SE466290B - Homogent humant fibroblastinterferon, dess framstaellning och farmaceutiska preparat paa basis daerav - Google Patents

Description

466 290 2 för rening av humant fibroblastinterferon. Sålunda beskriver Davey et al., J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), användning av Concanavalin A-Sepharose® 4B vid framställning av renat humant fibroblastinterferon. Jankowski et al., Biochemistry 15, 15, 5182 (1976) använde blått dextran-Sepharose® för samma ända- mål. Slutligen lyckades det enligt den amerikanska patent- skriften 4 172 071 (de Maeyer et al) att rena olika råa lös- ningar av leukocyt- och fibroblastinterferon genom affini- tetskromatografi på en kolonn av blått dextran-Sepharose®, varvid man erhöll preparat med en specifik aktivitet mellan l och 5 x 108 internationella interferonenheter. Ytterligare reningssteg beskrevs inte och de erhållna interferonpreparaten borde fortfarande innehålla en hög andel produkter med in- terferonliknande aktivitet och endast till stor del vara befriade från förorenande proteiner.

Det förbättrade förfarandet enligt uppfinningen för framställ- ning av humant fibroblastinterferon i homogen form avser en kombination av affinitetskromatografi och HPLC och utmärkes av att man A) tillför en vattenlösning av humant fibroblastinterferon i orent tillstånd på en affinitetskromatografikolonn, varpå interferonet adsorberas, eluerar interferonet och erhåller det i bestämda fraktioner av eluatet med högre renhet, och B) påför de erhållna interferonfraktionerna under HPLC-be- tingelser på en eller flera med en buffert med pH 4-8 ekvilib- rerade kromatografikolonner på basis av en cyklohexyl-, fe- nyl-, difenyl-, oktyl-, oktadecyl- eller cyanopropylgrupphal- tig SiO2-matris, varvid interferonet adsorberas och därefter elueras med en gradient av med vatten blandbara lösningsmedel i ett buffrat surt vattenhaltigt system, varigenom interfero- net erhålles i form av en enda utpräglad topp i bestämda fraktioner av eluatet.

För affinitetskromatografisteget vid förfarandet enligt upp- finningen kan man använda Concanavalin A-Sepharose® 4B eller. '-1 466 290 3 blått dextran-Sepharose®, varvid det senare föredrages på grund av väsentligt högre utbyten och en stabilare slut- produkt.

För genomförande av affinitetskromatografien med användning av Concanavalin A-Sepharose® 4B kan följande allmänna arbetsföre- skrifter anges: (a) 20-30 kolonnvolymer rått humant fibroblastinterferon (specifik aktivitet ungefär 104 enheter/mg) i Eagles minimal- medium, innehållande 5 % fetalt kalvserum pumpas på en Con- canavalin A-Sepharose® 4B-kolonn vid en genomflödeshastighet av 30-60 cm/timme; (b) därefter tvätt med fosfatbuffrad koksaltlösning (PPK) med PH 7,2; (c) tvätt med PPK-0,lM a-metylmannosid (a-M), och (d) eluering med PPK-0,lM a-MM, innehållande 50 % etylenglykol (v/v)- Det efter steg (d) erhållna renade interferonet uppvisar en specifik aktivitet av ungefär 107 enheter/mg vid ett utbyte av ungefär 10-30 %.

För genomförande av affinitetskromatografi med användning av blått dextran-Sepharose® kan följande allmänna arbetsföre- skrifter anges: (a) 10-40 kolonnvolymer av supernatant från en kultur (1-3 x 104 enheter/m1, 0,2-1 mg protein/ml) inställes genom tillsats av mättad NaCl-lösning på en halt av l,25M NaC1 och pumpas på kolonnen vid en linjär genomflödeshastighet av 20-40 cm/ timme; 466 290 4 (b) kolonnen tvättas med 5-15 kolonnvolymer lM NaCl/0,02- 0,05M fosfat och därefter med 5-15 kolonnvolymer lM NaCl/ 0,02-0,05M fosfat innehållande 15 % (v/v) etylenglykol (pH 7,2), och (c) interferonet elueras med lM NaCl/0,02-0,05M fosfat in- nehållande 50 % (v/V) etylenglykol (pH 7,2).

Det erhållna interferonet hade en specifik aktivitet av unge- fär 3 x 106 enheter/mg och kan vid detta steg erhållas med ett utbyte av ungefär 80 %.

Vid affinitetskromatografien använt blått dextran-Sepharose® kan erhållas genom koppling av blått dextran (till dextran kopplat "Cibacron Blau F3GA") till CNBr-aktiverad Sepharose® 4B vid pH 9,5.

Detta kopplingsförfarande är, liksom även tvättning och åld- ring av hartset och beskickning och eluering av kolonnen, av avgörande betydelse för erhållande av maximala utbyten och ett högrent humant fibroblastinterferon.

Om interferonet härstammar från ett serumfritt medium så kan man rena detta genom passage en eller två gånger genom en kolonn av blått Sepharose® 4B och eluering med en buffrad vattenlösning av etylenglykol (30-50 %, V/v, pH 7,2).

