HU185382B - Process for preparing homogenic humena fiariblast interferone - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás humán fibroblaszt-interferon előállítására homogén fehérje formájában, affinitás-kromatográfia és nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC) kombinálásával.

Az interferon felfedezése (Isaacs és Lindenmann, 1957) óta eltelt két évtized alatt a világszerte folyó intenzív kutatómunka ellenére sem leukocytákból, sem fibroblasztokból (fibrocytákból) nem sikerült az interferont a tennék jellemzését és specifikus biológiai és kémiai tulajdonságainak meghatározását lehetővé tevő mennyiségben homogén peptid formájában elkülöníteni. Néhány szerző ugyan azt közölte, hogy sikerült egérinterferont vagy emberi interferont a teljes homogenitás eléréséig tisztítania; a fehérjék homogenitását bizonyító klasszikus adatokat azonban nem közöltek, és az állítólagosán tiszta vegyületek tulajdonságait sem ismertették.

A nagynyomású folyadék-kromatográfia a fehérjék tisztításának általánosan ismert módszere. A szakirodalomban a fehérjék tisztítására elsősorban ioncserés és kiszorításos oszlopkromatográfiás eljárásokat ismertettek [lásd például Regnier és Noel; J. Chromatogr, Sci. 14, 316 (1976) és Chang és .munkatársai; Anal. öiochem. 48, 1839 (1976)]. A fordított fázisú (inverz) kromatográfiában a peptidek (így a (3-endorfin) tisztítására sikerrel alkalmaztak például Lichrosorb RP-18-at [oktadecillel módosított szilícium-dioxiddal töltött oszlopok; lásd például Rubinstein és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4969-4972 (1977)].

Ismert az is. hogy az emberi fibroblaszt-interferon tisztítására affinitás-kromatográfiás módszerek is felhasználhatók. így például Davey és munkatársai [J. Bioi. Chem. 251. 7620 í 1976)] concanavalin A-sepharose 4B alkalmazását ismertették tisztított emberi fibroblasztinterferon előállítására. Jankowski és munkatársai (Biochemistry 15, 5182 (1976)] ugyanerre a célra blau dextrán-sepharose abszorbenst használtak fel. Végül a 4 172 071 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (de Maeyer és munkatársai) szerint a különböző nyers leukocyta- és. fibioblaszt-interferonok oldatait affinitás-kromatográfiás módszerrel, blau dextránsepharose oszlopon tisztítják, és így 1-5 X10⁸ nemzetközi interferon-egységnek megfelelő fajlagos aktivitású készítményeket állítanak elő. További tisztítási lépéseket nem ismertettek. Minthogy a kapott interferon-készítmények még igen nagy mennyiségben tartalmaznak interferon-analóg aktivitással rendelkező termékeket, szükség van arra, hogy legalább a szennyező fehérjék nagy részét eitávolítsuk az interferon-készítményekből.

A találmány tárgya javított eljárás emberi fibroblasztinterferon előállítására homogén fehérje formájában, affinitás-kromatográfia és nagynyomású folyadék-kromatográfia kombinációjával. A találmány értelmében a következőképpen járunk el:

1) Szennyezett emberi fibroblaszt-interferon vizes oldatát affinitás-kromatográfiai oszlopra visszük fel, az oszlopon adszorbeáltatjuk az interferont, az interferont leoldjuk az oszlopról, és a nagyobb tisztasági fokú interferont tartalmazó eluátumfrakciókat összegyűjtjük; és

2) a kapott interferon-frakciókat a nagynyomású folyadék-kromatográfia körülményei között egy vagy több, pufferoldattal egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú kromatográfiás oszlopon bocsátjuk át, az oszlopon adszorbeáltatjuk az interferont, majd gradiens szerint változó 2 mennyiségű vízzel elegyedő szerves oldószereket tartalmazó, pufferolt savas vizes rendszerrel leoldjuk az interferont úgy, hogy az interferon az eluátum meghatározott frakcióiban egyetlen éles csúcs formájában jelenik meg.

Találmányunk tárgya eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására oly módon, hogy szennyezett humán fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként concanavalin A-sepharoset, blau dextrán-sepharoset vagy blau sepharose 4B-t tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadék-kromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy cianopropil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixalapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopon adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanolgrádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas (pH = 4-8) vizes rendszerrel eluáljuk.

A találmány szerinti eljárás affinitás-kromatográfiás lépésében concanavalin A-sepharose-t vagy blau dextránsepharose-t vagy blau sepharose 4B-t használhatunk fel. Ezek kereskedelmi forgalomban lévő termékek (gyártó cég: Firma Pharmacia). Előnyösen az utóbbi adszorbenst alkalmazzuk, mert ekkor az interferont lényegesen nagyobb kitermeléssel, stabilabb végtermék formájában kapjuk.

Ha az affinitás-kromatográfiás lépésben concanavalin A-sepharose 4B-t használunk fel, a kromatografálást a következőképpen végezhetjük:

(1) Concanavalin A-sepharose 4B oszlopra az oszlop térfogatának 20—30-szorosát kitevő mennyiségű, 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó Eagle-féle minimális tápközeggel készített nyers emberi fibroblaszt-oldatot (fajlagos aktivitás: körülbelül 10⁴ egység/mg) szivattyúzunk 30-60 cm/óra átfolyási sebességgel;

(2) az oszlopot 7,2 pH-értékű, foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal (PPK) mossuk;

(3) az oszlopot 0,1 mól α-metil-mannozidot (cr-MM) tartalmazó PPK-oldattal mossuk; és (4) az oszlopot 50 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó PPK-0,1 mólos α-MM oldattal eluáljuk.

A (4) lépésben kapott tisztított interferon fajlagos aktivitása körülbelül 10⁷ egység/mg, hozama pedig körülbelül 10-30%.

Ha az affinitás-kromatográfiás lépésben blau dextránsepharose adszorbenst használunk fel, a kromatografálást a következőképpen végezhetjük:

(1) az oszlop térfogatának 10-40-szeresét kitevő mennyiségű tenyészethez (1-3X10⁴ egység/ml, 0,2-1 mg fehérje/ml) 1,25 mól nátrium-klorid-tartalom eléréséig telített nátrium-klorid-oldatot adunk, és az elegyet 20-40 cm/óra lineáris átfolyási sebességgel az oszlopra szivattyúzzuk, (2) az oszlopot az oszlop térfogatának 5-15-szörösét kitevő mennyiségű 1 mólos NaCl/0,02-0,05 mólos foszfát-puffer-oldattal, majd az oszlop térfogatának

5-15-szörösét kitevő mennyiségű, 15 térfogat % etilénglikolt tartalmazó 1 mólos NaCl/0,02-0,05 mólos foszfát-puffer-oldattal (pH = 7,2) mossuk, és (3) az interferont 50 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó 1 mólos NaCl/0,02-0,0$ mólos foszfát-pufferoldattal (pH = 7,2) eluáljuk.

