참조). 감염성 질환 항원에 추가하여, 암 항원에 대한 srRNA-기반 백신의 면역원성을 평가하였다(도 6a-6c). 각각의 srRNA 백신은 ESR1, HER2, 및 HER3의 서열을 공동-인코딩하였다. 이러한 3개의 항원에 대한 비장 T 세포 반응을 2회의 면역화 처리된 마우스에서 ELISpot 분석을 사용하여 결정하였다. 강력한 T 세포 반응은 3개의 표적 모두에 대해 관찰된 반면, 반응 패턴은 srRNA 벡터 간에 상이하였다(예를 들어, 도 6a-6c 참조).
[0184] 단백질 발현 연구의 경우, 동물에게 0일에 투여하고, 단백질 발현을 3일 및/또는 7일에 혈청 ELISA에 의해 평가하였다. IL-12p70을 형성하기 위해 인간 IL12A 및 IL12B를 인코딩하는 srRNA를 마우스에서 근육내 투여하였다. 혈청을 7일에 수집하여 단백질의 전신 수준을 검출하였다(예를 들어, 도 7 참조). srRNA-인코딩된 바이오치료 단백질의 기능성을 확인하기 위해, 종-매칭된 마우스 Il12a 및 Il12b 유전자에 대한 코딩 서열을 갖는 EEEV FL93-939로부터 유래된 srRNA를 동물에 투여하였다. IL-12의 기능성은 다운스트림 약력학적 마커로서 IFNγ의 유도를 평가함으로써 측정되었다. srRNA의 투여 후 3일에 마우스로부터의 혈청은 검출 가능한 수준의 IFNγ를 나타내었다(예를 들어, 도 8 참조).
[0185] LNP 제형. 일부 연구를 위해, 레플리콘 RNA(예를 들어, 자가-복제 RNA)를 미세유체 믹서를 사용하여 지질 나노입자에서 제형화시키고, 입자 크기, 동적 광 산란을 이용한 다분산성 및 캡슐화 효율에 대해 분석되었다. LNP는 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, PEG-2K 및 DOPE로 구성된다
[0186] ELISpot. 항원-특이적 T 세포 반응의 크기를 측정하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 마우스 IFNγ ELISpot PLUS Kit(HRP)(MabTech)를 사용하여 IFNγ ELISpot 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 비장세포를 분리하고, 광견병 당단백질 G, ESR1, HER2 또는 HER3, 양성 대조군으로 PMA/이오노마이신 또는 모의 자극으로 DMSO에 해당하는 펩티드 풀을 나타내는 펩티드를 함유하는 배지에서 2-5 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다.
[0187] 항체. 광견병 바이러스에 대한 중화 항체 반응은 신속한 형광 초점 억제 시험을 사용하여 측정된다. 요약하면, 혈청 희석액을 표준량의 살아있는 광견병 바이러스와 혼합하고 인큐베이션하였다. 중화 항-광견병 항체가 존재하는 경우, 이들은 바이러스를 중화시킬 것이다. 다음으로, 배양된 세포를 첨가하고, 혈청/바이러스/세포를 함께 인큐베이션하였다. 코팅되지 않은 광견병 바이러스(즉, 항체에 의해 중화되지 않은 바이러스)는 세포를 감염시킬 것이며, 이는 현미경으로 가시화될 수 있다. 종점 역가의 계산은 슬라이드에서 관찰된 바이러스 감염된 세포의 퍼센트로부터 이루어진다.
[0188] ELISA. 인간 IL-12p70의 검출은 R&D Systems로부터의 상업적 키트 Human IL-12 p70 DuoSet ELISA(DY1270)를 사용하여 수행되었다. 마우스 혈청 IFNγ의 검출은 R&D Systems로부터의 상업적 키트(마우스 IFN-감마 DuoSet)를 사용하여 수행되었다.
[0189] 종합하면, 이러한 데이터는 EEEV-기반 srRNA 벡터가 항원(들) 및 바이오치료제 단백질을 인코딩하는데 사용될 수 있고, 각각 백신 및 치료제 둘 모두에 대한 벡터로서 사용되어 생체내에서 요망되는 약력학적 효과를 발생시킬 수 있음을 입증한다.
[0190] 본 개시내용의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 수정 및 조합이 가능하고 첨부된 청구범위의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 요약 및 개시 내용을 제한하려는 의도는 없다.

Claims (56)

  1. 변형된 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV) 게놈 또는 레플리콘 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물로서, 변형된 EEEV 게놈 또는 레플리콘 RNA에 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여된, 핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA에 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 실질적인 부분이 결여된, 핵산 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 바이러스 게놈 또는 레플리콘 RNA가 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함하고, 각각의 발현 카세트는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 핵산 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 발현 카세트 중 적어도 하나가 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 서브게놈(sg) 프로모터를 포함하는, 핵산 작제물.