För ytterligare rening av interferonet underkastas det efter affinitetskromatografien en eller flera gånger förpreparativ HPLC med hög upplösning och högt utbyte. För HPLC användes kolonner på basis av en porös Si02-matris, vartill cyklohe- xyl-, oktyl-, oktadecyl-, fenyl-, difenyl- eller cyanopropyl- grupper är bundna. Medelst dessa kolonner, som kan användas efter varandra och under olika pH-betingelser såväl som med olika gradienter av det organiska elueringsmedlet, kan det humana fibroblastinterferonet renas till homogenitet. Inter- feronets homogenitet har uppnåtts när vid natriumdodecylsul- 466 290 fat-(NaDodSO4)-polyakrylamid-gelelektroforesen ett enda band erhålles och konstant specifik aktivitet och en enda topp erhålles vid HPLC med överensstämmande aktivitets- och pro- teinband.

Kromatograferingskolonnerna på basis av en oregelbundet for- mad, helt porös SiO2-matris (partikelstorlek ungefär 10 p, porstorlek ungefär lO"5 mm), som innehåller cyklohexyl-, oktyl-, oktadecyl-, fenyl- eller cyanopropylgrupper, är kom- mersiellt tillgängliga. Ett lämpligt HPLC-system beskrives i den amerikanska patentskriften 4 116 046.

Vid förfarandet enligt uppfinningen passeras den genom affini- tetskromatografien renade lösningen av det humana fibroblast- interferonet i en vattenhaltig buffertlösning med pH 4-8 över Si02-kolonnen. En för detta ändamål föredragen buffert är en blandning av pyridin/myrsyra/vatten (8:8:84, v/v). Vanligen arbetar man under tryck, företrädesvis inom intervallet 3,4 till ungefär 340 atmosfärer. Det i kolonnen bundna interfero- net elueras därefter på selektivt sätt med användning av en vattenhaltig buffertblandning med en gradient av ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel. Som lämpligt, med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, ifrågakommer framför allt alkanoler, såsom n-propanol, isopropanol, n-butanol, tert.-butanol, etanol och metanol. För eluering av humant fibroblastinterferon är en blandning av propanol och butanol särskilt lämplig.

Eluatet fraktioneras på vanligt sätt och de enskilda fraktio- nernas proteinhalt registreras hela tiden medelst högkänsliga monitorer. Ett för detta ändamål lämpligt system har beskri- vits av Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975) (jämför även den amerikanska patentskriften 3 876 881).

Valet av de för HPLC lämpligaste hartserna beror av härkomsten och renheten för det humana fibroblastinterferonet. Material som härrör från en Concanavalin A-Sepharose®-kolonn renas 466 290 6 lämpligen genom HPLC på en oyklohexyl-modifierad Si02-kolonn och därefter på en oktylmodifierad Si02-kolonn till homogeni- tet. Å andra sidan renas material, som härrör från en blå dextran-kolonn medelst passage en eller flera gånger genom en oktyl-modifierad SiO2-kolonn eller medelst passage genom en oktyl-modifierad såväl som en cyanopropyl-modifierad SiO2- kolonn och slutligen, när så är nödvändigt, genom en difenyl- modifierad SiO2-kolonn till homogenitet. Härrör materialet från ett serumfritt preparat och genomföres affinitetskroma- tografin på en kolonn av blått Sepharose® 4B så är det till- räckligt med passage en gång genom en oktylmodifierad SiO2- kolonn för att homogeniteten skall uppnås.

Med hänsyn till känsligheten hos humant fibroblastinterferon mot organiska lösningsmedel såsom propanoler, butanol och 2- metoxietanol, vid neutralt pH, genomfördes kromatograferingen vid sura pH-värden. Då humant fibroblastinterferon är mera hydrofobt än leukocytinterferon och då andra mer hydrofoba proteiner förefinnes i de delvis renade fibroblastinterferon- preparaten har det visat sig bäst att använda en blandning av propanol och butanol som elueringsmedel vid HPLC med de an- vända omvända faserna. Användning av denna blandning gjorde det möjligt att begränsa halten av organiska lösningsmedel och därigenom erhållawen mindre mängd artefakter i elutet.

Det enligt uppfinningen erhållna homogena humana fibroblast- interferonet isolerades efter den sista HPLC-kolonnen i form av en enda topp och gav ett enda smalt band vid NaDodS04- polyakrylamid-gelelektrofores i närvaro av 2-merkaptoetanol.

Extraktion av gelen gav en enda topp av antiviral aktivitet, som överensstämde med proteinbanden. Varje vanligt förekomman- de analysmetod för bestämning av aktivitet av humant fibro- blastinterferon kan användas för detta ändamål.

Det enligt uppfinningen erhållna humana fibroblastinterferonet är i homogen form, vilket framgår av att interferonet 466 290 7 a) har en konstant specifik aktivitet; b) ger en enda topp på en kolonn på basis av en cyklohexyl-, fenyl-, difenyl-, oktyl-, oktadecyl- eller cyanopropyl- grupphaltig SiO2-matris under HPLC-betingelser; c) ger ett enda smalt band på SDS-PAGE i närvaro och frånvaro av 2-merkaptoetanol; d) tillåter bestämning av följande N-terminala delamino- syrasekvens HZN-Metl-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln1O-Arg- -Ser-Ser-Asn-Phe15-Gln-....-Gln-Lyslg-; e) är fritt från natriumdodecylsulfat; och f) är användbart för parenteral administration.

Molekylvikten för det homogena humana fibroblastinterferonet, bestämt genom polyakrylamid-gelelektrofores, uppgick till ungefär 20500. Den specifika aktiviteten för det renade mate- rialet var ungefär 4 x 108 enheter/mg.

Den följande N-terminala partialsekvensen kunde medelst ett prov av homogent humant fibroblastinterferon fastställas såsom följer: Metl-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Glnlo- -Arg-Ser-Ser-Asn-Phel5-Gln-...-Gln-Lyslg-...

Interferoner uppvisar antiviral, antitumör-, tillväxthämmande och immunsuppressiv aktivitet. Dessa verkningar kunde fast- ställas såväl i klinisk skala vid tillförsel av l-10 x 106 en- heter/dag med relativt orena preparat, som innehöll mindre än 1 % humant interferon. Det renade homogena humana fibroblast- interferonet enligt_uppfinningen kan användas på samma sätt som tidigare kända interferonpreparat under anpassning av doseringen till den stegrade renhetsgraden.

Aspekterna på förfarandet och produkten enligt uppfinningen belyses i följande exempel. Alla i enheter/ml eller enheter/mg angivna interferonhalter hänför sig till en standard för humant leukocytinterferon (GO23-901-527) angiven av US Natio- nal Institutes of Health. 466 290 Exempel 1 Concanavalin A-affinitetskromatocrafi 50 ml Concanavalin A-Sepharose® 4B (ekvilibrerad med 4 PPK med pH 7,2, innehållande 0,1M a-M) packades i en 50 ml poly- propylenkolonn med polyetylenstycken. Den beskickades med 1,25 liter rå interferonlösning (2 x 107 enheter, specifik aktivi- tet 2 x 104 enheter/mg) vid en genomflödeshastighet av 180 ml/timme (35,5 cm/timme). Kolonnen tvättades därefter med 150 ml PPK och med 600 ml PPK innehållande 0,1M a-MM. Interferonet eluerades slutligen med den ovannämnda bufferten innehållande 50 % (v/v) etylenglykol. Utbyte 9 % (1,8 x 106 enheter, speci- fik aktivitet ungefär l x 107 enheter/mg). Vid en större bandbredd för topparna erhölls under inneslutande av ytterli- gare fraktioner 15 % utbyte (3 x 106 enheter, specifik aktivi- tet 2-4 x 106 enheter/mg).

HPLC 120 ml av eluatet från Concanavalin A-Sepharose® 4B-kolonnen (2,5 x 105 enheter, ungefär 2-4 x 106 enheter/mg) infördes vid en genomflödeshastighet av 0,4 - 0,8 ml/minut direkt på en 4,6 x 300 mm-kolonn på basis av en cyklohexylgrupphaltig SiO2- matris ("Chromegabond" 10 p), som i förväg ekvilibrerats med en blandning av pyridin/myrsyra/isopropanol/vatten (8:8:20:64; v/v; buffert A), varvid det maximala trycket hölls under 306 atm. Det för HPLC använda systemet motsvarade väsentligen det som beskrivits av Bohlen et al. (Anal. Biochem. 67, 438 (1975)).

Vid en genomflödeshastighet av 0,4 ml/minut användes följande gradient med utgång från buffert A, för buffert B (PYridin/- myrsyra/isopropanol/n-butanol/vatten, 8:8:25:20:39, v/v): 0,25 % B, 32 minuter; 25-60 % B, 225 minuter; 60-100 % B, 63 minu- ter. Fraktioner om 2,0 ml tillvaratogs. De förenade fraktio- nerna 26-29 (2 x 106 enheter) utspäddes med 4 ml pyridin/myr- syra och påfördes direkt på en 4,6 x 300 mm-kolonn på basis av en oktylgrupphaltig Si02-matris ("Chromegabond" 10 u). Den eluerades under de betingelser som angetts för cyklohexy1ko-- 466 290 9 lonnen. Den specifika aktiviteten i centrum av aktivitetstop- pen var ungefär 4 x 108 enheter/mg vid ett totalt utbyte av renat humant fibroblastinterferon av 106 enheter.

Det i en "Concanavalin A"-kolonn renade interferonet eluerades vid HPLC i en cyklohexylgrupphaltig resp. en oktylgrupphaltig kolonn mycket nära vid huvudtoppen. Om vid HPLC man först kromatograferade på oktylkolonnen så eluerades interferonet direkt före huvudtoppen, under det att vid användning av en cyklohexylkolonn såsom första kolonn det eluerades omedelbart efter huvudtoppen, Prover av HPLC-renat humant fibroblastinterferon underkastades elektrofores i 12,5 eller 15 % NaDodS04-polyakrylamid-gel i tris/glycinbuffert (l pg/protein). Efter färgning med "Coomas- sie Blau" erhölls ett enda band. Genom analys av antiviral aktivitet fastställdes att maximum för denna aktivitet låg i centrum av det färgade bandet. Molekylvikten bestämdes till ungefär 20500 med användning av kalvserumalbumin, kymotrypsin, "Cytochrom C" och ribonukleas såsom jämförelsesubstanser. Den relativa rörligheten för bandet för det humana fibroblastin- terferonet var inte beroende av närvaro av merkaptoetanol i provet.

Exempel 2 Framställninq av kolonnen av blått dextran-Senharosa@_g§ 50 g packat "Sepharose® 4B" tvättades med l liter vatten och suspenderades ytterligare i 50 ml destillerat vatten. 15 g finfördelat CNBr tillsattes under lätt omröring och pH-värdet inställdes på ll i 0,2 genom droppvis tillsats av l0N Na0H.

Temperaturen hölls vid 20 i 5°C genom tillsats av is. Efter l5¿20 minuter tillsattes en volym isvatten och suspensionen tvättades i en Büchner-tratt ytterligare med 5 volymer 0,0lN HCl.

Det aktiverade hartset skakades omedelbart i 50 ml 0,4M nat- riumkarbonatbuffert (pH 9,5), innehållande 1,00 g löst blått 466 290 dextran och skakades över natten vid 4°C i en rundbottnad kolv. Det tvättades därefter med 10 volymer lM NaCl, 2 volymer 50%-ig (v/v) etylenglykol innehållande lM NaCl och 0,05M natriumfosfat (pH 7,2), varefter det förvarades över natten i 50%-ig etylenglykol (v/v), tvättades med en volymdel 80%-ig (v/v) etylenglykol och 5 volymer "Gibco No. ll Minimalmedium" (MEM) och förvarades därefter i detta medium över natten vid 50°C. Efter ytterligare tvättning med 3 volymer 80%-ig (v/v) vattenhaltig etylenglykol innehållande lM NaCl och därefter med 2 volymer MEM uppslammades hartset i MEM och överfördes till en kolonn.

Affinitetskromatoqrafi En blandning av 1,5 liter rått humant fibroblastinterferon (2 x 104 enheter/ml; l mg protein/ml; specifik aktivitet 2 x 104 enheter/mg protein) och 0,27 volymer mättad NaCl-lösning (ungefär 6,3M) infördes i en 50 ml polypropylenkolonn med en polyetylenfritta innehållande 35 ml blått dextran-Sepharose® 4B, vid en genomflödeshastighet av 100 ml/timme (20 cm/timme).

Kolonnen tvättades i tur och ordning med 200 ml lM NaCl inne- hållande 0,05M natriumfosfatbuffert (pH 7,2) och 500 ml lM NaCl innehållande 0,05M natriumfosfat (pH 7,2) och 75 ml etylenglykol och slutligen med 500 ml lM NaCl innehållande 0,05 M natriumfosfat (7,2) och 250 ml etylenglykol. Ungefär 90 % av interferonet eluerades i en enda topp tillsammans med det genomflödande lösningsmedlet innehållande 50 % etylenglykol.

Den specifika aktiviteten vid toppmaximum, varvid mer än 50 % av det totala interferonet eluerades, låg vid l x 107 enhe- ter/mg.

HPLC (A) 125 ml av den interferonlösning som eluerats från kolonnen innehållande blått dextran-Sepharose® 4B (3 x 107 enheter; l x 107 enheter/mg) pumpades på en kolonn med måtten 4,6 x 300 mm på basis av en SiO2-matris innehållande oktylgrupper ("Chrome- gaband“ l0 u), som i förväg ekvilibrerats med lM NaCl/50 % (v/v) etylenglykol. Vid en genomflödeshastighet av 0,45 ml/mi- 466 290 11 nut upprätthölls, utgående från buffert A (pyridin/myrsyra/ isopropanol/n-butanol/vatten, 8:8:20:3,3:60,7, v/v) följande gradient vid övergång till buffert B (pyridin/myrsyra/isopro- panol/n-butanol/vatten, 8:8:25:20:39, v/v): 0,25 % B, 30 minuter; 25-55 % B, 190 minuter; 55-100 % B, 20 minuter; 100 % B, 60 minuter. Interferonaktiviteten överensstämde väsentligen med en enda proteintopp i fraktionerna 18-23 (varje fraktion innehöll 1,5 ml elueringsvätska).

(B) Vid användning av ungefär en fjärdedel av den i steget (A) använda mängden på samma kolonn under de betingelser som beskrives i exempel l för cyklohexylkolonnen överensstämde interferonaktiviteten med en proteintopp i fraktionerna 24-26.

(C) Under samma betingelser med avseende på beskickning, gradient och genomförd mängd som i (A) och samma kolonner (9,6 x 500 mm, "Chromegabond") innehållande buffert A och B såsom angetts under (B) ovan, så att l/9 av beskickningen per ko- lonnvolym erhölls, uppnáddes en förbättrad separationskvali- tet.

