JPS6230721A - 新規な活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑制作
用を示す活性ペプチドに関する。

（従来の技術） エイチ・グレゴリ−（）１．　ＧｒｅｇＯｒＹ　）は、
ヒト尿に含まれる胃酸分泌抑制物質の抽出精製を行い。

２種の物質、すなわちβ−ウロガストロン（β−ＵＧ）
及びγ−ウロガストロン（γ−ＵＧ）を得た〔ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２５７巻、３２５−３２７頁、
１９７５年〕。β−ＵＧ及びγ−ＵＧは、いずれも１６
程のアミノ酸からなる１本鎖ポリペプリドであって、そ
れぞれ、アミノ酸総数５３及び５２１等電点４．５及び
４．３である。

一方、コーエン（ｃｏｈｅｎ　）らは、ヒト尿から上皮
細胞の成長促進作用を有する物質、すなわち。

ヒト上皮細胞成長因子（ｈ　−ＥＧＦ　）を発見しく　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７２巻１３１７頁、１９７５年）。このｈ−ＥＧ
Ｆはアミノ酸総数が４９ケである。

（発明が解決しようとする問題点） 種々の生理活性の類似性及び免疫学的交互性からウロガ
ストロン（ＵＧ）とｈ−ＥＧＦとは同一の物質であろう
と言われている反面、アミノ酸総数が前記したとおシ一
致しないことは、永らく疑問とされていた。そこで９本
発明者らは、コーエンらの方法に改良を加えて、ラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲ，Ａ）を指標にヒト尿からの
ｈ　−ＥＧＦの抽出を検討した。

この結果、β−ＵＧ、　　γ−ＵＧ及びコーエンらが発
見したｈ−ＥＧＦとは異なる新規なｈ−ＥＧＦを単離す
ることに成功し９本発明に至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ヒト尿から抽出され、下記の理化学的性質に
より特定され、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑
制作用を有する活性ペプチドに関する。

（ａ）紫外線吸収　　第１図に示す（活性ベプチスベク
トル　　ド濃度８０μｇ　／　ｍＩ！、　　リン酸２ナ
トリウム水溶液） （ｂ１分子量　　　　約６．０００ （８ＤＳ−尿素−ポリアク プルアミドゲルディスク電 気泳動法） （ｃ１等電点　　　　４．６０ （ポリアクリルアミドゲル 等電点電気泳動法） ｆｄｌ呈色反応　　　フォリン・ローリー法　十り−マ
シー・プリンヤ ント拳プル法　　　　　＋ ７エノール硫酸法　　　− フクシン法 （ｅｌ溶解性　　　　水に可溶（ただし、　　ｐＨ４，
６０付近では等電点沈殿 をする）。

酸性メタノール、酸性アセ トリトリル、塩基性メタノ ール及び塩基性アセトニト プルに可溶。

（ｆ）性状　　　　　白色粉末、水に溶かすと無色透明
。

（ｇ）構成アミノ　　Ａ／ａ、　Ａｓｎ、　Ａｓｐ、　
Ｃｙｓ。

酸　　　　　　　　Ｇｌｎ、　　Ｇｌｕ、　　Ｇｌｙ＊
　　Ｈｉｓ。

１１ｅ、　Ｌｅｕ、　Ｌｙｓ、　Ｍｅｔ。

Ｐｒｏ、　Ｓｅｒ、　Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ及びＶａｌ 本発明に係る活性ペプチドは次の条件にょシ。

高速液体クロマトグラフィーを行うとき、第２図に示す
ように保持時間２８分の位置に溶出する。

ただし、２ｇＯｎｍの波長の吸光度を指標とする。

カラム　　　８ｍｍφＸ　２５０　ｎｍカラム剤　　平
均粒径５μｍオクタデシル化シリカゲル〔例えば、デペ
ロジル ＯＤ８　（野村化学■商品名）〕 溶出液　　　５０　ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセト
ニトリル水溶液（アセトニ トリル／水が３４０／１０００．。

容量比） 流速　　　　１ｍ／／分 本発明に係る活性ペプチドは９次のようＫして製造する
ことができる。

まず、ヒト尿をｐＨ３〜４にし、ポリアクリル酸型イオ
ン交換樹脂、ポリメタクリル酸型イオン交換樹脂等の弱
酸性イオン交換樹脂と接触させ、っする。ついで、溶出
液を好ましくＶｉ濃縮及び脱塩した後、ゲルろ過及びイ
オン交換を適宜の順序で行う。ここで、ＩＩ縮は１例え
ば、スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体、アクリル
酸エステル系重合体、メタクリル酸エステル系重合体等
の巨大網状ポリマーからなる中性吸着樹脂と上記溶出液
を接触させ９次いで、該樹脂への吸着物をメタノール、
アセトニトリル、ｎ−グロバノール等の水溶性有機溶剤
と水との混合液で溶出する方法又は限外ろ過法によって
行うことができ、比活性を上げるような他の濃縮方法を
採用してもよい。上記脱塩は、架橋デキストランゲル、
架橋ポリアクリルアミドゲル等の親水性ゲルを用いたゲ
ルろ過法にニジ行うことができる。上記したゲルろ過は
。

脱塩に採用することができるゲルろ過法と同様の方法で
行うことができるが、展開液としては、酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の緩衝液であって。

０．０２Ｍ以上かつｐＨ５〜９のものを使用するのが好
ましい。上記したイオン交換は、ジエチルアミノエチル
セルロース、ジエチルアミノエチルアガロース等の弱塩
基性イオン交換樹脂を酢酸緩衝液。

リン酸緩衝液等の緩衝液であって０．０５　Ｍ以下でｐ
Ｈ５〜８．５のもので平衡化した後、前工程で得られた
溶出液を添加又は負荷し、ついで、該樹脂への吸着物を
酢酸アンモニウム水溶液で溶出することＫよシ行うこと
ができる。

このようにして得られた溶出液は、ついで、逆相分配型
液体クロマトグラフィーによって精製される。

逆相分配型液体クロマトグラフィーにおいて用いられる
逆相分配をカラムに充填するカラム剤としては、多孔性
シリカゲルに疎水性官能基を化学結合したものが使用さ
れる。特に、疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルが
９分離能及び回収率の点ゼすぐれている。シリカゲルに
導入される疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、
プロピル基、オクチル基、オクタデシル基等のアルキル
基、シアノプロピル基、フェニル基などが例示され、こ
れらはシリカゲルに対して炭素含量で８〜２０重量％含
まれているのが好ましい。細孔の孔径としては６０Ａ〜
３００Ｘに孔径を有するものが好ましい。又粒径として
は小さいものが望ましいが実用上５〜７０μｍ程度が良
い。

逆相分配型液体クロマトグラフィーは、先ず。

溶出させる。溶出用液としてはアセトニトリル。

メタノール、エタノール、ｎ−プロパノ−ｐ等の水溶性
有機溶媒と、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸。

トリフルオロ酢酸、メチル硫酸等の酸またはこれらの酸
とアンモニア、苛性ソーダ等のアルカリの塩を混合して
得られるｐｉ−ｉｌ、５〜７の範囲の緩衝液が用いられ
る。

この溶出にあたって、上記溶出用液の水溶性有機溶媒濃
度は、溶出に適するように適当な濃度に調整される。例
えば、アセトニトリル水溶液では。

アセトニトリルの濃度が１８〜２８容ｉ％、好ましくは
２０〜２５容量−の濃度でヒ）ＵＧを溶出ｐＨ７）でア
セトニトリル濃度２０〜２５容ｆｉ−チのものを使用す
るとｈ−ＥