JPS60161923A - ヒトウロガストロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトウロガストロン（以下ヒトＵＧと略す）の
製造方法に関する。

〔発明の背景〕

ヒトＵＧは１９３９年頃から妊婦には消化性潰瘍が少な
いという臨床的観察から尿中にその存在ら２種類（β−
型、γ−型）のＵＧの単離に成功し、そのアミノ酸配列
を決定した（Ｈ、Ｇｒｅｇｏｒｙ　；ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２５７巻、３２５−３２７頁、１９７５年
）。グレゴリ−はこれらβ−型及びγ゛−型のＵＧをそ
れぞれ次のように同定した。

総アミノ酸数５３及び５２（いずれも１６種のアミノ酸
からなる１本鎖ポリペプチド）、等電点４．５及び４．
３、ｐＨ８，９でのアクリルアミドゲル電気泳動のブロ
ムフェノールプルに対する相対移動度０．５４及び０．
６６、ろ紙クロマトグラフィのＲｆ；０．５９及び０．
６５であり、γ型ＵＧはβ型ＵＧ停Ｃ末端のアルギニン
残基が欠けたものである。このＵＧはコーエン（Ｃｏｈ
ｅｎ）らが累ウスの顎下線から単離した上皮細胞成長因
子［（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏ
ｒ　；以下ＥＧＦと略称；ニス・コーエン（Ｓ　、　Ｃ
ｏｈｅｎ）ら；ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｃ’Ｅ％ｉ
’１ｓｔｒｙ　）’、２３７巻、１５５５−１５６２頁
、１９６２年）〕と同同一姓を有することから、人尿由
来のＥＧＦと同一とみなされており、胃酸分泌抑制作用
や上皮細胞その他の細胞の成長促進作用があるので医薬
品及び組織培養に用いる錘加剤として有用である。

サヴエージ（Ｓａｖａｙｅ）らは、マウスのＥＧＦの精
製法を応用して妊婦尿から、２種類のヒトＥＧＦを単離
した〔シー・アール・サヴエージら（Ｃ、Ｒ，５ａｖＱ
ｙｅ　ａｔ　ａｌ）　；アナリテイカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）１１１巻、１９５−２０頁、１９８１年〕。この
ヒトＥＧＦは分子量約５５００で１６種のアミノ酸４９
個から成るがその配列順序、純度などは明らかでない。

ヒトＵＧは唾液、血液、尿などの体液の他顎下腺や消化
管中にその存在が知られている。比較的多いとされる尿
中でもその含量は極めて少なく、５０〜１００μｇ／Ｑ
程度に癌ぎず経済的に回収するのは困難である。ヒト尿
中のヒトＵＧを回収する方法として酸性法をたん白沈澱
剤で処理する方法が知られる。沈澱剤として安息香酸〔
エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）
　３立巻、１２９頁（１９４２年）〕、タンニン酸〔ホ
ツペーゼイラーズ・ゼット（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ
ｓ　Ｚ）著；フイジオロジカル・ケミストリー（Ｐｈｙ
ｓｉｏｌｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）　３５６巻、
１７６５頁（１９７５年）〕等が用いられる。これらは
、タン白一般の沈澱法でヒトＵＧ特異性に欠ける。その
他イオン交換樹脂による吸着法〔ジャーナル・オブ・ク
リニカル・エンドクリノロジ−０アンド・メタクリル酸
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ）土
１巻６６７頁（１９７９年）〕も知られている。

これらを更に精製する方法として、グレゴリ−は有機溶
媒による分別抽出法、イオン交換法、ゲルろ過法等の１
１工程をくり返し、又、サヴエージらはイオン交換法お
よびゲルろ過法を組みあわτ せて５工程まで短縮し木精製した。

しかし、以上の方法で得られる胃酸分泌抑制物質は純度
及び収率の点で十分なものとは言い難い。

〔発明の目的〕

本発明はこのような問題点を解決し高精度のヒトＵＧを
収率よく得るために有用であり、他の工点とも組合せる
ことのできる一工程を提供するものである。

〔発明の構成〕

すなわち、本発明は、ヒトＵＧを含有する試料から逆相
分配型液体クロマトグラフィーによりヒトＵＧを含む分
画を採取することを特徴とするヒトＵＧの製造方法に関
する。