(D) Det material, som innehöll den högsta aktiviteten (4 x 108 enheter/mg) från förfarandesteg (A) àterkromatograferades på en cyanopropylgrupphaltig kolonn med användning av pyridin/- myrsyra/vatten (8:8:84, v/v) och en entimmesgradient med avseende pà n-propanol (0-40 %, v/v), vid en genomflödeshas- tighet av 0,3 ml/minut. Härvid erhölls en symmetrisk huvud- topp.

NaDodSO4;polvakrv1amid-qelelektrofores Elektrofores av interferonprover såsom beskrivits i exempel l, vilka erhållits vid förfarandestegen (A), (B) och (C) gav ett huvudband med molekylvikten 20500, som vid analys med avseende på interferonaktivitet överensstämde med aktivitetstoppens mitt. Ett andra band, som uppvisade en molekylvikt av ungefär 10500 och innehöll 20-50 % av det totala materialet, beräknat pá färgningsintensiteten, varierade från prov till prov och 466 290 12 uppvisade ingen antiviral aktivitet. När proverna inte behand- las med merkaptoetanol iakttogs ett band med en molekylvikt av 40000, som emellertid endast uppvisade ringa aktivitet. Amino- syraanalyser av banden med molekylvikterna 20000 och 40000 skilde sig inte under det att analysen av de band, som upp- visade en molekylvikt av 1000, tydligt skilde sig från varan- dra.

Elektrofores av ett enligt förfarandet (D) erhållet interfe- ronprov gav en molekylvikt av ungefär 20500 och en specifik aktivitet av 4 x 108 enheter/mg. Aminosyraanalys av denna homogena peptid gav efter hydrolys 24 timmar i 6N HCl följande värden som hänför sig till Leucin med värdet 25,0: AsX 15,4 1 0,2 Ala 11,8 1 0,4 Tyr 9,6 1 0,2 Thr* 7,8 1 0,3 Cys ej bestämt Phe 7,3 1 0,1 Ser* 7,7 1 0,2 Val 6,9 1 0,1 His 4,5 1 0,1 Glx 24,1 1 0,4 Met 2,8 1 0,4 Lys 11,6 1 0,4 Pro 2,8 1 0,4 Ile 8,7 1 0,1 Arg 8,8 1 0,4 Gly 4,9 1 0,3 Leu 25,0 Trp ej bestämt * korrigerat värde Exempel 3 Affinitetskromatoarafi med blå dextran-Seoharose®L (a) 5 liter kultursupernatant innehållande 19400 enheter/ml fibroblastinterferon filtrerades genom ett 0,3 p filter och pàfördes därefter på en kolonn innehållande 275 ml blått dextran-Sepharose®. Supernatanten inställdes i förväg genom tillsats av 1350 m1 avTaB mättad lösning av Nac1 (6,3M) på 1,25M NaCl och pumpades till kolonnen vid en genomflödeshas- tighet av 360 ml/timme. Ungefär 4-6 % av interferonet passera- de kolonnen utan att adsorberas. (b) Kolonnen tvättades därefter vid en genomflödeshastighet av 420 ml/timme med 1300 ml av en vattenlösning innehållande 15 % (v/v) etylenglykol, 1M NaCl och 0,02M natriumfosfat (pH 7,2).

Ungefär 1 % av det absorberade interferonet eluerades från 466 290 13 kolonnen. (c) Interferonet eluerades därefter vid en genomflödeshastig- het av 420 ml/timme med en vattenlösning innehållande 50 % (v/v) etylenglykol, lM NaCl och 0,02M natriumfosfat (pH 7,2).

Med de första 200 ml av eluatet eluerades en ringa mängd inteferon. Det mesta interferonet eluerades i de därpå följan- de 300 ml, såsom framgår av följande tabell: Frak- Frak- Protein Interferon- Specifik ak- tion tionsvo- (pg/ml) titer tivitet nr. lym (enheter/ml) (enheter/mg) (ml) 1 200 ej best. 122 - 2 50 43 3,3 x 105 9,02 X 105 3 50 az 11,64 x 105 1,42 X 107 L 4 50 63 7,72 x 105 1,23 X 107 50 62 1,94 x 105 3,13 x 105 6 50 49 9,7 x 104 1,97 x 105 7 50 41 3,64 x 104 8,97 x 105 Totalt återfanns 114 % av den insatta interferonaktiviteten.

HPLC Fraktionerna 2-6 från kolonnen med blått dextran-Sepharose® (250 ml; 13 x 107 enheter; specifik aktivitet 8,12 x 105 enheter/mg) pumpades genom en kolonn (9,5 x 500 mm) på basis av oktylgrupphaltig SiO2-matris vid en genomflödeshastighet av 4 ml/minut. Under 12 minuter pumpades genom kolonnen buffert A (pyridin/myrsyra/2-propanol/n-butanol/vatten, 8:8:20:2,5:61,5, v/v) vid en genomflödeshastighet av 2 ml/minut. Därefter eluerades med följande gradienter med avseende på buffert B (pyridin/myrsyra/1-propanol/n-butanol/vatten, 8:8:25:25:34, v/v) vid en genomflödeshastighet av 1,25 ml/minut: 0-20 % B, 466 29Û 14 18 minuter; 20-29 % B, 57 minuter; 29 % B isokratiskt under 27 minuter; 29-30 % B, 3 minuter; 30-100 % B, 36 minuter; 100 % B, 54 minuter.