  6. 제5항에 있어서, sg 프로모터가 26S 서브게놈 프로모터인, 핵산 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함하는, 핵산 작제물.
  8. 제7항에 있어서, UTR 중 적어도 하나가 이종성 UTR인, 핵산 작제물.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트 중 적어도 하나가 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
  10. 제9항에 있어서, GOI가 치료용 폴리펩티드, 예방용 폴리펩티드, 진단용 폴리펩티드, 기능식품용 폴리펩티드, 산업용 효소 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는, 핵산 작제물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, GOI가 항체, 항원, 면역 조절제, 효소, 신호전달 단백질 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는, 핵산 작제물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, GOI의 코딩 서열이 참조 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준의 발현에 최적화된, 핵산 작제물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, GOI의 코딩 서열이 향상된 RNA 안정성에 최적화된, 핵산 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물이 벡터 내로 혼입되는, 핵산 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 벡터가 자가-복제 RNA(srRNA) 벡터인, 핵산 작제물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 핵산 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포.
  18. 제17항에 있어서, 재조합 세포가 진핵 세포인, 재조합 세포.
  19. 제18항에 있어서, 재조합 세포가 동물 세포인, 재조합 세포.
  20. 제19항에 있어서, 동물 세포가 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포인, 재조합 세포.
  21. 제20항에 있어서, 재조합 세포가 곤충 세포인, 재조합 세포.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 세포가 모기 세포인, 재조합 세포.
  23. 제20항에 있어서, 재조합 세포가 포유동물 세포인, 재조합 세포.
  24. 제20항에 있어서, 재조합 세포가 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, FS4 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero 세포), 인간 A549 세포, 인간 자궁경부 세포, 인간 CHME5 세포, 인간 PER.C6 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, 인간 표피 후두 세포, 인간 섬유아세포 세포, 인간 HUH-7 세포, 인간 MRC-5 세포, 인간 근육 세포, 인간 내피 세포, 인간 성상세포, 인간 대식세포, 인간 RAW 264.7 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 L929 세포, 마우스 결합 조직 세포, 마우스 근육 세포 및 토끼 신장 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 세포.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 트랜스제닉 동물.
  27. 제26항에 있어서, 동물이 척추동물 또는 무척추동물인, 트랜스제닉 동물.
  28. 제26항에 있어서, 동물이 곤충인, 트랜스제닉 동물.
  29. 제27항에 있어서, 동물이 포유동물인, 트랜스제닉 동물.
  30. 제29항에 있어서, 포유동물이 비인간 포유동물인, 트랜스제닉 동물.
  31. 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법으로서, (i) 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 동물을 사육하거나, (ii) 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합 세포를 트랜스제닉 동물 또는 재조합 세포가 GOI에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 대상체에게 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 척추 동물 또는 무척추 동물인, 방법.
  34. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 곤충인, 방법.
  35. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물 대상체인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 포유동물 대상체가 인간 대상체인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드.
  38. 약학적으로 허용되는 부형제, 및
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 세포; 및/또는
    c) 제37항의 재조합 폴리펩티드를 포함하는, 약학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 작제물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 제37항의 재조합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 리포솜, 지질-기반 나노입자(LNP) 또는 중합체 나노입자로 제형화되는, 약학적 조성물.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 면역원성 조성물인, 약학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 면역원성 조성물이 백신으로서 제형화되는, 약학적 조성물.
  45. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에 대해 실질적으로 비-면역원성인, 약학적 조성물.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 애쥬번트로서 제형화되는, 약학적 조성물.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 비강내 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절내 투여, 종양내 투여, 관절내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 질내 투여 및 경구 투여 중 하나 이상의 투여를 위해 제형화되는, 약학적 조성물.
  48. 약력학적 효과 유도를 필요로 하는 대상체에서 약력학적 효과를 유도하기 위한 방법으로서, 방법이
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    c) 제37항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    d) 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 약력학적 효과가 대상체에서 면역 반응을 유발하는 것을 포함하는, 방법.
  50. 건강 병태의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 건강 병태를 예방하고/거나 치료하기 위한 방법으로서, 방법이
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    c) 제37항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    d) 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 병태가 증식성 장애 또는 미생물 감염인, 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 증식성 장애 또는 미생물 감염과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 조성물이 대상체에서 인터페론의 생산을 증가시키는, 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 개별적으로 단일 요법(단독 요법)으로서 또는 적어도 하나의 추가 요법과 조합된 제1 요법으로서 대상체에게 투여되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 적어도 하나의 추가 요법이 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 표적 요법 및 수술로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 약력학적 효과를 유도하고/거나 면역 반응을 유도하고/거나 건강 병태 또는 미생물 감염을 예방하고/거나 치료하기 위한 키트로서, 키트가
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 작제물;
    b) 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 세포;
    c) 제37항의 재조합 폴리펩티드; 및/또는
    d) 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는, 키트.
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