CN1953992A - 源自胎盘和脑垂体同种型的嵌合体人生长激素和获得所述嵌合体的方法 - Google Patents

源自胎盘和脑垂体同种型的嵌合体人生长激素和获得所述嵌合体的方法 Download PDF

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帝潘威塔·麦提
施利康德·米施拉
拉克斯米·斯利尼瓦斯·劳
米林德·普拉布哈卡尔·尼普哈德卡尔
阿麦德蒙索尔·博尔伯惠亚
哥内施阿鲁那·克哈里
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)

Abstract

本发明涉及具有编码人生长激素的SEQ ID NO：3的新的hGH－NV cDNA嵌合体。本发明还涉及用于由人胎盘和垂体RNA的cDNA同种型获得新的hGH－NV cDNA嵌合体的方法：通过使用基因特异引物由反转录扩增该cDNA同种型，克隆该已扩增的cDNA同种型，在特异限制性内切核酸酶位点消化该已克隆的cDNA，随后用hGH－N片段替换该已消化的cDNA同种型hGH－V片段特异区域以获得hGH－NV cDNA嵌合体。此外，该新的hGH－NV cDNA嵌合体用作模板以获得含有具有SEQ ID NO：5的片段的表达结构，以产生成熟人生长激素。

Description

源自胎盘和脑垂体同种型的嵌合体人生长激素和获得所述嵌合体 的方法
技术领域
本发明主要涉及一种如SEQ ID NO：3中所示的编码人生长激素(hGH)的新的hGH-NV cDNA嵌合体和制备该所述的新的嵌合体的方法。此外，本发明涉及使用hGH-NV cDNA嵌合体获得可表达结构来产生成熟人生长激素。
背景技术
DNA同种型和基因簇
哺乳动物基因组的生长激素(GH，生长激素)位点在进化上仅在最近(可能一千万年以前)才膨胀成为5个高度保守基因的簇(如在猿类和人类中)。尽管，在啮齿动物和有蹄类动物中，该生长激素位点仅含有各自的生长激素基因，在人类中，该位点包含隐藏(harbor)另外4个基因(Fiddes et al，1979；Seeburg，1982)。人生长激素基因簇的结构已经确定超过78kb的DNA区域。该完整基因簇位于人染色体17的长臂在带q22-q24(George et al.，1981)。这里报道的66，495 bp的DNA序列(含有5个基因序列，每一个含5个外显子和4个内含子)代表约0.1％的完整人染色体17。其在两个重叠重组粘粒上分离(Barsh et al.，1983)并通过限制酶切分析和考虑其位置和转录取向来描述其特征。
两个生长激素基因散布在三个绒毛膜生长催乳激素基因中，所有基因在同一转录取向上。这些生长激素超家族的基因簇(5′至3′：hGH-N、hCS-L、hCS-A、hGH-V、hCS-B)显示同样的转录方向且由6至13kb长度的基因间的区域分离，该基因间的区域含有48个散布的Alu型中等重复序列元件(Chen et al.，1989，Seeburg，1982)。其中三个是被截短的显示生长激素超家族的基因簇图谱是串连的，这显示基因(5′到3′：hGH-N、hCS-L、hCS-A、hGH-V、hCS-B)在同一转录取向排列并由6至13kb长度的基因间的区域分离，该基因间区域含有48个散布的中等重复序列元件。hGH和hCS的基因在染色体17上在带q22-q24上簇生在一起，但是，促乳素基因位于染色体6上。已测序所有五个基因，包括其紧接的侧翼区，且全部保守(91-99％)。
人染色体生长激素位点横跨约66.5kb，并已被全部测序以为其生物学和进化分析提供框架(Chen，et al.，1989；Seeburg，etal.，1982；Lewis et al.，1980；Hirt et al.，1987)。hGH-N基因在垂体中专有地转录，而其它四个基因(hCS-L，hCS-A，hGH-V，hCS-B)仅在胎盘组织中以每个基因的特征水平表达(Hennen，etal.，1985；Macleod，et al.，1991；Frankenne，et al.，1990)。大量结构信息允许重建hGH位点在分子进化中的主要步骤，从单独的祖先类生长激素的祖基因到目前五个基因在染色体17上的排列。
有差别的同种型表达
基因序列分析和至少三个不同种类的散布于五基因的簇的重复单元的鉴定表明该簇的进化相当近代，且该基因重复机制包括Alu家族中等重复元件之间的同源但不等交换。
这些基因组在其整个5′侧翼和编码序列都是高度同源的，但在其3′侧翼区变化，这引起了在结构和侧翼序列如此类似的基因如何能被如此不同地调控的矛盾。尽管高度的序列一致性，但这些基因在两个不同的组织中在不同激素调节下选择性表达(Parks etal.，1989)。该hGH-N基因位于垂体中的活性染色质结构，其仅在前垂体的生长激素细胞中转录，尽管至少一种绒毛膜生长催乳激素基因位于胚胎滋养层中。
在RNA剪接方法中的第一步是3′剪接位点和其多聚嘧啶区的选择，伴随主要由其至3′剪接点的距离决定的因子与内含子分支点位点的结合。因此，看起来很明显的是剪接位点的选择在剪接的一般机制和选择性加工的特殊情况中都是关键因素。这与选择性RNA加工经常包括使用比选择性供体位点更多的选择性受体位点(就像其伴随hGH mRNA发生)的观察结果一致。细胞类型依赖于剪接变化且其稳定性限定了转录位点。
在人个体发生期间以组织特异的方式控制GH/PL基因转录：GH-V，PL-A，PL-B和PL-L基因在胎盘中是转录活性的(Seeburg et al，1982)，而在出生后源自垂体的hGH-N变成主要是内分泌活性的GH(Selby et al.，1984)。与hGH-N相反，胎盘hGH-V是在怀孕期间在人生命中的第一个月在合体细胞滋养层中合成的，但是其在生长，发育和新陈代谢中的作用还不清楚(Hennen et al.，1985；Cooke et al.，1988)。在妊娠多肽激素，hGH-V和由胎盘分泌的胎盘催乳素中，仅hGH-V分泌是由葡萄糖调节的，显示此激素在怀孕期间关键的新陈代谢作用(Seeburg，1982；Patel et al.，1995)。大多数总胎盘的GH/PL mRNAs源自PL-A和PL-B基因(95-99％)且仅1-4.2％编码GH-V基因产物(Chen et al.，1989；MacLeod et al.，1991；Lytras et al.，1994)。
两种可选择的已加工mRNAs：删除或包括GH-V基因内含子D(Untergasser，G.et al.，1998)由合体细胞滋养层表达产生分泌(22K，191aa)或推测的膜结合(26K，230aa)蛋白(Cookeet al.，1988)。分泌hGH-V可选择地被称为胎盘hGH，somatagen，可以在怀孕妇女的血清中检测到，且成为在不迟于妊娠末三个月时的主要血清hGH(Hennen et al.，1985；Cooke etal.，1988)。此信息帮助我们从一个同种型(hGH-V)到另一个同种型(hG H-N)进行新的cDNA步移。将两者之间的cDNA序列相似性和限制酶切图谱作为此新发明的平台。
源自垂体和胎盘的生长激素都是以具有或不具有分泌信号序列的经加工的成熟GH蛋白的方式生产，其分别在大肠杆菌的周质或在可溶部分积累(Hsiung et al.，1986；Chang et al.，1987；Martial et al.，1979；Gray et al.，1988 and Joly et al.，1998)。hGH-V cDNA编码分子量为20,000道尔顿的蛋白(Ucida et al.，1997；Honjo et al.，1996；Igout et al.，1988 and 1993；Frankenne et al.，1990)尽管，该生长激素由191个氨基酸构成并具有21,500道尔顿的分子量且被用于治疗垂体性侏儒症、小儿慢性肾功能衰竭(Mukhija et al.，1995；Grandi，1991)。最近发现hGH具有显著的活性如免疫促进活性或脂解促进活性，及生长促进活性。非常期待将来发现更广泛的应用。
初级hGH-N基因转录产物的选择性剪接产生两种不同的mRNA种类，其分别(DeNoto et al.，1981)编码hGH(22kD形式)和生长激素变异体(20kD形式)，其从hGH-N基因转录物的外显子III中删除了15个密码子(Singh et al.，1974；Lewis etal.，1978)。没有对hCS基因RNA这样的选择性剪接报道。对所有mRNAs来说存在完全的密码子共线性，只有带来不同的外显子III结构的hCS-L基因mRNA例外。
所有长度约为200个氨基酸的5个mRNA特异多肽，其N端26个残基起信号序列的功能。位于hCS-A和B基因之间的hGH-V基因编码与hGH-N相比在13个位点与GH不同的多肽(Seeburg，1982)，而hGH与hCS在28个残基中不同。hCS-LDNA序列显示在它的第二个内含子5′的共有区剪接供体位点显示点突变(Hirtet al.，1987)，表明剪接可能不在此位点发生。这样，该hCS-L基因可能不会产生稳定的RNA或蛋白产物。该假设的hCS-L蛋白与接近相关的hCS短18个氨基酸残基，并且包含一段与其它多肽没有同源性的6个残基，仅75％的序列与hGH一致。此五个基因转录物的空间分布可能在转录水平调控，或基于由在hGH位点染色质结构反应的位置，和在单个基因周围的序列特异调控元件是造成所观察到的组织特异性基因表达方式的原因。
真核密码子用法vs.区别
基因的D NA由几个结构上隔离的区域即用于调控和全长蛋白编码的开放可读框组成。酶“RNA聚合酶”变得有活性，在控制区结合(称为‘启动子’)，沿着结构基因滑行并在几个其它功能附件的帮助下将已编码的信息转录成已剪接的前信使核糖核酸(pre-mRNA)的大致轮廓，然后成为其最终的已加工信使核糖核酸(mRNA)。然后，此mRNA信息在核糖体中以每一可翻译氨基酸的三联体密码形式翻译，其中蛋白的翻译从起始信号(最常见ATG)开始并继续下去直至停止信号(通常为TAA、TAG、TGA)。
如上述，DNA内的遗传密码由氨基酸确定，其由三联体或“密码子”(选自A、T、G、C的三个相连核苷酸)指定，其中在任一蛋白中的每一特异氨基酸的第三个核苷酸是可变的。根据每一特异氨基酸的使用第三个氨基酸的遗传密码偏好，在原核细胞和真核细胞中变化，其定义了在不同生物体中密码子选择的‘简并性’(表1)。密码子选择的百分比和它们发生的频率已在Ausubel，F.M.et.al.(1987)中清楚的示出。这里，我们已示出在表1的生物体中氨基酸的使用和它们发生频率的变化(Ausubel，F.M.etal.，1987)。这一知识极大地帮助了在重组技术中在异源系统中感兴趣蛋白的表达，其可以在DNA水平在三联体内改变核苷酸以提高任一外源蛋白表达的产量。我们分析hGH嵌合体识别可能导致差的异源表达的序列区域。我们利用在hGH-N序列和其等位基因中密码子选择的差异来得到表达无性系，通过用适当密码子选择的修饰，其可以极大的帮助在各种生物体如大肠杆菌、酵母、昆虫、CHO等中表达人生长激素。
人生长激素(hGH)基因的全序列和该序列内hGH mRNA成熟5′末端的位置已由DeNoto F.M.等人在1981确定。此序列与已克隆的hGH cDNA序列的比较显示该基因被四个间插序列间断。S1图显示这些间插序列的其中之一有两个不同的3′剪接位点。这些可选择的剪接途径产生不同大小的hGH多肽，其可以在正常的垂体中找到。hGH mRNA的近5′末端序列和人糖蛋白激素α亚型的类似区域的比较揭示了一个在这些其它不相关肽激素之间的意外的同源区。
可选择性RNA剪接的机制普遍地暗示于蛋白多样性的产生中。在间插序列B的正常3′位点下游45bp处的一个可选择的3′位点剪接可能产生在正常垂体中以低水平得到的一个较小的hGH肽的mRNA。成熟mRNA的5′末端位置用S1图定位。S1核酸酶分析提供了多种RNA存在的证据。hGH基因可能是一个接近一些关于RNA剪接精确性和在可选择性途径中剪接位点的调节的未解决问题的良好系统。已发现认为包括在转录起始中的信号序列TATAAA在距成熟mRNA的5′末端上游约25bp处。在该基因中在多聚A(poly A)被加入mRNA处的序列附近还发现保守序列。意外地，在hGH mRNA的5′非翻译区和其它不相关人糖蛋白激素α亚型中有一个同源区。我们的工作进一步致力于带来嵌合体hGH的mRNA二级结构的净差以用于更好的表达。Sononick(1985)已提议RNA二级结构的影响存在于剪接位点的选择中。他已提出当被隔离在发夹环中时经常使用的剪接位点变成可选择的。根据他们的观察在hGH前体mRNA的可选择性剪接位点区存在局部二级结构、捕获22K和20K两个受体位点的大发夹结构，以及剪接位点的分支点序列。通过环出22K和20K剪接位点及通过随着套索结构的形成的干扰导致的特异剪接位点的稳定结构将会偏爱在可选择性受体位点跳跃剪接。
在很多内含子中，计算机检索已显示高度保守区在来自3′侧翼切割位点的-60和-21的配位之间。此盒具有一个影响受体剪接位点识别的附加元件和套索结构形成(Leocomte et al.，1987)。人垂体RNA的S1图谱分析确定了源自初级转录物第二个内含子的选择性受体位点的至少四个不同的hGH mRNA的存在。已对hGH基因序列进行分析以解释仅在此局部区域发生的高频率的选择性剪接。在hGH基因的四个内含子中，三个在受体剪接位点上游区域含有″CTTG″盒(内含子A、B、和D)。但是，在内含子C和从20K选择性剪接位点的上游没有发现″CTTG″盒。对于很多内含子，已报道在含有″CTTG″盒区域与U2 snRNA的第一个环的5′端之间的良好互补可能通过RNA-RNA碱基配对在特定剪接位点的分支点选择中起作用。在hGH中蛋白多样性的产生可能暗示其归因于它们在RNA二级结构上的不同以及在优选宿主中密码子选择具有不同水平的表达。
嵌合体构建和工业原理
在克隆中使用的重组载体的构建包括含有核苷酸序列的杂交质粒的构建，该核苷酸序列编码成熟兴趣蛋白如成熟hGH，在其5′端融合编码融合标签肽序列和蛋白酶切位点的序列。这样，通过构建使其具有在实验室范围和更大范围内潜在应用的嵌合体DNA结构使该杂交质粒变成异源的。在重组技术中兴趣基因的嵌合体构建概念方便了表达的产生及纯化步骤。在这两方面的成功的几率依赖于选择的融合多肽的选择。
固定金属离子亲和层析(IMAC)是用于重组蛋白纯化的应用最广的技术。在蛋白的氨基端或羧基端的His-标签设计使得重组蛋白在固定金属离子如Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+上的选择性吸收可以发生。这些技术提供了目的蛋白的选择性纯化(Mukhijaet al 1995；Shin et al.，1998；WO9115589)。由组氨酸或赖氨酸或精氨酸组成的基本氨基残基的使用使得该发明可以高效地工作。
在制造嵌合体结构中的所有选择和应用都有助于在小规模试验及在工业背景的大规模试验中产品收率的百分比。在嵌合体构建中普遍使用在亲和标签(His-tag或GST-tag)紧后面保持蛋白水解酶切割位点(例如，凝血酶、因子V、因子Xa、丝氨酸蛋白水解酶位点如肠激酶)，其中在柱中或在柱外很容易将表达的异源蛋白从标签切除且分离出具有天然序列的兴趣蛋白。亲和层析技术的选择有助于在提纯中用较少的步骤为工业目的处理任何大批的纯化，并减少最终兴趣产品的损失，因此，使整个方法的成本是有效的。
hGH克隆历史
人生长激素(hGH)在人垂体分泌。在其成熟形式中，它由191个氨基酸组成，具有分子量21500，因此比胰岛素的三倍还大。直到重组技术出现之前，hGH仅能从有限的来源即人尸体的垂体腺中通过费力的提取得到。随之带来的该物质的缺乏限制了其治疗低脑垂体功能性侏儒的应用，尽管已提出它在治疗烧伤、创伤愈合、营养不良、骨愈合、扩散性胃出血和假关节上有效。实际上，可得到的估计是从组织中可得到的hGH的量仅够提供低脑垂体功能性侏儒受害者的50％的估计。因此，对于其它应用，hGH是不可得的。由此，必需利用重组DNA技术来克隆hGH并在大肠杆菌中特定地生产。利用大肠杆菌作为复杂异源多肽的微生物宿主现已在微生物宿主中很好地建立。首先已显示hGH可以在重组宿主细胞，特别是大肠杆菌中以良好的量生产，这对治疗低脑垂体功能性侏儒和其它其有效的情况将是适当的(例如，美国专利No.4342,832)。hGH通过U.S.4,342,832的方法表达得到产品，其可用于治疗应用。后来，做过各种修饰以产生用于在大肠杆菌中(同样在芽孢杆菌和假单孢菌中)表达hGH的载体构建。迄今为止，大肠杆菌产生的重组hGH已被患者很好地接受，因其不产生任何免疫反应。因为其不是糖蛋白，大肠杆菌是用于表达hGH最适合的宿主。
在制造具有特定调节元件以控制在大肠杆菌宿主系统中表达的表达位点和产量以及在克隆步骤期间在表达的蛋白水平上二级结构的形成的载体结构方面已进行过尝试(Tokunaga et al.，1985)。hGH已在三种方式中进行过表达例如，在细胞内作为包涵体，在周质空间或在细胞外作为分泌蛋白(美国专利4755465)。
已报道22kD hGH分泌进入大肠杆菌周质中22kD hGH分泌(Gray et al.1985，247-254；美国专利5279947)。该周质是指包括大肠杆菌的革兰氏阴性菌内膜和外膜之间的空间。在革兰氏阴性菌中，含有信号序列的前体蛋白对于膜穿透是必需的且因穿过内膜该分泌信号被切除。该蛋白通过失去其分泌信号被加工成成熟蛋白。至今已有几个克隆专利报道(列表在下面给出)其帮助我们设计仅我们实验室才有的hGH克隆策略。
最近，通过其中hGH基因在作为宿主的微生物中表达的重组DNA技术，可能在细胞内、细胞外或周质中生产人生长激素(美国专利5047333、4755465、4604359和4601980)。
使用各种酶例如因子Xa、肠激酶、肾素或特定化学制剂如CNBr的原位转录后修饰是另一被看好的领域，在其中将成熟hGH从其嵌合体蛋白部分或从其延伸的N端部分分离。这可以从宿主蛋白的其它部分通过适当的层析技术使其容易总蛋白的分离和纯化。纯化的hGH的杂质分布图可能直接依赖于原位转录后修饰的选择。
没有与该发明在此处公开的如此接近的在先技术。稍微相关的在先专利技术的教导已总结如下。
这里，在US3853832中，该专利要求一种生产合成人生长促进物的方法，并且与本发明的发明方面无关。其针对188个氨基酸的多肽，而人的hGH具有191个氨基酸。其教导巯基(sulphhydryl)基团的引入，氧化并讨论了它们的位置。本发明涉及通过cDNA的克隆生产hGH的新途径。US5955346涉及编码各种人促乳素的核苷酸序列。唯一的相似是其涉及蛋白。
US4446235教导获得cDNA编码所需多肽的方法和包括探测所克隆的基因组DNA以获得基因组片断以及使用COS细胞载体。因此它没有教导本发明的教导。
US4665160要求如hGH-V中出现的氨基酸序列且没有教导为本发明的新颖性的cDNA克隆或使用源自同种型的嵌合体或新步移。本发明涉及由hGH-NV生产hGH。
US4670393要求包含插入DNA序列的可复制的克隆工具并列出该氨基酸序列，而本发明涉及通过在其中第一次使用嵌合体的概念的新技术来生产hGH。US5849535要求各种hGH的变体，因此它没有教导本发明。US5597709同样要求一种从野生型hGH中通过重组DNA技术生产人生长激素变体的方法，其主要集中于hGH-V而不是源自垂体的hGH-N，与本发明不类似。GB2055382A教导在合成hGH中使用垂体激素片断。它教导使用细菌表达系统组合自然发生的和合成的部分以获得hGH。它与为本发明的两种同种型嵌合体的克隆典型地不同。它讨论了不同的克隆工具和克隆载体。
US5496713教导在周质空间中生产hGH的方法，其等于分泌生产方法。本发明涉及一种生产方法，其是在细胞内的，完全在壁内，因此有根本不同。US5789199同样教导在细菌周质中生产异源多肽的技术。US5047333教导一种在芽孢杆菌细胞中生产自然发生的hGH的方法，因此与本发明不同。在本发明中使用的技术是新的和使用的宿主细胞不是芽孢杆菌，并且发明概念与US5047333不同。
US4859600要求制造含有hGH的重组原核细胞，其氨基酸序列由天然存在的hGH的氨基酸序列组成，其不含与其自然环境有关的其它蛋白且不含具有外来N端甲硫氨酸的成熟hGH，并且其通过所述重组原核宿主生产。US5618697教导一种生产hGH的方法，其中该结构含有一个具有带负电的氨基酸序列的氨基端延伸以用于更简单的下游方法。
US4601980主要讨论下游方法以获得所生产的多肽并因此涉及发酵和提纯方面，其不是本发明的主题。
US4755465和其它几个专利教导、揭示和描述N端甲硫氨酸的存在和其优点而没有教导本发明。US5633352示出包括由源自垂体的hGH的hGH的生物合成中的步骤。US5688666示出通过取代一系列氨基酸而具有改变的结合肽的多种天然人生长激素。
US5635604示出一个充分纯化的氨基端延伸的hGH，其中X是一个具有至少两个氨基酸的带电氨基酸序列，且其中X的N端氨基酸是一个带负电的氨基酸，而不是Lys(赖氨酸)和Arg(精氨酸)。
US6436674/EP0974654教导我们一种在大肠杆菌和沙门氏菌中有效克隆方法，其中使用分泌信号肽将人生长激素定位到周质空间中。优选的方法是根据本发明的分泌型，因为由于如该发明人所述的在周质中低水平的杂质蛋白而简化分离和纯化。
EP0587427中描述了使用来自淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的新中性蛋白水解酶生产20K hGH的方法。该方法是分泌型的，其中此hGH被分泌到细菌周质中。另一专利JP61224988讨论用于扩增20K hGH cDNA的大肠杆菌的重组质粒。而JP61202689描述从人垂体组织中提取生长激素的方法和其取代方法。
EP0489711描述生产具有天然存在hGH的氨基酸序列的hGH方法。该方法特征在于产生的第一个多肽在N端存在甲硫氨酸。
以上参考引用涉及分泌方法或涉及以具有甲硫氨酸为特征的较大多肽或使用人垂体和胎盘cDNA同种型来生产hGH。然而，这些文献中没有一个描述用人胎盘和人垂体hGH cDNA同种型来产生hGH-NV cDNA嵌合体，以进一步获得一种重复的与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5的表达结构，以随之生产与垂体hGH氨基酸序列相同的、具有比hGH-N(野生型)更好转录二级序列的22KhGH。该独特结构和成熟hGH的更好表达是本发明的创造性。
发明内容
发明目的
本发明的一个目的是提供一种如SEQ ID NO：3中所示编码人生长激素的新的hGH-NV cDNA嵌合体。
本发明的另一目的是提供一种含有新的hGH-NV cDNA嵌合体的质粒载体pGEHNV。
本发明的又一目的是提供含有重组质粒载体的重组大肠杆菌细胞。
本发明的再一目的是提供一种重复的与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5的表达结构。
本发明的再一目的是提供含有质粒表达载体pAB GH2的重组大肠杆菌细胞。
本发明的另一目的是提供一种用于制备新hGH-NV cDNA嵌合体的方法。
发明概要
本发明主要涉及源自从垂体和胎盘RNA获得的两种不同cDNA同种型的如SEQ ID NO：3中所示编码人生长激素的新的hGH-NV cDNA嵌合体，本发明还涉及获得所述新嵌合体的方法，该方法包括下列步骤：用基因特异引物通过反转录扩增，克隆该已扩增的cDNA同种型，在特定的限制性内切核酸酶位点消化该已克隆的cDNA，随后通过用hGH-N片断替换已消化的cDNA同种型中的hGH-V片断特异区域，以得到hGH-NV cDNA嵌合体。此外，本发明涉及使用hGH-NV cDNA嵌合体来获得可表达结构以生产成熟人生长激素。
附图说明
可能获得本发明的目的和优点的方式将从详细的描述和附图中更充分的显示，它们如以下所示：
图1表示与hGH-NV嵌合体结构对比的hGH同种型hGH-V和hGH-N的cDNA序列。
图2示出hGH-V(SEQ ID NO：10)、hGH-N(SEQ ID NO：11)和hGH-NV(SEQ ID NO：14)的氨基酸比较。
图3示出基于hGH-N和hGH-NV序列的折叠的RNA二级结构的对比。尽管两者(hGH-N和hGH-NV ORF序列)的最小能量是相当的，但由于它们序列不同，它们的RNA二级结构有很大不同。
图4示出用于产生嵌合体hGH-NV的hGH-N和hGH-V的限制酶切位点示意图。
图5a示出包括在制造hGH-NV嵌合体(SEQ ID NO：3)并克隆以获得pGEHNV质粒的步骤顺序的示意图。
图5b示出嵌合体hGH进入可阿拉伯糖诱导的载体以构建质粒克隆pABGH1的克隆策略流程图。
图6阐明包括通过使用抗-hGH抗体的Western从生长于发酵器的菌溶物中实现His标记的hGH和随后纯形式的hGH的步骤。
图7示出与商业Norditropin相比该重组hGH的生物活性的水平。
图8示出在考马司染色的凝胶中通过阿拉伯糖诱导的表达在hGH#1(pABGH1)和hGH#2(pABGH2)克隆之间在hGH表达水平上的不同。用未经诱导的克隆作为对照。