185 382

Á kapott interferon fajlagos aktivitása körülbelül 3X10⁶ egység/mg. Ebben a lépésben az interferont körülbelül 80%-os hozammal kapjuk.

Az affinitás-kromatográfiás lépésben felhasznált blau dextrán-sepharose adszorbenst úgy állíthatjuk elő, hogy 5 brómciánnal (CNBr) aktivált sepharose 4B-t 9,5-es pHértéken blau dextránnal (Cibracon blau F3GA-val kapcsolt dextránnal) kapcsolunk.

A kapcsolási eljárásnak - a gyanta mosásához és érleléséhez, valamint az oszlop feltöltéséhez .és eluálásához 10 hasonlóan — döntő szerepe van abban, hogy az emberi fibroblaszt-interferont maximális hozammal, rendkívül tiszta állapotban különítsük el.

Ha szérummentes közegből származó interferont használunk fel, az interferont úgy tisztítjuk, hogy az 15 interferont blau sepharose-4B oszlopon egyszer vagy kétszer átbocsátjuk, és az oszlopot 30-50 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó pufferolt vizes oldattal (pH = = 7,2) eiuáljuk.

Az interferon további tisztítása céljából az affinitáskromatográfia után kapott terméket egy vagy több lépésben nagy felbontóképességű, nagy hozamot biztosító nagynyomású folyadék-kromatográfiának vetjük alá.

A nagynyomású folyadék-kromatográfiához porózus szilícium-dioxid mátrix alapú oszlopokat használunk fel, ahol a mátrixhoz ciklohexil-, oktil-, oktadecil-, fenil-, difenil- vagy ciano-propil-csoportok kapcsolódnak. Ezeken az oszlopokon (amelyeket egymás után kapcsolva használhatunk fel, és a grádienselúciót oszloponként eltérő pH-értékeken, valamint oszloponként eltérő mennyiségű szerves oldószert tartalmazó eluálószerrel végezhetjük) a humán fibroblaszt-interferont homogenitásig tisztíthatjuk. Az interferont akkor tekinthetjük homogénnek, ha nátrium-dodecil-szulfát (NaDodS0₄)poliakrilamid gél-elektroforézisben egyetlen sávot ad, állandó fajlagos aktivitással rendelkezik, és.nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálatban egyetlen csúcsot ad, egymással összhangban lévő aktivitási és fehérjesávokkal.

A ciklohexil-, oktil-, oktadecil-, fenil- vagy cianopropil-csoportokat tartalmazó, szabálytalan alakú, teljes mértékben porózus szih'cium-dioxid-mátrix (szemcseméret: körülbelül 10 μ; pórusméret: körülbelül 10~^s mm) alapú kromatográfiás oszlopok kereskedelemben beszerezhető termékek. A találmány céljaira alkalmas nagynyomású folyadék-kromatográfiás rendszert ismertet többek között a 4 116 046 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Stanley Stein).

A találmány szerinti eljárás értelmében az affinitáskromatográfiával tisztított emberi fibroblaszt-interferonoldatot 4 és 8 közötti pH-értékü vizes pufferoldatban bocsátjuk át a szilíciumdioxid-oszlopon. Erre a célra pufferoldatként előnyösen használhatjuk fel piridin, hangyasav és víz 8 :8 :84 térfogatarányú elegyét. A kromatografálást előnyösen 344 505 és 34 450 500 Pa közötti nyomás-tartományban végezzük. Az oszlopon megkötött interferont ezután szelektíven leoldjuk az oszlopról; eluálószerként vizes pufferoldatot használunk, amely grádiens szerint változó mennyiségben tartalmaz vízzel elegyedő szerves oldószert. Vízzel elegyedő szerves oldószerekként mindenekelőtt alkanolokat, így n-propanolt, izopropanolt, n-butanolt, tercbutanolt, etanolt és metanolt alkalmazhatunk. A humán fibroblaszt-interferon eluálására különösen előnyösnek bizonyult a propanol és butanol elegye.

Az eluátumot szokásos módon bontjuk frakciókra, és nagy érzékenységű módszerrel folyamatosan regisztráljuk az egyes frakciók fehérje-tartalmát. Erre a célra például a Bolilen és munkatársai lAnal. Biochem. 67, 438 (1975)] által ismertetett rendszert alkalmazhatjuk (lásd még a 3 876 881 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

A nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben legelőnyösebben felhasználható gyanták jellege a tisztítandó emberi fibroblaszt-interferon eredetétől és tisztaságától függően változik. A concanavalin A-sepharose oszlopról elkülönített anyagot a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben célszerűen ciklohexil-csoportokkal módosított szilicium-dioxid-oszlopon, majd oktilcsoportokkal módosított szilicium-dioxid-oszlopon tisztítjuk a homogenitás eléréséig. A blau dextrán-oszlopról származó anyagokat ezzel szemben egy vagy több lépésben egy oktilcsopoTtokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon vagy egy oktilcsoportokkal módosított, valamint egy ciano-propilcsoportokkal módosított szih'cium-dioxid-oszlopon bocsátjuk át, végül szükség esetén egy difenil-csoportokkal módosított szilícium-dioxid-oszlopon tisztítjuk a homogenitás eléréséig. Abban az esetben, ha szérummentes preparátumból származó interferonból indulunk ki, és az affinitás-kromatográfiai lépésben blau sepharose-4B oszlopot alkalmazunk, a teljes homogenitás eléréséhez elegendő, ha a nagynyomású folyadékkromatográfiás lépésben a tisztítandó anyagot egyetlen alkalommal egy oktilcsoportokkal módosított sziliciumdioxid-oszlopon bocsátjuk át.