ヒトＵＧを含有する試料としては、尿そのもの。

尿をセライトろ過したろ液、ヒトＵＧを産生する組織又
は細胞からの抽出液、該組織又は細胞の培養液、遺伝子
組換えによりヒトＵＧを生産する細菌又は酵母からの抽
出液、該細菌又は酵母の培養液等が用いられる。また、
これらを次のような工程で部分精製したものも含まれる
。

（１）弱酸性吸着剤（ポリアクリル酸系イオン交換樹脂
、ポリメタクリル酸系イオン交換樹脂等）を使用し、吸
着条件として上記試料を酢酸、蟻酸、塩酸等の酸により
ｐＨ３〜４にして吸着させた後、ｐＨ３〜５の弱酸性下
で洗浄し、水酸化アンモニウム等により弱アルカリ性に
て溶出試 させてヒトＵＧを含有する饋料としたもの（吸着−溶出
法）。

（２）中性合成吸着剤である巨大網状ポリマー（スチレ
ン−ジビニルベンゼン系共重合体、アクリル酸エステル
系重合体、メタクリル酸エステル系重合体等）を吸着剤
とし、上記試料そのもの、ｐＨ３〜８の間で緩衝化させ
た上記試料又は食塩、硫酸ナトリウム等の塩を添加した
上記試料を用いて吸着させた後、水溶性有機溶剤（例え
ば、メタノール、アセトニトリル、ｎ−プロパツール等
）を含む水溶液で溶出させてＵＧを含有する試料とした
もの（吸着−溶出法）。

（３）上記試料をセライトろ過して沈渣を除去したろ液
を分画分子量３万の限外ろ過を行ない、そのろ液をさら
に分画分子量１０００の限外ろ過で濃縮して得られたヒ
トＵＧ分画（限外ろ過法）。

（４）上記（１）、（２）及び（３）に工程のうち二工
程以上を組合せて部分精製して得られたヒトＵＧ分画。

（５）上記（１）、（２）、（３）又は（４）で得られ
た部分精製物をゲルろ過１１Ｃ担体として、架橋デキス
トランゲル、架橋ポリアクリルアミドゲル等の親水性ゲ
ルが好ましいンで、好ましくは０．０２Ｍ以上でｐＨ５
〜９の緩衝液（酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等）により展
開して得られアミノエチルアガロース等の弱塩基性イオ
ン交換樹脂をカラムに詰めて０．０５Ｍ以下でｐＨ５〜
８，５　の緩衝液（酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等）で平
衡化したのち、上記（１）、（２）。

（３）、（４）又は（５）で得られたヒトＵＧ分画の脱
塩溶液を負荷して上記樹脂にヒトＵＧを吸着させ、上記
と同様の緩衝液を使用して塩濃度勾配法（塩としては、
塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム等が使用される）に
よって溶出させて得られたヒトＵＧ分画（陰イオン交換
クロマトグラフィー）。

（７）カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチル
アガロース等の弱塩性イオン交換樹脂を詰めたカラムに
上記（１）、（２）、（３）。

（４）又は（５）で得られたヒトＵＧ分画の脱塩溶液を
負荷し０．０１〜０　、０５　Ｍ　ｐ　Ｈ３、５〜４．
０の緩衝液（たとえば酢酸緩衝液、ギ酸緩衝液等）にて
塩濃度勾配（塩としてはたとえば塩化ナトリウム、酢酸
アンモニウム等）を用いて溶出させて得られたヒトＵＧ
分画（陰イオン交換クロマトグラフィー）。

（８）上記（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）
で得たヒトＵＧ分画を塩酸等で酸性（ＰＨ１〜２）とし
たのち塩酸等で酸性（ｐＨ１〜２）にし〃平衡化させた
架橋ポリアクリルアミドゲルに負荷し展開させて得られ
たヒトＵＧ分画（吸着型クロマトグラフィー）。

（９）上記（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）
で得たヒトＵＧ分画の脱塩溶液を上記（６）、（７）お
よび（８）の工程のうち二工程以上を組合わせて部分精
製し唇得られたヒトＵＧ分画。

本発明の逆相分配型液体クロマトグラフィーにおいて用
いられる逆相分配型カラムに充填するカラム剤としては
、多孔性のスチレン・ジビニルベンゼン共重合体粒子、
架橋化されたアクリル酸エステル重合体粒子、架橋化さ
れたメタクリル酸エステル重合体粒子、多孔性シリカゲ
ルに疎水性官能基を化学結合したもめ等が使用できる。