这里，pABGH1′指源自垂体cDNA的hGH(Chen et al.，1989，条带5和6)克隆，pABGH1(条带7和8)指源自嵌合体的hGH-NV的合成hGH克隆，以及pABGH2(条带3和4)指后者重复插入。
具体实施方式
本发明优选实施方案
相应地，本发明涉及如SEQ ID NO：3中所示的新hGH-NVcDNA嵌合体。
本发明的一个实施方案提供含有SEQ ID NO：3的质粒载体pGEHNV。
本发明的另一实施方案提供含有包括SEQ ID NO：3的质粒载体的pGEHNV的重组大肠杆菌细胞。
本发明的一个实施方案涉及获得编码人生长激素的新的hGH-NV cDNA嵌合体的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)自人胎盘和垂体分离总RNA，
(b)通过使用选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9的基因特异引物的反转录，扩增各自的cDNA同种型：hGH-V自人胎盘RNA和hGH-N自步骤(a)的垂体RNA。
(c)克隆步骤(b)的已扩增的cDNA同种型hGH-V和hGH-N，
(d)根据它们符合读框的翻译的ORF序列比较步骤(c)的已克隆的cDNA同种型两者的限制性内切核酸酶图谱，
(e)在特异限制性内切核酸酶位点消化步骤(c)的已克隆的该cDNA同种型，
(f)在特异限制性内切核酸酶位点，用hGH-N片段通过连接替换在步骤(e)的已消化的cDNA同种型中的该hGH-V片段特异区域，以获得想要的hGH-NV cDNA嵌合体的特异组合，和
(g)克隆如SEQ ID NO：3中所示的hGH-NV cDNA嵌合体。
本发明的另一实施方案，其中将来自同种型的部分插入特异的组合中，以开发为了更好的密码子选择的hGH的cDNA片段模板。
本发明的又一实施方案提供如SEQ ID NO：3中所示的1-62bp、63-587bp和588-728bp的hGH-NV cDNA嵌合体的所希望的特异组合的用途。
本发明的再一实施方案提供选自Bse MI、AatII、EcoNI、PleI、BstXI、EheI、SmII和SmaI的限制性内切核酸酶的用途。
本发明的再一实施方案由新的hGH-NV cDNA嵌合体产生如SEQ ID NO：5中所示的成熟hGH cDNA。
本发明的再一实施方案提供通过使用基因特异引物的cDNA扩增产生的SEQ ID NO：5。
本发明的另一实施方案选自SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：22的基因特异引物的用途。
而本发明的再一实施方案提供与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5的可表达结构。
本发明的再一实施方案其中与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5序列被重复。
本发明的再一实施方案提供含有如SEQ ID NO：5中所示的源自嵌合体的成熟cDNA序列的质粒表达载体pABGH2。
本发明的再一实施方案提供用于生产成熟人生长激素的含有质粒pABGH2的重组大肠杆菌细胞。
该克隆方法的意义和难点：
A.胎盘mRNA和组织的可用性
意外地，我们已发现hGH基因(即编码成熟蛋白的191个氨基酸和其信号肽的26个氨基酸的基因)，其在革兰氏阴性菌中被全长表达以得到pre-hGH，其在长度上与相应的胎盘配对物的pre-hGH类似。
生长激素以前体的形式合成，然后其在整个个体生命中在脑垂体的前叶产生，且在成年以前的时期以更大的量产生，且一旦经加工就从细胞中分泌。
直到几年前，该激素的唯一来源是通过复杂且昂贵的方法从尸体的垂体中以低的产量提取它。
因此，我们的本发明在本质上是非常有帮助的，其中胎盘mRNA和垂体mRNA是hGH-N类似物hGH-NV的克隆方法的起点。五个hGH-V cDNAs代表以与高度同源的人生长激素和人绒毛膜生长催乳激素基因转录物类似的方式剪接和加工的mRNA(Cooke et al.，1988)。此外，还应当考虑分离期间胎盘mRNA的稳定性。在最终的结构中，该克隆方法在寻找密码子选择上给予了一定程度的自由。在hGH-NV中的hGH-V部分旨在给出比hGH-N(图3)更好的mRNA二级结构。
B.胎盘cDNA结构的克隆
我们首次试图通过克隆hGH-V cDNA来克隆hGH-N类似物同种型，尽管事实上这些基因在有差别的激素控制下在两个不同组织中选择性表达(Parks et al.，1989)。该hGH-N基因仅在前垂体的生长激素细胞中转录而该hCS-A和-B基因仅在胎盘滋养层中。初级hGH-N基因转录产物的选择性剪接(DeNoto et al.，1981)产生两种分别编码人GH(22K形式)和具有从hGH中删除的氨基酸残基的生长激素变体(20K形式)的mRNA(Singh et al.，1974)。
C.基本同源
我们的本发明主要基于在同一染色体基因座中存在人生长激素的变体，特别地，一个编码hGH变异蛋白和含有4-5个间插基因的代表性基因。我们已采取独特的选择以通过hGH同种型例如hGH-V、hCS的克隆来克隆cDNA。
使用mRNA的同种型作为用于克隆的起始材料和用于高产量地得到纯形式以及适当的ORF处理的相关酶匹配位点。
在克隆的两个同种型的全长cDNA之间改组以用于且在靶cDNA中的特异氨基酸的摆动序列中引入变化的策略是本发明的新颖之处。
用于高产纯产品的在可表达质粒中克隆的编码区串连盒的重组方法同样已被报道(U.S.Pat Nos.5955323；5279947；4859765)。
合成cDNA的构建
其目的是使具有26aa信号序列的全长嵌合体(来自hGH-NV嵌合体(来自hGH-V同种型的hGH-N类似物)选择的所有可能组合，图5)进入更好的启动子调控的大肠杆菌表达系统。将此克隆用作模板来从全长嵌合体ORF转换至其合成形式的成熟ORF，其是在两氨基酸的摆动序列中具有引入可靠限制酶切位点的独特变化。
在细菌中，为了高水平的异源基因表达，通常使用可诱导的启动子-核糖体结合位点(rbs)表达元件。携带该所述启动子-rbs表达元件且编码用于直接高水平表达异源蛋白的遗传信息的质粒，可以把兴趣基因的ORF在这些以上提到的调控元件的控制下构建。此外，表达载体系统还包括亲和标签和紧接成熟cDNA序列之后的特定切割位点，以通过所述重组微生物提供细菌生产的异源蛋白的希望的且更简单的纯化系统。
cDNA插入物的表达在可诱导的阿拉伯糖C启动子的控制下，从载体的NcoI位点的ATG密码子开始并用肠激酶特定切割位点(图5a，5b)切割融合蛋白。用该重组质粒转化大肠杆菌TOP10并选为氨苄青霉素抗性菌落。在细菌生长对数期在介质中加入L-阿拉伯糖进行蛋白诱导并持续6小时。该可检测的融合蛋白在特异酶切割位点被切割并展示具有天然的生物活性的正确的分子量大小。将DNA编码的人促生长素抑制素、前胰岛素原、胰岛素原、胰岛素A链、胰岛素B链或牛或人生长激素、LH、ACTH和胰腺多肽(微生物基因组偏好的大多数密码子)插入质粒以在微生物中表达。
人胎盘mRNA的分离
由标准程序通过硫氰酸胍方法从人胎盘中分离总RNA(Ausuble et al.，1987)。通过亲和层析在Oligo(dT)纤维素上纯化Poly(A+)RNA。通过Oligo(dT)纤维素亲和层析从总RNA中分离该mRNA，如Promega Total RNA IsolationSystems′protocol(Cat.#Z51110)所述将其匀化。然后，在AMV转录酶的帮助下通过使用标准方法将此所得的mRNA用于产生第一链。使用RNase H和RNase A降低两链之间的非特异交互作用，随后使用酚/氯仿/异戊醇和70％酒精洗涤来纯化此第一链DNA(20ng/μl)。
通过使用″RNAgents for Total RNA Isolation Systems″(Promega，Cat.#Z51110)从人胎盘中分离总RNA。每次处理约2gm的组织。将总RNA沉淀重新悬浮在1ml不含核酸酶的水中并保存在-70℃。总RNA浓度为约4μg/μl。在oligo(dT)8-12和oligo(dT)10颗粒的帮助下从总RNA中汇集聚腺苷酰化RNA。每次反应使用1μg总RNA。使用AMV反转录酶在42℃进行1小时将聚腺苷酰化RNA反转录成与单链的第一链互补的DNA。第一链cDNA的最佳浓度在20ng/μl的范围。
cDNA的合成与克隆
用Oligo(dT)12-18颗粒来纯化并选择稳定的poly(A+)RNA(信使RNA)，将其用于形成反转录的引物按照标准RT-PCR技术产生第一链cDNA(图1，2，5a)。
反转录和第一链的合成：
为该转录反应准备1.0ug RNA/mRNA、0.5ug引物(oligodT)、无核酸酶的水并在70℃加热5分钟，然后在冰上急冷5分钟。微离心5秒以沉淀材料。然后依次加入：无核酸酶的水、RT缓冲液(5X)、dNTP混合物(12.5mM)、核糖核酸酶抑制剂(40U/ul的1∶2稀释物)和焦磷酸钠(40mM，4mM终浓度)，温和混合，然后在42℃预热该混合物2分钟，然后加入AMV反转录酶(RT)(10U/ul)。充分地温和混合，然后在42℃/1.0hr(RT反应)下放置，接着在75℃加热10分钟(RT的失活)。每管加入1.0单位RNase A并在25℃下温育30分钟。随后加入0.5单位RNase H至每一反应管，并且在37℃下温育30分钟。
接着，加入Tris-Cl/1.0mM EDTA(pH5-7.5)以纯化第一链cDNA。然后，加入缓冲的酚(pH5-8.0)-氯仿-异戊醇，涡旋并在微离心机中在约14,000rpm下旋转。转移水相至新管中并加入3M乙酸钠(pH3-7)，混合均匀。然后加入经冷却的100％EtOH并置于-70℃，然后在约14,000rpm下旋转5分钟。用EtOH通过在4℃以14,000rpm旋转5分钟洗涤沉淀。然后重新悬浮于不含核酸酶的水中。
在将兴趣基因克隆进入选择的合适的载体之前使用Taq聚合酶进行标准的PCR扩增以制备双链cDNA。在此，混合所有的成分即：缓冲液、引物、第一链cDNA、2mM的dNTP和酶，并在热循环仪中在94℃下加热1分钟以变性。在低于引物的Tm2-4℃下退火，然后在72℃延伸。为扩增经过总共45个循环。然后根据需要在0.8％-2％的琼脂糖凝胶上电泳该PCR反应。
通过使用Taq聚合酶由标准PCR扩增技术来合成双链cDNAs。然后将此兴趣片断直接克隆进基于pUC-18的TA-克隆载体。为产生转化株以进一步工作，选用细菌株系JM109。
克隆技术
将PCR Taq聚合酶扩增的在两侧具有腺嘌呤的双链片断克隆并构建直接进入TA-克隆载体(图2，5)。从胎盘和垂体组织中制备hGH-V的聚腺苷酰化mRNA。由5μg的该总RNA制备总共100ng的第一链cDNA。将20ng的该第一链用作模板以退火基因特异引物，即，引物A(SEQID NO：6)；引物B(SEQ ID NO：7)；引物C(SEQ ID NO：8)；引物D(SEQ ID NO：9)以扩增694bp(SEQ ID NO：1)hGH-V片断和723bp(SEQ ID NO：2)hGH-N片断。在大肠杆菌T4 DNA连接酶的存在下将这些在5′和3′末端都具有A尾巴的双链片断直接克隆进入基于pUC-18的克隆载体中以得到pGEHV和pGEHN结构。这些克隆进一步分别通过NcoI/NotI，NcoI/PstI双切消化检测。此外，用NcoI/RsaI、BstXI、EcoRI/Sm/I、SmaI、EcoRI/BgIII、HgaI进行限制性酶切图谱分析，该分析确定了cDNA PCR片断的保真度。
从hGH-V质粒结构到hGH-N质粒结构的步移与制备可能的模板 嵌合体cDNA结构
在制备hGH-嵌合体结构时，将hGH-V(SEQ ID NO：1)和hGH-N(SEQ ID NO：2)分别从胎盘和胎儿垂体中克隆，各自进入克隆载体。随后，使用几个限制性内切酶由大肠杆菌能用的(E.coli-able)hGH-N替换hGH-V片断的特异区域来得到合成hGH-NV(SEQ ID NO：3)(图1，4，5a)。
使用独特的限制酶进行两个cDNA的彻底的限制酶切分析。对两克隆的限制酶图谱进行比较和分析，以选择独特的策略来使用限制酶切消化在特定区域用hGH-N替换hGH-V。在制备hGH-NV嵌合体时，用于制备hGH-NV嵌合体的酶是NcoI、NotI、AatII和SmII，没有引物或PCR扩增以避免突变。只在hGH-N和hGH-V两片断上进行限制性酶切消化以用hGH-N cDNA改组AatII和SmII hGH-V 525bp cDNA片断部分。728bp(SEQ IDNO：3)的hGH-NV的嵌合体的最终结构在基于pUC-18的载体中在NcoI/NotI酶切位点之间制备。