Tekintettel arra, hogy a humán fibroblaszt-interferon semleges pH-értékeken szerves oldószerekre, így propánotokra, butanolra vagy 2-metoxi-etanolra érzékeny, a kromatografálást savas pH-értékeken végezzük. Minthogy a humán fibroblaszt-interferon a leukociía-interferonnál nagyobb mértékben hidrofób, és a részlegesen tisztított fibroblaszt-interferon preparátumok további, nagyobb mértékben hidrofób fehérjéket is tartalmaznak, a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépésben alkalmazott fordított fázison a propanol és butanol elegyét tartalmazó eluálószerek bizonyultak a legjobbnak. Propanol és butanol elegyének alkalmazásakor korlátozhatjuk az eluálószer szerves oldószer-tartalmát, és így csökkenthetjük az eluátumban megjelenő idegen adalék (szerves oldószer) mennyiségét.

A találmány szerinti eljárással kapott homogén humán fibroblaszt-interferont a mindenkori utolsó nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopon végzett átvezetés után egyetlen csúcsot adó anyag formájában különítjük el. A kapott tennék 2-merkapto-etanol jelenlétében végzett nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél-elektroforézis során egyetlen szűk sávot ad. A gél extrakciójakor egyetlen vírusellenes aktivitással rendelkező csúcsot kapunk, ami megfelel a fehérje-sávoknak. Erre a célra az emberi fibroblaszt-interferon aktivitásának meghatározására alkalmas bármilyen ismert vizsgálati módszert felhasználhatunk.

A homogén emberi fibroblaszt-interferon molekulasúlya (poliakrilamid gél-elektroforézis alapján meghatározva) 20 500 körüli érték. A tisztított anyag fajlagos aktivitása körülbelül 4X10⁸ egység/mg.

A homogén humán fibroblaszt-interferon mintájának vizsgálata során a következő (az. N-terminális oldalról kiinduló) aminosav-részszekvenciát határoztuk meg:

-3185 382

Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu^s-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-SerSer-Asn-Phe^ls-Gln-.... -Gln-Lys¹⁹-....

Az interferonok vírusellenes, tumorgátló, növekedésgátló és az immunreakciót visszaszorító aktivitással rendelkeznek. Ezek a hatásterületek klinikai körülmények között még akkor is kimutathatók, ha az interferont viszonylag szennyezett, 1%-nál kisebb mennyiségű emberi interferont tartalmazó készítmények formájában, 1-10X10⁶ egységnek megfelelő napi dózisban adják be a betegeknek. A találmány szerint előállított tisztított, homogén humán fibrobíaszt-interferont az ismert interferon-készítményekhez hasonlóan használhatjuk fel a gyógyászatban; a dózist azonban a megnövekedett tisztasági foknak megfelelően csökkentjük.

A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Az egység/ml vagy egység/mg értékekben megadott interferon-faktorok az US National Institute of Health intézetben elhelyezett standard emberi leukocita-interíeronra (G023-901-527) vonatkoztatott adatok.

Az egyes példákban kiindulási anyagként felhasznált nyers interferon-oldat előállítása Havell és Vilcek módszerével történik [Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2, 476-484(1972)].

Az egyes példák szerint felhasznált nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopok kereskedelmi forgalomban lévő termékek (gyártó cégek; ES Industries, Marlton, N. J. és Rainin, Piscataway, N. J., Amerikai Egyesült Államok). A difenil-csoportokkal módosított oszlopok a kereskedelemben nein szerezhetők be, ezért készítésüket a példákban ismertetjük.

7. példa

Affínitás-kromatográfia concanavalin A-oszlopon

0,1 mól α-ΜΜ-t tartalmazó PPK-oldattal (pH = 7,2) egyensúlyba hozott 50 ml concanavalin A-sepharose 4B gélt porózus polietilén-lemezzel ellátott, 50 ml térfogatú polipropilén-oszlopba töltünk. Az oszlopra 180 ml/óra (35,5 cm/óra) átfolyási sebességgel 1,25 liter nyers interferon-oldatot (2X10⁷ egység; fajlagos aktivitás 2X10⁴ egység/mg) viszünk fel. Ezután az oszlopot 150 ml PPKoldattal és 600 ml, 0,1 mól α-ΜΜ-t tartalmazó PPKoldattal mossuk. Végül az interferont 50 térfogat % •úilén-glikolt tartalmazó, a fentivel azonos összetételű pufferoldattal eluáljuk. Az interferont 9 %-os hozammal kapjuk (l,8X10⁵ egység: fajlagos aktivitás: kb. 1X10¹ egység/mg). További frakciók bevonásával, nagyobb sávszélességgel a hozam 15%-ra növelhető (3X10⁶ egység; fajlagos aktivitás: 2-4X10⁶ egység/mg).

Nagynyomású folyadék-kromatográfia

8:8:20:64 térfogatarányú piridin-hangyasav-izopropanol-víz eleggyel („A” pufferoldat) előzetesen egyensúlyba hozott, 4,6X300 mm méretű oszlopba töltött, ciklohexilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbensen (Chromegabond) 10 μ) 0:4-0,8 ml/perc átfolyási sebességgel- közvetlenül átvezetünk 120 ml, a concanavalin A-sepharose 4B-oszlopról elkülönített eluátumot (2,5X1O⁶ egység; fajlagos aktivitás: körülbelül 2-4X10⁶ egység/mg). A maximális nyomást 306 4 atmoszféra értéken tartjuk. A nagynyomású folyadékkromatográfia során felhasznált rendszer lényegében megfelel a Bohlen és munkatársai által ismertetettnek [Anal. Biochem. 67, 438 (1975)].

0,4 ml/perces átfolyási sebesség esetén a grádíenselúciót a következőképpen végezzük: az „A” pufferoldatból indulunk ki, és ahhoz a következők szerint keverünk „B” pufferoldatot (piridin, hangyasav, izopropanol, n-butanol és víz 8 8 :25 r29:39 térfogatarányú elegye): 0—25% „B” 32 perc; 25-60% „B”, 225 perc; 60-100% „B”_; 63 perc. Az eluátumot 2,0 ml térfogatú frakciókba gyűjtjük. A 26—29. frakciót (2X10⁶ egység) egyesítjük, 4 ml piridin-hangyasav eleggyel hígítjuk, majd közvetlenül felvisszük egy 4,6X X300 mm méretű, oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (Chromegabond 10 μ) töltött oszlopra. Az oszlopot a ciklohexilcsoportokat tartalmazó oszlopnál ismertetett körülmények között eluáljuk. Az aktivitási csúcs centrumában mért fajlagos aktivitás körülbelül 4X10⁸ egység/mg a tisztított humán fibrobíaszt-interferont 10⁶ egységnek megfelelő hozammal kapjuk.