特に、疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルが、分離
能及び回収率の点ですぐれている。シリカゲルに導入さ
れる疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、プロピ
ル基、オクチル基、オクタデシル基等のアルキル基、シ
アノプロピル基、フェニル基などが例示され、これらは
シリカゲルに対して炭素含量で８〜２０重量％含まれて
いるのが好ましい。細孔の孔径としては６０Ａ〜３００
Ａに孔径を有するものが好ましい。又粒径としては小さ
いものが望ましいが実用上５〜７０μｍ程度が良い。

本発明の逆相分配型液体クロマトグラフィーは、先ず、
試料を有機溶剤を含まない水溶液としてこれをカラムに
負荷してヒトＵＧを樹脂に吸着させたのち溶出液で溶出
させる。ヒトＵＧの溶出液としてはアセトニトリル、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパツール等の水溶性有
機溶媒と、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢
酸、メチル硫酸等の酸またはこれらの酸とアンモニア、
苛性ソーダ等のアルカリの塩を混合して得られるｐＨ１
，５〜７　の範囲の緩衝液が用いられる。

この溶出にあたって、上記溶出液の水溶性有機溶媒濃度
は、溶出に適するように適当な濃度に調整される。例え
ば、アセトニトリル水溶液では、アセトニトリルの濃度
が１８〜２８容量％、好ましくは２０〜２５容量％の濃
度でヒトＵＧを溶出するのが好ましい。アセトニトリル
濃度が１８容量％未満では、全く溶出されないか溶出時
間が長くなり、２８容量％を越えると溶出先端付近に溶
出されるため精製効果が低下する傾向がある。また、ア
セトニトリル濃度に勾配をつけて溶出する場合、溶出後
のアセトニトリルの初期濃度は０〜１６容量％及び最終
濃度は２０〜３０容量％とするのが好ましい。なお、最
終濃度は３０容量％を越えてもさしつかえない。このよ
うにアセトニトリル濃度に勾配をつけて溶出を行なう場
合、アセト ｔニトリル濃度が２０〜２５容量％の時にヒトＵＧを溶
出させる。溶出に際し、用いる有機溶媒は、その極性が
小さくなるに従い溶出力が増すため、極性の大きなもの
程、有機溶媒濃度を大きくする必要がある。゛例えばメ
タノール、エタノール。

アセトニトリル、ｎ−プロパツールの順に極性が小さく
なり、この順により低濃度でヒトＵＧを溶出することが
できる。以上の溶出は、常圧下で行なっても高圧下で行
なってもよい。

本発明により得られたヒトＵＧ分画は、減圧濃縮により
有機溶媒を留去したのち、ゲルろ適法、限外ろ適法等に
より脱塩することができる。又、溶出液中の塩として酢
酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム等の揮撥性塩および
酸として揮撥性のものを用いた場合はそのまま凍結乾燥
により、塩を含まない乾燥品が得られる。

本発明に係る工程の後、さらに必要に応じて、Ｅ記（１
）〜（８）の工程を適宜適用しても良く、本発明に係る
工程を二度以上繰返えしてもよい。

本発明に係る工程は、前記（４）、（５）。

（６）又は（８）の工程と組みあわせるのが好ましい。

この場合、本発明の逆相分配型クロマトグラフィーにお
いて、カラム剤としてオクタデシル化シリカゲルを用い
溶出液としては中性（たとえば、酢酸アンモニウム、Ｐ
Ｈ７）でアセトニトリル濃度２０〜２５容量％のものを
使用すると尿中のヒトＵＧは、まず３種類に分離される
。これらをそれぞれ溶出順にＵＧ−１，ＵＧ−２，ＵＧ
−３とする。これらをさらに本発明の逆相クロマトグラ
フィーとして、酸性（たとえば、上記溶出液に酢酸を０
．５容量％加える）で行うとＵＧ−１は溶出順にＵＧ−
１−１とＵＧ−１−２の２種類に％ＵＧ−２はＵＧ−２
−１とＵＧ−２−２の２種類に、並びにＵＧ−３は、溶
出順にＵＧ−３−１、ＵＧ−３−２およびＵＧ−３−３
の３種類に分離される。即ち、このような方法で計７種
類の新規なヒトＵＧを分離できる。

上記７種類のヒトＵＧのうちＵＧ−１−１及びＵＧ−２
−２の２種類を除く５種類のヒトＵＧは各々５ＤＳ−尿
素−ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動（モノマ
ー濃度１３．８％）で分析するとき、それぞれ単一バン
ドとして認められ、その指定分子量はミオグロビン部分
加水分解物（分子量１６９４９．１４４０４．８１５９
．６２１４．２５１２．１３６０）の混合物を標準とし
た分子量を一カーを用いたとき約６０００に位置する。

又、ＰＨ勾配（ｐＨ４からＰＨ６，５）　を有するポリ
アクリルアミドゲルプレートを用いた等電点電気泳動を
行うときそれぞれ異なる位置に単一バンドとして認めら
れた。

表面電極を用いて測定したこれらの等電点は、ＵＧ−１
−２は４．４５、ＵＧ−２−１は４．４０、ＵＧ−３−
１は４．６５、ＵＧ−３−２は４．６０およびＵＧ−３
−３は４．４５である。これら各各をイヌにヒスタミン
刺激を１５分毎に与えた後ヒトＵＧを０．２５μｇ　／
　ｋｇ静脈注射により投与したところ、ヒトＵＧ投与前
１時間の胃酸分泌量の総量に対して、ヒトＵＧ投与後１
時間の胃酸分泌量の総量は５０％以下であった。

本発明において、ヒトＵＧ分画の確認は、マウスの顎下
線から得たマウスＥＧＦがマウス肝細胞膜上のＥＧＦレ
セプターに対してヒトＵＧと競争的に結合する性質を利
用して測定される。すなわち、ヒトＵＧ又はヒトＵＧを
含む試料、ＥＧＦレセプター及び放射性ヨウ素で標識し
たマウスＥＧＦを水溶液中で混合して反応させ、ＥＧＦ
セレプターとマウスＥＧＦ又はヒトＵＧとの結合物を生
成させ、これを分離して、その放射活性を測定し、検量
線に照らし、ヒトＵＧ濃度を決定する〔以下、この方法
を、ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡと略す）という
〕。

（実施例） 次に、ヒトＵＧを含む試料の調整列を示す。なお、以下
において、ヒトＵＧ量は、上記ＲＲＡ法によりめたもの
であり、比活性は、２８０ｎｍの吸光度と試料の液量（
ｍＱ）の積あたりのヒトＵＧ量である。

参考例１ 男子法３ｋｍ　（ヒトＵＧ量１６０ｍｇ、比活性１．６
Ｘ１０−”≠蝿〆≠１）に４Ｎ塩酸を加えム（４０ｆｉ
）に流速２００Ｑ／時間で流した。次いで、カラムを水
１００Ｑで洗浄し、１００Ｑの酢酸アンモニウム緩衝液
（塩化ナトリウム５０ｋｇ、酢酸アンモニウム７　、７
　ｋｇおよびアンモニア水１５．５　ｆｉ　に水を加え
て１００Ｑとしたもの）、次いで４８Ｑの４Ｎ苛性ソー
ダ溶液、更に９０１の水で溶出した。溶出後のｐＨは溶
出時間と共に増大する。このうち、溶出後のｐＨが１１
以下の分画を集めた。この溶出液中のヒトＵＧは６０．
４ｍｇ（回収率３８％、比活性０．０５）　であった。

参考例２ 参考例１で得た溶出液の２０　Ｑ　（ｐＨ４，５に調整
）にメタクリレート系中性吸着樹脂（ＨＰ２０：三菱化
成工業（株）商品名）８００ｍＱを加えて２時間撹拌し
てヒトＵＧを吸着、次いで塩酸−メタノール混合液（６
Ｎ塩酸：メタノール＝１：’１２．５、容量比）８Ｑで
溶′出した。これを中和後、減圧濃縮し蹄５００’ｍ　
Ｑとし架橋デキストランゲル（セファデックスＧ−２５
、ファルマシア・ファインケミカル・ＡＢ商品名）に負
荷し、０．０１Ｍ酢酸アンモニウムで展開して塩を含ま
ない部分を採取した。次いでｐＨ５，３の０．０１Ｍ酢
酸アンモニウム液で平衡化したジエチルアミノエチル（
ＤＥＡＥ）セルロース（ＤＥ−３２゜カラムに吸着させ
た。０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で洗浄後、０．３Ｍ
酢酸アンモニウム液で溶出した。この溶出液中のＵＧ量
は１４．４ｍｇ（回収率３８％、比活性１．２）であっ
た。

参考例３ 参考例２で得た溶出液を限外ろ過（分画分子量１０００
）により脱塩し、６０ｍＱまで濃縮した後、架橋デキス
トランゲル（セファデックスＧ−５０、ファルネシア・
ファイン・ケミカル・ＡＢ商品名）でゲルろ過した。展
開液は０．ＯＩＭ酢七 酸アンモニウム液で展開し、ＲＲＡ活性分画を採取した
。この溶出液中のヒトＵＧ量は１０ｍｇ（回収率７０％
、比活性５．６）であった。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ この実施例では参考例３で得られたヒトＵＧを含む溶出
液をオクタデシルシリル化シリカゲルを充填したカラム
を装置した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で
精製した例を示す。

参考例３で得られた溶出液をヒトＵＧ量で１．０ｍｇの
量でオフデシルシリル化シリカゲル（リクロゾルブＲＰ
−１８、メルク社商品名、炭素含量１９．８重量％）　
を充填したカラム（８ｎｎｍφ×２５０ｍｏ）（これは
、ＨＰＬＣ装置日立６３八型。

日立製作新製に装着されている）に注入し、展開液の第
１液と第２液の混合比を変化させて、グラジェント方式
により展開した。第１液は、水とアセトリニトリルを９
＝１　（容量比）に混合した溶液とし、第２液は塩酸０
．０１Ｍを含む０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液とアセト
ニトリルを２＝３（容量比）で混合した溶液とした。第
１液と第２液の混合は第１液１００　ｍ　Ｑに第２液が
２　ｍ　Ｑ　７分の割分て加わるように調整すると共に
、第１液と第２液の混合液が２ｍＱ１分の流速でカラム
内に送り込まれるように調整した。そのクロマトグラム
を第１図に示す。横軸に保持時間、縦軸に元 ２８０ｎｍの吸光度をセす。ヒトＵＧは保持時間４２〜
５２分の間に溶出された。この溶出液中のヒトＵＧ量は
０．７５ｍｇ　（収率７５％、比活性２６０）であった
。これを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けると四バンドが検知できた。また第１図に上記タロマ
ドグラフィーにおける各分画のＲＲＡ活性値を斜線棒グ
ラフで示す。

ＲＲＡ活性は４２〜４６分及び４６〜５２分の分画に現
われ、他の分画には現われなかった。

上記保持時間４２〜５２分に溶出された溶出液は減圧濃
縮した後、分画分子量１０００の限外ろ過膜（ＹＭ−２
、アミコン（株）商品名）で限外ろ過して脱塩後、凍結
乾燥して、ヒトＵＧの乾燥品を得た。

実施例２ 参考例３で得られた溶出液をヒトＵＧ量で１．２ｍｇと
して、オクタデシルシリル化シリカゲルとしては炭素含
有量が２０重量％のもの（デベロジル○ＤＳ、野村化学
（株）商品名）を使用して、実施例１と同様にして溶出
した。ただし、展開液の第１液としては０．０５Ｍ　の
酢酸アンモニウム水溶液を、第２液にはアセトニトリル
水溶液ζ水ニアセトニトリル＝１　：　１　（容量比）
〕に酢酸アンモニウム０．０５Ｍ　を溶解したものを用
いた。第１ミ壱「 第１液と第２液の混合物が２ｍＱ／分の流速でカラム内
に送り込まれるよう流速を調整した。そのクロマトグラ
ムを第２図に示した。ヒトＵＧは保持時間３８〜４６分
に溶出された。この溶出液中ヒトＵＧ量はＲＲＡ法で測
定して０．９ｍｇ　（収率７５％、比活性３２）であっ
た。この溶出液は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
電気泳動で４バンドが検知できた。また、第２図に各分
画のＲＲＡ活性値を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は
保持時間３８〜４２分の分画と４２〜４６分の現 分画に現われ、他の分画には表われなかった。上記保持
時間が３８〜４６分の溶出液を実施例１と同様にしてヒ
トＵＧ乾燥品を得た。

実施例３ 別に参考例３と同様の方法で得られた溶出液（比活性７
．６）をヒトＵＧ量で１９ｍｇ　およびデベロジルＯＤ
Ｓ　（野村化学（株）商品名）を充填したカラム（３６
，７ｏｎφ×５００１１Ｉ１１）　を使用し、実施例１
と同様にして、溶出した。ただし、展開液の第１液は、
０．０５Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を、第２液は、アセ
トニトリル水溶液（水ニアセトニトリル＝３＝２、容量
比）に酢酸アンモニウム０．０５Ｍ　を溶解したものを
用いた。第１液と第２液の混合は、第１液１００　ｍ　
Ｑに第２液を２５　ｍ　Ｑ　／分で加わるようにし、混
合液が流速２５ｍｇ／分でカラムに流入するようにした
。

この結果、得られたクロマトグラムを第３図に示す。ヒ
トＵＧは保持時間２５〜４５分に溶出され、このうち、
保持時間３０〜４０分の分画を採取した。この溶出液中
のＵＧ量は１６．９ｍｇ　（収率８９％、比活性８０）
であった。これを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけると３バンドを検知した。また、第３図に、
各分画のＲＲＡ活性値を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活
性は、保持時間２５〜３０分、３０〜３５分、３５〜４
０分および４０〜４５分に現われ、他の分画には現われ
なかった。

実施例４ この実施例では実施例３で得られた保持時間３０〜４０
分の溶出液をさらに精製し、三種のＵＧを分離した。

実施例３で得られた溶出液をＵＧ量で２　、５　ｍ　ｇ
デベロジルＯＤＳ　（野村化学（株）商品名）を充填し
たカラム（２０ｍｉφＸ５００ｍｎ、日立６３Ａ型に装
置）に注入し、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むアセ
トニトリル水溶液（水：アセトニトＩＪ／Ｌ／＝１４０
：５００．容積比）を展開液として流速５　ｍ　意／　
ｗｉｎで展開し、溶出した。このときのクロマトグラム
を第４図に示す。横軸に保持時間、縦軸に２８０ｎｍの
吸光度を示す。ヒトＵＧは、保持時間が２６〜３０分、
３４〜４２分及び４４〜５０分に溶出した。各保持時間
毎に溶出液を採取したところ、ＵＧの比活性は、溶出順
に１２００．１７５０．２２００であり、ヒトＵＧ量は
溶出順に１：１：２の割合で、これらの総ＵＧ量は、２
　、０　ｍ　ｇ　であった。また、第４図に各分画のＲ
ＲＡ活性値を斜線誇グラフで示す。

ＲＲＡ活性は、保持時間２６〜２８分、２８〜３０分、
３０〜３２分、３４〜３６分、３６分〜３８分、３８〜
４０分、４４〜４６分、４６〜４８分及び４８〜５０分
の分画に現われ、他の分画には現われなかった。

上記三種の溶出液は、それぞれ減圧濃縮した後、凍結乾
燥し、得られた乾燥品を生理食塩水に溶解した。これら
の溶液をインタクト・フエスチューラ犬に、それぞれ犬
の体重１　ｋｇ当り、ヒトＵＧ量０．２５μｇ静脈内注
射したとき、いずれも同等の胃酸分泌抑制効果を示した
。

実施例５ 別に参考例３と同様の方法により得られた溶出液（比活
性４．３ン丑をヒトＵＧ量で１２．３ｍｇ及びデベロジ
ルＯＤＳ　（野村化学（株）商品名）を充填したカラム
（３６，７ｍａ＋φｘ５００＋ｍ）　を使マ 用し、！実施例１と同様にし水溶出した。ただし、展開
液の第１液には酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むアセ
トニトリル水溶液（水ニアセトニトリル＝５：Ｌ容量比
）、第２落液には、酢酸アンミニラム０．０５Ｍ　を含
むアセトニトリル水溶液（水ニアセトニトリル：＝５：
、１．６、容量比）を用いた。第２液は第１液１００ｍ
Ｑに２５　ｍ　Ｑ　／分で流入すると共に、第１液と第
２液の混合液はカラムに２５ｍＱ／分で流入するように
した。この結果、得られたクロマトグラムを第５図に示
す。

ＲＲＡ法で各溶出分画を測定すると三つの活性分画が現
われ、各分画のヒトＵＧには、それぞれ胃酸分泌抑制作
用が認められた。該活性分画はそれぞれ、保持時間が４
８〜５２分、５４〜６２分及び６２〜６８分に溶出し、
これらの総ヒトＵＧ量は１０　、５　ｍ　ｇ、　それぞ
れの分画のヒトＵＧ量は、溶出順に２　、４　ｍ　ｇ、
１　、９　ｍ　ｇ及び６・２　ｍ　ｇであり、各ヒトＵ
Ｇの比活性は溶出順に１３０゜２４．０及び２９０であ
った。各分画を減圧濃縮し、凍結乾燥して乾燥品を得、
上記溶出順にＵＧ−１゜′ｔＰ″″ ＵＧ−２及にＵＧ量３とした。５ＤＳ−尿素−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（モノマー濃度１３．８％、標
準物質：ミオグロビン部分加水分解物で分子量が１６９
４９．１４４０４．８１５９．６２１４．２５１２及び
１３６０の混合物）によるとＵＧ−１については、分子
量約６０００と約７４００のニバンド、ＵＧ−２につい
ては、分批量約６０００と約７０００の二バンド及びＵ
Ｇ−３については、分子量約６０００の一バンドが検出
された。

これらのＵＧ−１，ＵＧ−２及びＵＧ−３は、それぞれ
、実施例４において得られた三つの溶出分画のそれぞれ
に溶出順に対応するものであった。

第５図は、上記の溶出における各分画毎のＲＲＡ活性値
を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は４６〜４８分、４
８〜５０分、５０〜５２分、５４〜５６分、５６〜５８
分、５８〜６０分、６２〜６４分、６４〜６６分及び６
６〜６８分の分画に現われ、他の分画には現われなかっ
た。

実施例に の実施例は、実施例５で得られたＵＧ量−１、ＵＧ−２
及びＵＧ−３を各々、再び逆相分配クロマトグラフィー
により精製した例を示す。

ＵＧ−１、ＵＧ−２及びＵＧ−３をＵＧ量で各各５００
μｇ及びデベロジルＯＤＳ　（野村化学（株）商品名）
を上世マ充填したカラム（８ｍｎφＸ２５０ｍｏ、日立
６３Ａ型に装置）に負荷し、酢酸アンモニウム０．０５
Ｍ　を含むアセトニトリル水溶液（アセトニトリル：水
＝１４０：５００、容量比）２００ｍＱに対し、酢酸０
　、１　ｍ　Ｑ　を添加したものを溶出液とし、流速１
’ｍＱ／分で溶出した。得られたクロマトグラム（横軸
に保持時間、縦軸に２８０ｎｍ吸光度）を、ＵＧ−１に
ついて、第６図、ＵＧ−２について第７図に示す。第６
〜７図には、それぞれ、ＲＲＡ活性値を斜線棒グラフ（
ＲＲＡ活性を示す分画）が現われ、ＵＧ−２については
、４８〜６０分及び６５〜７７分にＵＧ分画が現われた
。ＵＧ−３については、保持時間８０分までに溶出され
なかった。

ＵＧ−３については、展開液として、酢酸アンモニウム
０．０５Ｍ　を含むアセトニトリル水溶液（アセトニト
リル：水＝１７０：５００＞、２００ｍＱに酢酸１　ｒ
ｎ　Ｑを添加したものを使用して上記と同様に溶出した
。このときのクロマトグラムおよびＲＲＡ活性値を第８
図に示す。この結果、ＲＲＡ活性は、ＵＧ−３について
は、保持時間２２〜２６分、２７〜３０分及び４９〜５
５分のＵＧ分画が現われた。ＵＧ−３については、２８
０ｎｍの吸光度ピークとＲＲＡ活性分画とが対応した。

ＵＧ−１について、分離されたＵＧを溶出順にＵＧ−１
−’１及びＵＧ−１−２とし、ＵＧ−２について溶出順
にＵＧ量−２’−１及びＵ、Ｇ−２−２とし、ＵＧ−３
について溶出順にＵＧ−３−１、Ｕ、Ｇ　−３−２及び
ＵＧ−３−３とする。

ＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３の収量（ＵＧ量）比は、実
施例５で得られた総ＵＧ量（１０，５ｍｇ）について、
順に、０．５　：　４　：　４　：　０．５　：８：２
：２であった。このうち、ＵＧ−１−１及びＵＧ−２−
２は少量であった。ｔＪａ−１−２、ＵＧ−２−１、Ｕ
Ｇ−３−１、ＵＧ−３−２及びＵＧ−３−３の比活性は
、各々２０３０，２２００゜２４５０．２３００及び２
４００であり、等電点電気泳動法による等電点は、各々
、４．４５．４．４０．４．６５．４．６０及び４．４
５であった。