Interferonaktiviteten eluerades tillsammans inom det isokra- tiska intervallet för gradienterna och pàvisades med en topp som erhölls med ett fluroescamin-monitorsystem. 45 x 106 enheter interferon (utbyte 35 %) med en specifik aktivitet av 2 x 108 enheter/mg tillvaratogs i en gemensam volym (50 ml).

Efter förvaring två månader vid -20°C i förslutna polypropy- lenampuller minskade aktiviteten till 10 % av värdet efter HPLC. Proteinförlust skedde inte.

Denna 50 ml-pool (specifik aktivitet ungefär 0,2 x 108 enhe- ter/mg) försattes med 1 ml tiodiglykol och 20 ml n-propanol.

Medelst analys fastställdes för denna blandning totalt 4,26 x 106 enheter. Blandningen försattes med 100 ml 0,1 % Triton X- 100/0,3 % tiodiglykol. Denna blandning innehöll enligt analys totalt 5,1 x 106 enheter och påfördes under loppet av 30 minuter på en kolonn pà basis av en CN-grupphaltig Si02-matris (4,6 x 250 mm, 5 p/8 x 106 mm, "Spherisorb"), ekvilibrerades med en blandning av pyridin/myrsyra/vatten (8:8:84, v/v, buffert A) vid en genomflödeshastighet av 1,5 ml/timme. Föl- jande gradient med avseende på buffert B (pyridin/myrsyra/n- propanol/vatten, 8:8:50:34, v/v) vid en genomflödeshastighet av 0,5 ml/minut: 0-25 % B, 30 minuter; 25-50 % B, 210 minuter.

Interferonaktiviteten eluerades med en enda fastställd topp. 4,2 x 106 enheter (82 %) återfanns i tre 1 ml-fraktioner.

Denna pool, som utgjorde 69 % av det totala, på den första CN- kolonnen påförda proteinet, blandades med 2 ml 0,1 % "Triton X-100" och påfördes på nytt på samma CN-kolonn. Därefter eluerades med samma gradienter vid halva tiden. Den totala aktiviteten (11,75 x 106 enheter; utbyte 280 %) eluerades i en enda topp. 466 290 De fraktioner (4 ml) som innehöll interferonaktiviteten frán den andra CN-kolonnen pumpades på en 4,6 x 250 mm kolonn på basis av en difenylgrupphaltig SiO2-matris, som i förväg be- handlats med en två timmar lång gradient av buffert A till buffert B (samma buffert som för CN-kolonnen) och ekvilibrera- des med buffert A, vid en genomflödeshastighet av 1,5 ml/mi- nut.

Därvid användes följande gradient vid en genomflödeshastighet av 0,5 ml/minut: 0-25 % B, 22 minuter; 25-50 %, 98 minuter.

Den andra toppen, som eluerades som gradientinstrumentet 33 % buffert B visade, överensstämde med interferonaktivitets- toppen. Totalt eluerades 2,6 x 106 enheter (22 %) och 40 pg protein med denna topp.

Den difenylgrupphaltiga S102-kolonnen framställdes pà följande sätt: SiO2 (lO'2 mm, l0'5 mm porstorlek) behandlades i 6N HCl (l0:l, volym/vikt) under 24 timmar under skakning då och då, tvätta- des därefter neutral med vatten och vattnet avlägsnades genom tvättning med aceton och metanol. Efter torkning under för- minskat tryck över natten upphettades kiselsyra (10 g) i 100 ml torr toluen, som innehöll l0 ml diklordifenylsilan 6 timmar under återflöde. Den så modifierade kiselsyran tvättades först med 200 ml toluen och därefter i en Soxhlet-extraktor i tur och ordning med 250 ml toluen, aceton och metanol, vardera under 8 timmar. Slutligen skedde behandling med trimetylklor- silan på ovan angivet sätt.

Varje 3 g bärarmaterial suspenderades därefter i 10,7 ml kloroform och 2,3 ml n-butanol och materialet fylldes i 4,6 x 250 mm-kolonner av rostfritt stål under ett tryck av 340 atm.

Kolonnerna tvättades därefter med 75 ml etanol.

Aminosyraanalys av mellanfraktionen av den erhållna interfe- rontoppen efter hydrolys i 5,7N HCl gav följande resultat: 466 290 16 ,4 17,6 17,95 15,2 Asx 7,8 8,6 8,4 7,3 Thr* 7,7 8,3 9,1 9,9 Ser* 24,1 21,1 21,4 i.b. Glx 2,8 i.b. i.b. 3,36 Pro 4,9 6,9 6,6 7,4 Gly _ 11,8 10,7 10,7 9,9 Ala i.b. 3,96 3,4 i.b. Cys 6,9 7,84 8,2 6,9 Val 2,8 4,5 4,5 3,7 Met 8,7 8,6 8,9 7,8 Ile ,0** 25** 25** 25** Leu 9,6 10,3 9,0 8,1 Tyr 7,3 9,5 9,8 9,0 7Phe 4,5 7,5 6,9 6,1 His 11,6 12,3 11,8 11,25 Lys 8,8 11,25 10,6 8,8 Arg _32; _i_-A-_ _i_-_bi __._____Q2 93 Tr 24 tim. 24 tim. 48 tim. 24 tim.

