DE69733467T2 - Adsorbtionsvorrichtung und absorbens für immunuglobine und deren komplexe - Google Patents

Adsorbtionsvorrichtung und absorbens für immunuglobine und deren komplexe Download PDF

Info

Publication number
DE69733467T2
DE69733467T2 DE69733467T DE69733467T DE69733467T2 DE 69733467 T2 DE69733467 T2 DE 69733467T2 DE 69733467 T DE69733467 T DE 69733467T DE 69733467 T DE69733467 T DE 69733467T DE 69733467 T2 DE69733467 T2 DE 69733467T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
peptide
adsorbent
amino acid
immunoglobulins
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69733467T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69733467D1 (de
Inventor
Takamune Kobe-shi YASUDA
Osamu Takasago-shi ODAWARA
Eiji Kobe-shi Ogino
Michio Kakogawa-shi NOMURA
Takahisa Kobe-shi NAKAI
Takashi Kobe-shi ASAHI
Nobutaka Oasaka-shi TANI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Publication of DE69733467D1 publication Critical patent/DE69733467D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69733467T2 publication Critical patent/DE69733467T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/328—Polymers on the carrier being further modified
    • B01J20/3282—Crosslinked polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A61M2202/0415—Plasma
    • A61M2202/0417—Immunoglobulin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Adsorptionsmittel und eine Adsorptionsvorrichtung zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen und auf ein Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen.
  • HINTERGRUNDSTAND DER TECHNIK
  • In den vorangegangenen Jahren wurde klar, dass bei Autoimmunerkrankungen, wie Rheumatoidarthritis, systemischer Lupus erythematodes, Landry-Guillain-Barré-Syndrom und idiopathische thrombozytopenische Purpura, oder bei Erkrankungen, wie Glomerulonephritis, Abstoßung transplantierter Organe, Tumor und bei Infektionserkrankungen, Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe, die im Blut vorhanden sind, eine enge Beziehung mit der Ursache oder dem Fortschreiten von Erkrankungen und/oder Phänomenen haben.
  • Unter den oben genannten Umständen wurden etliche adsorbierende und entfernende Materialien in der Hoffnung darauf genutzt, das Fortschreiten der oben genannten Erkrankungen zu verhindern, die Zustände zu erleichtern und weiterhin die Heilung durch das spezifische Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen aus der Körperflüssigkeit, wie dem Blut und dem Plasma, zu fördern. Zum Beispiel ist ein Immunadsorptionsmittel (japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-242628), bei welchem Protein A, das in der Lage ist, an Immunglobuline zu binden, auf einer Kieselsäurematrix immobilisiert wird, als ein Adsorptionsmittel bekannt, das hochspezifisch für Immunglobulin G und Immunglobulinkomplexe davon ist. Weiterhin wurde ein Adsorptionsmittel (japanische Offenlegungsschrift Nr. 57-122875) für Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe, bei denen eine hydrophobe Verbindung auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, bereits klinisch in Japan angewandt.
  • Das Adsorptionsmittel, welches verwendet worden ist (z. B. das oben genannte Adsorptionsmittel für Protein A) hat jedoch Nachteile. Genauer ist Protein A, das eine funktionelle Gruppe ist, ein heterogenes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 42.000 Dalton, abgeleitet von Staphylococcus aureus, so dass, wenn das Adsorptionsmittel in Kontakt mit der Körperflüssigkeit verwendet wird, Protein A eluiert wird und seine Antigenität Nebenwirkungen verursachen kann. Ebenfalls gibt es ein Problem der Stabilität während der Sterilisation des Adsorptionsmittels, deswegen ist das Sterilisationsverfahren begrenzt. Zusätzlich ist die Lagerungsstabilität nicht ausreichend, nachdem Protein A auf einer Kieselsäurematrix immobilisiert ist; und Ähnliches. Weiterhin haben das Adsorptionsmittel für Immunglobuline und/oder Immunkomplexe davon, das in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 57-122875 beschrieben ist, die Nachteile schlechter Adsorbierungseigenschaften, wie die Adsorptionsspezifität für eine Substanz von Interesse und Adsorptionskapazität (I. Amano et al., "Blood purification therapy, 1 st part", Japanese Journal of Clinical Medicine, Band 49, S. 649–654 (1991 sup.). Demgemäß ist hinsichtlich der Sicherheit, Stabilität, Adsorptionsspezifität, Adsorptionskapazität und Ähnlichem das gewöhnlich bekannte Adsorptionsmittel zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen nicht notwendigerweise geeignet für die Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch die Anwesenheit der oben genannten pathogenen Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe in der Körperflüssigkeit verursacht werden.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Adsorptionsmittel mit hoher Stabilität und Sicherheit, welches eine hohe Adsorptionsspezifität für Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe hat und dessen Adsorptionseigenschaften während der Sterilisation oder Lagerung weniger abnehmen, eine Adsorptionsvorrichtung unter Verwendung des Adsorptionsmittels und die Verwendung des Peptids für die Herstellung eines Adsorptionsmittels zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen bereitzustellen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung berücksichtigten die Faktoren, dass (1) zahlreiche Proteine dafür bekannt sind, dass sie Immunglobulinbindungsproteine sind, wie Protein A, Protein G, Protein H, Protein L und ein Rheumatoidfaktor (N. Tsuchiya, Clinical Immunology, Band 23, S. 896–903 (1991); P. Akesson et al., Mol. Immunol., Band 27, S. 523–531 (1990); und L. Bjorck, J. Immunol., S. 1194–1197 (1988)) mit einer im Wesentlichen hohen Adsorptionsspezifität für Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe, (2) ein Peptid mit mehreren zehn Aminosäureresten oder ungefähr zehn oder weniger Aminosäureresten, das viel kleiner als jenes eines heterogenen, natürlich vorkommenden Makromolekülproteins ist, für einen lebenden Organismus Antigenität hat, und (3) solch ein kurzes Peptid eine hohe Stabilität hat, die durch thermische Stabilität, besonders hohe Stabilität für Sterilisation und Lagerungsstabilität repräsentiert wird. Wir erzeugten zahlreiche Peptide aus Immunglobulinbindungsproteinen und untersuchten diese. Als ein Ergebnis waren wir erfolgreich dabei, ein Peptid, das eine hohe thermische Stabilität, Arzneimittelstabilität und/oder Sterilisationsstabilität hat, wenn sie basierend auf einer hohen Adsorptionsspezifität und Adsorptionskapazität hinsichtlich Immunglobulin und/oder Immunglobulinkomplexen als Indizes bestimmt werden, und von dem unwahrscheinlich ist, dass es durch Antigenität bewirkte Nebenwirkungen hat, durch Verwendung eines Teilpeptides von Protein G zu gewinnen.
  • Protein G ist eines der Immunglobulinbindungsproteine, das ein Molekulargewicht von ungefähr 50.000 Dalton hat und das auf einer Bakterienzellwand von Streptococcus anwesend ist. Die cDNS von Protein G wurde bereits kloniert. Basierend auf einer aus der cDNS vorhergesagten Aminosäuresequenz, wird von Protein G angenommen, dass es aus 448 Aminosäureresten besteht. Weiterhin wurde angenommen, dass etliche ähnliche wiederholte Aminosäuresequenzen in der vorhergesagten Aminosäuresequenz vorhanden sind und dass die wiederholten Aminosäuresequenzen Bindungsdomänen für Albumin und Immunglobuline sind. Siehe z. B. S. R. Fahnestock et al., J. Bacteriol., Band 167, S. 870–880 (1986); U. Sjobring et al., J. Biol. Chem., Band 266, S. 399–405 (1991). In B. Guss et al., EMBO J., Band 5, S. 1567–1575 (1986), wird eine wiederholte Aminosäuresequenzregion, repräsentiert durch C1, C2 oder C3, beschrieben, was eine Immunglobulin-(IgG)-Bindungsdomäne in der Sequenz von Protein G nahe legt. Wenn übliche Aminosäuren und Aminosäuren, die in jeder Aminosäuresequenz von C1, C2 und C3 nicht üblich sind, zusammengefasst werden, ist die Aminosäuresequenz der IgG-Bindungsdomäne, so wie sie durch SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls dargestellt ist.
  • Weiterhin untersuchten die Erfinder ebenfalls die Sterilisationsstabilität von C3-Peptiden gegenüber γ-Strahlensterilisation durch Binden eines C3-Peptides, welches eines der oben genannten Peptide ist, an einen Träger und fanden, dass die Sterilisationsstabilität von C3-Peptiden nicht notwendigerweise ausreichend war. Dann erzeugten wir zahlreiche Peptide und untersuchten sie hinsichtlich der Sterilisationsstabilität durch aufeinander folgendes Modifizieren jeder Aminosäure eines C3-Peptides in eine andere Aminosäure unter Verwendung einer Technologie der Gentechnik. Als ein Ergebnis gewannen wir ein Peptid; das eine hohe Affinität für Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe hat, bei dem die Adsorptionskapazität eines Peptidliganden kaum durch γ-Strahlensterilisation geschädigt wird und welches eine ausgezeichnete thermische Stabilität und Arzneimittelstabilität hat, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht worden ist.
  • In einem Adsorptionsmittel zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid, das in der Lage ist, Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe zu adsorbieren, auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert und das Peptid umfasst eine Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls dargestellt wird.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird wenigstens eine der Eigenschaften der thermischen Stabilität, Arzneimittelstabilität, γ-Strahlensterilisationsstabilität und Hochdruckdampfsterilisationsstabilität der oben genannten Peptidderivate gegenüber jenen eines Peptides mit der Aminosäuresequenz, die von der SEQ ID Nr. 1 repräsentiert wird, verbessert.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird (Lys)n oder (Cys)m zu einem Aminoende und/oder einem Carboxyende des oben genannten Peptids oder Peptidderivates hinzugefügt, wobei n und m ganze Zahlen von 0 bis 9 sind.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht das oben genannte Peptid oder Peptidderivat aus einer Aminosäuresequenz von 70 Aminosäuren oder weniger.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Adsorptionsmittel Hochdruckdampfsterilisation ausgesetzt.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Adsorptionsmittel γ-Strahlensterilisation ausgesetzt.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der oben genannte wasserunlösliche Träger porös.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der oben genannte wasserunlösliche Träger hydrophil.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel liegt ein Molekulargewicht der Ausschlussgrenze des oben genannten wasserunlöslichen Trägers im Bereich von ungefähr 150.000 bis ungefähr 5.000.000.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung für das Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen verwendet, die in dem Blut, Plasma oder in anderen, von einem lebenden Organismus gewonnenen Körperflüssigkeiten vorhanden sind.
  • Die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung können in einem Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen verwendet werden, wobei das Verfahren den Schritt des in Kontaktbringens des oben genannten Adsorptionsmittels mit einer Lösung, die Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe enthält, einschließt.
  • In einer Vorrichtung zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen der vorliegenden Erfindung wird jedes der oben genannten Adsorptionsmittel in einem Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für eine Lösung untergebracht und die Vorrichtung umfasst den Austritt verhindernde Mittel, um das Adsorptionsmittel daran zu hindern, aus dem Gefäß herauszufließen.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die oben genannte Lösung, die Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe enthält, Blut, Plasma oder eine andere von einem lebenden Organismus gewonnene Körperflüssigkeit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines Peptids, umfassend eine durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, bei der Herstellung solch eines Adsorptionsmittels für die Verwendung in einem Verfahren zum Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen aus einer Lösung bereit, wobei das Verfahren den Schritt des in Kontaktbringens des Adsorptionsmittels mit der Lösung umfasst und worin die Lösung Blut, Plasma oder eine andere von einem lebenden Organismus gewonnene Körperflüssigkeit ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein schematisches Diagramm des Plasmids pUCNTMK3P47 zum Exprimieren des MK3P47-Peptids. In einem Vektor zum Exprimieren anderer in den Beispielen beschriebener Peptide wird die das MK3P47-Peptid kodierende DNS, die zwischen NdeI-HindIII von pUCNTMK3P47 inseriert ist, durch DNS ersetzt, die andere in jedem einzelnen Beispiel beschriebene Peptide kodieren.
  • 2 zeigt Denaturierungskurven von MG56-, MK3G56- und MK3P47-Peptiden, gewonnen unter Verwendung von Guanidinhydrochlorid.
  • 3 zeigt Denaturierungskurven von MK3P47-, MP47K3-, MP47- und MP47C-Peptiden, gewonnen unter Verwendung von Guanidinhydrochlorid.
  • 4 zeigt Überschusswärmekapazitätskurven des durch thermische Denaturierung mit DASM-4 gewonnenen MK3G56-Peptids.
  • 5 zeigt Überschusswärmekapazitätskurven des durch thermische Denaturierung mit DASM-4 gewonnenen MK3P47-Peptids.
  • 6 ist ein schematisches Querschnittsdiagramm eines Beispiels einer Vorrichtung zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen der vorliegenden Erfindung.
  • 7 ist eine Grafik, die durch Untersuchen der Beziehung zwischen der Durchflussgeschwindigkeit und dem Druckverlust gewonnene Ergebnisse unter Verwendung von drei Arten an Gelen zeigt.
  • BESTE WEISE, UM DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
  • I. Definition
  • In der vorliegenden Spezifikation werden verschiedene Arten an Aminosäureresten wie folgt abgekürzt: Ala: L-Alaninerest; Asp: L-Asparaginsäurerest; Asn: L-Asparaginrest; Cys: L-Cysteinrest; Gln: L-Glutaminrest; Glu: L-Glutaminsäurerest; Gly: L-Glycinrest; Ile: L-Isoleucinrest; Leu: L-Leucinrest; Lys: L-Lysinrest; Phe: L-Phenylalaninrest; Thr: L-Threoninrest; Trp: L-Tryptophanrest; Tyr: L-Tyrosinrest; and Val: L-Valinrest. Weiterhin wird in der vorliegenden Spezifikation eine Aminosäuresequenz eines Peptids in solch einer allgemeinen Weise beschrieben, dass der Aminoterminus des Peptids (auf den hierin nachfolgend Bezug genommen wird als der "N-Terminus") auf der linken Seite positioniert wird, und der Carboxyterminus des Peptids (auf den hierin nachfolgend Bezug genommen wird als der "C-Terminus") auf der rechten Seite positioniert wird.
  • In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich thermische Stabilität auf den Grad einer thermischen Denaturierungstemperatur eines Peptids. Der Ausdruck "aufweisend eine ausgezeichnete thermische Stabilität" bezieht sich darauf, dass eine thermische Denaturierungstemperatur eines Peptids, umfassend eine durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, höher ist als jene eines Peptids, bestehend aus den durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuren. Als ein Beispiel eines Verfahrens zum Messen einer thermischen Denaturierungstemperatur gibt es ein Verfahren zum Messen einer thermischen Denaturierungstemperatur in einer wässrigen Lösung, wie z. B. Salzlösung, unter Verwendung eines adiabatischen Kalorimeters mit Differentialabtastung.
  • In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich Arzneimittelstabilität auf ein Denaturierungsverhältnis eines Peptids nach Arzneimittelbehandlung mit Bezug auf das Peptid, das nicht der Arzneimittelbehandlung ausgesetzt wird. Der Begriff "aufweisend eine ausgezeichnete Arzneimittelstabilität" bezieht sich darauf, dass ein Denaturierungsverhältnis eines Peptids, umfassend eine durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, niedriger ist als jenes eines Peptids, bestehend aus den durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuren. Als ein Beispiel eines Verfahrens zum Bestimmen eines Denaturierungsverhältnisses eines Peptids gibt es ein Verfahren zum Vergleichen der Fluoreszenzintensität eines Peptids, gemessen nach der Behandlung in einer wässrigen Lösung, enthaltend eine angemessene Konzentration von Guanidinhydrochlorid, bei 30°C für 10 Minuten, mit der Fluoreszenzintensität eines Peptids vor der Behandlung.
  • In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich ein γ-Strahlensterilisationsverfahren auf ein Verfahren zum Abtöten von Mikroorganismen, indem sie mit γ-Strahlen aus einer Strahlungsquelle, die radioaktive Isotope enthält, bestrahlt werden, wie beschrieben in (i) Radiation Methods: An irradiation method as a "Sterilization method", beschrieben in der japanischen Pharmakopöe. Als ein Beispiel des γ-Strahlensterilisationsverfahrens gibt es ein Verfahren zum Bestrahlen jedes Adsorptionsmittels in einer wässrigen Lösung durch Verwendung einer Strahlungsquelle, die Kobalt 60 und Ähnliches enthält. γ-Strahlensterilisationsstabilität bezieht sich auf ein Verhältnis der Kapazität eines Peptidderivates, das γ-Strahlensterilisation ausgesetzt wird, Immunglobuline zu adsorbieren, im Vergleich mit der Fähigkeit des Peptids, das nicht der γ-Strahlensterilisation ausgesetzt ist, Immunglobulin zu adsorbieren. Der Begriff "aufweisend eine ausgezeichnete γ-Strahlensterilisationsstabilität" bezieht sich darauf, dass ein verbleibendes Verhältnis der Adsorptionskapazität eines Peptids, umfassend eine durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, höher ist als jene eines Peptids, bestehend aus den durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuren.
  • In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich ein Hochdruckdampf-Sterilisationsverfahren auf ein Verfahren zum Abtöten von Mikroorganismen, indem sie in einem gesättigten Strom bei einer geeigneten Temperatur unter einem geeigneten Druck erhitzt werden, wie beschrieben in (iii) High-pressure Vapor Methods: A heating method as a "Sterilization method", beschrieben in der japanischen Pharmakopöe. Als ein Beispiel des Hochdruckdampf-Sterilisationsverfahrens gibt es ein Verfahren zum Aussetzen eines Adsorptionsmittels in einer wässrigen Lösung einer Autoklavenbehandlung bei 121°C für 20 Minuten. Hochdruckdampf-Sterilisationsstabilität bezieht sich auf ein Verhältnis der Fähigkeit eines Peptidderivats vor der Hochdruckdampf-Sterilisationsbehandlung, Immunglobuline zu adsorbieren, im Vergleich mit der Fähigkeit des Peptidderivats, das der Behandlung ausgesetzt wird, Immunglobuline zu adsorbieren. Der Ausdruck "aufweisend eine ausgezeichnete Hochdruckdampf-Sterilisationsstabilität" bezieht sich darauf, dass ein verbleibendes Verhältnis der Adsorptionskapazität eines Peptidderivates höher ist als jenes eines Peptids, bestehend aus den durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuren.
  • II. Bevorzugtes Ausführungsbeispiel
  • Hierin anschließend wird die vorliegende Erfindung im Wege bevorzugter Ausführungsbeispiele beschrieben werden. Es sollte bemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht durch die folgende Beschreibung begrenzt wird.
  • Als ein Peptid, das für ein Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird ein Peptid mit der durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls repräsentierten Aminosäuresequenz verwendet. Die wichtigsten Eigenschaften in dieser Aminosäuresequenzregion sind, dass die C-terminale Sequenz (Aminosäuresequenz von Position 47 bis Position 56 des durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Peptids), enthalten in C1, C2 und C3 von Protein G,
    Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
    ist, wohingegen die korrespondierende Sequenz in der durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierten Aminosäuresequenz
    Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
    ist. Genauer wird an der Position 47 eine Aminosäure (Asp) durch eine andere Aminosäure (Pro) ersetzt. Es wurde herausgefunden, dass wegen diesen Aminosäuresubstitutionen die Sterilisationsstabilität (insbesondere die Stabilität hinsichtlich der γ-Strahlensterilisation) des durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierten Peptids merklich verbessert wird und dass die Arzneimittelstabilität, basierend auf einer Denaturierungskonzentration, durch Guanidinhydrochlorid als einem Index, und die thermische Stabilität, basierend auf einem durch Kalorimetrie gemessenen thermischen Denaturierungspunkt als einem Index, sich ebenfalls verbessert. Weiterhin war die pH-Stabilität des durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierten Peptids ausgezeichnet. Seit kurzem ist es üblich, eine Aminosäure durch eine Technik der Gentechnik zu ersetzen, und folglich ist es eine wohlbekannte Technik, die Verbesserung von Eigenschaften eines Peptids und eines Proteins durch Aminosäuresubstitution zu untersuchen. Es gab jedoch keine Beispiele, die zeigen, dass die Sterilisationsstabilität eines Peptids oder eines Proteins durch Ersetzen von nur einer Aminosäure durch eine andere merklich verbessert wäre. Folglich ist die oben genannte Tatsache ein überraschender Befund.
  • Ein Peptid mit einer adsorbierenden, funktionellen Gruppe, das für das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat eine oder zwei Arten an Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus den durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls repräsentierten Aminosäuresequenzen, und kann dieselbe Art wiederholter Aminosäuresequenzen oder eine Kombination verschiedener Aminosäuresequenzen enthalten. Zum Beispiel kann ein aus den durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls repräsentierten Aminosäuresequenzen ausgewähltes Peptid nur eine Art an Peptid enthalten, ausgewählt aus den C1, C2 und C3 in der Aminosäuresequenz von Protein G, beschrieben in B. Guss et al., EMBO J., Band 5, S. 1567–1575 (1986), entsprechenden Peptiden. Alternativ kann das Peptid eine ausgewählte Art wiederholter Peptide (das heißt ein Peptid, das wenigstens zwei C1, wenigstens zwei C2 oder wenigstens zwei C3 enthält) oder kann zwei ausgewählte Arten an Aminosäuresequenzen enthalten (das heißt ein Peptid, enthaltend C1 und C2, C1 und C3 oder C2 und C3). Ferner kann das Peptid zwei ausgewählte Arten an Aminosäuresequenzen enthalten, die willkürlich wiederholt sind (z. B. ein Peptid, enthaltend zwei C1 und ein C2, zwei C1 und ein C3, ein C2 und zwei C3, zwei C 1 und zwei C3 oder Ähnliches). Das Peptid kann aus im Wesentlichen nur der durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls repräsentierten Aminosäuresequenz bestehen oder kann weiter jeden Aminosäurerest oder jede Aminosäuresequenz an dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Aminosäuresequenz enthalten.
  • Ein Peptid mit einer adsorbierenden, funktionellen Gruppe, das für das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann einen Zusatz von wenigstens drei Aminosäuren bezüglich der durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls repräsentierten Aminosäuresequenz aufweisen. Jeder Aminosäurerest oder Aminosäuresequenz kann an dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Aminosäuresequenz platziert werden. Ein bevorzugtes Peptid hat eine Aminosäuresequenz, bei welcher (Lys)n oder (Cys)m an den N-Terminus und/oder den C-Terminus hinzugefügt werden, unter Bezugnahme auf wenigstens eine Art einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den durch SEQ ID Nr. 3 repräsentierten Aminosäuresequenzen (hierin sind n und m ganze Zahlen von 0 bis 9). Insbesondere ist ein Peptid mit (Cys)m an dem C-Terminus der Aminosäuresequenz bevorzugter.
  • Solch ein Peptid kann die Fähigkeit haben, Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe in den Körperflüssigkeiten zu adsorbieren, und hat bevorzugter die ausgezeichnete Adsorptionsfähigkeit nach der Hochdruckdampf-Sterilisationsbehandlung, Hitzebehandlung, Arzneimittelbehandlung oder γ-Strahlensterilisationsbehandlung, im Vergleich mit den durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Peptiden.