A concanavalin A-oszlopon tisztított interferont a ciklohexilcsoportokat, illetve oktilcsoportokat hordozó nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopokon a főcsúcshoz igen közel eső tartományban eluáljuk. Ha a nagynyomású folyadék-kromatográfia során az anyagot először az oktilcsoportokat tartalmazó oszlopon kromatografáljuk, az interferont közvetlenül a főcsúcs előtt oldjuk le, míg ha első oszlopként ciklohexil-csoportokat tartalmazó oszlopot alkalmazunk, az interferont közvetlenül a főcsúcs után eluáljuk.

A nagynyomású folyadék-kromatográfiával tisztított emberi fibroblaszt-interferon mintáit (1 pg fehérje) trisz/glicin pufferoldatban, 12,5% vagy 15% nátriumdodecíl-szulfátot tartalmazó poliakrilamid gélen elektroforézisnek vetettük alá. Coomassie Blau színezékkel végzett megfestés után egyetlen sávot kaptunk. A vírusellenes vizsgálat eredményeinek elemzése során megállapítottuk, hogy az aktivitás maximuma a megfestett sáv centrumában van. A termék molekulasúlya körülbelül 20 500 (a mérés során összehasonlító anyagokként marhaszérum-albumint, kimotripszint, citokróm C-t és ribonukleázt használtunk fel). Az emberi fibroblasztinterferon-sáv relatív mozgékonysága a mintában független volt a merkapto-etanol jelenlététől.

2. példa

Blau dextrán-sepharose 4B oszlop előállítása g sepharose 4B gélt 1 liter desztillált vízzel mosunk, majd újabb 50 ml desztillált vízben szuszpendálunk. A szuszpenzlóhoz enyhe keverés közben 15 g finomra őrölt brómeiánt adunk, és az elegy pH-ját cseppenként adagolt 10 n nátriumhidroxid-oldattal ll±0,2-re állítjuk. Az adagolás során az elegy hőmérsékletét jég beadagolásával 20 ±5 °C-on tartjuk. 15—20 perc elteltével az elegyhez egy térfogatrész jeges vizet adunk, és a szuszpenziót Büchner-tölcséren ismét 5 térfogatrész 0,01 n sósavoldattal mossuk.

Az aktivált gyantát azonnal 50 ml, 1,00 g oldott blau dextránt tartalmazó 0,4 mólos nátrium-karbonátpufferoldatban (pH = 9,5) szuszpendáljuk, és a szusz-41

185 382 penziót éjszakán át 4 °C-on, gömblombikban rázzuk. A szilárd anyagot 10 térfogatrész 1 mólos nátriumkloríd-oldattal és 2 térfogatrész, 1 mól nátrium-kloridot és 0,05 mól nátrium-foszfátot tartalmazó 50 térfogat %-os etilén-glikollal (pH = 7,2) mossuk, éjszakán át 50 térfogat %-os etilén-glikolban állni hagyjuk, majd egy térfogatrész 80 térfogat %-os etilén-glikollal és 5 térfogatrész Gibco No. 11 minimális közeggel (MÉM) mossuk, (kereskedelmi forgalomban lévő termék; gyártó cég; Gibco Laboratories) és ebben a közegben éjszakán át 50 °C-on tartjuk. A gyantát ismét 3 térfogatrész, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó 80 térfogat %-os vizes etilénglikollal, végül 2 térfogatrész MEM-mel mossuk, majd MEM-ben szuszpendáljuk és oszlopba töltjük.

Affinitás-kromatográfia ml blau dextrán-sepharose 4B gyantát tartalmazó, porózus polietilén-lemezzel ellátott, 50 ml térfogatú polipropilén-oszlopon lOOml/óra (20 cm/óra) átfolyási sebességgel 1,5 liter nyers emberi fibroblaszt-interferon oldat [2X10⁴ egység/ml, 1 mg fehérje/ml; fajlagos aktivitás: 2X10⁴ egység/mg fehérje] és 0,27 térfogatrész telített vizes nátrium-klorid-oldat (körülbelül 6,3 mól nátriumklorid) elegyét bocsátjuk át. Az oszlopot egymás után 200 ml, 0,05 mól nátrium-foszfát-puffert (pH = 7,2) tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal és 500 ml, 0,05 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) és 75 ml etilénglikolt tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, végül 500 ml, 0,05 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) és 250 ml etilénglikolt tartalmazó 1 mólos nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az interferons körülbelül 90 %-át egyetlen csúcsban eluáljuk az áttört, 50 % etilén-glikolt tartalmazó, oldószerrel együtt. A csúcs maximumának fajlagos aktivitása, amellyel az összes interferon több mint 50%-át eluáltuk, IX10⁷ egység/mg.

Nagynyomású folyadék-kromatográfia

A) 1 mólos nátrium-klorid-oldat és 50 térfogat % etilénglikol elegyével előzetesen egyensúlyba hozott, 4,6X300 mm méretű oszlopba töltött, oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbensen⁴5 (Chromegabond 10 μ) 125 ml, a blau dextrán-sepharose 4B oszlopról elkülönített interferonoldatot [3X10⁷ egység; fajlagos aktivitás: IX10⁷ egység/mg] bocsátunk át. 0.45 ml/perc átfolyási sebesség esetén az oszlopot „A” pufferoldatból (piridin, hangyasav, izopropanol, n-buta- 50 nol és víz 8:8:20:3,3:60,7 térfogatarányú elegye) kiindulva és a „B” pufferoldat (piridin, hangyasav, izopropanol, n-butanol és víz 8 :8 :25 :70:39 térfogatarányú elegye) felé haladva a következő grádiens szerint eluáljuk: 0-25 % „B” 30 perc; 25-55 % „B”, 190 perc; ⁵⁵ 55-100% „B”, 20 perc; 100% „B”, 60 perc. A 18-23. frakcióban az interferon-aktivitás lényegében egyetlen fehéije-csúcsnak felel meg (mindegyik frakció 1,5 ml eluáló folyadékot tartalmaz).