使用hGH-V cDNA的改进形式的hGH-N克隆是为了更好地大肠杆菌的表达。为此目的，将来自胎盘的hGH-V(SEQ IDNO：1)和来自胎儿垂体的hGH-N(SEQ ID NO：2)先克隆进pUC-18TA-克隆载体，然后使用该嵌合体(SEQ ID NO：3)作为模板，将hGH-NV成熟cDNA在紧接肠激酶切割位点之后亚克隆进阿拉伯糖诱导的大肠杆菌表达载体(图5a，b)。
在hGH-NV嵌合体(728bp，SEQ ID NO：3)的成熟肽部分上，通过PCR扩增将hGH-NV成熟片断(591bp，SEQ ID NO：4)克隆进入pBAD-HisA表达载体，通过基因特异引物排除26个氨基酸，其给出所期望的591bp(SEQ ID NO：4)PCR产物。为扩增591bp成熟hGH-NV片断，使用引物E(SEQ ID NO：12)和引物F(SEQ ID NO：13)进行PCR扩增。在图5中示出用于扩增591bp成熟hGH-NV片断的基因特异引物对，即引物E(SEQ ID NO：12)和引物F(SEQ ID NO：13)。通过引物对：引物Q(SEQ ID NO：15)和引物R(SEQ ID NO：16)，由质粒(pBAD/His A，Invitrogen)扩增载体部分以得到357bp片断。
考虑在hGH-V中与hGH-N具有不同的氨基酸的优点，其中在hGH-V克隆中以这样的方式进行改变，以使那些氨基酸用hGH-NV cDNA序列替换。因此，这些变化同样使得大肠杆菌能用的经改进的hGH cDNA产品记住其表达效率。hGH-NV片断的选择基于密码子选择和RNA二级结构理论。在最终的hGH-NV嵌合体结构(728bp，SEQ ID NO：3)中，来自26个氨基酸信号肽的前8个氨基酸来自hGH-V cDNA，在第三个氨基酸中，丙氨酸与hGH-N的第三个氨基酸不同。从9至192氨基酸是借自hGH-NcDNA，以及193-218氨基酸又是借自hGH-V cDNA。
这里，我们采用前述的包含SEQ ID NO：1的pGEHV和包含SEQ ID NO：2全长cDNA克隆的pGEHN，并且用独特的限制酶分别消化以用大肠杆菌能用的hGH-N部分替换hGH-V片断的特异区域。然后，将该最终hGH-NV嵌合体在限制酶切位点NcoI和NotI之间重新克隆进基于pUC-18的TA-克隆载体，pGEHNV。进行限制酶切分析以确定在基于pUC的TA-克隆载体内的已连接的hGH-NV嵌合体。
为进一步改进，用hGH-NV嵌合体结构(pGEHNV)作为模板以产生具有对于相似氨基酸和附加的独特RE位点(BsrGI)改进的摆动序列的cDNA，但是保持序列其它部分与垂体形式的hGH(pABGH1)相似。最终，使用引物E(SEQ ID NO：12)和引物F(SEQ ID NO：13)将改进形式的成熟hGH ORF(已引入独特的限制酶切位点，BsrGI)在紧接EK切割位点之后克隆进阿拉伯糖诱导的大肠杆菌表达载体，其长度是约579bp，(SEQ IDNO：5)hGH克隆#1(pABGH1)(图5b)。为与最初的垂体cDNA表达比较，使用来自胎儿垂体的总RNA扩增的PCR产物并在紧接EK切割位点之后克隆进阿拉伯糖诱导载体，显示比579bp的合成片断(SEQ ID NO：5，图8)差的蛋白表达水平。根据保留在大肠杆菌中的简并性，此源自hGH-NV嵌合体的cDNA序列进行密码子选择的挑选以提高表达效率。作为我们已看到的结果，在两个克隆中hGH表达的水平虽然并不存在很大的差别(图8)，例如从hGH-V(SEQ ID NO：1)至hGH-N(SEQ ID NO：2)到最终hGH-NV嵌合体(SEQ ID NO：3)，但引入很少的大肠杆菌能用的密码子，并且在克隆步骤期间(图5b)使用SEQ ID NO：17-22的引物J-O引入限制酶切位点(BsrG1)还改变了氨基酸的第三个密码子(SEQ ID NO：5)。
制备hGH-NV嵌合体结构的细节
用于总RNA提取的原始组织来源对于hGH-N取自人胎儿垂体组织和对于hGH-V cDNA合成取自人胎盘。将hGH-N(723bp，SEQ ID NO：2)和hGH-V(694bp，SEQ ID NO：1)cDNAs的期望的RT-PCR扩增cDNA产物经TA-连接进基于pUC-18的载体(图5a)。使用独特的限制酶进行两个cDNA的彻底限制酶切分析(图.4)。
步骤I.在制备hGH-NV嵌合体cDNA形式时，用基于pUC-18的载体的独特位点且在hGH-V694bp片断(SEQ IDNO：1)内不存在的NcoI/NotI对基于pUC-18的hGH-V克隆(#6和#25)进行双酶切消化。将经NcoI/NotI消化的720bp片断(在SEQ ID NO：3中识别)进行凝胶纯化以分离5’(55bp)和3’末端(139bp)。同样纯化该经NcoI/NotI消化的开放的基于pUC-18的载体(pGEHNV，2941bp)用于以后克隆(图5a，b)。
步骤II.用AatII/SmII再次消化经NcoI/NotI双酶切消化的720bp经凝胶纯化的片断，以从中间525bp AatII/SmII片断中分离55bp的5’-末端和139bp的3’-末端片段。用AatII/SmII 525bphGH-N片断替换该525bp的hGH-V cDNA片段，由此改变在人胎盘hGH-V中与人垂体分离的hGH-N不同的13个氨基酸。HGH-V与hGH-N信号序列在来自26个氨基酸中的两个氨基酸不同(在第3和第19处)，而在hGH-NV信号序列中该第三个氨基酸与hGH-V匹配但是该第19个氨基酸与hGH-N匹配。包括成熟多肽的来自165个氨基酸的hGH-NV的140个氨基酸与hGH-N序列匹配而此处hGH-N与hGH-V有很大不同。后25个氨基酸又与hGH-V序列匹配。
在此步骤中，在T4 DNA连接酶的帮助下，在4℃进行连接反应过夜，以在它们的相应限制性位点(图4)用粘性末端连接55bp和139bp片段。
选择独特的策略以在特定区域使用限制酶消化(NcoI、NotI、AatII and SmII)用hGH-NV取代hGH-V的双克隆的比较的限制酶图谱显示经连接的hGH-NV cDNA的728bp全长片断(SEQ IDNO：3)。
通过基因特异引物对的hGH-NV cDNA成熟肽部分的PCR扩增给出了期望的591bp的PCR产物(SEQ ID NO：4，图5b)。在图5中示出用于扩增591bp成熟hGH-NV片断的基因特异引物对(引物E & F)：引物E(SEQID NO：12)以及引物F(SEQ ID NO：13)。通过引物对：引物Q(SEQ ID NO：15)和引物R(SEQ ID NO：16)由质粒(pBAD-HisA)扩增该载体部分以产生357bp片断。以这样的方式选择引物E，以至在第一氨基酸(TTC)、苯丙氨酸之外，将成熟hGH的起点TC(在SEQ ID NO：3中引物E在119位)选做最初核苷酸。引物F选择在SEQ ID NO：3中的681-694，而其它核苷酸基于阿拉伯糖诱导的载体选择，其中包括用于克隆的限制性位点XhoI。以下示出591bp序列，其中引物的位置限定在框中：
Figure A20048004298900281
TTTTTGACAACGCTATG
CTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCT
ACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAA
GTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCT
CAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACA
ACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTG
CTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGA
GTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAG
CAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATC
CAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGA
CTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACAC
AAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGG
CTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGA
CATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCA
Figure A20048004298900282
↓XhoI
Figure A20048004298900284
使用NcoI/Eco24I、NheI/EheI、NcoI/XhoI、BshTI/XhoI/BstXI、BshTI/XhoI、NcoI/EcoRI限制酶消化该pBAD/HisA的hGH-NV成熟克隆，同样给出正确的片断大小。在该克隆上和在NcoI/EcoRI消化的经凝胶纯化的片断上用NcoI/Bsh1236I、NcoI/PleI、NcoI/PstI、NcoI/BstXI、NcoI/EheI、NcoI/BgIII、NcoI/Eco57I、PleI/XhoI、NcoI/PstI/EheI、Bsh1236I/BgIII进一步分析。
制备阿拉伯糖诱导的hGH克隆的独特结构
为优化在大肠杆菌中的hGH蛋白的表达，试图将含有启动子-插入物-终止子序列的整个盒的多聚体克隆进类似的表达载体。为达到此改进，将显示总大肠杆菌表达的5％的hGH克隆#1，pABGH1(源自hGH-NV的合成的单hGH插入物，图5a)作为模板质粒。
用BshTI/EcoRI(分别地，在74和977的独特位点)消化hGH克隆#1(pABGH1)并分别纯化两个经消化的片断，3717bp(片断1)和903bp(片断2)。用AccI(位点在350、1447、3412)和EcoRI(位点在977)消化pABGH1 DNA，其产生627bp、470bp、1558bp和1965bp。然后纯化该470bp片断(片断3)。用AccI(以上提及位点)和BshTI(位点在74)进行pABGH1 DNA的另一消化，导致276bp、1097bp、1282bp和1965bp。然后纯化该1282bp片断(片断4)。所有连接反应在室温下温育1小时，然后在4℃过夜。
连接片断2和片断3以得到1373bp(片断5)。然后连接该片断5与片断1以得到5090bp(片断6)。接着分别连接片断4和片断2以达到2185bp(片断7)。最终，连接片断6和7，其将完成hGH克隆#1(pABGH1，4620bp)至hGH克隆#2(pABGH2，7275bp)的改进。通过DNA提取和使用独特切点如PvuI的限制性内切酶酶切分析对阳性克隆进行分析，以获得7275bp的线性pABGH2片断以及双限制性切点即EcoRI、BshTI。插入物的准确长度是2655bp，其重复并以串连盒插入阿拉伯糖诱导的表达载体紧接EK切割位点之后。为进一步确认该盒，在NcoI或BshTI消化之后，通过在两片段2655bp和4620bp上的测序进行分析。在制备pABGH2克隆中的该尝试通过几乎两倍的增长直接反应在hGH表达水平上(图8)。
为了更高水平的hGH表达，已尝试增加在阿拉伯糖诱导载体中的盒数。在制备pABGH2结构之后，附加的额外盒的加入不能使该质粒作为稳定质粒。在两段相同结构之后，pABGH3，第三个插入盒已测序并确认丢失。pABGH2是甚至经过两年之后的唯一稳定质粒且在发酵罐生长培养中同样显示稳定性。
从发酵细胞培养物中分离成熟hGH
将来自发酵罐的诱导细胞培养物用作溶菌材料的来源，其中获得重组hGH以及可溶性大肠杆菌蛋白。
通过在这里由在图6和8中相应的Western Blot示出的几个独特步骤实现重组hGH的纯化(从pABGH1和pABGH2表达克隆)。检测该已纯化的hGH的生物活性，其与来自Novagen的商品化的Norditropin标准相比显示出高效能(图7)。