  • Die Kombination eines oben genannten Peptids ohne Zusatz mit einem oben genannten Peptid mit Zusatz kann für das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Das für das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendete Peptid kann durch ein allgemein verwendetes Peptidsyntheseverfahren (z. B. ein Festphasensyntheseverfahren, ein Flüssigphasensyntheseverfahren, wie ein schrittweises Verlängerungsverfahren, und ein Fragmentkondensationsverfahren) hergestellt werden oder kann durch ein Genmanipulationsverfahren hergestellt werden, die die Schritte des Verbindens von DNS, die ein Peptid kodiert, mit einem Vektor und das Einführen des Vektors in einen Wirt, um ein rekombinantes Peptid zu erzeugen, einschließen.
  • Bei der chemischen Synthese eines Peptids macht es Manipulation leichter, ein Festphasensyntheseverfahren anzuwenden, eher als ein Flüssigphasensyntheseverfahren. Gemäß dem Festphasensyntheseverfahren kann ein Peptid z. B. wie folgt synthetisiert werden. (1) Eine Aminosäure, entsprechend dem C-Terminus eines zu synthetisierenden Peptides, wird an einen in einem organischen Lösungsmittel unlöslichen Untergrund gebunden. (2) Jede korrespondierende Aminosäure, die eine funktionelle Gruppe, wie z. B. eine α-Aminogruppe anders als eine α-Carboxygruppe, schützt wird an die Aminosäure gebunden, die an das Substrat bindet, aufeinander folgend in Richtung der N-Terminusrichtung durch Kondensationsreaktion. (3) Eine Schutzgruppe der α-Aminogruppe der gebundenen Aminosäure wird entfernt. (4) Die Schritte (1) bis (3) werden abwechselnd wiederholt. Als ein Ergebnis dieser Manipulationsschritte wird eine Peptidkette verlängert, um ein Peptid mit einer gewünschten Länge zu gewinnen.
  • Nachdem das Peptid von Interesse gewonnen worden ist, wird eine Peptidkette von dem Untergrund abgespalten und Schutzgruppen werden entfernt. Zu diesem Zweck wird oftmals Flusssäure verwendet. Es ist jedoch in Bezug auf Sicherheit und Einfachheit der Handhabung angemessen, Trifluoressigsäure (auf die hierin anschließend als "TFA" Bezug genommen wird) zu verwenden. Genauer wird das Peptid von Interesse in 95% TFA, enthaltend 1,2-Ethandithiol und Anisol (1:3), zur Reaktion gebracht, wodurch das Peptid von dem Untergrund abgespalten wird und die Schutzgruppen entfernt werden. Folglich wird ein Rohpeptid gesammelt. Das Rohpeptid wird mit Ethylether gefällt, wodurch ein grob gereinigtes Peptid gewonnen wird.
  • Das demzufolge erhaltene grob gereinigte Peptid kann durch etliche, Fachleuten bekannte Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel kann das grob gereinigte Peptid Hochdruckflüssigchromatographie (auf die hierin nachfolgend Bezug genommen wird als "HPLC") unter Verwendung einer Umkehrphasensystemsäule ausgesetzt werden, wodurch das Peptid fraktioniert, gesammelt und gereinigt werden kann. HPLC-Bedingungen sollten basierend auf einem allgemein zum Aufreinigen eines Proteins verwendeten System optimiert werden. Eine dem Chromatographiepeak entsprechende Fraktion wird folglich gewonnen und lyophilisiert. Die resultierende gereinigte Peptidfraktion wird der Primärsequenzanalyse durch ein Aminosäurensequenziergerät ausgesetzt und einer Aminosäurenzusammensetzungsanalyse, wodurch ein synthetisiertes Peptid bestätigt wird.
  • In dem Fall, wo ein rekombinantes Peptid durch ein Genrekombinationsverfahren, basierend auf einer Aminosäuresequenz eines Peptids von Interesse, erzeugt wird, wird die Aminosäuresequenz kodierende DNS synthetisiert und in einen Phagen oder einen Plasmidvektor eingeführt. Der resultierende Phage oder Plasmidvektor wird in einen geeigneten Mikroorganismus (z. B. E. coli) integriert, um eine Transformante zu selektieren und zu gewinnen, und die Transformante wird durch ein bekanntes Verfahren kultiviert. Es liegt wohl innerhalb des Fachwissens von Fachleuten, ein Peptid von Interesse aus diesem Kulturüberstand oder aus Zellen aufzureinigen und zu isolieren. Weiterhin können, solange ein geeigneter Vektor ausgewählt wird, Hefe, Bacillus subtilis und Ähnliche leicht als ein Wirt genutzt werden.
  • Ein als ein Untergrund für das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung verwendeter wasserunlöslicher Träger ist nicht besonders begrenzt. Beispiele des in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserunlöslichen Trägers schließen ein anorganische Träger, wie Glasperlen und Kieselsäuregele; organische Träger, hergestellt aus synthetischen Makromolekülen, wie quervernetzter Polyvinylalkohol, quervernetztes Polyacrylat, quervernetztes Polyacrylamid und quervernetztes Polystyrol, oder Polysaccharide, wie kristalline Cellulose, quervernetzte Cellulose, quervernetzte Agarose und quervernetztes Dextran; und komplexe Träger, gewonnen durch Kombinieren dieser organischen Träger und anorganischen Träger, wie eine Kombination aus zwei Arten organischer Träger und einer Kombination eines organischen Trägers und eines anorganischen Trägers. In dem Falle der Verwendung eines Trägers für Hämolyse ist es notwendig, Wirkungen eines Trägers auf ein Komplementsystem, ein Gerinnungssystem und Ähnliches zu berücksichtigen, wenn der Träger in Kontakt mit Blutbestandteilen kommt. Deswegen werden hydrophile Träger, die eine vergleichsweise geringe Möglichkeit unspezifischer Adsorption haben und die eine zufrieden stellende Adsorptionsselektivität hinsichtlich Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen haben, bevorzugt verwendet. In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich ein hydrophiler Träger auf einen Träger, bei welchem, wenn eine einen Träger bildende Verbindung zu einer flachen Platte geformt wird, ein Kontaktwinkel zwischen der flachen Platte und dem Wasser ungefähr 60° oder weniger wird. Beispiele solcher Träger schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Träger, gebildet aus Polysacchariden, wie Cellulose, Chitosan, Sepharose und Dextran, Polyvinylalkohol, einem verseiften Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Poly(methylmethacrylat), mit Polyacrylsäure polymerisiertes Polyethylen, mit Polyacrylamid polymerisiertes Polyethylen und Glas oder aus Derivaten davon gebildete Träger.
  • Unter den oben genannten wasserunlöslichen Trägern haben jene mit einer -OH-Gruppe eine ausgezeichnete Adsorptionskapazität und Adsorptionsselektivität. Vor allem hat ein poröses Cellulosegel die folgenden ausgezeichneten Punkte:
    • (1) Das poröse Cellulosegel ist steif wegen relativ hoher mechanischer Festigkeit, so dass es unwahrscheinlich ist, dass es beschädigt wird oder feines Pulver auf Grund von Rühren erzeugt. Folglich ist es unwahrscheinlich, dass, wenn die Körperflüssigkeit durch eine mit dem Gel gepackte Säule bei einer hohen Geschwindigkeit geführt wird, das Gel in der Säule Verdichtung oder Verstopfen erzeugt. Weiterhin ist es unwahrscheinlich, dass sich die poröse Struktur des Gels während Hochdruckdampfsterilisation und Ähnlichem ändert.
    • (2) Da es aus Cellulose gebildet ist, ist das poröse Cellulosegel hydrophil. Da eine Anzahl Hydroxylgruppen, die der Bindung eines Liganden zugänglich sind, auf dem Gel vorhanden sind, besteht eine geringe Wahrscheinlichkeit unspezifischer Adsorption.
    • (3) Da das poröse Cellulosegel seine relativ hohe Festigkeit sogar in dem Fall bewahrt, wo eine Porenfläche vergrößert wird, wird eine Adsorptionskapazität, die vergleichbar ist mit einem Weichgel, gewonnen.
    • (4) Das poröse Cellulosegel hat einen höheren Sicherheitsfaktor als ein synthetisches makromolekulares Gel.
  • Folglich ist das poröse Cellulosegel eines jener, die am besten geeignet sind für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger ist nicht auf jene oben beschriebenen beschränkt. Die oben genannten Träger können einzeln verwendet werden oder es können jede beliebigen zwei oder mehr Arten davon vermischt werden.
  • Eine Haupteigenschaft, die von dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserunlöslichen Träger gefordert wird, ist, dass der Träger eine Anzahl Poren mit einer geeigneten Größe hat, das heißt dass der Träger porös ist. Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe, die adsorbiert werden sollen durch das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung, haben ein Molekulargewicht in einem weiten Bereich von ungefähr 160.000 bis ungefähr 1.000.000 und können folglich nicht spezifiziert werden. Deswegen ist bevorzugt, damit das Adsorptionsmittel effizient ein Protein adsorbiert, dass Immunglobuline und Immunglobulinkomplexe in Poren mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zu einem gewissen Grad eindringen können und dass andere Proteine an dem Eindringen in Poren, soweit möglich, gehindert werden.
  • In dem für die vorliegende Erfindung verwendeten wasserunlöslichen Träger beträgt ein durchschnittlicher Porendurchmesser eines porösen Trägers vorzugsweise ungefähr 300 bis ungefähr 10.000 Å. Der Durchmesser einer Pore wird am häufigsten durch ein Verfahren der Quecksilberporosimetrie gemessen. In dem Falle eines in der vorliegenden Erfindung verwendeten porösen wasserunlöslichen Trägers kann dieses Verfahren jedoch oftmals nicht angewendet werden. Als ein Kriterium für den Durchmesser einer Pore wird vorzugsweise ein Ausschlussgrenzenmolekulargewicht verwendet. Ein Ausschlussgrenzenmolekulargewicht bezieht sich auf das Molekulargewicht eines Moleküls mit dem kleinsten Molekulargewicht innerhalb einer Gruppe von Molekülen, die in Poren nicht eindringen können (das heißt, die ausgeschlossen sind) in der Gelpermeationschromatographie (H. Hatano und T. Hanai, Experimental High Performance Liquid Chromatography (Jikken Kosoku Ekitai Chromatography), Kagaku Dojin, 1988). Ein Ausschlussgrenzenmolekulargewicht ist allgemein wohl untersucht für globuläre Proteine, Dextran, Polyethylenglykol und Ähnliches. In dem Fall des in der vorliegenden Erfindung verwendeten porösen wasserunlöslichen Trägers wird ein unter Verwendung eines globulären Proteins gewonnener Wert geeigneterweise verwendet.
  • Als ein Ergebnis der Untersuchung von Trägern mit verschiedenen Ausschlussgrenzenmolekulargewichten, wurde die Ausschlussgrenze eines geeigneten Trägers, der deswegen einen für das Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen geeigneten Durchmesser hat, als ungefähr 150.000 oder mehr im Molekulargewicht befunden. Genauer ist in dem Fall, wo ein Träger mit einem Ausschlussgrenzenmolekulargewicht von weniger als ungefähr 150.000 verwendet wird, die adsorbierende und entfernende Menge von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen klein, was in einer abnehmenden Praktikabilität resultiert. Folglich beträgt ein bevorzugtes Ausschlussgrenzenmolekulargewicht des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Trägers ungefähr 150.000 oder mehr. Auf der anderen Seite werden in dem Fall, wo ein Ausschlussgrenzenmolekulargewicht verwendet wird, das 5.000.000 überschreitet, keine besonderen Probleme verursacht, solange das Plasma oder das Serum als die Körperflüssigkeit verwendet werden. Makromoleküle, die keine Wechselwirkung mit einem Liganden haben, haben jedoch eine Tendenz dazu, eine Bindungsstelle eines Liganden zu blockieren, wodurch die effektive Ligandenmenge wesentlich reduziert wird. Weiterhin gibt es in dem Fall, wo das Blut als die Körperflüssigkeit verwendet wird, wenn das Ausschlussgrenzenmolekulargewicht ungefähr 5.000.000 überschreitet, eine Tendenz, dass ein Verhältnis, bei welchem Blutblättchen an einem Träger anhaften, steigt. Folglich wird in dem Fall, wo das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung in einem Hämolysesystem vom Typ der DHP (direkte Hämoperfusion) verwendet wird, eine ausreichende Leistungsfähigkeit nicht notwendigerweise ausgeübt werden können. Auf der anderen Seite werden in dem Fall, wo das Ausschlussgrenzenmolekulargewicht ungefähr 5.000.000 oder weniger beträgt, keine bestimmten Probleme verursacht, sogar wenn Träger für jeglichen Zweck verwendet werden. Folglich, um das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung für etliche Zwecke zu verwenden, beträgt ein Ausschlussgrenzenmolekulargewicht wünschenswerterweise ungefähr 5.000.000 oder weniger. Demgemäß liegt ein bevorzugteres Ausschlussgrenzenmolekulargewicht des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Trägers bei ungefähr 150.000 bis ungefähr 5.000.000.
  • Als Nächstes ist es, unter Berücksichtigung der Adsorptionskapazität pro Volumen eines Adsorptionsmittels, bevorzugt, dass ein Träger eine insgesamt poröse Struktur hat anstelle einer porösen Oberflächenstruktur und ein Porenvolumen von 20% oder mehr und eine spezifische Oberfläche von 3 m2/g oder mehr. Als eine Form eines Trägers kann jede Form, wie eine Perle, eine Faser und/oder eine Membran (einschließlich eines hohlen Fadens) ausgewählt werden.
  • Um einen Liganden zu immobilisieren, ist es bevorzugt, dass für eine Immobilisierungsreaktion eines Liganden zugängliche funktionelle Gruppen auf der Oberfläche eines Trägers anwesend sind. Beispiele der funktionellen Gruppen schließen eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Aldehydgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Silanolgruppe, eine Amidgruppe, eine Epoxygruppe, eine Halogengruppe, eine Succinylimidgruppe und eine Säureanhydridgruppe ein.
  • Als Nächstes, es kann als der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger jeder harte Träger und/oder weiche Träger verwendet werden. Um einen Träger als ein Adsorptionsmittel für eine außerhalb des Körpers stattfindende Zirkulationsbehandlung zu verwenden, ist es wichtig, dass, wenn der Träger in eine Säule gepackt wird und die Körperflüssigkeit durch die Säule hindurchgeführt wird, der Träger Verklumpen nicht verursacht. Deshalb ist eine ausreichende mechanische Festigkeit für den Träger erforderlich. Folglich ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger bevorzugt ein harter Träger. In der vorliegenden Spezifikation bezieht sich ein harter Träger auf jene, bei welchen, z. B. in dem Falle eines granulären Gels, wo das Gel unter den folgenden Bedingungen einheitlich in eine zylindrische, aus Glas hergestellte Säule (Innendurchmesser: 9 mm, Säulenlänge: 150 mm) gepackt ist und eine wässrige Flüssigkeit durch die Säule geführt wird, der Druckverlust ΔP und die Durchflussgeschwindigkeit der wässrigen Flüssigkeit eine lineare Beziehung bis zu einem Druck von 0,3 kg/cm2 haben.
  • Zum Beispiel wurden jeweils ein Agarosegel (Biogel A-5m, hergestellt von Bio-Rad; Partikeldurchmesser: 50 bis 100 Mesh), ein Polymergel vom Vinyltyp (Toyopearl HW-65 hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.; Partikeldurchmesser: 50 bis 100 μm) und ein Cellulosegel (Cellulofine GC-700m, hergestellt von Chisso Corporation; Partikeldurchmesser: 45 bis 105 μm) einheitlich in ihre eigene aus Glas hergestellte zylindrische Säule gepackt (Innendurchmesser 9 mm; Säulenlänge 150 mm), die an beiden Enden mit Filtern mit einem Porendurchmesser von 15 μm ausgestattet war. Wasser wurde durch die Säule durch eine Rollkolbenpumpe hindurchgeführt und die Beziehung zwischen der Durchflussgeschwindigkeit und dem Druckverlust ΔP wurde gewonnen (7). Die Durchflussgeschwindigkeit (cm/Min.) wurde auf eine Ordinate und der Druckverlust (kg/cm2) wurde auf eine Abszisse aufgetragen. Wie in 7 gesehen werden kann, stehen O, Δ und
    Figure 00190001
    für Toyopearl HW-65, Cellulofine GC700m bzw. Biogel-A5m. Als ein Ergebnis wird verstanden, dass die Durchflussgeschwindigkeit der wässrigen Flüssigkeit durch Toyopearl HW-65 und Cellulofine GC700m hindurch annähernd im Verhältnis zu dem Druckanstieg steigt, wohingegen Biogel-A5m in Verdichtung resultiert und die Durchflussgeschwindigkeit steigt mit dem Druckanstieg nicht an.
  • Zum Immobilisieren eines Peptids auf dem oben genannten Träger, um ein Adsorbieren wirksam durch Minimieren von sterischer Hinderung eines Peptids oder Peptidderivates zu verbessern und um unspezifische Adsorption zu unterdrücken, wird ein Peptid vorzugsweise auf einem Träger über hydrophile Spacer immobilisiert. Als die hydrophilen Spacer werden z. B. Derivate von Polyalkylenoxid, bei welchen beide Enden durch Carboxylgruppen, Aminogruppen, Aldehydgruppen, Epoxygruppen oder Ähnliche ersetzt werden, vorzugsweise verwendet.
  • Da eine organische Verbindung, die als ein Peptid verwendet wird, und die in die oben genannten Träger eingeführten Spacer vergleichsweise stabile Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht sind, gibt es eine weniger strenge Anforderung für die Immobilisierungsreaktionsbedingungen, z. B. im Vergleich mit dem Fall, wo ein Protein wie ein Enzym und ein Antikörper immobilisiert wird. Folglich ist ein Immobilisierungsverfahren nicht besonders begrenzt. Es ist jedoch unter Berücksichtigung, dass ein Adsorptionsmittel verwendet werden kann, für die außerhalb des Körpers stattfindende Zirkulationsbehandlung und Hämolyse bevorzugter ein Immobilisierungsverfahren anzuwenden, bei welchem Peptide nicht leicht von einem Träger während der Stabilisation des Adsorptionsmittels oder der Behandlung entfernt werden. Zum Beispiel gibt es (1) ein Verfahren, bei dem es einer Carboxylgruppe eines mit N-Hydroxysuccinimid zu reagierenden Trägers ermöglicht wird, die Carboxylgruppe in einer Succinimiddesoxycarbonylgruppe zu ersetzen, und indem es einem Peptid ermöglicht wird, an einem Teil einer Aminogruppe zur Reaktion gebracht zu werden (aktives Esterverfahren), (2) ein Verfahren, um einer Carboxygruppe oder einer Aminogruppe eines Peptides zu ermöglichen, zur Kondensationsreaktion mit einer Aminogruppe oder einer Carboxygruppe eines Trägers in der Anwesenheit eines Kondensationsreaktionsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, gebracht zu werden (Kondensationsverfahren), und (3) ein Verfahren zur Quervernetzung eines Peptids oder eines Peptidderivates mit einem Träger unter Verwendung einer Verbindung, die wenigstens zwei funktionelle Gruppen hat, wie Glutaraldehyd (Trägerquervernetzungsverfahren). Um die Desorption und Elution von Peptiden auf ein Minimum zu reduzieren, werden Peptide vorzugsweise an einen Träger durch ein kovalentes Bondingverfahren gebunden.
  • Es gibt etliche Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen in der Körperflüssigkeit, indem ein Träger, auf welchem eine funktionelle Peptidgruppe immobilisiert ist, in Kontakt mit der Körperflüssigkeit, wie dem Blut oder dem Plasma, gebracht wird. Repräsentative Beispiele schließen ein (1) ein Verfahren, einschließend die Schritte der Entnahme der Körperflüssigkeit, ihres Lagerns in einem Beutel, des Vermischens der Körperflüssigkeit mit einem Adsorptionsmittel, um Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe zu adsorbieren und zu entfernen, und des Abfilterns des Adsorptionsmittels, wodurch Körperflüssigkeit gewonnen wird, aus welcher Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe entfernt worden sind, und (2) ein Verfahren zum Beladen eines Adsorptionsmittels in einem Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für die Körperflüssigkeit und ausgestattet mit einem Filter an dem Auslass, welches die Körperflüssigkeit hindurch lässt, nicht jedoch das Adsorptionsmittel, und Hindurchfließenlassen der Körperflüssigkeit durch das Gefäß und Ähnliche. Jedes Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen kann verwendet werden. Das letztere Verfahren ist jedoch leicht durchzuführen und weiterhin kann das Gefäß in einen außerhalb des Körpers stattfindenden Zirkulationskreislauf eingebaut werden, wodurch Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe wirksam online aus der Körperflüssigkeit eines Patienten entfernt werden können. Folglich ist das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung geeignet für dieses Verfahren.
  • Als Nächstes wird eine Vorrichtung zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Adsorptionsmittels zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen mit Bezugnahme auf ihre schematische Querschnittsansicht beschrieben werden.
  • Ein in 6 gezeigtes Gefäß 7 schließt einen Einlass oder einen Auslass 1 für eine Lösung, einen Auslass oder Einlass 2 für eine Lösung, ein Immunglobulin- und/oder Immunglobulinkomplex-Adsorptionsmittel 3 der vorliegenden Erfindung, Ausfluss verhindernde Mittel 4 und 5 zum Verhindern des Ausfließens des Adsorptionsmittels, welche es einer Lösung und einem darin enthaltenen Bestandteil ermöglichen, dadurch hindurchgeführt zu werden, die es jedoch dem Adsorptionsmittel nicht ermöglichen, dadurch hindurchgeführt zu werden, und eine Säule 6. Die Form und das Material für dieses Gefäß sind nicht besonders beschränkt. Es wird jedoch z. B. ein zylindrisches Gefäß mit einer Kapazität von ungefähr 20 bis ungefähr 400 ml und einem Durchmesser von ungefähr 2 bis 10 cm vorzugsweise verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung wird detaillierter im Wege der folgenden Beispiele beschrieben werden. Es sollte festgestellt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1 (nur für erläuternde Zwecke)
  • Chemische Synthese eines Peptids und Immobilisierung des Peptids auf Sepharose
  • Chemische Synthese eines Peptids
  • Die Synthese eines Peptids mit einer Sequenz, die aus 57 Resten der Domäne C3 von Protein G besteht, wobei Cystein am N-Terminus angehängt ist, wurde wie folgt durch ein Festphasensyntheseverfahren durchgeführt unter Verwendung eines Peptidsynthesegerätes Peptide Synthesizer Model 4170 (hergestellt von Pharmacia LKB). Unter Verwendung von 0,1 mmol Fmoc-Glutamin NovaSyn KA (hergestellt von Pharmacia LKB), welches ein Untergrund ist, an welchen dem C-Terminus entsprechendes Glutamin gebunden wird, wurden eine Deprotektionierungsreaktion und eine Kondensationsreaktion in Übereinstimmung mit einer Syntheseprogrammeingabe an dem Peptidsynthesegerät wiederholt, wodurch eine Peptidkette erfolgreich durch Anheften an den N-Termins verlängert wurde. Genauer wurden die folgenden Prozessschritte wiederholt: eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe, auf die hierin nachfolgend Bezug genommen wird als "Fmoc", welche eine Schutzgruppe einer α-Aminogruppe der Aminosäure ist, wurde durch Piperidin entfernt, die Peptidkette wurde mit N,N-Dimethylformamid (auf das hierin nachfolgend Bezug genommen wird als "DMF") gewaschen, eine Kondensationsreaktion wurde unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorphosphat (auf das hierin nachfolgend Bezug genommen wird als "HBTU") und N,N-Diisopropylethylamin (auf das hierin nachfolgend Bezug genommen wird als "DIPEA") durchgeführt und die Peptidkette wurde mit DMF gewaschen. Als Aminosäuren wurden Fmoc-L-Ala, Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Asp(OtBu), Fmoc-L-Cys(Trt), Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Glu(OtBu), Fmoc-L-Gly, Fmoc-L-Ile, Fmoc-L-Leu, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-L-Phe, Fmoc-L-Thr(tBu), Fmoc-L-Trp, Fmoc-L-Tyr(tBu) und Fmoc-LVal verwendet. Diese Aminosäuren (0,5 mmol) wurden in einem Röhrchen verwendet. Die Menge der verwendeten Aminosäuren beträgt ungefähr das 5-fache der Molmenge eines Substrates, das verwendet wird. (Hierin repräsentieren Trt, OtBu, Boc und tBu eine Tritylgruppe, einen o-tertiären Butylester, eine tertiäre Butyloxycarbonylgruppe bzw. eine tertiäre Butylgruppe.)