(B) Az (A) pontban felhasznált anyagmennyiség ⁶⁰ körülbelül egynegyedét visszük fel az (A) pontban ismertetett oszlopra, és az oszlopot az 1. példában, a ciklohexilcsoportekat tartalmazó oszlopnál ismertetett körülmények között eluáljuk. A 24-26. frakcióban az interferon-aktivitás egyetlen fehérje-csúcsnak felel meg. θ5 (C) A kromatografálást az (A) pontban ismertetett anyagmennyiséggel, átfolyási sebességgel és gradienssel végezzük, a (B) pontban felhasznált „A” és „B” pufferoldatot alkalmazzuk, adszorbensként pedig oktilcsoportokat tartalmazó, 9,6X500 mm méretű oszlopot (Chromegabond) használunk [a felvitt anyagmennyiség és az oszloptérfogat aránya 1/9]. Az előzőeknél jobb minőségű elválasztást érünk el.

(D) Az (A) pontban ismertetett eljárással kapott, legnagyobb fajlagos aktivitású [4X10⁸ egység/mg] anyagot ciano-propil-csoportokat tartalmazó oszlopon újra kromatografáljuk. Eluálószerként kezdetben piridin, hangyasav és víz 8:8:84 térfogatarányú elegyét használj uk, és az eluálószerben a n-propanol részarányát egy óra alatt, gradiens szerint 0-ról 40 térfogat %-ra növeljük. Az átfolyási sebességet 0,3 ml/percre állítjuk be. Szimmetrikus főcsúcsot kapunk.

Elektroforézis NaDodSO^ - poliakrilamid gélen

Az (A), (B) és (C) pontban ismertetett eljárással kapott interferon mintáit az 1. példában ismertetett módon gél-elektroforézisnek vetettük alá. 20 500-as molekulasúlyú anyagból álló főcsúcsot kaptunk, amely egybeesik az interferon-aktivitás vizsgálatban meghatározott aktivitási csúcs közepével. Mintáról mintára változó mennyiségben egy másik, körülbelül 10 500-as molekulasúlyú anyagnak megfelelő csúcsot is észleltünk, amely — az elszíneződés intenzitása alapján — a teljes anyagmennyiség körülbelül 20—50%-ának felelt meg, és vírusellenes aktivitást nem mutatott. Azokban a kísérletekben, amikor a mintákat nem kezeltük merkapto-etanollal, egy 40 000-es molekulasúlyú sávot is észleltünk, amely azonban csak alárendelt mértékű aktivitással rendelkezett. A 20 000-es és 40 000-es molekulasúlyú sávok aminosav-elemzésének eredményei nem tértek el egymástól, míg a 10 000-es molekulasúlyú sáv aminosav-elemzésének eredményei jelentősen eltértek az előzőektől.

A (D) pont szerint kapott interferon mintájának molekulasúlya - az elektroforézis eredményei alapján kb. 20 500, fajlagos aktivitása pedig 4X10® egység/mg volt. Ezt a homogén pepiidet 24 órán át 6 n sósav-oldatban hidrolizáltuk, majd meghatároztuk az aminosavak mennyiségét. Az észlelt eredményeket - leucinra vonatkoztatva és a leucint 25,0-nak tekintve - az alábbiakban soroljuk fel:

Asx	15,4 + 0,2	Alá	11,8 + 0,4	Tyr	9,6 + 0,2
Thr*	7,8 + 0,3	Cys	n.h.	Phe	7,3 + 0,1
Ser*	7,7 + 0,2	Val	6,9 + 0,1	His	4,5 ±0,1
Glx	24,1 + 0,4	Met	2,8 + 0,4-	Lys	11,6 + 0,4
Pro	2,8 + 0,4	He	8,7±0,l	Arg	8,8 ±0,4
Gly	4,9 ±0,3	Leu	25,0	Trp	n.h.

* = korrigált érték

n.h. = nem határoztuk meg

3. példa

Affinitás-kromatográfia blau dextrán-sepharose adszorbensen (a) 5 liter tenyészetet [előállítása Havell és Vilcek módszerével történik: Antimicrobial Agents and Chemo5

-5185 382 therapy 2, 476- 484 (1972) fibroblaszt interferontartalom: 19 400 egység/ml] 0,3 μ pórusméretű szűrőn szűrünk, majd a szűrletet 275 ml blau dextrán-sepharose adszorbenssel töltött oszlopra visszük fel. A szűriethez előzetesen 1,25 mólos nátrium-klorid-koncentráció eléréséig 1350 ml telített vizes nátrium klorid-oldatot (6,3 mól) adunk. Az oldatot 360 ml/óra átfolyási sebességgel szivattyúzzunk az oszlopra. Az interferon körülbelül 4-6 %-a adszorbeálódás nélkül áthalad az oszlopon.

(b) Ezután az oszlopot 420 ml/óra átfolyási sebességgel 1300 ml vizes oldattal mossuk, amely 15 térfogat % etilénglikolt, 1 mól nátrium-kloridot és 0,02 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) tartalmaz. Az adszorbeált interferon körülbelül 1 %-át a mosás során leoldjuk az oszlopról.

(c) Ezután az interferont 50 térfogati, etilénglikolt, 1 mól nátrium-kloridot és 0,02 mól nátrium-foszfátot (pH = 7,2) tartalmazó vizes oldattal 420 ml/óra átfolyási sebességgel eluáljuk. Az eluátum első 200 ml-es frakciója csak kevés interferont tartalmaz. Miként az alábbi táblázat adataiból megállapítható, az interferon főtömege a következő — összesen 300 ml térfogatú — eluátumfrakciókban dúsul fel.

Frakció száma	Frakció térfogata, ml	Fehérje pg/ml	Interferon faktor egység/ml	Fajlagos aktivitás egység/mg
1.	200	n.h.	122
2.	50	43	3,8X10®	9,02X10®
3.	50	82	11,64X10®	1.42X107
4.	50	64	7,72X10®	1.23X 107
5.	50	62	1,94X10®	3,13X10®
6,	50	49	9,7X104	1,97X10®
7.	50	41	3,64X10®	8.87X105

A bemért interferon-aktivitás összesen 114 %-át nyertük vissza.

Nagynyomású folyadék-kromatográfia

A blau dextrán-sepharose oszlopról elkülönített

2-6. frakciót (250 ml; 13X10⁷ egység, fajlagos aktivitás: 8,12X10® egység/mg] 4 ml/perc átfolyási sebességgel egy 9,5X500 mm méretű, oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbens-oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopon 12 perc alatt 2 ml/perc átfolyási sebességgel „A” pufferoldatot (piridin, hangyasav, 2-propanol, n-butanol és víz 8:8:20:2,5:61,5 térfogatarányú elegye) szivattyúzunk keresztül. Ezután az eluálást 1,25 ml/perc átfolyási sebességgel folytatjuk, az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat (piridin, hangyasav, 1-propanol, n-butanol és víz 8:8:25:25:34 térfogatarányú elegye) felé haladva folytatjuk, a következők szerint: 0-20% „B” 18 perc; 20-29% „B” 57 perc; 29% „B” (izokratikus) 27 percen keresztül; 29-30% „B” 3 perc, 30-100% „B” 36 perc; 100% „B” 54 perc.

Az interferon-aktivitás a grádienselúció izokratikus tartományában dúsul fel egyetlen csúccsal, amit fluoreszcamin monitor-rendszerrel mutattunk ki. Az 50 ml-es frakció 45X10® egység (hozam: 35 %) interferont tartalmaz, amelynek fajlagos aktivitása 2X10⁸ egység/mg. 6

A terméket zárt polipropilén-ampullákban 2 hónapon át —20 °C-on tárolva az aktivitás a nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépés után mért érték 10%-ára esik vissza, a fehérjetartalom azonban nem csökken.

A fentiek szerint kapott 50 ml térfogatú frakciót [fajlagos aktivitás: körülbelül 0,2X10® egység/mg] 1 ml tiodiglikollal és 20 ml n-propanollal keverjük össze.

A kapott elegy aktivitása - aktivitás vizsgálattal meghatározva - összesen 4,26X10® egység. Az elegyhez 100 ml 0,1% Triton X-100) 0,3% tiodiglikol elegyet adunk, majd a kapott elegyet (amelynek aktivitás vizsgálattal meghatározott interferon-tartalma összesen 5,1X10® egység), 30 perc alatt, 1,5 ml/óra átfolyási sebességgel átszivattyúzzuk egy ciano-propil-csoportokát tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (5 p/8X10^_® mm, Spherisorb) töltött, 4,6X250 mm méretű oszlopon. Az interferon felvitele előtt az oszlopot „A” pufferoldattal (piridin, hangyasav és víz 8:8:84 térfogatarányú elegye) hozzuk egyensúlyba. Ezután az oszlopot 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel grádienselúciónak vetjük alá, az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat (piridin, hangyasav, n-propanol és víz 8 :8 :5034 térfogatarányú elegye) felé haladva, a következők szerint: 0-25% „B” 30 perc; 25-50% „B” 210 perc. Az _x interferon-aktivitás az egyetlen meghatározott csúcsban jelenik meg. Három, egyenként 1 ml-es frakcióban 4,2X 10® egység (82%) interferont nyerünk vissza.

Ezt az egyesített frakciót, amely az első cianocsoportokat tartalmazó oszlopra felvitt összfehérje 69%-ának felel meg, 2 ml 0,1 %-os Triton X-100 oldattal elegyítjük, és az elegyet ismét átbocsátjuk ugyanazon a ciano-csoportokat tartalmazó oszlopon. A grádienseiúciót ugyanolyan arányokkal, azonban csak az előzőekben megadott idő feléig végezzük. A teljes aktivitás (11,75X10® egység; hozam 280%). egyetlen csúcsban jelenik meg.

A második ciano-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott, interferon-'aktÍvitást mutató, összesen 4 ml térfogatú frakciót 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel egy difenil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel töltött, 4,6X250 mm méretű oszlopon szivattyúzzuk át. Az adszorbenst előzetesen két órás lineáris grádienskezeléssel az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat felé haladva előkezeljük, majd az „A” pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. Az „A” és a „B” pufferoldat összetétele azonos a ciano-csoportokat tartalmazó oszlop eluálásakor alkalmazottakkal.

Az adszorbens-oszlopot az „A” pufferoldattól a „B” pufferoldat felé haladva 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel gradienselúciónak vetjük alá a következők szerint: 0-25 % „B” 22 perc; 25-50% „B” 98 perc. A második csúcs, amit akkor oldunk le, amikor a grádiensmérő műszer 33 %-os „B” pufferoldat-tartalmat jelez, megegyezik az interferon-aktivitási csúccsal. Ez a csúcs összesen 2,6X10® egység (22%) aktivitást és 40 pg fehérjét tartalmaz.

A difenil-csoportokat hordozó szilícium-dioxid-oszlopot a következőképpen állítjuk elő:

10^-2 mm szemcseméretű. 10^-5 mm pórusméretű szilíciumdioxidot 10:1 térfogat/súlyarányban 6 N sósavoldatban áztatunk 24 órán át, időnkénti rázogatás közben. Ezután a szilíciumdioxidot vízzel semlegesre mossuk, majd acetonnal és metanollal végzett mosással eltávolítjuk a vizet. A szilícium-dioxidot éjszakán át csökkentett nyomáson szárítjuk, majd 1 g így kapott anyagot

185 382 ml diklór-difenil-szilánt tartalmazó 100 ml vízmentes toluolhoz adunk, és az elegyet 6 órán át visszafolyatás közben forraljuk. A kapott módosított kovasavat először 200 ml toluollal mossuk, majd Soxhlet-extraktorban

8-8 órán át egymás után 250-250 ml toluollal, aceton- 5 nal és metanollal kezeljük. Végül a szilárd anyagot a fent ismertetett módon trimetil-klórszilánnal kezeljük.

Ezután 3-3 g hordozóanyagot 10,7 ml kloroform és 2,3 ml n-butanol elegyében szuszpendálunk, és a szuszpenziót 340 atmoszféra nyomáson 4,6X250 mm 10 méretű, rozsdamentes acélból készült oszlopba töltjük. Ezután az oszlopokat 75-75 ml etanollal mossuk.

A kapott interferon-csúcs középső frakcióját 5,7 N sósavoldattal hidrolizáljuk, majd meghatározzuk az aminosavak mennyiségét. Az eredményeket az alábbi 15 táblázatban közöljük:

Asx 15,4	17,6	17,95	15,2 Thr*
7,8	8,6	8,4	7,3 Ser*
7,7	8,3	9,1	9,9 Glx	20
24,1	21,1	21,4	n.h. Pro
2,8	n.h.	n.h.	3,36 Gly
4,9	6,9	6,6	7,4 Alá
11,8	10,7	10,7	9,9 Cys
n.h.	3,96	3,4	n.h. Val	25
6,9	7,84	8,2	6,9 Met
2,8	4,5	4,5	3,7 Ile
8,7	8,6	8,9	7,8 Leu
25,0**	25**	25**	25** Tyr	30
9,6	10,3	9,0	8,1 Phe
7,3	9,5	9,8	9,0 His
4,5	7,5	6,9	6,1 Lys
11,6	12,3	11,8	11,25 Arg
8,8	11,25	10,6	8,8 Trp
n.h.	n.h.	n.h.	2,93	35
24 óra TGS	24 óra TGS	48 óra TGS	24 óra TGS

TGS = tioglikolsav 40 * = korrigálatlan érték ** = vonatkoztatási érték nJi. = nem határoztuk meg.

A difenil-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott 45 interferon-csúcs középső frakciójából mintát veszünk, a mintát 0,02% tioglikolsavat tartalmazó 5,7 N sósavoldattal 110 °C-on 6, 14 és 24 órán át hidrolizáljuk, majd meghatározzuk a hexózaminokat. A mérés szerint az interferon molekulánként 3 glükózamin-csoportot 50 tartalmaz; az elemzés sem galaktózamint, sem mannózamint nem mutatott ki.

A végcsoport-meghatározáshoz a difenil-csoportokat tartalmazó oszlopról leoldott interferon-csúcs középső frakciójából származó 90 pmól súlyú mintát használtunk 55 fel. A mérés szerint az interferon N-terminális aminosavként metionint (Met) tartalmaz.

Fibroblaszt- és leukocyta-interferon 150-150 pmólos mintáit triptikus lebontásnak vetettük alá, majd a mintákat kromatografáltuk. A két mintában nem találtunk azonos peptid-fragmenseket.

Fibroblaszt-interferon 1,25 nmólos mintájában meghatároztuk az aminosavak szekvenciáját. Az elemzés szerint a fehérje N-terminális aminosavként Met-t tartalmaz, a 3-10. aminosav szekvenciája pedig Tyr³-Asn-LeuLeu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰, ami megegyezik a Hunkapillar és Hood által közölt adatoknak [Biochemistry 17, 2124 (1978)]. A fibroblaszt-interferon további 5,9 nmólos mintájának elemzése alapján a következő N-terminális aminosav-szekvenciát kaptuk: H₂N-Met¹-Ser-Tyr-AsLeu^s-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe^ls Gin- ...Gln-Lys¹⁹-....

4. példa

Emberi fibroblasztból (GM 2504A sejtvonal) nyers interferont különítünk el. A nyers interferonhoz annyi telített, vizes nátriumklorid-oldatot adunk, hogy a kapott oldat nátriumklorid-koncentrációja 1 mólos legyen. Az így kapott oldatot Blau Sepharose-4B oszlopra visszük fel [térfogat: 20-25 ml, átmérő: 2,5 cm, átfolyási sebesség: 2,5 ml/perc]. A nyersanyagot a felvitel során jéggel hűtjük. A felvitel után az oszlopot

2,5 ml/perc átlolyási sebességgel 250 ml oldattal mossuk, amelynek összetétele a következő: 30% etilénglikol, 2 mól NaCl, 50 millimól Na₂HPO₄ (pH = 7,2).

Végül az interferont 2,5 ml/perc átfolyási sebességgel 250 ml oldattal eluáljuk, amelynek összetétele a következő: 50% etilén-glikol, 1 mól NaCl, 50 millimól Na₂HPO₄ (pH = 7,2).

Az oszlopon átfolyt oldatok jellemző elemzési adatai a következők:

az aktivitás 5 %-a az átfolyt interferon-oldatban jelenik meg;

az aktivitás 15 %-a a 30 %-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg;

az aktivitás 85 %-a az 50%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg.

Az első blau sepharose-oszlopról távozó, az interferon-csúcsnak megfelelő frakciókat egyesítjük, és az egyesített oldat etilén-glikol-tartalmát pufferoldattal (2 mól NaCl, 50 millimól Na₂HPO₄; pH = 7,2) 10 térfogat %-ra állítjuk be.

A kapott oldatot blau sepharose-oszlopra visszük fel [térfogat: 20-25 ml, átmérő: 2,5 cm, átfolyási sebesség:

2,5 ml/perc]. Az oszlopot 250 ml, 2 mól nátrium-kloridot, 50 millimól dinátrium-hidrogén-foszfátot (pH = = 7,2) és 30 térfogat % etilén-glikolt tartalmazó oldattal mossuk, majd 2 mól nátrium-kloridot, 50 millimól dinátrium-hidrogén-foszfátot (pH = 7,2) és 50 térfogat% etilén-glikolt tartalmazó oldattal eluáljuk.

Az oszlopon átfolyt oldatok jellemző aktivitáselemzési adatai a következők:

az aktivitás 10 %-a az átfolyt interferon-oldatban jelenik meg;

az aktivitás 30 %-a a 30 %-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg;

az aktivitás 60%-a az 50%-os etilén-glikol-oldatban jelenik meg.

Nagynyomású folyadék-kromatográfia

Először a blau sepharose-oszlopról 50%-os etilénglikol-oldattal leoldott mintát vizsgáljuk. Ezután a blau sepharose-oszlopon kétszer kromatografált mintákat vizsgáljuk; ekkor mind a 30 %-os, mind pedig az 50%-os etilén-glikol-oldattal kapott eluátumokat felhasználhatjuk.

⁷ í

-7185 382

A nagynyomású folyadék-kromatográfiához oktilcsoportokkal módosított szilícium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (Lichrosorb RP-8) töltött, 25X0,46 cm méretű oszlopot használunk fel. Az oszlopot először vízzel mossuk, majd felvisszük a blau sepharose-oszlopról távozó eluátumot. A szivattyú elé 5 ml térfogatú elegyítő kamrát helyezünk el. Az oszlopot 1 mól hangyasavat és 0,8 mól piridint tartalmazó oldattal (pH —4»2) eluáljuk, és az eluáló oldat n-propanol-tartalmát a következők szerint növeljük: 0% 10 perc; 30% 40 perc; 32% 40 perc.

Végül az oszlopot 60 %-os n-propanollal mossuk, és a következő felhasználás előtt 1 mólos hangyasavval és 0,08 mólos piridinnel egyensúlyba hozzuk.