生长激素的生物活性：
测试已纯化的hGH与商品化的hGH(Norditropin，来自Novagen)一起检测其生物活性。假设在血清中该刺激或抑制原理与该比较标准相同，GH生物活性是与通过已知标准诱导的反应相当的目的组织的响应。相当长时间已知淋巴瘤细胞特定地响应催乳激素，其包括已知为催乳活性的人生长激素(hGH)。用于hGH生物分析的方法是根据Tanaka’s方法(Tanaka et al.1980，Ealeyet al.1995)的具有稍微改进的方法。将作为赠品获得的Nb-2：鼠淋巴瘤细胞系用于检测hGH的生物活性。将该Nb-2细胞常规保存在含有10％胎牛血(FBS)和10％马血清(HS)的RPMI中。在生物分析前的二十四小时，将细胞保存在静止培养基：含有1％FBS和10％马血清的RPMI 1640中。在分析时，将细胞洗涤并计数且使用平板培养基RPMI+10％马血清，将细胞密度调整到1×105细胞/毫升。对于24孔平板该平板细胞密度是1×105细胞/毫升/孔。将不同浓度的标准和按本发明的新方法生产的hGH加入细胞中并在37℃，5％CO2的恒温箱中温育24、48和72小时。在每24、48和72小时之后，用血细胞计数器进行细胞计数。
在表2和直方图(图8)中很明显的是作为时间函数、细胞数量的用量的相关增长。最大细胞增值在72小时后获得。按本发明的新方法生产的生长激素的生物活性与生长激素标准的参考标准是可比的且是可再现的。表2中的数据是至少4次试验的表示。
提供下列实施例仅用于说明而不应被认作限定本发明的范围。
实施例1
从突变发生至兴趣cDNA的克隆
在合成基因特异引物期间进行引入独特限制酶位点或在密码子水平改变ORF区域。例如，使用hGH-V和hGH-N已发表的cDNA序列作为模板，在人生长激素上引入cDNA上的这种变异(自身突变)。将hGH-V cDNA序列作为例子在下面示出，其中突出的装入盒部分定义用于694bp hGH-V片断(SEQ ID NO：1)的PCR扩增的上游(引物A，SEQ ID NO：6)和下游PCR引物(引物B，SEQ ID NO：7)选择位点的位点。这里，示出引物对的位置以从胎盘第一链扩增694bp hGH-V片断(SEQ ID NO：1)。在同一序列区域用不同颜色突出启始ATG和终止密码子，TAG。
5′-AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTC
CTGCAGGCTCCC
GGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTC
CTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTAT
CCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCGTCGCCT
GTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAA
GCCTATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAA
CCCCCAGACCTCCCTCTGCTTCTCAGAGTCTATTCCAACAC
CTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGA
GCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTG
GAGCCCGTGCAGCTCCTCAGGAGCGTCTTCGCCAACAGCC
TGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCT
GAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGG
CTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAATC
AGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGA
CGCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGG
AAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGC
AGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAG
Figure A20048004298900321
Figure A20048004298900322
CCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTG
GTCGTGGAAGGTGCTACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCC
TAATAAAATTAAGTTGCATCATTT-3′
期望的产品长度694bp(SEQ ID NO：1)
在PCR扩增期间，在cDNA的5′和3′末端，在合适的位点内引入限制酶位点是可能的。为进一步克隆进特定表达载体，利用这些改变。将在全长cDNA内的这些突变，其不影响编码区域如推定的hGH-V cDNA，与其它部分一起使用基因特异引物(引物C & D；SEQ ID NOs：8 & 9，表3)扩增。
用于hGH-V扩增的引物：
引物序列(5’→3’) 特征 长度 Tm  在野生型序列中核苷酸位置(Chen，et al.1989)
4CTGTGGACAGCTCAGGTACCGGCAATGG(引物C)SEQ ID NO：8 具有KpnI切点 28mer 60.7℃  39-66
4GATGGGATCCGAGCAGCTAGAAGCCACAG(引物D)SEQ ID NO：9 具有BamHI切点 29mer 60.7℃  571-600
实施例2
通过位点的限制酶分析确定推定的克隆
通过使用限制性内切酶SaII和XhoI在20μl总反应设置中双消化基于pUC-18的克隆来得到约723bp(hGH-N，SEQ ID NO：2)或694bp(hGH-V，SEQ ID NO：1)DNA片断。在1％琼脂糖凝胶上电泳反应样品以通过使用MBI，Gel Extraction Kit，Cat.#K0513来纯化兴趣带。然后，通过组合或单独(通常酶浓度是10U/μl)使用六至七个独特的切割物如NcoI/NotI、KpnI/BamHI、BsrDI/SpeI、BgIII/BamHI、NcoI/HgaI、NcoI/RsaI和EcoRI/BgIII，对所得的2-3μl已纯化的片断来分析其限制内切核酸酶图谱。从这些限制性核酸内切酶酶消化估计大约的片断长度，然后在电泳已消化的样品之后在琼脂糖凝胶上分析。同样检测限制性核酸内切酶酶消化以确定含有我们感兴趣的插入物的细菌克隆的正确性。这里，以这样的方式选择该限制性核酸内切酶酶消化以至绘制该插入物从载体酶切位点的距离的图谱且知道该插入物在5′至3′方向的定向，例如，PvuI、SaII/EcoRI、Cfr1OI、ApaLI、BshTI、AvaI、SspI、AccI等。
实施例3
制备第一链和密码子选择
在本发明中，我们的兴趣在于通过Oligo-dT RT-PCR来克隆来自胎盘的hGH-V和来自垂体的hGH-N进入大肠杆菌TA-克隆载体。为克隆hGH-V，从人胎盘中提取总RNA。根据hGH-VcDNA序列，设计基因特异的上游和下游引物(Chen et al.，1989)。在oligo dT(8+12)和oligo dT10纯化的mRNA上使用Oligo-dT(8+12)引物进行RT-PCR来产生mRNA和随后合成的第一链cDNA。在AMV转录酶的帮助下，通过RT反应将该池mRNA合成第一链cDNA。通过扩增作为对照物的标准管家基因例如β-肌动蛋白基因来保证第一链的质量。将PCR扩增的694bp推定的hGH-V片断(SEQ ID NO：1)直接通过TA-克隆克隆进基于pUC-18的载体。所有的阳性克隆已进行限制性分析(使用AatII、BstXI、NcoI、NotI、PstI)以检测该片断的正确性以及该片断在载体内的取向。结果证实该694bp片断(SEQ ID NO：1)作为hGH-V cDNA的正确性。
按照以上提到的相同程序使用胎儿垂体mRNA同样产生HGH-N cDNA片断。将四个独立的经RT-PCR扩增的推定的723bp hGH-N片断(SEQ ID NO：2)通过TA-克隆直接克隆进基于pUC-18的载体(pGEHN)。使用八个来自人hGH-N cDNA图谱的独特的限制酶检测该已克隆片断的正确性，其显示来自胎儿垂体和脑的该723bp RT-PCR产物(SEQ ID NO：2)都是推定的hGH-N cDNA。
由于根据大肠杆菌密码子简并性分析hGH-N用于密码子优化，其显示多数区域，所以类似于密码子选择(Gray et al.，1988；美国专利4604359)。在一个优选的实施方案中，在该成熟ORF中在它们的摆动序列中仅对两个氨基酸进行处理，其造成独特的限制性位点。
实施例4
测序分析
使用普通测序程序测序该结构，该程序在试验室中经过改进。通过柱或通过在Kraft et al.1988中描述的PEG沉淀来纯化待测序的DNA：PCR产物或质粒结构。纯化之后，给出在50ng至500ng范围内样品DNA以测序。在10μl或20μl最终体积内进行循环测序反应。对于每一反应，在DNA模板中加入4μl或8μl的终止子备用反应混合物(terminator ready reaction mix)。该备用的反应混合物具有预先混合的dNTP、染料终止子(dye terminator)、ampliTaq DNA聚合酶、MgCl2和缓冲液。加入1μl引物(5pmol/μl)，使管在热循环仪中进行循环测序(94℃10秒、50℃5秒和60℃4分钟，25个循环)。
用2.7M乙酸钠(pH4.6)和乙醇沉淀该PCR产物，用70％乙醇洗涤两次且最终DNA沉淀在甲酰胺中重新悬浮。然后在自动测序仪(来自ABI Technology的310 Genetic Analyzer)中分析样品。
实施例5
嵌合体cDNA的构建
在我们的策略中，已考虑hGH-V与hGH-N之间在氨基酸上的不同(总共13个)，其中以这样的方式在hGH-V克隆上进行改变，以至于用hGH-N cDNA一段序列替换那些氨基酸，其随后产生大肠杆菌能用的(E.coli-able)经改进的hGH cDNA产物。我们已采用在基于pUC-18的载体中先前克隆的hGH-V和hGH-N cDNA。用独特的限制酶分别消化这些克隆(pGEHV和pGEHN)以用大肠杆菌能用的(E.coli-able)hGH-N部分或合成结构替换hGH-V片断的特定区域。然后使用限制酶克隆该最终hGH-NV嵌合体互相连接该经消化的片断在NcoI/NotI位点之间连接回的TA-克隆载体中。进行限制性分析以确认在相同的基于pUC-18的TA-克隆载体中该已连接的hGH-NV嵌合体(Yanisch-Perron et al.，1985)。
在基于pUC-18的克隆载体pGEHNV上在NcoI/NotI位点进行hGH-NV cDNA嵌合体的克隆，并进入pBAD启动子(或类似启动子)(pBAD/HisA)调控的大肠杆菌表达载体和具有该载体的经转化的TOP10大肠杆菌株系中。通过在4℃-14℃温育反应混合物过夜16小时进行连接反应。为提高转化株的数量必须以此方式温育连接反应混合物。为转化，接着进行常规程序，其中在温育后将100μl-200μl转化混合物涂布在存在50μg/μl氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上。每个平板上出现超过50-70个菌落；用线性化的载体设置对照平板。在以上提到的碱裂解法的帮助下通过随后的小量DNA提取进行DNA提取。在获得推定的阳性克隆之后用NcoI/Eco24I、NheI/EheI、NcoI/XhoI、BshTI/XhoI/BstXI、BshTI/XhoI、NcoI/EcoRI进行彻底的限制酶切分析以检测插入限制酶切图。
为检测在大肠杆菌中hGH-NV的表达，我们试图将该嵌合体cDNA克隆进pBAD/HisA表达载体中。申请人对cDNA的仅部分克隆感兴趣，其代表排除26个氨基酸，分泌信号肽，的成熟肽区域。为达到这一点，在成熟肽区域的起点(引物E，SEQ ID NO：12)和终点(引物F，SEQ ID NO：13)制备基因特异引物对。同时为在载体内克隆紧接因子VIIIa和/或EK切割位点之后的成熟hGH-NV，以这样的方式设计载体片断的引物对(引物Q &R；SEQ ID NOs：17和18)以至于通过T-A克隆方法该成熟hGH-NV cDNA与载体片断部分锁定。使用此独特的策略，申请人在pBAD/HisA表达载体(或类似载体)中已获得7个hGH-NV阳性克隆。
对来自TOP10大肠杆菌表达株系(或类似株系)的六个成熟嵌合体中的两个进行详尽的限制酶切分析，证实这些克隆是通过T-A连接在载体上以正确的取向连接的推定的hGH-NV成熟cDNA克隆。需要注意的是hGH-NV(SEQ ID NO：3)序列与hGH-N序列在密码子选择、一个附加的限制酶切位点和mRNA二级结构(图3 & 4)上不同且该合成hGH-NV给出与生长激素同样的蛋白序列(图2)。
实施例6
制备多聚盒(multiple cassettes)
采用独特的策略以串连方式插入包括调控区的编码域多聚盒。这有助于提高在大肠杆菌中源自重组hGH-NV的人生长激素的表达水平，这在其表达水平上直接显示出希望的差别(图8)。这里，克隆进阿拉伯糖诱导的(或类似的诱导系统)表达载体(pABGH2)的多聚盒总共7275bp。
在此尝试中，我们的兴趣在于在可诱导的表达载体中以重复盒的形式克隆hGH成熟cDNA，以用于大肠杆菌中高水平表达。对所表达的蛋白进行彻底的分析，在SD S-PAGE上的显示正确摩尔分子量的蛋白条带，并通过蛋白质印记法(Western blotting)进一步确认N端氨基酸测序和蛋白酶切图(未发表的数据)。由于先前的克隆显示仅总大肠杆菌蛋白表达的5％，我们已集中在改进hGH Clone#1(pABGH1，)。通过应用连接和克隆的策略，我们已获得至少八个这样的阳性克隆。此独特克隆由启动子-hGH插入物-终止子盒的多个拷贝组成。通过几个限制酶分析的结合进行阳性克隆的确认。通过快速诱导试验随后通过SDS-PAGE的分析显示该表达水平比先前的hGH Clone#1(pABGH1)更高。为达到甚至更好的表达水平，使用各种诱导剂在经优化的培养基上进行诱导。
对阳性克隆进行彻底的分析。采用小量制备的DNA上的PvuI消化作为我们用于选择阳性的筛选方法。
用AccI/BshTI、BshTI/EcoRI和AccI/EcoRI消化来自hGH克隆#1(pABGH1)的大量提取的DNA，分别产生1965bp、1282bp、903bp、3717bp和470bp的DNA片断。在37℃下消化2小时之后在1.2％琼脂糖凝胶上电泳经消化的样品且纯化以上提到的条带用于连接。
限制酶消化的(pABGH1)大量制备的DNA显示经凝胶纯化的兴趣片断。用AccI/BshTI双消化的pABGH1克隆，其显示1965bp和1282bp感兴趣DNA片断用BshTII/EcoRI双消化pABGH1，其显示经纯化的903bp已消化片断用AccI/EcoRI消化pABGH1克隆。已纯化的470bp和1965bp兴趣条带这些将会被连接。
一个接一个地连接这三个DNA片断，其含有调节、hGH cDNA插入和3’-下游终止子区域。最后通过用1965bp片断连接环化此整个2655bp盒。质粒结构的总长度达到7275bp(SEQ ID NO：18，图5b)，其中以串连排列的重复盒插入的插入片断大小是2655bp。
相应地在表3中列出所有的序列(SEQ ID NOs：)
在实验室规模生产
克隆hGH-NV多聚盒进入阿拉伯糖-可诱导的表达载体的计划是为以后阶段的生产增加表达水平。此计划至少在1L范围是成功的，在合适的发酵条件下生产产量4-5g/L hGH(或更高)。在图8中给出单合成的hGH与重复盒比较的蛋白表达水平。
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27)Hirt，H.et al.(1987).The human growth hormone genelocus：Structure，evolution and allelic variations.DNA 6：59-70.
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33)Yanisch-Perron，C.，et al.Improved M13 phage cloningvectors and host strains：nucleotide sequences of theM13mp 18 and pUC19 vectors(1985)Gene 33，103-119.
34)Molecular Cloning：A laboratory Manual(2nd Edition)，publishers，Sambrook，Fritsch，Maniatis(1989).
35)Kraft，R.et al.Using mini-prep plasmid DNA forsequencing double stranded templates with Sequenase.BioTechniques(1988)6：544-547.
36)Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology (Vol.3)，copyright 1997 by John Wiley & Sons，Inc.
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42)Martial，J.A.et al.human growth hormone：complementary DNA cloning and expression in bacteria.Science；(1979)205：602-606.
本发明主要优点：
1.在原核细胞中，为更好的密码子选择，由两种同种型即hGH-V和hGH-N产生新嵌合体。
2.不使用定点诱变获得hGH-NV cDNA嵌合体。
3.更好的hGH表达，因为改进的密码子选择不使用辅助载体且不损害蛋白序列。
4.由于源自hGH-NV cDNA嵌合体的表达结构随同其来自载体的调控元件的复制，hGH表达水平的提高是可能的。
表1(引自Ausubel，F.M.et al.，1987)
 氨基酸  密码子  哺乳动物频率  ％  其它频率  脊椎动物％  酵母频率 ％  革兰氏频率  阴性菌％  革兰氏频率  阳性菌％
 Gly  GGG  16.6  22.8  14.8  20.7  5.2  9.0  9.4  12.3  9.2  13.7
 Gly  GGA  18.5  25.5  20.9  29.2  8.5  15.0  7.0  9.2  20.5  30.5
 Gly  GGU  12.8  17.6  15.2  21.3  34.9  61.0  25.1  32.9  18.2  27.2
 Gly  GGC  24.7  34.1  20.7  28.9  8.9  15.0  34.9  45.6  19.1  28.5
 Pro  CCG  6.8  11.2  6.0  11.0  4.1  9.0  23.7  54.4  10.8  30.3
 Pro  CCA  16.5  27.3  16.7  30.4  21.9  49.0  7.4  17.1  10.3  28.9
 Pro  CCU  17.4  28.8  15.7  28.6  12.7  29.0  6.6  15.2  11.9  33.2
 Pro  CCC  19.7  32.7  16.4  30.0  5.7  13.0  5.8  13.3  2.7  7.6
 Stop  UAA  1.0  23.2  1.4  28.0  1.0  49.0  1.8  57.2  2.1  65.6
 Stop  UAG  0.7  17.2  0.7  13.8  0.4  17.0  0.3  9.7  0.5  15.6
 Stop  UGA  2.6  59.6  2.9  58.1  0.7  34.0  1.0  33.2  0.6  18.9
 Phe  UUU  15.3  40.7  14.6  44.2  22.7  53.0  17.1  47.5  27.3  68.0
 Phe  UUC  22.3  59.3  18.4  55.8  20.0  47.0  18.9  52.5  12.8  32.0
表2
 24小时   48小时     72小时
 对照  1.25×105+/-0.11   1.72×105+/-0.27     2.05×105+/-0.11
 0.1ng Novo Nordisk  1.72×105+/-0.18   5.07×105+/-0.55     5.30×105+/-0.92
 1ng Novo Nordisk  1.73×105+/-0.06   6.50×105+/-0.45     10.12×105+/-0.27
 10ng Novo Nordisk  1.79×105+/-0.27   8.37×105+/-0.73     16.35×105+/-1.15
 按照本发明的新方法生产的0.1ngGH 1.49×105+/-0.11 2.53×105+/-0.29 5.20×105+/-0.66
 按照本发明的新方法生产的1ngGH 2.04×105+/-0.22 5.90×105+/-0.42 11.8×105+/-0.74
 按照本发明的新方法生产的10ngGH 1.95×105+/-0.22 9.1×105+/-0.44 19.05×105+/-1.73
表3
    SEQ IDNO： 序列名称     序列长度(核苷酸/多肽)   位置
    1. hGH-V(cDNA)     694   1-694
    2. hGH-N(cDNA)     723   1-723
    3. hGH-NV(嵌合体)     728   1-728
    4. 591-NV     591   119-695+TAA的加入
    5. 579-NV     579   120-695
    6. 引物A     29   1-29正向引物，从5′-非翻译区开始
7. 引物B 29   反向引物以从人胎盘中扩增694bphGH-V cDNA
    8. 引物C     29   1-28正向引物，从5′-非翻译区开始
9. 引物D 27   反向引物以从人胎儿垂体中扩增723bphGH-N cDNA
    10. V的肽     217   包括26个氨基酸信号肽
    11. N的肽     217
    12. 引物E     24   在SEQ ID NO：3的120-144
    13. 引物F     30   在SEQ ID NO：3的681-695
    14. 肽NV     217   包括26个氨基酸信号肽
    15. 引物Q     17   在pBAD载体上上游序列退火
16. 引物R 18   在pBAD载体上在EK切割位点序列区域退火
    17. 引物J     31   在SEQ ID NO：3的298-328
    18. 引物K     31   在SEQ ID NO：3的388-418
    19. 引物L     31   在SEQ ID NO：3的934-963
    20. 引物M     27   在SEQ ID NO：3的744-714
    21. 引物N     30   在SEQ ID NO：3的927-953
    22. 引物O     32   在SEQ ID NO：3的1304-1335
序列表
<110>印度USV有限公司(USV Ltd.India)
帝潘威塔·麦提(Maiti，Dipanwita)
施利康德·米施拉(Shrikant，Mishra)
拉克斯米·斯利尼瓦斯·劳(Laxmi Srinivas，Rao)
米林德·普拉布哈卡尔·尼普哈德卡尔(Milind Prabhakar，Niphadkar)
阿麦德·蒙索尔·博尔伯惠亚(Ahmed Monsur，Borbhuiya)
哥内施·阿鲁那·克哈里(Ganesh Aruna，Khare)
<120>源自胎盘和脑垂体同种型的嵌合体人生长激素和获得所述嵌合体的方法
<130>PCT 018 USV
<160>22
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>694
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctgtggacag ctcaggtacc ggcaatggct gcaggctccc ggacgtccct gctcctggct    60
tttggcctgc tctgcctgtc ctggcttcaa gagggcagtg ccttcccaac cattccctta    120
tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccgtcgcc tgtaccagct ggcatatgac    180
acctatcagg agtttgaaga agcctatatc ctgaaggagc agaagtattc attcctgcag    240
aacccccaga cctccctctg cttctcagag tctattccaa caccttccaa cagggtgaaa    300
acgcagcaga aatctaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcatgg    360
ctggagcccg tgcagctcct caggagcgtc ttcgccaaca gcctggtgta tggcgcctcg    420
gacagcaacg tctatcgcca cctgaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgtgg    480
aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca atcagtccta cagcaagttt    540
gacacaaaat cgcacaacga tgacgcactg ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc    600
aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag    660
ggcagctgtg gcttctagct gcacggatcc catc                                694
<210>2
<211>723
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac agctcaccta gcggcaatgg    60
ctacaggctc ccggacgtcc ctgctcctgg cttttggcct gctctgcctg ccctggcttc    120
aagagggcag tgccttccca accattccct tatccaggct ttttgacaac gctatgctcc    180
gcgcccatcg tctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagtttgaa gaagcctata    240
tcccaaagga acagaagtat tcattcctgc agaaccccca gacctccctc tgtttctcag    300
agtctattcc gacaccctcc aacagggagg aaacacaaca gaaatccaac  ctagagctgc   360
tccgcatctc cctgctgctc atccagtcgt ggctggagcc cgtgcagttc ctcaggagtg    420
tcttcgccaa cagcctggtg tacggcgcct ctgacagcaa cgtctatgac ctcctaaagg    480
acctagagga aggcatccaa acgctgatgg ggaggctgga agatggcagc ccccggactg    540
ggcagatctt caagcagacc tacagcaagt tcgacacaaa ctcacacaac gatgacgcac    600
tactcaagaa ctacgggctg ctctactgct tcaggaagga catggacaag gtcgagacat    660
tcctgcgcat cgtgcagtgc cgctctgtgg agggcagctg tggcttctag ctgcccgggt    720
ggc                                                                  723
<210>3
<211>728
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>该序列从多聚序列中产生
<400>3
 gccatggccg cgggattctg tggacagctc aggtaccgca atggctgcag gctcccggac    60
gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg cttcaagagg gcagtgcctt    120
cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg ctccgcgccc atcgtctgca    180
ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc tatatcccaa aggaacagaa    240
gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc    300
ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca tctccctgct    360
gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct    420
ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag aggaaggcat    480
ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca    540
gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca agaactacgg    600
gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca    660
gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctagctgcac ggatcccatc aatcactagt    720
gcggccgc                                                             728
<210>4
<211>591
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>该序列从重组微生物中产生
<400>4
tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc catcgtctgc   60
accagctggc ctttgacacc taccaggagt ttgaagaagc ctatatccca aaggaacaga   120
agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgttt ctcagagtct attccgacac   180
cctccaacag ggaggaaaca caacagaaat ccaacctaga gctgctccgc atctccctgc   240
tgctcatcca gtcgtggctg gagcccgtgc agttcctcag gagtgtcttc gccaacagcc   300
tggtgtacgg cgcctctgac agcaacgtct atgacctcct aaaggaccta gaggaaggca   360
tccaaacgct gatggggagg ctggaagatg gcagcccccg gactgggcag atcttcaagc   420
agacctacag caagttcgac acaaactcac acaacgatga cgcactactc aagaactacg   480
ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga gacattcctg cgcatcgtgc   540
agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagtaact cgagtggccg c            591
<210>5
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg    60
caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag    120
aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca    180
ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg    240
ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc    300
ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc    360
atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag    420
cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac    480
gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg    540
cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagtaa                           579
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>合成序列
<400>6
cctgtggaca gctcacctag cggcaatgg                                      29
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>合成序列
<400>7
gatgggatcc gagcagctag aagccacag                                      29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>8
ccaaggccca  actccccgaa  ccactcagg                     29
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>9
gccacccggg cagctagaag ccacagc                         27
<210>10
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从重组微生物中生产的多肽
<400>10
Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala Arg Arg Leu Tyr Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Val Lys Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Leu Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Arg His Leu Lys Asp Leu Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Trp Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Asn Gln Ser Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Lys Ser
                165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
        195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>11
<211>217
<212>PRT
<400>11
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                      30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
    50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
                165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
       195                  200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
tcccaaccat tcccttatcc aggc                                            24
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gcggccactc gagttactag aagccacagc                 30
<210>14
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
    50                  55                      60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                      75              80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
    130                     135             140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
                165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
        195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gctcttctcg ctaacca     17
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cttatcgtca tcgtcgta    18
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>17
gagtatgccg gcagcagggg atcattttgc g    31
<210>18
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>18
ccccaacgga atttgtcgtc gtcgtcgtcg a    31
<210>19
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>19
gatctgtacg acgatgaaat tcccaaccat t    31
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>20
ggcactgtac aatgcgcagg aatgtct         27
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工有机体
<400>21
 cctgcgcatt gtacagtgcc gctctgtgga    30
<210>22
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>22
                                                           32
ttcagatcgg ctcccggcgg atttgtccta ct
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种如SEQ ID NO：3中所示的hGH-NV cDNA嵌合体。
2.一种由hGH-NV cDNA嵌合体编码的如SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。
3.一种含有如SEQ ID NO：3中所示的嵌合体cDNA序列的质粒载体。
4.一种含有如SEQ ID NO：5中所示的源自嵌合体的成熟cDNA序列的质粒表达载体pABGH2。
5.一种获得SEQ ID：3的新的hGH-NV cDNA嵌合体的方法，其编码人生长激素(hGH)，该所述方法包括以下步骤：
(a)自人胎盘和垂体分离总RNA，
(b)通过使用选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9的基因特异引物的反转录，扩增各自的cDNA同种型：hGH-V自人胎盘RNA和hGH-N自步骤(a)的垂体RNA，
(c)克隆步骤(b)的已扩增的cDNA同种型hGH-V和hGH-N，
(d)根据它们符合读框的翻译的ORF序列比较步骤(c)的已克隆的cDNA同种型两者的限制性内切核酸酶图谱，
(e)在特异限制性内切核酸酶位点消化步骤(c)的该已克隆的cDNA同种型，
(f)在特异限制性内切核酸酶位点，用hGH-N片段通过连接替换在步骤(e)的已消化的cDNA同种型中的该hGH-V片段特异区域以获得hGH-NV cDNA嵌合体，和
(g)在适合的质粒载体中克隆如SEQ ID NO：3中所示的hGH-NV cDNA嵌合体。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所希望的hGH-NV cDNA嵌合体的特异组合是如SEQ ID NO：3中所示的1-62bp、63-587bp和588-728bp。
7.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(e)中该特异限制性内切核酸酶选自BseMI、AatII、EcoNI、PleI、BstXI、EheI、SmII和SmaI。
8.如权利要求5所述的方法，其中该新hGH-NV cDNA嵌合体产生如SEQ ID NO：5中所示的成熟hGH cDNA。
9.如权利要求8所述的方法，其中，该SEQ ID NO：5由使用基因特异引物的cDNA扩增产生。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，该基因特异引物选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
11.根据权利要求8所述的方法，其中将源自嵌合体的SEQID NO：5的可表达结构与非GC富集序列的一段序列连接。
12.根据权利要求11所述的方法，其中与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5序列重复。
13.一种源自包含如权利要求4所述的质粒表达载体pABGH2的大肠杆菌的重组细胞。
14.一种源自包含含有如权利要求1所述的在EQ ID NO：3中所示的嵌合体cDNA序列的质粒载体的大肠杆菌的重组细胞。
15.一种用于生产合成人生长激素的方法，所述方法包括下列步骤：
a)在合适的培养基上培养包含根据权利要求4所述质粒表达载体pABGH2的重组细胞，和
b)通过已知方法，从该所述重组细胞的该培养基中重获所述的合成人生长激素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，该重组细胞源自由大肠杆菌、酵母、CHO组成的组中，优选大肠杆菌。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，质粒表达载体pABGH2含有源自嵌合体的SEQ ID NO：5的两个拷贝。
18.根据权利要求15中所述的方法，其中，含有源自嵌合体的SEQ ID NO：5的质粒表达载体pABGH2与非GC富集序列的一段序列连接。

Claims (13)

1.一种如SEQ ID NO：3中所示的hGH-NV cDNA嵌合体。
2.一种由hGH-NV cDNA嵌合体编码的如SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。
3.一种含有如SEQ ID NO：3中所示的嵌合体cDNA序列的质粒载体。
4.一种含有如SEQ ID NO：5中所示的源自嵌合体的成熟cDNA序列的质粒表达载体pABGH2。
5.一种获得SEQ ID：3的新的hGH-NV cDNA嵌合体的方法，其编码人生长激素(hGH)，所述方法包括以下步骤：
(a)自人胎盘和垂体分离总RNA，
(b)通过使用选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9的基因特异引物的反转录，扩增各自的cDNA同种型：hGH-V自人胎盘RNA和hGH-N自步骤(a)的垂体RNA，
(c)克隆步骤(b)的已扩增的cDNA同种型hGH-V和hGH-N，
(d)根据它们符合读框的翻译的ORF序列比较步骤(c)的已克隆的cDNA同种型两者的限制性内切核酸酶图谱，
(e)在特异限制性内切核酸酶位点消化步骤(c)的该已克隆的cDNA同种型，
(f)在特异限制性内切核酸酶位点，用hGH-N片段通过连接替换在步骤(e)的已消化的cDNA同种型中的该hGH-V片段特异区域，以获得希望的hGH-NV cDNA嵌合体的特异组合，和
(g)在适合的质粒载体中克隆如SEQ ID NO：3中所示的hGH-NV cDNA嵌合体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(f)中，将来自该同种型的cDNA的部分插入特异的组合中以开发为了更好的密码子选择的hGH的cDNA片段模板。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所希望的hGH-NVcDNA嵌合体的特异组合是如SEQ ID NO：3中所示的1-62bp、63-587bp和588-728bp。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(e)中的该特异限制性内切核酸酶选自BseMI、AatII、EcoNI、PleI、BstⅪ、EheI、SmlI和SmaI。
9.根据权利要求5和7所述的方法，其中，该新hGH-NVcDNA嵌合体产生如SEQ ID NO：5中所示的成熟hGH cDNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该SEQ ID NO：5由使用基因特异引物的cDNA扩增产生。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该基因特异引物选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，将源自嵌合体的SEQID NO：5的可表达结构与非GC富集序列的一段序列连接。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，与非GC富集序列的一段序列连接的源自嵌合体的SEQ ID NO：5序列重复。
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