又５ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドデイスク電気泳動
によって、各々単一バンドが表われ、ミオグロビン加水
分解物（分子量１６９４９．１４４０４．８１５９゜６
２１４、２５１２及び１３６０の混合物）を標準物質と
したとき、いずれも分子量は約６０００と推定される。

上記ＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３を含む溶出液は、各々
減圧濃縮し、凍結乾燥しｆｌｌＵＧ−１−１〜ＵＧ−３
−３を得た。

試験例 実施例６で得られたＵＧ−１−１〜ＵＧ−３−３の胃酸
分泌抑制作用を示す。

体重１３ｋｇのピーグル犬（雄性）の幽門部から約５ｃ
ｍ１ｌれた背体部に異痕管を取りつけてインタクトフイ
スチューラ犬とし、これに、ヒスタミン４〜６μｇ／ｋ
ｇ体重を１５分間隔で皮下注射し、１５分間隔で胃液を
異痛管から採取した。胃液量がほぼ一定になった時点で
、ｕａ−ｔｕｌ−ｔｒＧ−３−３の各々を生理食塩水に
溶解してＵＧ量で０．２５μｇ／ｋｇ体重だけ静脈内注
射した。胃液量はいずれの場合も１５〜３０分後から減
少し、３０〜６０分後に胃液量が最も少なくなった。こ
の結果のうち、ＵＧ−１＝２、ＵＧ　２　１及びＵＧ−
３−２について、ヒスタミン投与し胃酸分泌量の関係を
示す棒グラフを各々第９図、第１０図及び第１１図に示
す。

また、ＵＧ投与後３０〜１２０分の間に分泌された胃酸
分泌量を表１に示す。

表　１　胃酸分泌量 （発明の効果） 以上より明らかなように本発明に係る工程により、ヒト
ＵＧを含む試料から高収量、高比活性でヒトＵＧを得る
ことができ、７種の新規なＵＧ量を採取することもでき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるクロマトグラフィーの結果を
示すクロマトグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第２図は
実施例２におけるクロマトグラフィーの結果を示すクロ
マトグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第３図は実施例３
におけるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラ
ム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第４図は実施例４における
クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＲ
ＲＡ活性棒グラフ、第５図は実施例５におけるクロマト
グラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＲＲＡ活性
棒グラフ、第６図は実施例におけるＵＧ−１に関するク
ロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＲＲ
Ａ活性棒グラフ、第７図は実施例６におけるＵＧ−２に
関するクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム
及びＲＲＡ活性棒グラフ、第８図は実施例６におけるＵ
Ｇ−３に関するクロマトグラフィーの結果を示すクロマ
トグラム及びＲＲＡ活性棒グラフ、第９図は試験例にお
けるＵＧ−１−２に関する胃酸分泌を示す棒グラフ、第
１０図は試験例におけるＵＧ−２−１に関する胃酸分泌
を示す棒グラフ及び第１１図は試験例におけるＵＧ−３
−２に関すラジオｌ／上ブタ（ＲＲＡ）透性イ直Ｃｐ４
ｈｎｌｌ）吸光度Ｃ２８０ｎ＊） 尺ＲＡ３占性イ直（暦／ｍ吻 吸　光　笈　Ｃ２８０ｎ荒） ＲＲＡ　イ直　（）ＶノつワＬ（乙） 吸光ＪＥ　Ｃ？８０ｎ乳） 尺ＲＡ＞セ５ナリ三イα＃　Ｃｑ／ｍｌ）吸光度（？１
！３０ｎ乳） Ｒ尺Ａ：、占’Ｉｉ’、ａ　（μ４／ｙＪ）吸光度（？
６０ル乳） ＲＲＡ活性値（ｐ、ｔｉ／ｎｌ、） 吸光度（？δＯｎ尻） ＲＲＡ３！；性イ１ｖ（ｐｇ／１ｎｉ）吸　光　ｆｉ　
（２８Ｃ随仄） ｒｙＸＬ光度（２園１机） 鳥９図 県１０図 しスタミン６ｐｇ／ｋｇ／　１５勿 児１１区

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトウロガストロンを含有する試料から逆相分配型
   液体クロマトグラフィーによりヒトウロガストロンを含
   む分画を採取することを特徴とするヒトウロガストロン
   の製造法。 ２、逆相分配型液体クロマトグラフィーのカラム剤とし
   て疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルを使用する特
   許請求の範囲第１項記載のヒトウロガストロンの製造方
   法。