FI70721B - Foerfarande foer framstaellning av maenskligt fibroblast-interferon som homigent protein - Google Patents

Description

GStt rBl KUULUTUSjULKA.SU

®tSF® K 'UTLÄGGN,NGSSKR,FT / U/21 C (45) Patentti r.:y3;u;ctty (51) Kv.lk.*/lnt.Cl.* C 07 K 15/26, A 61 K 45/02 (21) Patenttihakemus — PatentansAknlng 802400 (22) Hakemispäivä — AnsAknlngsdag 31 . 0 7.8 0 (FI) (23) Alkupäivä — Glltighetsdag 3 1,0 7.8 0 (41) Tullut (ulkiseksi — Blivlt offentllg 01 .02.81

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon |a kuul.julkalsun pvm. — ?6 06 86

Patent- och registerstyrelsen v ' Ansökan utlagd och utl.skriften publlcerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 31 .07.79» 14.03.80 USA(US) 62371, 130635 (71) F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesel1schaft, Grenzacherstrasse 124-184, 4002 Basel, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Heinz-Jurgen Friesen, Paterson, New Jersey, Sidney Pestka, North Caldwell, New Jersey, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä ihmisen fibroblasti-interferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina - Förfarande för framstälIning av mänskligt fibroblast-interferon som homigent protein

Keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen fibroblasti-interferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina. Menetelmässä käytetään affiniteettikromatografiaa ja suurpaine-neste-kromatografiaa (HPLC).

Interferonin keksimisestä lähtien (Isaacs ja Lindenmann vuonna 1957) on sekä leukosyyteistä että fibroblasteista eristettyä interferonia yritetty kaikkialla maailmassa eristää homogeenisena peptidinä sellaisissa määrin, että niiden avulla on mahdollista suorittaa interferonin spesifisten, sekä biologisten että kemiallisten ominaisuuksien karakterisointi ja määritys. Samalla kun useat tutkijat vaativat, että hiiren tai ihmisen interferoni on puhdistettava homogeeniseksi, ei heistä kukaan esitä yhtään klassista todistetta proteiinin homogeenisuuden puolesta tai kuvaa luultavasti puhtaita yhdisteitä.

2 70721 HPLC:n (suurpaine - nestekromatografia) käyttö proteiinien puhdistamiseen on yleisesti tunnettua. Kirjallisuudessa on erityisesti kuvattu ioninvaihto- ja ekskluusiokromatograf iaan käytettäviä pylvästyyppejä, jotka soveltuvat proteiinien puhdistukseen /esim. Regnier ja Noel, J. Chromatog. Sei. 14 (1976) 316 ja Chang et ai., Anal. Biochem, 48 (1976) 1839/. Käänteisfaasikro-matografiässä on käytetty menestyksellisesti esim. Lichrosorb RP-18-pylväitä, joiden pohjana on oktadekyyIillä modifioitu SiC^, peptidien, kuten /^-endorfiinin puhdistukseen /katso esim. Rubinstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 4969-727·

On edelleen tunnettua, että ihmisen fibroblasti-interfe-ronin puhdistukseen voidaan käyttää affiniteettikromatografiaa. Davey et ai., J. Biol. Chem. 251 (1976) 7620, kuvaavat Conca-navalin A-Sepharose 4B:n käyttöä puhdistetun ihmisen fibroblas-ti-interferonin valmistukseen. Jankowski et ai., Biochemistry 15 (1986) 5182, käyttävät Blau Dextran Sepharosea samaan tarkoitukseen. US-patenttijulkaisun 4 172 071 (de Maeyer et ai.) mukaisesti onnistuu leukosyytti- ja fibroblasti-interferonia sisältävien erilaisten raakojen liuosten puhdistus affiniteettikromatograf iällä Blau Dextran Sepharose-pylväässä, jolloin saadaan vai- g misteita, joiden spesifinen aktiivisuus on 1-5 x 10 kansainvälistä interferoni-yksikköä. Muita puhdistusvaiheita ei esitetä, ja saadut interferoni-valmisteet sisältävät vielä suuressa osassa tuotteita interferonin kaltaista aktiivisuutta, tosin ne ovat suureksi osaksi vapaita epäpuhtaista proteiineista.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen fibroblasti-in-terferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina on tunnusomaista, että A. epäpuhtaan, ihmisen fibroblasti-interferonin vesiliuos pannaan affiniteettikromatografia-pylvääseen, johon interferoni adsorboituu, interferoni eluoidaan ja se saadaan eluaatin tietyissä fraktioissa erittäin puhtaana, ja B. saadut interferoni-fraktiot pannaan HPLC-olosuhteiden mukaisesti yhteen tai useampaan puskurilla tasapainoitettuun kromatografia-pylvääseen, jonka perustana on sykloheksyyli-, fenyyli-, difenyyli-, oktyyli-, oktadekyyli- tai syanopropyyli-ryhmiä sisältävä SiC^-ymatriisi, jolloin interferoni adsorboituu 11 3 70721 ja se eluoidaan kussakin tapauksessa veden kanssa sekoittuvan liuottimen gradientilla, joka liuotin on puskuroidussa, happa-messa, vettä sisältävässä järjestelmässä, niin että interferoni saadaan eluaatin tietyissä fraktioissa yhden ainoan selväpiirteisen piikin muodossa.

Menetelmän affiniteettikromatografia-vaiheissa voidaan käyttää Concanavalin A-Sepharose 4B:tä tai Blau Dextran Sepha-rosea, jolloin viimeksimainittua pidetään parempana oleellisesti korkeampien saantojen sekä kestävämmän lopputuotteen vuoksi.

Affiniteettikromatografiän suorittamiselle voidaan antaa seuraava yleinen työohje, kun käytetään Concanavalin A-Sepharose 4B:tä: (a) 20-30 pylvääntilavuutta raakaa ihmisen fibroblasti- 4 interferonia (spesifinen aktiivisuus noin 10 yksikköä/mg), joka on Eaglen "minimalmediumissa" sisältäen 5 % vasikan sikiön seerumia, pumpataan Concanavalin A-Sepharose 4B-pylvääseen läpivir-tausnopeuden ollessa 30-60 cm/tunti; (b) pestään fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella (PPK), pH 7,2; (c) pestään PPK-0,1 M x.-metyylimannosidilla ( xi-MM) ja (d) eluoidaan PPK-0,1 M at-MM:lla, joka sisältää 50 % etyleeniglykolia (tilav./tilav.).

Vaiheen (d) jälkeen saatu, puhdistettu interferoni sisältää 7 spesifistä aktiivisuutta noin 10 yksikköä/mg saannon ollessa noin 10-30 %.

Affiniteettikromatografiän suorittamiselle voidaan antaa seuraava yleinen työohje, kun käytetään Blau Dextran Sepharosea: (a) 10-40 pylvääntilavuutta viljelmän yläpuolella olevaa 4 liuosta (1-3 x 10 yksikköä/ml, 0,2-1 mg proteiinia/ml), jonka NaCl sisältö säädetään 1,25 M:ksi lisäämällä kyllästettyä NaCl-liuosta, pumpataan pylvääseen käyttäen lineaarista läpivirtaus-nopeutta 20-40 cm/tunti; (b) pylväs pestään 5-15 pylvääntilavuudella IM NaCl/0,02-0,05 M fosfaattia ja sen jälkeen 5-15 pylvääntilavuudella 1 M NaCl/0,02-0,05 M fosfaattia, joka sisältää 15 7, (tilav ./tilav.) etyleeniglykolia (pH 7,2) ja 4 70721 (c) interferoni eluoidaan 1 M NaCl/0,02-0,05 M fosfaatilla, joka sisältää 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia (pH 7,2).

Saadun interferonin spesifinen aktiivisuus on noin 3 x 10^ yksikköä/mg, ja tässä vaiheessa sen saanto voi olla noin 80 %.

Affiniteettikromatografiässä käytettyä Blau Dextran Sepha-rosea voidaan saada kytkemällä Blau Dextrania (Dextraniin kytkettyä Cibacron Blau F3GA:a) CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen pH 9,5:ssä.

Tällä kytkemismenetelmällä, samoinkuin hartsin pesemisellä ja vanhentamisella sekä pylvään kuormittamisella sekä eluoinnilla on ratkaiseva merkitys maksimaalisten saantojen sekä erittäin puhtaan ihmisen fibroblasti-interferonin saamiseksi.

Jos interferoni on peräisin seerumittomasta elatusainees-ta, se saadaan puhtaaksi käyttämällä yhtä tai kahta työvaihetta Blau Sepharose 4B-pylväässä sekä eluointia etyleeniglykolin puskuroidulla vesiliuoksella (30-50 % tilav./tilav., pH 7,2).

Interferonin jatkopuhdistusta varten sitä käsitellään af-finiteettikromatografiän jälkeen yhden tai useamman kerran pre-paratiivisella HPLC:llä, jolloin interferonin liukoisuus on suuri ja saanto korkea. HPLC:ään käytetään pylväitä, joiden perustana on huokoinen Si02-matriisi, johon on sidottu sykloheksyyli-, oktyyli-, oktadekyyli-, fenyyli-, difenyyli- tai syanopropyyli-ryhmä. Näillä pylväillä, joita voidaan käyttää peräkkäin sekä erilaisissa pH-olosuhteissa samoinkuin voidaan eluoida orgaanisen eluentin erilaisilla gradienteilla, voidaan ihmisen fibro-blasti-interferoni puhdistaa homogeeniseksi. Interferonin homogeenisuus on saavutettu silloin, kun natriumdodekyylisulfaatti (NaDodS04)-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla saadaan yksi ainoa vyöhyke, saavutetaan vakio spesifinen aktiivisuus ja HPLC:llä saadaan yksi ainoa huippu, jolloin aktiivisuus- ja proteiinivyöhykkeet ovat yhtäpitävät.

Kaupallisesti on saatavissa kromatografia-pylväitä, joiden pohjana on epäsäännöllisen muotoinen, täysin huokoinen SiO„-mat- -5 ^ riisi (partikkelikoko noin 10 mm), joka sisältää sykloheksyyli-, oktyyli-, oktadekyyli-, fenyyli- tai syanopropyyli-ryhmiä. Erästä soveliasta HPLC-järjestelmää on kuvattu US-patenttijulkaisussa 11 70721 4 116 046 (Stanley Stein).

Keksinnön mukaisesti ihmisen fibroblasti-interferonin affiniteettikromatografiällä puhdistettu liuos pannaan vettä sisältävässä puskurissa, jonka pH on 4-8, Si02-pylvääseen. Tähän tarkoitukseen edullinen puskuri on pyridiini/muurahaishappo/vesi-seos (8:8:84, tilav./tilav.). Tavallisesti työskennellään paineen alla, edullisesti paineessa 0,34-34 MPa. Pylvääseen sidottu interferoni eluoidaan tämän jälkeen selektiivisesti ja käytetään vettä sisältävää puskuriseosta sekä veden kanssa sekoittuvan orgaanisen liuottimen gradienttia. Sopivana, veden kanssa sekoittuvana orgaanisena liuottimena tulevat ennen kaikkea kysymykseen alkano-lit, kuten n-propanoli, isopropanoli, n-butanoli, tert.-butanoli, etanoli ja metanoli. Erityisen hyvin ihmisen fibroblasti-interferonin eluointiin soveltuu propanolin ja butanolin seos.

Eluaatti fraktioidaan tavalliseen tapaan, ja yksittäisten jakeiden proteiinisisältö rekisteröidään erittäin herkän tarkis-tuslaitteen avulla. Erästä tähän soveltuvaa järjestelmää ovat kuvanneet Bohlen et ai., Anal. Biochem. 67 (1975) 430 (vrt. myös patenttijulkaisu 3 876 881).

HPLC:hen soveltuvan hartsin valinta riippuu ihmisen fibroblasti-interferonin alkuperästä ja puhtaudesta. Materiaali, joka on peräisin Concanavalin A-Sepharose-py1väästä, puhdistetaan tarkoituksenmukaisesti HPLC:n avulla sykloheksyyIillä modifioidussa SiC^-pylväässä ja tämän jälkeen oktyylillä modifioidussa Si02-pylväässä, kunnes se on homogeenista. Toisaalta Blau Dextran-pylväästä peräisin oleva aine puhdistetaan homogeenisesti yhden tai useamman työvaiheen avulla käyttämällä oktyylillä modifioitua Si02-pylvästä tai kuljettamalla aine yhden oktyylillä modifioidun sekä yhden syanopropyylillä modifioidun SiC^-pylvään läpi sekä lopuksi, tarvittaessa, yhden difenyylillä modifioidun Si02~pylvään läpi. Jos aine on peräisin valmisteesta, jossa ei ole seerumia, suoritetaan affiniteettikromatografia Blau Sepharose-4B-pylväässä, ja tällöin riittää yksi oktyylillä modifioidulla SiC>2-pylväällä suoritettu työvaihe homogeenisuuden saavuttamiseksi.

Koska ihmisen fibroblasti-interferoni on herkkä orgaanisille liuottimille, kuten propanolille, butanolille tai 2-metoksi- 6 70721 etanolille neutraalissa pH:ssa, suoritettiin kromatografia hap-pamella pH-alueella. Koska ihmisen fibroblasti-interferoni on hydrofobisempi kuin leukosyytti-interferoni ja koska edelleen muita, hydrofobisempia proteiineja on osittain puhdistetuissa fibroblasti-interferoni-valmisteissa, osoittautuu propanolin ja butanolin seos eluutioaineena parhaimmaksi HPLC:ssä käytetyissä käänteisfaaseissa. Tämän seoksen avulla oli mahdollista rajoittaa orgaanisen liuottimen tilavuutta ja saada täten vähemmän artefakteja eluaatista.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti saatu, homogeeninen ihmisen fibroblasti-interferoni eristettiin kulloinkin viimeisen HPLC-pylvään jälkeen yksittäisen huipun muodossa, ja se tuotti yhden, yksittäisen, kapean vyöhykkeen NaDodSO^-polyakryyliamidi-geelielektroforeesissa 2-merkaptoetanolin läsnäollessa. Geelin uutto tuotti yhden ainoan huipun, jolla oli virusten vastaista aktiivisuutta ja joka oli yhtäpitävä proteiinivyöhykkeen kanssa. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää kaikkia tavallisia, ihmisen fibroblasti-interferonin aktiivisuusmäärityksiä.

Homogeenisen ihmisen fibroblasti-interferonin molekyyli-paino polyakryyliamidigeelielektroforeesilla määritettynä nousi noin 20500:aan. Puhdistetun aineen spesifinen aktiivisuus oli g noin 4 x 10 yksikköä/mg.

Seuraava N-terminaalinen osittaissekvenssi voitiin määrätä homogeenisesta ihmisen fibroblasti-interferonista suoritetussa kokeessa: Met^-Ser-Tyr-Asn-Leu^-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln^-Arg-Ser-Ser- 15 19

Asn-Phe -Gin-...-Gln-Lys -...

Interferonilla on virusten ja tuumoreiden vastaista sekä immunosupressiivista aktiivisuutta. Nämä aktiivisuudet voitiin määrittää vieläpä kliinisessä mittakaavassa antamalla 1-10 x 10^ yksikköä/päivä suhteellisen epäpuhtaita valmisteita, jotka sisälsivät vähemmän kuin 1 % ihmisen interferonia. Puhdistettua, homogeenista, tämän keksinnön mukaisesti saatua ihmisen fibroblasti-interferonia voidaan käyttää samalla tavalla, kuten jo interferoni-valmisteista on tunnettua, mukauttamalla annostus lisääntyvään puhdistusasteeseen.

Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein. Kaikki yksikköinä/ml tai yksikköinä/mg ilmaistut interferonitiit- 7 7 0 7 21 terit viittaavat US National Institutes of Healthin ihmisen leukosyytti-interferoni standardiin (GO 23-901-527).

Esimerkki 1

Concanavalin A-affiniteettikromatografia 50 ml Concanavalin A-Sepharose 4B:ä (tasapainoitettu PPK:lla, pH 7,2, sisältäen 0,1 M <#-MM:a) pakattiin 50 ml:n polypropyleenipylvääseen, joka oli varustettu polyetyleeni-sint- terillä. Siihen pantiin 1,25 1 raakaa interferoniliuosta 7 4 (2 x 10 yksikköä, spesifinen aktiivisuus 2 x 10 yksikköä/mg) virtausnopeuden ollessa 180 ml/tunti (35,5 cm/tunti). Pylväs pestiin sitten 150 mlrlla PPK:a ja 600 ml PPK:a, joka sisälsi 0,1 M C&-MM. Interferoni eluoitiin lopulta yllämainitulla puskurilla, joka sisälsi 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia. Saanto 9 % 6 7 (1,8 x 10 yksikköä, spesifinen aktiivisuus noin 1 x 10 yksikköä/mg)

Huipun vyöhykkeen leveyden ollessa suurempi saatiin, ottamalla β mukaan muita jakeita»saannoksi 15 % (3 x 10 yksikköä, spesifinen aktiivisuus 2-4 x 10^ yksikköä/mg).

HPLC

Concanavalin A-Sepharose 4B-pylvään eluaattia 120 ml (2,5 x 10^ yksikköä, noin 2-4 x 10^ yksikköä/mg) pantiin virtausnopeudella 0,4 - 0,8 ml/min suoraan pylvääseen, jonka koko oli 4,6 x 300 mm ja jonka pohjana oli sykloheksyyliryhmiä sisältävä SiC^mätriisi (Chromegabond 10 μ), joka oli aiemmin tasapainoitettu pyridiini/muurahaishappo/isopropanoli/vesi-seoksella (8:8:20:64, tilav./tilav., puskuri A), ja maksimaalinen paine oli alle 306 atm (31 MPa). Systeemi vastasi olennaisesti Bohlen et ai. Anal.

Biochem. 67 (1975) 438 kuvaamaa järjestelmää.

Läpivirtausnopeudella 0,4 ml/min käytettiin seuraavaa gra-dienttia, alkaen puskurista A, puskurille B (pyridiini/muurahais-happo/isopropanoli/n-butanoli/vesi, 8:8:25:20:39, tilav./tilav.): 0-25 % B, 32 min; 25-60 % B, 225 min, 60-100 % B, 63 min. Koottiin 2,0 ml:n jakeet. Yhdistetyt jakeet 26-29 (2 x 106 yksikköä) laimennettiin 4 ml:11a pyridiini/muurahaishappo-seosta ja pantiin suoraan pylvääseen, jonka koko oli 4,6 x 300 mm ja jonka pohjana oli oktyyli-ryhmiä sisältävä SiC>2“inatriisi (Chromegabond 10 μ) . Se eluoitiin sykloheksyyli-pylväälle ilmoitetuissa olosuhteissa. Spesifinen 70721 o aktiivisuus aktiivisuushuipun keskellä oli noin 4 x 10 yksik-köä/mg puhdistetun ihmisen fibroblasti-interferonin kokonaissaannon ollessa 10^ yksikköä.

Concanavalin A-pylväässä puhdistettu interferoni eluoidaan HPLC:n avulla sykloheksyyli- tai oktyyli-ryhmiä sisältävässä pylväässä. Kun eluoidaan HPLC:llä ensin oktyyli-pylväässä, niin interferoni eluoituu suoraan ennen päähuippua, kun se taas, käytettäessä sykloheksyylipylvästä ensimmäisenä pylväänä, eluoituu välittömästi pääpiikin jälkeen. HPLC:llä puhdistetun ihmisen fibroblasti-interferonin näytteet tutkittiin elektroforeesilla, jossa käytettiin 12,5 tai 15 %:ista NaDodSO^-polyakryyliamidi-geeliä Tris/glysiinipuskurissa (1 mg proteiinia). Coomassie Blaulla (sinisellä) suoritetun värjäyksen jälkeen saatiin yksi ainoa vyöhyke. Määrittämällä virusten vastainen aktiivisuus todettiin, että pääosa tästä aktiivisuudesta oli värjäytyneen vyöhykkeen keskustassa. Molekyylipainoksi saatiin noin 20 500 käyttämällä naudan-seerumin albumiinia, kymotrypsiiniä, sytokromi c:tä ja ribonukleaa-sia vertailuaineina. Ihmisen fibroblasti-interferoni-vyöhykkeen suhteellinen liikkuvuus ei ollut riippuvainen merkaptoetanolin läsnäolosta näytteessä.

Esimerkki 2

Blau Dextran-Sepharose 4B-pylvään valmistus 50 g kuormitettua Sepharose 4B:tä pestiin 1 1:11a vettä, ja suspendoitiin vielä kerran 50 ml:aan tislattua vettä. Lisättiin 15 g hienojakoista CNBr:a kevyesti sekoittaen ja pH-arvo säädettiin ll-0,2:een lisäämällä pisaroittain 10N NaOHita. Lämpötila pidettiin jäitä lisäämällä 20- 5°C:ssa. 15-20 minuutin kuluttua sekoitettiin yhden tilavuuden kanssa jäävettä, ja suspensio pestiin Buchner-suppilossa vielä kerran 5 tilavuudella 0,01 N HCl:a.

Aktivoitu hartsi suspendoitiin heti 50 ml:aan 0,4 M natrium-karbonaattipuskuria (pH 9,5), joka sisälsi 1,00 g liuotettua Blau Dextrania, ja ravistettiin yön yli 4°C:ssa pyöreäpohjäisessä pullossa. Se pestiin 10 tilavuudella 1 M NaC'l:a, 2 tilavuudella 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia, joka sisälsi 1 M NaCl:a ja 0,05 M natriumfosfaattia (pH 7,2), jätettiin seisomaan yön yli 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykoliin, pestiin yhdellä tilavuus- n 70721 9 osalla 80 %:ista (tilav./tilav.) etyleeniglykolla ja 5 tilavuudella Gibco nro 11 minimaalielatusainetta (MEM) ja säilytettiin tässä elatusaineessa yli yön 5Q°C:ssa. Pestiin vielä 3 tilavuudella 80 %:ista (tilav./tilav.), vettä sisältävää etyleeniglykolia, joka sisälsi 1 M NaCl:a ja tämän jälkeen 2 tilavuudella MEM:a, minkä jälkeen hartsi lietettiin MEM:hen ja siirrettiin pylvääseen .

Affiniteetti-kromatografia

Seos, jossa oli 1,5 1 raakaa ihmisen fibroblasti-interfero- 4 nia (2 x 10 yksikköä/ml, 1 mg proteiinia/ml, spesifinen aktiivisuus 4 2 x 10 yksikköä/mg proteiinia) ja 0,27 tilavuutta kyllästettyä NaCl-liuosta (noin 6,3 M) pantiin 50 ml:n polypropyleenipylvääseen, jossa oli polyetyleenisintteri ja joka sisälsi 35 ml Blau Dextran-Sepharose 4B:tä, käyttäen läpivirtausnopeutta 100 ml/tunti (20 cm/ tunti) . Pylväs pestiin peräkkäin 200 ml :11a 1 M NaCl:a, joka sisälsi 0,05 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,2) sekä 500 ml :11a 1 M NaCl:a, joka sisälsi 0,05 M natriumfosfaattia (pH 7,2) sekä 75 ml:11a etyleeniglykolia sekä lopuksi eluoitiin 500 ml :11a 1 M NaCl:a, joka sisälsi 0,05 M natriumfosfaattia (pH 7,2) sekä 250 ml :11a etyleeniglykolia. Noin 90 % interferonista eluoitui yhdessä ainoassa piikissä 50 % etyleeniglykolia sisältävän liuottimen adsorptiosyklin kriittisessä pisteessä. Spesifinen aktiivisuus piikin huipussa, jossa oli enemmän kuin 50 % koko interferonista, oli noin 1 x 10^ yksikköä/mg.

HPLC

(A) 125 ml Blau Dextran-Sepharose 4B-pylväästä eluoitua 7 7 interferoni-liuosta (3 x 10 yksikköä, 1 x 10 yksikköä/mg), pumpattiin 4,6 x 300 mm:n pylvääseen, jonka pohjana oli oktyyli-ryhmiä sisältävä Si02~matriisi (Chromegabond 10 p) , joka oli esitasapainoi--tettu 1 M NaCl/50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykoli-seoksella. Virtausnopeudella 0,45 ml/min, lähtien puskurista A (pyridiini/ muurahaishappo/isopropanoli/n-butanoli/vesi, 8:8:20:3,3:60,7 tilav./ tilav.), pidettiin yllä seuraavaa gradienttia siirtymällä puskuriin B (pyridiini/muurahaishappo/isopropanoli/n-butanoli/vesi, 8:8:25:20:39, tilav./tilav.): 0-25 % B, 30 min; 25-55 % B, 190 min; 55-100 % B, 20 min, 100 % B, 60 min. Interferoni-aktiivisuus oli 70721 10 olennaisesti yhtäpitävä fraktioissa 18-23 (jokainen fraktio sisälsi 1,5 ml eluutioliuosta) sijaitsevan yhden ainoan proteiini-piikin kanssa.

(B) Kun applikoitiin noin neljäsosa vaiheessa (A) aplikoi-dusta määrästä samaan pylvääseen sykloheksyyli-pylväälle esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa, interferoni-aktiivisuus oli yhtäpitävä fraktioissa 24-26 sijaitsevan yhden proteiinipiikin kanssa.

(C) Käyttämällä samanlaisia olosuhteita kuormituksen, gradientin sekä virtausnopeuden suhteen kuten (A):ssa sekä samanlaisia puskureita A ja B kuten (B):ssä oktyyliryhmiä sisältävässä pylväässä (9,6 x 500 mm, Chromegabond), niin että tuloksena oli 1/9 kuormituksesta kolonnin tilavuutta kohti, saavutettiin parempi erottumiskyky.