TGS TGS TGS TGS TGS tioglykolsyra * okorrigerat värde ** beräkningsvärde i.b. icke bestämd Hexosaminanalys efter hydrolys i 6, 14 och 24 timmar av in- terferonet med 5,7N HCl innehållande 0,02 % tioglykolsyra, vid l10°C och med användning av mellanfraktionen från interferon- toppen från difenylkolonnen gav 3 glukosamingrupper per mole- kyl. Varken galaktosamin eller mannosamin återfanns. Ändgruppsbestämning utfördes med ett 90 pmol prov från mellan- fraktionen av interferontoppen från difenylkolonnen och gav Met såsom N-terminalaminosyra. 150 pmol prov såväl från fibroblastinterferon som från leuko- 466 290 17 cytinterferon underkastades tryptisk nedbrytning och kromato- graferades därefter. Det visade sig att i de båda proverna återfanns inga identiska peptidfragment.

Genom sekvenering av ett 1,25 nmol prov av fibroblastinterfe- ron konstaterades Met såsom N-terminal aminosyra. Sekvenering av ett ytterligare 5,9 nmol prov av fibroblastinterferon gav följande N-terminala aminosyrasekvens: HZN-Metl-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln1o-Arg-Ser-Ser- -Asn-Phels-Gln-....-Gln-Lyslg-...

Exempel 4 Rätt interferon utvanns från fibroblaster från människa (cell- linje GM 2504A). Det råa materialet gjordes lM med avseende på natriumklorid genom tillsats av mättad natriumkloridlösning.

Detta material fördes genom en kolonn av blått Sepharose®4B (volym 20-25 ml, diameter 2,5 cm, genomflödesmängd 2,5 ml/mi- nut). Under påföringen kyldes ràmaterialet med is. Efter på- föringen tvättades kolonnen med 250 ml av följande lösning (2,5 ml/minut): % etylenglykol, lM NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Slutligen eluerades interferonet vid en genomflödeshastighet av 2,5 ml/minut med 250 ml av följande lösning: 50 % etylenglykol, lM NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Typiska analysresultat är de följande: % aktivitet i gšïomfiödet % aktivitet i den 30%-iga etylenglykollösningen 85 % aktivitet i den 50%-iga etylenglykollösningen Interferontoppens fraktioner från den första kolonnen med blått Sepharose® sammanfördes och inställdes medelst följande lösning på en etylenglykolhalt av 10 % (v/v): 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2). 466 290 18 Detta material påfördes en kolonn av blått Sepharose® (volym -25 ml, 2,5 cm diameter, genomflödeshastighet 2,5 ml/minut).

Därefter tvättades med 250 ml av en lösning innehållande 2M NaCl, 50 mM Na2HPO4 (pH 7,2) och 30 % (v/v) etylenglykol och eluerades med en lösning innehållande 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) och 50 % (v/v) etylenglykol.

Typiska resultat för interferonanalysen var de följande: % aktivitet i genomflöde % aktivitet i den 30%-iga etylenglykollösningen 60 % aktivitet i den 50%-iga etylenglykollösningen.

HPLC Först undersöktes ett prov från det 50%-iga (v/v) etylengly- koleluatet från blått Sepharose®. Därefter följde prover, som fördes två gånger genom kolonnen med blått Sepharose®, i vilka fall de 30%-iga eller 50%-iga etylenglykoleluaten kunde an- vändas.

En 25 x 0,46 cm kolonn på basis av en oktylgruppmodifierad SiO2-matris ("Lichrosorb RP-8") användes. Kolonnen tvättades först med vatten och därefter beskickades den med eluatet från kolonnen med blått Sepharose®. Före pumpen inkopplades en blandningskammare (5 ml). Därvid arbetades med en genomflödes- hastighet av 22 ml/timme och med följande stegvisa gradienter av n-propanol, vid ett konstant genom lM myrsyra/0,8M pyridin upprätthållet pH av 4,2: O % lO minuter; 30 % 40 minuter; 32 % 40 minuter.

Slutligen tvättades kolonnen med 60%-ig n-propanol och före nästa användning ekvilibrerades med lM myrsyra och 0,8M pyri- din.

Interferonet eluerades med det 32%-iga n-propanol-eluatet (mellan 80 och 90 minuter). Detta material var homogent på basis av NaDodSO4-akrylamid-gelelektrofores (färgning med "Coomassie Blau" eller märkning av provet i förväg med "Flu-. 466 290 19 ram").