Az interferont a 32 % n-propanolt tartalmazó oldattal (a 80. és a 90. perc között) oldjuk le. A kapott termék a NaDodSO4-akrilamid gélen végzett elektroforézis eredményei alapján (Coomassie blau-val végzett színezés, vagy a minta előzetes jelzése Fluram-mal) homogén.

Négy különböző készítményből kilenc különböző mintát vettünk, és a mintákat 0,2% TGS-t tartalmazó

5,7 n sósavoldatban 24 órán át hidrolizáltuk. Ezután meghatároztuk az aminosav-tartalmat. Az átlagos ami.nosav-összetételt (22,0-ás leucin-értékre vonatkoztatva) az alábbiakban közöljük:

Asx	15,1 ±0.7	Met	4,5 ±0,7
Thr*	7,0 + 0,5	He	9,4 ±0,1
Ser*	7,5 + 0,5	Leu	22,0
Gly	22,2 ±0,5	Tyr	8,8 ±0,2
Pro	n.h.	Phe	8,0 ±0,3
Cys	3,0+0,3	His	4,5 ±0,1
Gly	6,9 + 0,7	Lys	ll,0±0,6
Alá	7,4 ±0,0	Arg	11,9 ±0,7
Val	5,7 + 0,5	Trp	n.h.

*korrigálatlan érték

A jelen és az előző példákban ismertetett különböző eljárásokkal kapott minták különböző időpontokban végzett elemzései alapján a homogén emberi fibroblaszt-interíeron aminosav-összetétele (±15 %-os eltéréssel) a következő [a hidrolízist 24 órán át 0,2 % tiglikolsav (TGS) jelenlétében 6 n sósavoldattal végeztük]:

Asx	15,1	Gly	6,9	Tyr	8,8
Thr*	7,0	Alá	7 A	Phe	8,0
Ser*	7,5	Val	5,7	His	4,5
Glx	22,2	Met	4,5	Lys	11,0
Pro	3^0	Ile	9,4	Arg	11,9
V S	3,9	T *♦ Leu	22,0	Trp	3,0

*konigáiatlan érték * vonatkoztatási érték

5. példa

1,5 mg homogén humán fibroblaszt-interferont [fajlagos aktivitás: 4X10® egység/mg] 25 ml 5%-os normál emberi szérumalbuminban oldunk. Az oldatot bakteriológiai szűrőn szűrjük, és aszeptikus körülmények között 100 ampullába töltjük. Minden egyes ampulla 6X10® egység tiszta interferont tartalmaz parenterális adagolásra alkalmas formában. Az ampullákat felhasználásig előnyösen hűtés közben (—20 °C-on) tároljuk.

Claims (6)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy szennyezett humán fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként: concanavalin A-sephaioset, blau dextrán-sepharoset vagy blau sepharose 4B-t tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk Fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadék-kromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, difenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propilcsoportokat tartalmazó szih'cium-dioxid-mátrix-alapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopon adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanolgrádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas, vizes, 4-8 pH-jú rendszerrel eluáljuk.

   (Elsőbbség: 1980. március 14.)
2. 2. Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy szennyezett humáh fibroblaszt-interferon-oldatot adszorbensként concanavalin A-sepharoset vagy blau dextrán-sepharoset tartalmazó affinitás-kromatográfiás oszlopra viszünk fel, az oszlopon adszorbeált interferont foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat/etilén-glikol rendszerrel eluáljuk; a kapott tisztított frakciókat nagynyomású folyadékkromatográfiás körülmények között egy vagy több, pufferrel egyensúlyba hozott, ciklohexil-, fenil-, oktil-, oktadecil- vagy ciano-propil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-rnátrix-alapú kromatográfiás oszlopon rétegezzük és az oszlopra adszorbeált interferont kis szénatomszámú alkanol-grádiens - előnyösen három vagy négy szénatomos alkanol-grádiens - alkalmazásával, pufferolt, savas, vizes, 4-8 pH-jú rendszerrel eluáljuk.

   (Elsőbbség: 1979. július 31.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromatografálásnál concanavalin A-sepharoset alkalmazunk és a nagynyomású folyadék-kromatográfiát előbb ciklohexilcsoportokat tartalmazó szih'cium-dioxid-oszlopon, majd oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon végezzük el; és grádiens szerint növekvő mennyiségű n-butanolt tartalmazó piridin - hangyasav - 2-propanol - n-butanol - víz elegyeket alkalmazunk, rhol is az eluálószer kiindulási összetétele 8:8:20:0:64 térfogat/térfogat rész és végső összetétele 8 :8:25 :20:39 térfogat/térfogat rész.

   (Elsőbbség: 1979. július 31.)
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromatografálásnál blau dextrán-sepharoset alkalmazunk és a nagynyomású folyadék-kromatografálást oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon, grádiens szerint növekvő mennyiségű n-butanolt tartalmazó piridin - hangyasav - 2-propanol — n-butanol — víz elegyekkel végezzük el, ahol is az eluálószer kiindulási összetétele 8:8:20:3,3:60,7 térfogat/térfogat rész vagy 8 :.8:20:0:64 térfogat/térfogat rész és végső összetétele 8:8:25:20:39 térfogat/térfogat rész.

   (Elsőbbség: 1979. július 31.)
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy az affinitás-kromato-81

   185 382 grafálásnál szérummentes készítményből származó interferont blau sepharose 4B adszorbensen kötünk meg; a nagynyomású folyadék-kromatogiafálást oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon végezzük el, és az eluálást piridin - hangyasav - n-propanol - víz 5 elegyekkel, az n-propanol-grádiens nem-folyamatos, lépésenként történő növelése mellett hajtjuk végre, az alábbi n-propanol-grádiensek alkalmazásával (térfogat/térfogat rész): 10 perc: 0%, 40 perc: 30%, és 40 perc: 32%; és az interferont a 80. és 90. perc között 10 eluáljuk.

   (Elsőbbség: 1980. március 14.)
6. 6. Az 1-5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az oktilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopról eluált egyesített interferon-frakciókat cianopropil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon újra kromatografáljuk és grádiens szerint növekvő mennyiségű n-propanolt tartalmazó piridin - hangyasav - n-propanol - víz elegyekkel eluáljuk, ahol is az eluálószer kiindulási összetétele 8:8:0:84 térfogat/térfogat rész és végső összetétele 8:8:40:44 térfogat/térfogat rész; az egyesített frakciókat ugyanezen az oszlopon újrakromatografáljuk, végül difenil-csoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-oszlopon ismét kromatografáljuk.