(D) Aine, jolla oli menetelmävaiheessa (A) suurin spesifi- 0 nen aktiivisuus (4 x 10 yksikköä/mg) kromatografoitiin uudelleen syanopropyyliryhmiä sisältävässä pylväässä käyttäen pyridiini/muu-rahaishappo/vesi (8:8:84 tilav./tilav.)-eluenttia ja yksituntista gradienttia n-propanolin (0-40 %, tilav./tilav.) suhteen, virtausnopeuden ollessa 0,3 ml/min. Saatiin symmetrinen pääpiikki.

NaPodSO^-polyakryyliamidi-geelielektroforeesi

Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla interferoninäytteistä, jotka saatiin menetelmävaiheessa (A), (B) ja (C), suoritettu elektro foreesi tuotti päävyöhykkeen, jonka molekyylipaino oli 20 000 ja joka interferonin aktiivisuuden määrityksessä piti yhtä aktiivisuus-piikin keskuksen kanssa. Toinen vyöhyke, jonka molekyylipainoksi osoittautui noin 10 500 ja jossa oli väri-intensiteettiin nähden 20-50 % koko materiaalista, vaihteli näytteestä toiseen, eikä sillä ollut virusten vastaista aktiivisuutta. Kun näytteitä ei käsitelty merkaptoetanolilla, havaittiin vyöhyke, jonka molekyylipaino oli 40 000, mutta jolla oli vain toissijaista aktiivisuutta. Vyöhykkeiden, joiden molekyylipainot olivat 20 000 ja 40 000, aminohappo-analyysit eivät eronneet toisistaan, kun taas sen vyöhykkeen, jonka molekyylipaino oli 10 000, analyysi oli hyvin selvästi erilainen.

70721 11

Menetelmän (D) mukaan saadun interferoni-nävtteen elektroforeesi tuotti yhden vyöhykkeen, jonka molekyylipaino, joka oli noin 20 500, sekä spesifinen aktiivisuus 4 x 10“ yksikköä/mg.

Tämän homogeenisen peptidin aminohappoanalyysi tuotti 24-tuntisen, 6N HCl:ssä suoritetun hydrolyysin jälkeen, seuraavat, leusiinin 25,0:aan verratut arvot:

Asx 15,4 - 0,2 Ala 11,8 - 0,4 Tyr 9,6 - 0,2

Thrx 7,8 - 0,3 Cys ei määritetty Phe 7,3 - 0,1

Serx 7,7 - 0,2 Vai 6,9 - 0,1 His 4,5 - 0,1

Glx 24,1 - 0,4 Met 2,8 - 0,4 Lys 11,6 - 0,4

Pro 2,8 - 0,4 Ile 8,7 - 0,1 Arg 8,8 - 0,4

Gly 4,9 - 0,3 Leu 25,0 Trp ei määritetty x korjattu arvo

Esimerkki 3

Blau Dextran-Sepharose-affiniteettikromatografia (a) 5 1 viljelmää, joka sisälsi 19 400 yksikköä/ml fibro-blasti-interferonia, suodatettiin 0,3 μ:η suodattimen läpi ja pantiin sitten pylvääseen, jossa oli 275 ml Blau Dextran-Sepharo-sea. Liuoksen NaCl-konsentraatio säädettiin ennen pylvääseen panoa 1,25 M:ksi NaCl:a lisäämällä 1350 ml kyllästettyä NaCl-liuosta (6,3 M), ja se pumpattiin pylvääseen läpivirtausnopeudella 360 ml/ tunti. Noin 4-6 % interferonista kulki pylvään kautta adsorboitumatta siihen.

(b) Pylväs pestiin sitten läpivirtausnopeudella 420 ml/tun-ti 1300 ml :11a vesiliuosta, joka sisälsi 15 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia, 1 M NaCl:a sekä 0,02 M natriumfosfaattia (pH 7,2). Noin 1 % adsorboituneesta interferonista eluoitui pylväästä.

(c) Interferoni eluoitiin sitten läpivirtausnopeudella 420 ml/tunti käyttäen vesiliuosta, joka sisälsi 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia, 1 M NaCl:a ja 0,02 M natriumfosfaattia (pH 7,2). Eluaatin ensimmäisen 200 ml:n mukana eluoitui vähän interferonia. Suurin osa interferonista eluoitui eluaatin seuraavaa 300 ml:n mukana, kuten seuraava taulukko osoittaa: 12 70721

Fraktio Fraktio Proteiini Interferoni- Spesif. aktiivi- nro. tilavuus Λ L.. . suu<? /ml7 /vig/ml/ tiitteri suus Z /yks./ml/ /yks./mg/ 1 200 ei määritetty 122 2 50 43 3,8 x 105 9,02 x 106 3 50 82 11,64 x 105 1,42 x 107 4 50 63 7,72 x 105 1,23 x 107 5 50 62 1,94 x 105 3,13 x 106 6 50 49 9,7 x 104 1,97 x 106 7 50 41 3,64 x 104 8,87 x 105

Hyväksikäytetystä interferoniaktiivisuudesta saatiin kaikkiaan 114 % takaisin.

HPLC

Blau Dextran-Sepharose-kolonnin fraktiot 2-6 (250 ml; 7 6 13 x 10 yksikköä, spesifinen aktiivisuus 8,12 x 10 yksikköä/mg) pumpattiin pylvääseen (9,5 x 500 mm), jonka pohjana oli oktyyli- ryhmiä sisältävä SiC^-matriisi, ja käytettiin läpivirtausnopeutta 4 ml/min. 12 minuutin aikana pumpattiin puskuria A (pyridiini/ muurahaishappo/2-propanoli/n-butanoli/vesi, 8:8:20:2,5:61,5, tilav./tilav.) läpivirtausnopeudella 2 ml/min pylvään läpi. Tämän jälkeen eluoitiin puskurin B suhteen (pyridiini/muurahaishappo/1- propanoli/n-butanoli/vesi, 8:8:25:25:34, tilav./tilav.) seuraavin gradientein käyttäen virtausnopeutta 1,25 ml/min : 0-20 % B, 18 min, 20-29 % B, 57 min; 29 % B isokraattisesti 27 minuutin aikana; 29-30 % B, 3 min; 30-100 % B, 36 min; 100 % B, 54 min.