Aminosyraanalyser (24 timmars hydrolys; 0,2 % TGS, 5,7N HC1) utfördes på nio olika prov från fyra olika preparat. Den mellersta aminosyrasammansättningen, beräknat på basis av ett leucinvärde av 22,0, framgår av följande tabell: Asx 15,1 1 0,7 Met 4,5 1 0,7 Thr* 7,0 1 0,5 Ile 9,4 1 0,1 Ser* 7,5 1 0,5 Leu 22,0 Gly 22,2 1 0,5 Tyr 8,8 1 0,2 Pro icke best. Phe 8,0 1 0,3 Cys 3,0 1 0,3 His 4,5 1 0,1 Gly 6,9 1 0,7 Lys 11,0 1 0,6 Ala 7,4 1 1,0 Arg 11 9 1 0,7 Val 5,7 1 0,5 Trp icke best. * okorrigerat värde Baserat på de vid olika tider genomförda analyserna av olika prover, som framställts genom olika förfaranden beskrivna i detta och de föregående exemplen (24 timmars hydrolys i 6N HC1 med 0,2 % tioglykolsyra, TGS) uppvisar homogent humant fibro- blastinterferon följande aminosyrasammansättning (1 15 %): Asx 15,1 Gly 6,9 Tyr 8,8 Thr* 7,0 Ala 7,4 Phe 8,0 Ser* 7,5 Val 5,7 His 4,5 Glx 22,2 Met 4,5 Lys 11,0 Pro 3,0 Ile 9,4 Arg 11,9 Cys 3,0 Leu** 22,0 Trp 3,0 * okorrigerat värde, ** beräkningsvärde Exempel 5 Homogent humant fibroblastinterferon (1,5 mg) med en specifik aktivitet av 4 x 108 enheter/mg löstes i 25 ml 5%-igt normalt humanserumalbumin. Lösningen filtrerades genom ett bakteriolo- giskt filter och fördelades på 100 aseptiska ampuller. Varje 466 290 ampull innehöll 6 x 106 enheter rent interferon, som lämpade sig för parenteral tillförsel. Ampullerna förvarades före användning företrädesvis i kyla (vid -20°C).

Claims (7)

W ' 466 299 PATENTKRAV

1. Humant fibroblastinterferon, k ä n n e t e c k n a t av att det är i homogen form, vilket framgår av att interferonet a) har en konstant specifik aktivitet; b) ger en enda topp på en kolonn på basis av en cyklohexyl-, fenyl-, difenyl-, oktyl-, oktadecyl- eller cyanopropyl- grupphaltig Si02-matris under HPLC-betingelser; c) ger ett enda smalt band på SDS-PAGE i närvaro och frånvaro av 2-merkaptoetanol; å d) tillåter bestämning av följande N-terminala delamino- syrasekvens H2N-Metl-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg- -Ser-Ser-Asn-Phe15-Gln-....-Gln-Lyslg-; e) är fritt från natriumdodecylsulfat; och f) är användbart för parenteral administration.

2. Förfarande för framställning av humant fibroblastinteferon i homogen form, k ä n n e t e c k n a t av att man A) tillför en vattenlösning av humant fibroblastinterferon i orent tillstånd till en affinitetskromatograferingskolonn, varpå interferonet adsorberas, eluerar interferonet och er- håller detta i bestämda fraktioner av eluatet i högre renhet, och B) påför de erhållna interferonfraktionerna under högupplösan- de vätskekromatografi-(HPLC)-betingelser på en eller flera med en buffert med pH 4-8 ekvilibrerade kromatograferingskolonner på basis av en cyklohexyl-, fenyl-, difenyl-, oktyl-, oktade- cyl- eller cyanopropylgrupphaltig SiO2-matris, varvid inter- feronet adsorberas, och eluerar med en gradient av med vatten blandbara lösningsmedel i ett buffrat surt vattenhaltigt sys- tem, så att interferonet erhålles i form av en enda utpräglad topp i bestämda fraktioner av eluatet.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t av att affinitetskromatograferingen utföres på Concanavalin A- 466 290 22 Sepharose® och HPLC först på en cyklohexylgrupphaltig SiO2- kolonn med stigande n-butanol-gradienter i en blandning av pyridin/myrsyra/2-propanol/n-butanol/vatten och därefter på en oktylgrupphaltig Si02-kolonn under samma betingelser.

4. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t av att affinitetskromatograferingen utföres på blå dextran Sepharose® och HPLC på en oktylgrupphaltig SiO2-kolonn med stigande n-butanol-gradienter i en blandning av pyridin/myr- syra/2-propanol/n-butanol/vatten.

5. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t av att de fràn den oktylgrupphaltiga SiO2-kolonnen eluerade, förenade interferonaktiva fraktionerna därefter återkromato- graferas på en cyanopropylgrupphaltig SiO2-kolonn med stigande n-propanol-gradienter i en blandning av pyridin/myrsyra/n-pro- panol/vatten.

6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t av att de från den cyanopropylgrupphaltiga Si02-kolonnen eluerade, förenade interferonaktiva fraktionerna àterkromato- graferas på samma kolonn och därefter kromatograferas på en difenylgrupphaltig Si02-kolonn.

7. Farmaceutiska preparat på basis av ett homogent human- fibroblastinterferon enligt patentkravet 1.