  • Deprotektionierungsreaktion und Abspalten einer Peptidkette
  • Nachdem ein Reaktionsdurchgang für sämtliche Aminosäuren abgeschlossen worden war, wurde der resultierende Untergrund mit tert.-Amylalkohol, Essigsäure und Diethylether nacheinander auf einem Glasfilter mit einer Porengröße 3G-3 gewaschen. Dann wurde der Untergrund in einem Vakuum getrocknet, wodurch ein trockener Untergrund erhalten wurde. In einem Röhrchen wurden 20 ml TFA, 260 μl 1,2-Ethandithiol und 780 μl Anisol zu 1 g des erhaltenen Trägers hinzugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt. Danach wurde die Mischung von dem Untergrund durch Filtration durch den Glasfilter mit einer Porengröße 3G-3 abgetrennt. Das resultierende Filtrat wurde bei 35°C unter reduziertem Druck kondensiert. Zu dem kondensierten Filtrat wurde zuvor abgekühlter absoluter Diethylether hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde so lange gerührt, bis kein absoluter Diethylether mehr ausgefällt wurde. Dann wurde die Mischung zentrifugiert und ein rohes Peptidpräzipitat wurde gesammelt. Weiterhin wurde das Rohpeptid etliche Male mit absolutem Diethylether gewaschen und danach unter einem reduzierten Druck getrocknet, wodurch ein grob gereinigtes Peptid von Interesse gewonnen wurde.
  • Aufreinigung eines Peptids
  • Das demzufolge gewonnene, grob gereinigte Peptid wurde in 0,1% TFA gelöst und die Lösung wurde durch ein 0,2-μm-Membranfilter filtriert. Das demzufolge erhaltene Filtrat wurde Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) ausgesetzt. Für HPLC wurde ein Model-LC-10A-System (hergestellt von Shimadzu Corporation) verwendet und als eine Säule wurde eine μBondasphere-C18-Säule vom Umkehrphasentyp (hergestellt von Nihon Millipore Waters Ltd.) verwendet. Für eine mobile Phase unter Verwendung von 0,1% wässriger TFA-Lösung als A-Lösung und 80% (v/v) Acetonitril/Wasser, enthaltend 0,1% TFA, als B-Lösung, wurde die Säule durch einen linearen Konzentrationsgradienten von der A-Lösung zur B-Lösung eluiert. Fraktionen, die einem Peptid an dem Peak des gewonnenen Chromatogramms entsprechen, wurden gesammelt. Das Sammeln wurde etliche Male wiederholt und die Fraktionen wurden lyophilisiert, wodurch ein gereinigtes Peptid gewonnen wurde. Das demzufolge gewonnene Peptid wurde durch das Gasphasenproteinsequenziergerät Modell 477, (hergestellt von Applied Biosystems Co. Ltd.) analysiert und Aminosäureanalyse wurde unter Verwendung eines gewöhnlichen Ionenaustauscherharzes von Hitachi durchgeführt. Folglich wurde bestätigt, dass ein Peptid mit der durch SEQ ID Nr. 2 repräsentierten Aminosäuresequenz gewonnen worden war.
  • Immobilisierung eines Peptids auf Sepharose
  • Das oben genannte Peptid wurde auf poröser Sepharose immobilisiert, wodurch ein Adsorptionsmittel wie folgt hergestellt wurde. Als Sepharose wurde Thiopropyl Sepharose 6B (hergestellte von Pharmacia LKB) verwendet. Zu 50 mg Thiopropyl Sepharose 6B wurden 50 ml destilliertes Wasser hinzugefügt und der Mischung wurde ermöglicht, bei Raumtemperatur für 15 Minuten zu stehen, wodurch dem Harz ermöglicht wurde, zu schwellen. Dann wurde das destillierte Wasser entfernt und durch 0,1 M Tris-Hydrochlorid-Kopplungspuffer (pH 7,5), enthaltend 0,5 M NaCl ersetzt.
  • Auf der anderen Seite wurden 4 mg des oben genannten gereinigten Peptids in 400 μl 0,1 M Tris-Hydrochlorid-Kopplungspuffer (pH 7,5), enthaltend 0,5 M NaCl, gelöst und 40 mg der oben genannten Thiopropyl Sepharose 6B wurden zu der resultierenden Lösung hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 4°C für 12 Stunden gerührt, wodurch ein Adsorptionsmittel, auf das das gereinigte Peptid immobilisiert war, gewonnen wurde. Weiterhin wurde das resultierende Adsorptionsmittel mit dem darauf immobilisierten Peptid durch Nutschen filtriert und der Gehalt des Peptids in dem Filtrat wurde durch ein absolutes Kalibrierungskurvenverfahren unter Verwendung von HPLC quantifiziert. Folglich wurde ein Verhältnis des auf dem Träger immobilisierten Peptids gewonnen. Das Adsorptionsmittel mit dem darauf immobilisierten Peptid wurde gründlich mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 150 mM NaCl, gewaschen und durch Nutschen. filtriert, wodurch ein Peptid-Sepharose-Adsorptionsmittel von Interesse gewonnen wurde.
  • Beispiel 2 (nur für erläuternde Zwecke)
  • Beurteilung der Adsorptionskapazität eines Adsorptionsmittels mit einem darauf immobilisierten Peptid
  • Test 1
  • Das in dem oben genannten Beispiel 1 hergestellte Adsorptionsmittel wurde hinsichtlich der Adsorptionskapazität thermisch koagulierter Komplexe (Modell eines Immunkomplexes) in dem Blut unter Verwendung des Serums eines gesunden Patienten beurteilt. 50 μl (ein Volumen) des oben genannten Adsorptionsmittels wurden in einem Röhrchen gesammelt und 150 μl (drei Volumen) des Serums eines gesunden Patienten, enthaltend 20 μg/ml thermisch koagulierter Komplexe (siehe M. Makino, Clinical Immunology, Band 18, S. 111–119 (1986)), wurden zu dem Adsorptionsmittel hinzugefügt und das Serum und das Adsorptionsmittel wurden unter Schütteln bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Weiterhin wurden als eine Kontrolle 150 μl (drei Volumen) des Serums eines gesunden Patienten, enthaltend 20 μg/ml thermisch koagulierter Komplexe, auf 50 μl (ein Volumen) eines unbehandelten Trägers hinzugefügt, und das Serum und der Träger wurden unter Schütteln bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Danach wurden diese Suspensionen bei 5.000 rpm für eine Minute zentrifugiert und die Menge der Komplexe in den Überständen wurde durch ein außerhalb des Körpers befindliches Diagnosekit "FRELISA Clq-CIC", hergestellt von Fujirebio Inc., gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Das Adsorptionsverhältnis der thermisch koagulierten Komplexe wurde durch ein Adsorptionsverhältnis (%), berechnet aus einem Wert des Kontrollserums durch die folgende Gleichung, dargestellt. Weiterhin wurde jede Adsorptionskapazität der Immunglobuline (IgG, IgA, IgM) durch ein außerhalb des Körpers befindliches medizinisches Diagnoseprodukt, "N-Assay TIA"-Messkit, im Handel erhältlich von Nittobo Co., Ltd., quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Ferner wurden IgG-Unterklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) durch ein Messkit unter Verwendung eines Immundiffusions-(SRID)-Verfahrens, im Handel erhältlich von Bindingsite, quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Figure 00260001
  • Tabelle 1
    Figure 00260002
  • Tabelle 2
    Figure 00260003
  • Tabelle 3
    Figure 00270001
  • Ausgehend von den obigen Ergebnissen wurde entdeckt, dass es die Verwendung des Adsorptionsmittels der vorliegenden Erfindung IgG, welches ein Bestandteil von Immunkomplexen ist, und Immunkomplexen ermöglicht, selektiv adsorbiert und entfernt zu werden, und IgG3 ermöglicht, das nicht durch Protein A adsorbiert wird, adsorbiert und entfernt zu werden.
  • Test 2
  • Das oben genannte Adsorptionsmittel wurde hinsichtlich der Adsorptionsfähigkeit zirkulierender Immunkomplexe in dem Blut unter Verwendung des Serums eines Patienten, der an Rheumatismus leidet, beurteilt. 50 μl (ein Volumen) des oben genannten Adsorptionsmittels wurden in einem Gefäß gesammelt und 150 μl (drei Volumen) des Serums eines Patienten, der an Rheuma leidet, wurden zu dem Adsorptionsmittel hinzugefügt und das Serum und das Adsorptionsmittel wurden unter Schütteln bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Ferner wurden als eine Kontrolle 150 μl (drei Volumen) des Serums eines Patienten, der an Rheuma leidet, zu 50 μl (ein Volumen) eines unbehandelten Trägers hinzugefügt und das Serum und der Träger wurden unter Schütteln bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Danach wurden diese Suspensionen bei 5.000 rpm für eine Minute zentrifugiert und die Menge der Komplexe in dem Überstand wurde durch das in Test 1 beschriebene Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammen mit aus einem Wert des Kontrollserums berechneten Adsorptionsverhältnis (%) gezeigt. Ferner wurde jede Adsorptionskapazität von Immunglobulinen (IgG, IgA, IgM) durch das oben genannte Verfahren quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00280001
  • Tabelle 5
    Figure 00280002
  • Ausgehend von den Tabellen 4 und 5 wurde entdeckt, dass es die Verwendung des Adsorptionsmittels der vorliegenden Erfindung IgG, welches ein Bestandteil von Immunkomplexen in dem Blut eines an Rheuma leidenden Patienten ist, und Immunkomplexen ermöglicht, selektiv adsorbiert und entfernt zu werden.
  • Beispiel 3 (nur für erläuternde Zwecke)
  • Hochdruckdampfsterilisationsstabilität eines Adsorptionsmittels mit einem darauf immobilisierten Peptid
  • Autoklavenbehandlung eines Adsorptionsmittels
  • Fünfzig Mikroliter des in Beispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 150 mM NaCl, suspendiert und die resultierende Suspension wurde unter Hochdruck bei 121°C für 20 Minuten in einem Autoklavensterilisationsgerät erhitzt.