Interferoni-aktiivisuus eluoitiin gradientin isokraattisella alueella ja vieläpä yhdessä piikin kanssa, joka havaittiin

Fluorescamin-tarkkailu-järjestelmän avulla. 45 x 10^ yksikköä inter- g feronia (saanto 35 %), jonka spesifinen aktiivisuus oli 2 x 10 yksikköä/mg, yhdistettiin pooliksi (50 ml). Kaksi kuukautta kestäneen säilytyksen jälkeen -20°C:ssa, suljetussa polypropyleeni-ampullissa oli aktiivisuus laskenut 10 %:iin HPLC:n jälkeisestä aktiivisuudesta. Proteiinitappiota ei ilmennyt.

n 70721 13 Tämä 50 ml:n suuruinen pooli (spesifinen aktiivisuus noin g 0,2 x 10 yksikköä/mg) laimennettiin 1 ml :11a tiodiglykolia ja 20 ml:11a n-propanolia. Määrityksen perusteella tämä seos sisälsi kaikkiaan 4,26 x 10^ yksikköä. Seokseen lisättiin 100 ml 0,1 %

Triton X-100/0,3 % tiodiglykoli-seosta. Tämä seos, joka määrityk- g sen mukaan sisälsi kaikkiaan 5,1 x 10 yksikköä, pumpattiin 30 minuutin kuluessa pylvääseen, jonka pohjana oli CN-ryhmiä sisältävä g

SiC^-matriisi (4,6 x 250 mm, 5 p/8 x 10 mm, Spherisorb) ja joka oli tasapainoitettu pyridiini/muurahaishappo/vesi-seoksella (8:8:84, tilav./tilav., puskuri A). Käytettiin seuraavaa gradient-tia puskurin B suhteen (pyridiini/muurahaishappo/n-propanoli/vesi, 8:8:50:34, tilav./tilav.) sekä virtausnopeutta 0,5 ral/min: 0-25 % B, 30 min; 25-50 % B, 210 min. Interferoni-aktiivisuus eluoitui ainoan määritetyn piikin mukana. 4,2 x 106 yksikköä (82 %) saatiin takaisin kolmessa 1 ml:n fraktiossa.

Tämä pooli, joka muodostaa 69 % ensimmäiseen CN-pylvääseen pannusta proteiinin kokonaismäärästä, sekoitettiin 2 ml:n kanssa 0,1 % Triton X-100:a ja pantiin vielä kerran samaan CN-pylvääseen.

Se eluoitiin samoja gradientteja käyttäen puolessa ajassa. Kokonais- g aktiivisuus (11,75 x 10 yksikköä, saanto 280 %) eluoitui yhdessä ainoassa piikissä.

Toisen CN-pylvään interferoni-aktiivisuutta sisältävät fraktiot (4 ml) pumpattiin virtausnopeudella 1,5 ml/min pylvääseen, jonka koko oli 4,6 x 250 mm, ja jonka pohjana oli difenyyli-ryhmiä sisältävä Si02-matriisi ja joka aiemmin oli käsitelty kaksituntisella, lineaarisella gradientilla puskurista A puskuriin B (sama puskuri kuin CN-pylväälle) sekä tasapainoitettu puskurilla A.

Käytettiin seuraavaa gradienttia sekä virtausnopeutta 0,5 ml/min: 0-25 % B, 22 min; 25-50 % 98 min. Toinen piikki, joka eluoitui, kun gradienttilaite osoitti 33 %:a puskuria B, piti yhtä interferoni-aktiivisuus-piikin kanssa. Tämän piikin mukana eluoitui kaikkiaan 2,6 x 10^ yksikköä (22 %) sekä 40 mg proteiinia.

Difenyyli-ryhmiä sisältävä Si02-pylväs valmistettiin seuraa-valla tavalla: -2 -5

Si02:a (10 mm, 10 mm huokoskoko) liuotettiin pehmeäksi 6N HCl:ssa (10:1, tilav./paino) 24 tunnin ajan sopivasti ravistellen. Sitten se pestiin vedellä neutraaliksi, ja tämän jälkeen vesi poistettiin pesemällä asetonilla ja metanolilla. Yli yön alennetussa 14 70721 paineessa suoritetun kuivauksen jälkeen palautusjäähdytettiin piihappoa (10 g) 6 tunnin ajan 100 ml:ssa kuivaa tolueenia, joka sisälsi 10 ml diklooridifenyylisilaania. Näin muunneltu piihappo pestiin seuraavaksi 200 ml:11a tolueenia ja tämän jälkeen Soxhlet-uuttimessa peräkkäin 250 ml:11a tolueenia, asetonia sekä metano-lia kulloinkin 8 tunnin ajan. Lopuksi käsiteltiin trimetyylikloo-risilaanilla edellä kuvatulla tavalla.

Sitten suspendoitiin 3 g:n kantaja-aine eriä kukin 10,7 ml:aan kloroformia ja 2,3 ml:aan n-butanolia, ja täytettiin 340 atm:n (34 MPa) paineessa ruostumattomasta teräksestä valmistettuja pylväitä, joiden koko oli 4,6 x 250 mm. Pylväät pestiin tämän jälkeen 75 ml:11a etanolia.

Saadun interferoni-piikin keskifraktion aminohappoanalyysit tuottivat 5,7 N HClrssä suoritetun hydrolyysin jälkeen seuraavat tulokset:

Asx 15,4 17,6 17,95 15,2 Thr* 7,8 8,6 8,4 7,3 Ser* 7.7 8,3 9,1 9,9 Glx 24,1 21,1 21,4 n.b. Pro 2.8 n.b. n.b. 3,36 Gly 4.9 6,9 6,6 7,4 Ala 11/8 10,7 10,7 9,9 Cys n.b. 3,96 3,4 n.b. Vai 6.9 7,84 8,2 6,9 Met 2,8 4,5 4,5 3,7 Ile 8.7 8,6 8,9 7,8 Leu _xx uxx -cxx 1cxx m 25,0 25 25 25 Tyr 9,6 10,3 9,0 8,1 Phe 7,3 9,5 9,8 9,0 His 4,5 7,5 6,9 6,1 Lys 11,6 12,3 11,8 11,25 Arg 8.8 11,25 10,6 8,8 Trp n.b. n.b. n.b. 2,93 24 h. 24 h. 48 h. 24 h.

TGS TGS TGS TGS

TGS tioglykolihappo x korjaamaton arvo xx vertailuarvo n.b. ei määritetty

II

70721 15 6-, 14- ja 24-tuntisen, 5,7 N HCl:lla, joka sisälsi 0,02 % tioglykolihappoa, 110°C:ssa suoritetun hydrolyysin jälkeen, kun käytettiin difenyylipylväästä saadun interferoni-piikin keski-fraktiota, kaksoisamiinianalyysi tuotti 3 glukosamiinitähdettä molekyyliä kohti.

Ei löydetty galaktosamiinia eikä raannosamiinia.

Pääteryhmämääritys tehtiin 90 p molaarisella näytteellä difenyyli-pylväästä saadun interferoni-piikin keskifraktiosta, ja määrityksen perusteella Met oli N-terminaalinen aminohappo.

150 pmolaariset sekä fibroblasti- että leukosyytti-inter-feroni-näytteet pilkottiin trypsiinillä ja kromatografoitiin. Kummastakaan näytteestä ei löydetty yhtään identtistä peptidifragmenttia.

Määrittämällä 1,25 nmolaarisen fibroblasti-interferonin sekvenssi valmistettiin Met N-terminaaliseksi aminohapoksi, samoin todettiin oikeaksi Hunkapillarin ja Hoodin, Biochemistry 17, 3 (1978) 2124 esittämä sekvenssi 3-10, nimittäin Tyr -Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln^. Sekvenssin määrittäminen eräästä toisesta 5,9 nmolaarisesta fibroblasti-interfer:oninäytteestä tuotti seuraavan N-terminaalisen aminohapposekvenssin: H„N-Met^-Ser-Tyr-Asn-Leu^-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln^°-Arg- ά 15 19

Ser-Ser-Asn-Phe -Gin-... -Gln-Lys -...

Esimerkki 4

Raaka interferoni saatiin ihmisen fibroblasteista (solu-linja GM 2504A). Raaka materiaali tehtiin 1 molaariseksi natrium-kloridin suhteen lisäämällä kyllästettyä natriumkloridiliuosta.

Tämä materiaali laskettiin Blau Sepharose-4B -ny1vään läpi (tilavuus 20-25 ml), läpimitta 2,5 cm, läpivirtausnopeus 2,5 ml/min). Kuormituksen aikana raaka materiaali jäähdytettiin jäiden avulla. Kuormituksen jälkeen pylväs pestiin 250 ml :11a seuraavaa liuosta (2,5 ml/min): 30 % etyleeniglykolia, 1 M NaCl, 50 mM Na2HP0^ (pH 7,2).

Lopuksi interferoni eluoitiin virtausnopeudella 2,5 ml/min käyttäen 250 ml seuraavaa liuosta: 7 0 7 21 16 50 % etyleeniglykolia, 1 M NaCl:a, 50 mM Na2HPC>4 (pH 7,2).

Määritykselle luonteenomaiset tulokset olivat: 5 % aktiivisuudesta läpivirtauksessa 10 % aktiivisuudesta 30 %:isessa etyleeniglykoli-liuoksessa 85 % aktiivisuudesta 50 %:isessa etyleeniglykoli-liuoksessa

Ensimmäisen Blau Sepharose-pylvään interferoni-piikin fraktiot koottiin yhteen ja seuraavan liuoksen kanssa etyleeniglykoli-pitoisuus säädettiin 10 %:ksi (tilav./tilav.): 2 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Tämä materiaali pantiin Blau Sepharose-pylvääseen (tilavuus 29-25 ml, läpimitta 2,5 cm, läpivirtausnopeus 2,5 ml/min). Se pestiin 250 ml :11a liuosta, joka sisälsi 2 M NaCl:a, 50 mM Na^HPO^ja (pH 7,2) sekä 30 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia sekä eluoitiin liuoksella, jossa oli 2 M NaCl:a, 50 mM Na2P04:a (pH 7,2) sekä 50 % (tilav./tilav.) etyleeniglykolia.

Interferoni-määrityksen luonteenomaiset tulokset olivat: 10 % aktiivisuutta läpivirtauksessa 30 % aktiivisuutta 30 %:isessa etyleeniglykoli-liuoksessa 60 % aktiivisuutta 50 %:isessa etyleeniglykoli-liuoksessa

HPLC

Seuraavaksi tutkittiin Blau Sepharosea 50 %:isen (tilav./tilav.) etyleeniglykolieluaatin näyte, öitä seurasivat näytteet, jotka pantiin kaksi kertaa Blau Sepharose-pylvääseen, missä tapauksissa voitiin käyttää 30 %:ista tai 50 %:ista etyleeniglykoli-eluaattia.

Käytettiin pylvästä, jonka koko oli 25 x 0,46 cm ja jonka pohjana oli oktyyliryhmin modifioitu Si02~matriisi (Lichrosorb RP-8). Seuraavaksi pylväs pestiin vedellä ja kuormitettiin sitten Blau Sepharose-pylvään eluaatilla. Pumpun eteen kytkettiin sekoi-tuskammio (5 ml). Työskenneltiin läpivirtausnopeudella 22 ml/tunti käyttäen seuraavaa, asteittaista n-propanolin gradienttia vakio pH 4,2:ssa, joka saatiin aikaan 1 M muurahaishappo/0,8 M pyridiini-suhteen avulla: 70721 17 O % 10 min, 30 % 40 min; 32 % 40 min.

Lopuksi pylväs pestiin 60 %:isella n-propanolilla ja tasapainoitettiin ennen seuraavaa käyttöä 1 M muurahaishapolla ja 0,8 M pyridiinillä.

Interferoni eluoitiin 32 %:isella n-propanoli-eluaatilla (80. ja 90. minuutin välillä). Tämä materiaali oli homogeenista NaDodS04-akryyliamidi-geelielektroforeesin perusteella (värjäys Coomassie Blaulla tai näytteen edeltävä merkitseminen fluramilla).

Aminohappoanalyysi (24-tuntinen hydrolyysi, 0,2 % TGS (= tioglykolihappo), 5,7 N HC1) suoritettiin yhdeksästä uudesta erilaisesta näytteestä, jotka oli otettu neljästä erilaisesta valmisteesta. Keskimääräinen aminohappokoostumus leusiinin arvon 22,0 suhteen käy ilmi seuraavasta taulukosta.

Asx 15,1 - 0,7 Met 4,5 - 0,7

Thrx 7,0 - 0,5 Ile 9,4 - 0,1

Ser* 7,5 - 0,5 Leu 22,0

Gly 22,2 - 0,5 Tyr 8,8 - 0,2

Pro ei määritetty Phe 8,0 - 0,3

Cys 3,0 - 0,3 His 4,5 - 0,1

Gly 6,9 - 0,7 Lys 11,0 - 0,6

Ala 7,4 - 1,0 Arg 11,9 - 0,7

Vai 5,7 - 0,5 Trp ei määritetty x korjaamaton arvo

Eri näytteistä (24-tuntinen hydrolyysi 6N HCl-.ssa 0,2 % tioglykolihapon, TGS kanssa), jotka oli saatu tässä sekä edellä esitetyssä esimerkissä kuvatuilla menetelmillä, eri aikoina suoritettujen analyysien perusteella homogeenisella ihmisen fibroblasti-interferonilla on seuraava aminohappokoostumus (- 15 %).

Asx 15,1 Gly 6,9 Tyr 8,8

ThrX 7,0 Ala 7,4 Phe 8,0

SerX 7,5 Vai 5,7 His 4,5

Glx 22,2 Met 4,5 Lys 11,0

Pro 3,0 Ile 9,4 Arg 11,9

Cys 3,0 Leu 22,0 Trp 3,0 x korjaamaton arvo xx vertailuarvo 18 70721

Esimerkki 5

Homogeeninen ihmisen fibroblasti-interferoni (1,5 mg), 0 jonka spesifinen aktiivisuus oli 4 x 10 yksikköä/mg, liuotettiin 25 ml:aan 5 %:ista normaalia ihmisen seerumialbumiinia. Liuos suodatettiin bakteriologisella suodattimena ja jaettiin 100 aseptiseen ampulliin. Jokainen ampulli sisälsi : 6 x 106 yksikköä interferonia, joka soveltui parenteraaliseen annosteluun. Ampullit säilytettiin käyttöön saakka etupäässä kylmässä (-20°C:ssa).

Claims (12)

19 70721

1. Menetelmä ihmisen fibroblasti-interferonin valmistamiseksi homogeenisena proteiinina, tunnettu siitä, että A. epäpuhtaan, ihmisen fibroblasti-interferonin vesiliuos pannaan affiniteettikromatografia-pylvääseen, johon interferoni adsorboituu, interferoni eluoidaan ja se saadaan eluaatin tietyissä fraktioissa erittäin puhtaana, ja B. saadut interferoni-fraktiot pannaan HPLC-olosuhteiden mukaisesti yhteen tai useampaan, puskurilla tasapainoitettuun kromatografia-pylvääseen, jonka perustana on sykloheksyyli-, fenyyli-, difenyyli-, oktyyli-, oktadekyyli- tai syanopropyyli-ryhmiä sisältävä SiC^-matriisi, jolloin interferoni adsorboituu ja se eluoidaan kussakin tapauksessa veden kanssa sekoittuvan liuottimen gradientilla, joka liuotin on puskuroidussa, happames-sa, vettä sisältävässä järjestelmässä, niin että interferoni saadaan eluaatin tietyissä fraktioissa yhden ainoan selväpiirteisen piikin muodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että A. epäpuhtaan, ihmisen fibroblasti-interferonin vesiliuos pannaan affiniteettikromatografia-pylvääseen, johon interferoni adsorboituu, interferoni eluoidaan ja saadaan eluaatin tietyissä fraktioissa erittäin puhtaana, ja B. saadut interferoni-fraktiot pannaan HPLC-olosuhteiden mukaisesti yhteen tai useampaan puskurilla tasapainoitettuun kromatograf ia-pylvääseen , jonka perustana on sykloheksyyli-, fenyyli-, oktyyli-, oktadekyyli- tai syanopropyyliryhmiä sisältävä SiC^-matriisi, jolloin interferoni adsorboituu ja se eluoidaan kulloinkin veden kanssa sekoittuvan liuottimen gradientilla, joka liuotin on puskuroidussa, happamessa, vettä sisältävässä järjestelmässä, niin että interferoni saadaan yhden ainoan selväpiirteisen piikin muodossa eluaatin tietyissä fraktioissa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että suoritetaan affiniteettikromatografia Concanavalin A-Sepharosella sekä HPLC ensin sykloheksyyli-ryhmiä sisältävässä 20 7 0 7 21 Si02-pylväässä nousevilla n-butanolin gradienteilla pyridiini/ muurahaishappo/2-propanoli/n-butanoli/vesi-seoksessa sekä tämän jälkeen oktyyli-ryhmiä sisältävässä Si02~pylväässä samoissa olosuhteissa .

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että HPLC:n yhteydessä eluenttina käytettävän seoksen lähtökoostumus on 8:8:20:0:64, tilav./tilav. ja sen loppukoostumus on 8:8:25:20:39, tilav./tilav.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että suoritetaan affiniteettikromatografia Blau Dextran-Sepharosella sekä HPLC oktyyliryhmiä sisältävässä SiC>2“ pylväässä nousevilla n-butanoli-gradienteilla pyridiini/muura-haishappo/2-propanoli /n- butanoli/vesi-seoksessa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että HPLC:n yhteydessä eluenttina käytettävän seoksen lähtökoostumus on 8:8:20:3,3:60,7, tilav./tilav., ja sen loppu-koostumus on 8:8:25:20:39, tilav./tilav.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että oktyyli-ryhmiä sisältävästä Si02~pylväästä eluoi-tuvat, yhdistetyt interferoni-aktiiviset fraktiot tämän jälkeen uudelleen kromatografoidaan syanopropyyli-ryhmiä sisältävässä SiC^-pylväässä nousevilla n-propanoli-gradienteilla pyridiini/muu-rahaishappo/n-propanoli/vesi-seoksessa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että eluenttina käytettävän seoksen lähtöainekoostumus on 8:8:0:84, tilav./tilav. ja sen loppukoostumus on 8:8:40:44, tilav./tilav.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että HPLC:n yhteydessä eluenttina käytettävän seoksen lähtöainekoostumus on 8:8:20:0:64, tilav./tilav. ja sen loppukoostumus on 8:8:25:20:39, tilav./tilav.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että syanopropyyliryhmiä sisältävästä Si02~pylväästä eluoidut, yhdistetyt interferoni-aktiiviset fraktiot uudelleen kromatografoidaan samanlaisessa pylväässä ja kromatografoidaan tämän jälkeen uudelleen difenyyli-ryhmiä sisältävässä SiC^-pyl-väässä. Il 2i 70721

11. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että raa'alle ihmisen fibroblasti-interferonille, joka on peräisin seerumittomasta valmisteesta, suoritetaan affi-niteettikromatografia Blau Sepharose 4B:llä sekä HPLC oktyyli-ryhmiä sisältävässä SiC^-pylväässä käyttäen pyridiini/muurahais-happo/n-propanoli/vesi-seosta sekä epäjatkuvaa, portaittaista n-propanoli-gradienttia.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että noudatetaan seuraavaa n-propanoli-gradienttia (tilav./tilav.): 10 minuuttia 0 %, 40 minuuttia 30 % ja 40 minuuttia 32 %, jolloin interferoni eluoituu 80. ja 90. minuutin välillä. 22 70721