  • Beurteilung der Adsorptionskapazität eines der Autoklavenbehandlung ausgesetzten Adsorptionsmittels
  • Das Serum wurde auf demselben Wege wie in Beispiel 2 suspendiert, unter Verwendung des in Beispiel 1 gewonnenen Adsorptionsmittels und des oben genannten Adsorptionsmittels, das durch Autoklavensterilisation behandelt worden ist. Die Konzentrationen an Komplexen und Immunglobulinen in dem gewonnenen Überstand wurden gemessen, um ein Adsorptions- und Entfernungsverhältnis zu berechnen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00300001
  • Tabelle 7
    Figure 00300002
  • Ausgehend von den oben genannten Testergebnissen wurde gefunden, dass die Adsorptionsentfernungskapazität des Adsorptionsmittels mit dem darauf immobilisierten Peptid der vorliegenden Erfindung durch eine Autoklavensterilisationsbehandlung erniedrigt worden ist, während eine Adsorptionsentfernungskapazität bezüglich Komplexen und IgG beibehalten wurde.
  • Beispiel 4
  • Produktion des Peptidderivates MK3P47-Peptid
  • DNS (DNS-Sequenz repräsentiert durch SEQ ID Nr. 5), die durch SEQ ID Nr. 4 repräsentiertes MK3P47-Peptid kodiert, wurde synthetisiert. Diese DNS ist so gestaltet, dass sie unter Nutzung jeder Restriktionsenzymstelle (NdeI an einer 5'-Seite; HindIII an einer 3'-Seite) eines pUCNT-Vektors (japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-212693) verbunden werden kann.
  • DNS mit der oben genannten Sequenz wurde mit einem pUCNT-Vektor, gespaltet durch Verdauen mit Restriktionsenzymen NdeI und HindIII (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), unter Verwendung des von Takara Shuzo Co. Ltd. hergestellten DNS-Ligationskits (DNA Ligation Kit Ver. 2) in Übereinstimmung mit einem Vorgehen verbunden, wodurch ein pUCNTMK3P47-Vektor (1) erzeugt wurde.
  • Die pUCNTMK3P47-Vektor-DNS wurde in den E. coli HB101-Stamm (erhältlich von Funakoshi) unter Verwendung eines bekannten Verfahrens eingeführt und eine Transformante wurde basierend auf Resistenz bezüglich des Antibiotikums Ampicillin als einem Index selektiert. Weiterhin wurde Plasmid-DNS aus dieser Transformante durch ein übliches Verfahren extrahiert und ihre Sequenz wurde bestimmt, wodurch bestätigt wurde, dass der pUCNTMK3P47-Vektor eine DNS-Sequenz, wie gestaltet, hat. Als Nächstes wurde die Transformante unter Schütteln in 61 L-Nährlösung (5 g/l NaCl, 10 g/l Bactotrypsin, 5 g/l Hefeextrakt) bei 37°C für 20 Stunden kultiviert und Kulturen wurden zentrifugiert (bei 4°C und 6.000 rpm für 20 Minuten unter Verwendung eines RPR9-2-Rotors von Hitachi), um die Zellen zu sammeln. Die demzufolge gewonnenen Pellets wurden in 300 ml eines TE-Puffers (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA: pH 7.5) suspendiert und die resultierende Suspension wurde Ultraschallzerstörung (3-mal (jeweils für 6 Minuten) in Eis unter Verwendung von BRANSON 250) ausgesetzt. Dann wurde die Suspension zentrifugiert (bei 4°C und 15.000 rpm für 20 Minuten unter Verwendung eines RPR16-Rotors von Hitachi) und der Überstand wurde gesammelt. Der demzufolge gewonnene Überstand wurde bei 70°C für 10 Minuten erhitzt, zentrifugiert (bei 4°C und 15.000 rpm für 20 Minuten unter Verwendung eines RPR16-Rotors von Hitachi) und 300 ml eines Überstandes wurden gesammelt. Das MK3P47-Peptid wurde von dem folglich gewonnenen Überstand unter Verwendung von HPLC-Chromatographie (Säule: Waters μBONDASPHERE 5 μ C18 300A 19,0 × 150 mm) wie folgt gereinigt. Als Erstes wurden 40 ml einer 0,1% TFA-Lösung durch die Säule bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/Min. hindurchgeführt, um die Säule zu aktivieren, und 300 ml einer Probe wurden durch die Säule mit derselben Durchflussgeschwindigkeit hindurchgeführt. Die Säule wurde mit 200 ml 0,1% TFA + 14% Acetonitrillösung gewaschen. Dann wurde das MK3P47-Peptidderivat von Interesse von der Säule unter Verwendung von 200 ml 0,1% TFA + 40% Acetonitrillösung eluiert, wodurch Fraktionen, die MK3P47-Peptid enthielten, gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden auf 100 ml durch einen Verdampfer konzentriert und lyophilisiert, wodurch 1,2 g MK3P47-Peptid als eine gereinigte Probe mit hoher Reinheit gesammelt wurden. Diese Probe wurde für zahlreiche Untersuchungen verwendet.
  • Beispiel 5
  • Herstellung des Peptidderivats MP47K3-Peptid
  • Durch SEQ ID Nr. 7 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 6 repräsentiertes MP47K3-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das mit jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden ein pUCNTMP47K3-Vektor unter Verwendung der DNS und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die so erhaltene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MP47K3-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 600 mg einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 6
  • Herstellung des Peptidderivats MP47-Peptid
  • Durch SEQ ID Nr. 9 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 8 repräsentiertes MP47-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das mit jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden ein pUCNTMP47-Vektor unter Verwendung der DNS und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die demzufolge erhaltene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MP47-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 500 mg einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 7
  • Herstellung des Peptidderivats MP47C-Peptid
  • Durch SEQ ID Nr. 11 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 10 repräsentiertes MP47C-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das mit jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden unter Verwendung der DNS ein pUCNTMP47-Vektor und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die demzufolge gewonnene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MP47C-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 1,3 g einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 8
  • Herstellung eines MK3G56-Peptids zum Vergleich
  • Durch SEQ ID Nr. 13 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 12 repräsentiertes MK3G56-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das zu jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden unter Verwendung der DNS ein pUCNTMK3G56-Vektor und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die folglich erhaltene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MK3G56-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 1,0 g einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 9
  • Herstellung des Peptidderivates MK3-7M-Peptid
  • Durch SEQ ID Nr. 15 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 14 repräsentiertes MK3-7M-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das zu jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden ein pUCNTMK3-7M-Vektor unter Verwendung der DNS und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die folglich erhaltene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MK3-7M-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 800 mg einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 10
  • Herstellung von MG56-Peptid zum Vergleich
  • Durch SEQ ID Nr. 17 repräsentierte DNS, die durch SEQ ID Nr. 16 repräsentiertes MG56-Peptid kodiert, wurde unter Verwendung des Verfahrens synthetisiert, das zu jenem von Beispiel 4 ähnlich ist, und es wurden ein pUCNTMG56-Vektor unter Verwendung der DNS und ein pUCNT-Vektor hergestellt. Dann wurde der Vektor in E. coli transformiert. Die folglich erhaltene Transformante wurde kultiviert (6 l) und das MG56-Peptid von Interesse wurde gereinigt, wodurch 400 mg einer hochreinen Probe gewonnen wurden.
  • Beispiel 11
  • Arzneimitteldenaturierungskurvenanalyse eines Peptids
  • Als Erstes wurde 1 mg/ml einer wässrigen Lösung jedes in den Beispielen 4 bis 8 und Beispiel 10 gewonnenen Peptids auf 10 μg/ml durch 0 bis 8 M.
  • Guanidinhydrochloridlösung (bei 30°C) verdünnt und es wurde eine Fluoreszenzintensität bei EM 340 nm (angeregt bei EX 278 nm) gemessen mit dem von Hitachi Ltd. hergestellten Spektrofluorometer vom Typ F-2000. Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 gezeigt. Die Fluoreszenzintensität (%) wurde auf eine Ordinate aufgetragen und die Konzentration von Guanidin (M) wurde auf eine Abszisse aufgetragen. In 2 stehen ♢, ☐ und Δ für ein MG56-Peptid, MK3G56-Peptid bzw. MK3P47-Peptid. In 3 stehen ♢, ☐, Δ und x für ein MK3P47-Peptid, MP47K3-Peptid, MP47-Peptid bzw. MP47C-Peptid. Folglich wurde, wie in den 2 und 3 gezeigt, wenn die Höhe der Denaturierungskonzentration jedes Peptids verglichen wurde, eine Beziehung von MP47C > MP47 > MP47K3 > MK3P47 > MG56 > MK3G56 gewonnen.
  • Beispiel 12
  • Messen eines thermischen Denaturierungspunktes eines Peptids
  • MK3G56-Peptid und MK3P47-Peptid wurden für einen thermischen Denaturierungspunkt mittels des adiabatischen Kalorimeters mit Differenzialabtastung DASM-4 (hergestellt von Mashpriborintorg in Russland: japanischer Vertreter Shinkurikou Kabushikikaisha) mit Bezug auf ein in Protein, Nucleic acid, Enzyme, Band 33, Nr. 4 (1988), S. 337–347 beschriebenem Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt. Die Wärmekapazität (Cp J/g·k) wurde auf einer Ordinate abgetragen und die Temperatur (°C) wurde auf einer Abszisse abgetragen. Wie in den 4 (MK3G56) und 5 (MK3P47) gezeigt, lag der thermische Denaturierungspunkt des MK3G56-Peptids bei 76,3°C, wohingegen jener des MK3P47-Peptids 78,1°C war. Dies zeigt, dass eine Aminosäure Pro an der Position 47 in SEQ ID Nr. 3 offensichtlich die thermische Stabilität verbessert.
  • Beispiel 13
  • Immobilisierung und γ-Strahlensterilisationsstabilität von K3P47-Peptid
  • Wasser wurde zu 90 ml GCL2000m (hergestellt von Chisso Corporation, Molekulargewicht der Ausschlussgrenze eines globulären Proteins: 3.000.000) hinzugefügt, welches ein poröses Hartgel vom Cellulosetyp ist, so dass das Gesamtvolumen 180 ml wurde. Danach wurden 60 ml 2 M Natriumhydroxid zu der Mischung hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde auf 40°C erhitzt. Dann wurden 21 ml Epichlorhydrin zu der Mischung hinzugefügt und der Mischung wurde ermöglicht, bei 40°C für eine Stunde ohne Rühren zu reagieren. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt gründlich mit Wasser gewaschen, um ein epoxy-aktiviertes Gel zu erhalten.
  • Das epoxy-aktivierte Gel wurde sauggetrocknet (angesaugt durch eine Wasserstrahlpumpe auf einem Glasfilter G3 für 15 Minuten). 1 g epoxy-aktiviertes Gel wurde in 2,7 ml eines Boratpuffers (pH 10,0) suspendiert (8,74 ml 0,1 N wässriges Natriumhydroxid wurden zu 10 ml einer wässrigen Lösung aus 0,1 M Natriumtetraborat und 0,1 M Kaliumchlorid hinzugefügt und Wasser wurde zu der Mischung hinzugefügt, so dass das Gesamtvolumen 20 ml wurde) und 10 mg MK3P4-Peptid (SEQ ID Nr. 4) wurden zu der Suspension hinzugefügt. Der resultierenden Suspension wurde ermöglicht, bei 40°C für 60 Stunden unter Rühren zu reagieren.
  • Die Überstände des Reaktionsmittels vor bzw. nach der Reaktion wurden zweifach verdünnt. Dann wurden 100 μl eines BCA-Messreagens (hergestellt von Pierce) zu jeweils 10 μl der verdünnten Überstände hinzugefügt, dann wurden die Überstände bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde die Adsorption bei λ = 550 nm gemessen. Kalibrierung wurde durchgeführt und die Konzentration des Peptids und die immobilisierte Menge davon vor und nach der Reaktion wurden berechnet. Als ein Ergebnis betrug die Reaktionsausbeute des Peptids hinsichtlich des Gels 34% und die immobilisierte Menge davon war 2,1 mg pro 1 ml Gel.
  • Das synthetisiere Adsorptionsmittel mit dem darauf immobilisierten Peptid wurde mit einer ausreichenden Menge Salzlösung gewaschen, um das Adsorptionsmittel GCL2000mMK3P47 zu erhalten.
  • Ferner wurde ein Teil des synthetisieren Adsorptionsmittels GCL2000mMK3P47 γ-Strahlensterilisation (25 kGy) ausgesetzt, während es in einer Salzlösung suspendiert worden ist, wodurch das Adsorptionsmittel γGCL2000mMK3P47 gewonnen wurde, welches der γ-Strahlensterilisation ausgesetzt wurde. (Hiernach wird ein der γ-Strahlensterilisation ausgesetztes Adsorptionsmittel mit γ dargestellt werden.)
  • Dann wurden 300 μl des menschlichen Serums, das 20 μg/ml thermisch koagulierte Immunglobulinkomplexe (auf die hiernach Bezug genommen wird als "Model IC") enthielt, zu 100 μl des so gewonnenen Adsorptionsmittels GCL2000mMK3P47 oder γGCL2000mMK3P47 hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37°C für 2 Stunden geschüttelt. Der Überstand des Serums wurde durch Zentrifugation gesammelt und die Konzentration der Immunglobuline (auf die hiernach Bezug genommen wird als "IgG") und von IC wurden gemessen, um ein Adsorptionsverhältnis zu berechnen. Die Konzentration von IgG wurde durch ein außerhalb des Körpers befindliches diagnostisches Medizinprodukt, den "N-Assay-TIA"-Messkit, erhältlich von Nittobo, gemessen und die Konzentration von IC wurde durch einen Enzymimmunoassay Flerizer Clq-CIC, hergestellt von Fujirebio Inc., in Übereinstimmung mit einem daran angehefteten Handbuch gemessen. Die Ergebnisse sind, wie in Tabelle 8 gezeigt. Genauer zeigte das GCL2000mMK3P47, das als einen Liganden rekombinantes MK3P47-Peptid verwendet, bei welchem Asp an der Position 47 des C3-Peptids durch Pro ersetzt worden war und bei welchem Lys-Lys-Lys- zu dem N-Terminus als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisierung auf einem Träger hinzugefügt worden war, eine hohe Adsorptionskapazität bezüglich IC und IgG und die Adsorptionskapazität nahm kaum ab, sogar nach dem Aussetzen an γ-Strahlensterilisation.
  • Beispiel 14 (nur zum Vergleich)
  • Immobilisierung und γ-Strahlensterilisationsstabilität des MK3G56-Peptids
  • Ein Adsorptionsmittel GCL2000mMK3G56 und ein Adsorptionsmittel γGCL2000mMK3G56 wurden auf demselben Wege wie im Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass das in Beispiel 8 gewonnene MK3G56-Peptid verwendet wurde. Die Reaktionsausbeute des Peptids bezüglich eines Gels war 40% und die immobilisierte Menge davon war 2,5 mg pro 1 ml Gel.
  • Das IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis von demzufolge gewonnenen GCL2000mMK3G56 oder γGCL2000mMK3G56 sind wie in Tabelle 8 gezeigt. GCL2000mMK3G56, das als einen Träger rekombinantes MK3G56-Peptid verwendete, bei welchem Lys-Lys-Lys- zu dem N-Terminus des C3-Peptids als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisierung an einen Träger hinzugefügt worden war, zeigt ein vergleichsweise hohes Adsorptionsverhältnis bezüglich IgG und IC. Das GCL2000mMK3G56 verlor jedoch das meiste seiner Adsorptionskapazität, nachdem es einer γ-Strahlensterilisationsbehandlung ausgesetzt worden war.
  • Beispiel 15
  • Immobilisierung und γ-Strahlensterilisationsstabilität von MP47K3-Peptid
  • Ein Adsorptionsmittel GCL2000mMP47K3 und ein Adsorptionsmittel γGCL2000mMP473 wurden auf demselben Wege wie in Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass das in Beispiel 5 gewonnene MP47K3-Peptid verwendet wurde. Die Reaktionsausbeute des Peptids bezüglich eines Gels war 42% und die immobilisierte Menge davon war 2,6 mg pro 1 ml Gel.
  • Das demzufolge gewonnene IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis von GCL2000mMP47K3 oder γGCL2000mMP47K3 sind, wie in Tabelle 8 gezeigt. In dem GCL2000mMP47K3, das als einen Liganden rekombinantes MP47K3-Peptids verwendet, bei welchem Asp an der Position 47 des C3-Peptids durch Pro ersetzt worden war und bei dem Lys-Lys-Lys- zu dem C-Terminus als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisierung an einen Träger hinzugefügt worden war, war die γ-Strahlensterilisationsstabilität einer Adsorptionskapazität hinsichtlich IC und IgG wesentlich verbessert, im Vergleich mit dem Fall, wo das MK3G56-Peptid (Vergleichsbeispiel) als ein Träger verwendet worden war.
  • Beispiel 16
  • Immobilisation und γ-Strahlensterilisationsstabilität von MP47-Peptid
  • Wasser wurde zu 90 ml GC700m (hergestellt von Chisso Corporation, ein Molekulargewicht der Ausschlussgrenze eines globulären Proteins: 400.000) hinzugefügt, welches ein poröses Hartgel vom Cellulosetyp ist, so dass das Gesamtvolumen 180 ml wurde. Danach wurden 60 ml 2 M Natriumhydroxid zu der Mischung hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde auf 40°C erhitzt. Dann wurden 21 ml Epichlorhydrin zu der Mischung hinzugefügt und der Mischung wurde ermöglicht, bei 40°C für 1 Stunde unter Rühren zu reagieren. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt gründlich mit Wasser gewaschen, um ein epoxy-aktiviertes Gel zu gewinnen.
  • Ein Adsorptionsmittel GC700mMP47 und ein Adsorptionsmittel γGC700mMP47 wurden auf demselben Wege wie in Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass das demzufolge gewonnene epoxy-aktivierte Gel und das in Beispiel 6 gewonnene MP47-Peptid verwendet wurden. Die Reaktionsausbeute des Peptids war 42% und die immobilisierte Menge war 2,6 mg pro 1 ml Gel.
  • Das IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis des demzufolge gewonnenen GC700mMP47 oder γGC700mMP47 sind in Tabelle 8 gezeigt. In dem GC700mMP47, das rekombinantes MP47-Peptid, bei welchem Asp an der Position 47 des C3-Peptids durch Pro ersetzt worden war, als einen Liganden verwendet, war die γ-Strahlensterilisationsstabilität der IC- und IgG-Adsorptionskapazität wesentlich verbessert, im Vergleich mit dem Fall, wo in Beispiel 18 beschriebenes rekombinantes C3-Peptid (MG56) als ein Ligand verwendet worden war.
  • Beispiel 17
  • Immobilisierungs- und γ-Strahlensterilisationsstabilität von MP47C-Peptid
  • Ein Adsorptionsmittel GC700mMP47C und ein Adsorptionsmittel γGC700mMP47C wurden auf demselben Wege wie im Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass das in Beispiel 16 erhaltene epoxy-aktivierte Gel und das im Beispiel 7 erhaltene MP47C-Peptid verwendet worden sind. Die Reaktionsausbeute des Peptids hinsichtlich eines Gels betrug 64% und die immobilisierte Menge betrug 4,0 mg pro 1 ml Gel.
  • Das IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis des demzufolge gewonnenen GC700mMP47C oder γGC700mMP47C sind, wie in Tabelle 8 gezeigt. In dem GC700mMP47C, das rekombinantes MP47C-Peptid, bei welchem Asp an der Position 47 das C3-Peptid durch Pro ersetzt worden war und -Cys an den C-Terminus als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisierung an einen Träger angehängt worden war, als einen Liganden verwendet, war das Adsorptionsverhältnis bezüglich IC und IgG merklich verbessert im Vergleich mit dem Fall, wo das MG56 entsprechende rekombinante C3-Peptid als ein Ligand in Beispiel 18 verwendet worden war, und dem Fall, wo das MP47-Peptid ohne an den C-Terminus angeheftetes -Cys als ein Ligand in Beispiel 16 verwendet worden war. Weiterhin nahm die Adsorptionskapazität kaum ab, sogar nach der γ-Strahlensterilisation.
  • Beispiel 18 (nur zum Vergleich)
  • Immobilisierungs- und γ-Strahlensterilisationsstabilität von MG56-Peptid
  • Ein Adsorptionsmittel GC700mMG56 und ein Adsorptionsmittel γGC700mMG56 wurden auf demselben Wege wie in Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass das in Beispiel 16 gewonnene epoxy-aktivierte Gel und das in Beispiel 10 gewonnene MG56-Peptid verwendet wurden. Die Reaktionsausbeute des Peptids im Verhältnis zu einem Gel war 64% und die immobilisierte Menge davon war 4,0 mg pro 1 ml Gel.
  • Das IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis von den demzufolge gewonnenen GC700mMG56 oder γGC700mMG56 sind, wie in Tabelle 8 gezeigt. Das GC700mMG56, das als einen Liganden MG56, welches ein rekombinantes C3-Peptid ist, verwendet, zeigte ein vergleichsweise hohes Adsorptionsverhältnis im Vergleich zu IC und IgG. Das GC700mMG56 verlor jedoch die meiste seiner Adsorptionskapazität, nachdem es einer γ-Strahlensterilisationsbehandlung ausgesetzt worden war.
  • Beispiel 19 (nur zum Vergleich)
  • Immobilisation und γ-Strahlensterilisationsstabilität von MK3-7M-Peptid
  • Ein Adsorptionsmittel HW65MK3-7M und ein Adsorptionsmittel γHW65MK3-7M wurden auf demselben Wege wie in Beispiel 13 gewonnen, mit der Ausnahme, dass 0,3 g AF-Torecyl Toyopearl 650 in 3 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid (pH 9,0), suspendiert wurden, anstelle des Suspendierens des oben genannten epoxy-aktivierten Gels; 10 mg in Beispiel 9 gewonnenes MK3-7M-Peptid wurden zu der Suspension hinzugefügt und der resultierenden Suspension wurde ermöglicht, bei 40°C für 60 Stunden unter Rühren zu reagieren. Die Reaktionsausbeute des Peptids betrug 57% und die immobilisierte Menge war 3,6 mg pro 1 ml Gel.
  • Das IgG-Adsorptionsverhältnis und das IC-Adsorptionsverhältnis von den demzufolge gewonnenen HW65MK3-7M oder γHW65MK3-7M sind, wie in Tabelle 8 gezeigt. In dem HW65MK3-7M, welches ein rekombinantes Peptid MK3-7M als einen Liganden umfasst, in welches 7 Mutationen in das C3-Peptid eingeführt worden waren und Lys-Lys-Lys- an den N-Terminus als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisierung an einen Träger hinzugefügt worden war, war die γ-Strahlensterilisationsstabilität der IC- und IgG-Adsorptionskapazität wesentlich verbessert, im Vergleich mit dem MG56, welches das in Beispiel 18 beschriebene rekombinante C3-Peptid ist.
  • Tabelle 8
    Figure 00420001
  • Beispiel 20
  • Hochdruckdampfsterilisationsstabilität eines Adsorptionsmittels mit einem darauf immobilisierten Peptidderivat
  • Ein Teil des in Beispiel 17 gewonnenen Adsorptionsmittels GC700mMP47C und ein Teil des in Beispiel 18 gewonnenen Adsorptionsmittels GC700mMG56 wurden jeweils einer Autoklavensterilisation (121°C, 20 Minuten) unter der Bedingung, dass sie in einer Salzlösung suspendiert waren, ausgesetzt. Folglich wurden aGC700mMP47C bzw. aGC700mMG56 gewonnen. Das IgG-Adsorptionsverhältnis dieser Adsorptionsmittel wurde unter Verwendung des Verfahrens berechnet, das mit jenem von Beispiel 13 ähnlich ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
  • Das GC700mMP47, das als einen Liganden rekombinantes Peptid MP47C verwendet, bei welchem Asp an der Position 47 des C3-Peptids durch Pro ersetzt worden war und bei dem -Cys an einen C-Terminus als eine funktionelle Gruppe für die Immobilisation an Träger angeheftet worden war, zeigte ein sehr hohes IgG-Adsorptionsverhältnis (50%) nach einer Autoklavenbehandlung, wohingegen das in Beispiel 18 gewonnene Adsorptionsmittel GC700mMG56, das rekombinantes C3-Peptid (MG56) als einen Liganden verwendet, die IgG-Adsorptionskapazität nach einer Autoklavenbehandlung vollständig verlor.
  • Tabelle 9
    Figure 00430001
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Indem ein Adsorptionsmittel mit einem darauf immobilisierten Peptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe selektiv adsorbiert und entfernt werden und IgG3, das durch Protein A nicht adsorbiert wird, kann adsorbiert und entfernt werden. Weiterhin ist das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung nicht teuer und kann einer Autoklavensterilisationsbehandlung wegen seiner ausgezeichneten Lagerungsstabilität, wie der thermischen Stabilität, ausgesetzt werden. Weiterhin kann das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung wirksam Immunglobuline und/oder Immunglobulinkomplexe, die in der Körperflüssigkeit enthalten sind, adsorbieren und entfernen, sogar, nachdem das Adsorptionsmittel einer Arzneimittelbehandlung und einer Sterilisationsbehandlung ausgesetzt worden ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001

Claims (10)

  1. Adsorptionsmittel zum Adsorbieren von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen, worin ein Peptid, umfassend eine durch die SEQ ID-Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist.
  2. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, worin (Lys)n oder (Cys)m am Amino-Terminus und/oder am Carboxy-Terminus des Peptids angefügt werden, worin n und m ganze Zahlen von 0 bis 9 sind.
  3. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 2, worin das Peptid aus einer Aminosäuresequenz von 70 Aminosäuren oder weniger besteht.
  4. Sterilisiertes Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich durch Unterwerfen des Adsorptionsmittels unter eine Hochdruck-Dampfsterilisation.
  5. Sterilisiertes Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich durch Unterwerfen des Adsorptionsmittels unter eine γ-Strahlen-Sterilisation.
  6. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der wasserunlösliche Träger porös ist.
  7. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der wasserunlösliche Träger hydrophil ist.
  8. Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 6 oder 7, worin das Molekulargewicht der Ausschlußgrenze des wasserunlöslichen Trägers im Bereich von 150.000 bis 5.000.000 liegt.
  9. Vorrichtung zum Adsorbieren und Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen, worin das Adsorptionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Behältnis mit einem Einlass und einem Auslass für eine Lösung angeordnet ist und worin die Vorrichtung den Abfluss verhindernden Mittel enthält, um das Adsorptionsmittel am Ausströmen aus dem Behältnis zu hindern.
  10. Verwendung eines Peptids, umfassend eine durch die SEQ ID-Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz, bei der Herstellung eines Adsorptionsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in einem Verfahren zum Entfernen von Immunglobulinen und/oder Immunglobulinkomplexen aus einer Lösung, welches Verfahren den Schritt des In-Kontakt-Bringens des Adsorptionsmittels mit der Lösung umfasst, und worin die Lösung Blut, Plasma oder andere Körperfluide, darstellt, die aus einem lebenden Organismus erhalten werden.
DE69733467T 1996-01-25 1997-01-24 Adsorbtionsvorrichtung und absorbens für immunuglobine und deren komplexe Expired - Lifetime DE69733467T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1128196 1996-01-25
JP1128196 1996-01-25
PCT/JP1997/000161 WO1997026930A1 (fr) 1996-01-25 1997-01-24 Adsorbant pour immunoglobulines et complexes de celles-ci, procede et dispositif d'adsorption

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69733467D1 DE69733467D1 (de) 2005-07-14
DE69733467T2 true DE69733467T2 (de) 2006-03-23

Family

ID=11773620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69733467T Expired - Lifetime DE69733467T2 (de) 1996-01-25 1997-01-24 Adsorbtionsvorrichtung und absorbens für immunuglobine und deren komplexe

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6133431A (de)
EP (1) EP0882463B1 (de)
JP (1) JP3908278B2 (de)
KR (1) KR100445644B1 (de)
CA (1) CA2244734A1 (de)
DE (1) DE69733467T2 (de)
WO (1) WO1997026930A1 (de)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1286535C (zh) * 1997-03-25 2006-11-29 钟渊化学工业株式会社 用于消除丙肝病毒的吸附剂、吸附器和吸附方法
US8197430B1 (en) 1998-05-22 2012-06-12 Biopheresis Technologies, Inc. Method and system to remove cytokine inhibitor in patients
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
JP4685294B2 (ja) * 2001-09-18 2011-05-18 株式会社カネカ 新規ペプチド、生産方法、新規吸着体、吸着器および吸着方法
US7232635B2 (en) * 2002-02-04 2007-06-19 Konica Corporation Image forming method, image forming apparatus, and processing cartridge
US7276042B2 (en) * 2003-01-23 2007-10-02 National Quality Care, Inc. Low hydraulic resistance cartridge
EP1816137A4 (de) * 2004-10-28 2009-12-23 Kaneka Corp Adsorbens adsorbierender antikkörper gegen den beta 1-adrenorezeptor
KR100931027B1 (ko) * 2006-06-27 2009-12-10 한국생명공학연구원 Ｎ-말단에 시스테인 태그된 단백질 ｇ 변형체
US7833660B1 (en) 2006-09-07 2010-11-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fluorohaloborate salts, synthesis and use thereof
US7820323B1 (en) 2006-09-07 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Metal borate synthesis process
WO2009044650A1 (ja) * 2007-10-05 2009-04-09 Kaneka Corporation 免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチド、および上記ペプチドを用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法
JP5382675B2 (ja) * 2007-10-19 2014-01-08 独立行政法人産業技術総合研究所 安定な変異型タンパク質の製造方法
JP5278940B2 (ja) * 2007-11-12 2013-09-04 独立行政法人産業技術総合研究所 安定な抗体結合性タンパク質
JP5236311B2 (ja) * 2008-02-22 2013-07-17 株式会社カネカ ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体結合性ペプチド
JP6506691B2 (ja) 2013-08-30 2019-04-24 株式会社カネカ Ｆａｂ領域結合性ペプチド
JP6236278B2 (ja) * 2013-10-08 2017-11-22 旭化成メディカル株式会社 体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材
JP6596005B2 (ja) * 2014-08-28 2019-10-23 株式会社カネカ Ｆａｂ領域含有ペプチド用アフィニティー分離マトリックス
WO2018180204A1 (ja) 2017-03-31 2018-10-04 株式会社カネカ 安定性改良型免疫グロブリン結合性ペプチド
CN112940090B (zh) * 2021-03-18 2023-02-24 广州康盛生物科技股份有限公司 耐受辐照灭菌及高效消毒的蛋白a免疫吸附介质

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4614513A (en) * 1984-08-13 1986-09-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and apparatus for treatment to remove immunoreactive substances from blood
EP0197521B1 (de) * 1985-04-09 1989-08-02 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Immunoglobulinadsorbent und Adsorptionsvorrichtung
SE459503B (sv) * 1985-05-03 1989-07-10 Excorim Kommanditbolag Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g
US5312901A (en) * 1986-02-14 1994-05-17 Pharmacia Lkb Biotechnology Ab Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US4956296A (en) * 1987-06-19 1990-09-11 Genex Corporation Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
WO1987005025A1 (en) * 1986-02-14 1987-08-27 Genex Corporation Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g
JPH0611336B2 (ja) * 1987-07-14 1994-02-16 テルモ株式会社 体液浄化材および体液浄化装置
JPH01158970A (ja) * 1987-09-14 1989-06-22 Terumo Corp 直接血液潅流用免疫グロブリン吸着材および吸着装置
JP2566325B2 (ja) * 1987-11-20 1996-12-25 クリエイティブ・バイオマリキュールズ・インコーポレーテッド 免疫複合体の選択的除去
US5084398A (en) * 1987-11-20 1992-01-28 Creative Biomolecules Selective removal of immune complexes
US5306812A (en) * 1989-09-08 1994-04-26 The Regents Of The University Of California Immunoglobulin-binding polypeptides
JPH06263795A (ja) * 1992-09-30 1994-09-20 Kuraray Co Ltd ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤
JPH0792167A (ja) * 1993-09-24 1995-04-07 Kinki Univ ＩｇＥ吸着材

Also Published As

Publication number Publication date
EP0882463A1 (de) 1998-12-09
EP0882463B1 (de) 2005-06-08
DE69733467D1 (de) 2005-07-14
JP3908278B2 (ja) 2007-04-25
EP0882463A4 (de) 2002-01-09
US6133431A (en) 2000-10-17
KR100445644B1 (ko) 2005-01-13
WO1997026930A1 (fr) 1997-07-31
KR19990082040A (ko) 1999-11-15
CA2244734A1 (en) 1997-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69733467T2 (de) Adsorbtionsvorrichtung und absorbens für immunuglobine und deren komplexe
EP1435360B1 (de) Neues peptid, neues adsorbens, adsorptionseinheit und adsorptionsverfahren
US6686457B1 (en) Material
JPH119688A (ja) タンパク質を含有する溶液を浄化する装置、その装置のための支持材料を生産する方法及びその装置の使用方法
CN111057153A (zh) 一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用
CN110026166A (zh) 一种用于靶向吸附的蛋白a吸附材料及其制备方法
TW202045527A (zh) 包含使用活性碳材料之步驟之抗體純化方法
WO2004067549A2 (de) Peptide gegen kälteunverträglichkeit hervorrufende autoantikörper und ihre verwendung
JPH11507041A (ja) ラナ・ピピエンス卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質
EP1570272A2 (de) Bestimmung agonistischer autoantikörper
DE10011481A1 (de) Adsorbens zum Absenken der Konzentration von Fibrinogen und/oder Fibrin, Verwendung des Adsorbens zur Herstellung eines Adsorbers und Adsorber mit dem Adsorbens
JP3926573B2 (ja) フィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度を減少させるための吸着剤の製造法、吸着剤、および吸着装置の製造のための吸着剤の使用
JP2001286554A (ja) 拡張型心筋症用吸着体
JP2004105529A (ja) 細胞吸着材および細胞吸着器の滅菌方法ならびに細胞吸着器
JP3357139B2 (ja) 抗デオキシリボ核酸抗体の吸着剤
RU2681413C9 (ru) Способы получения нового поколения безопасных с биологической точки зрения продуктов klh, применяемых для лечения рака, для разработки конъюгированных терапевтических вакцин и в качестве стимулирующих средств
CN114195858B (zh) 多肽及其改造体和在制备抗炎杀菌药物中的应用
EP1890150A1 (de) Bestimmung agonistischer, mit der humoralen Nierenabstossung assoziierten Autoantikörper
JP4443309B2 (ja) フィブリノゲン吸着剤ｉｉｉ
JP4773354B2 (ja) インスリン結合たんぱく質と結合能力のあるペプチドおよび吸着材
JPH06263795A (ja) ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤
DE10311106B4 (de) Peptide gegen Kälteunverträglichkeit hervorrufende Autoantikörper, dafür kodierende Nukleinsäuren, ihre Verwendung und diese umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen
JPH06116298A (ja) 新規ペプチド及びエンドトキシン除去方法
Richner et al. In vitro adsorption of colon cancer sera over staphylococcus protein a: lymphocyte stimulation by leakage of adsorbance
JPH06142198A (ja) 抗血小板抗体吸着材

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition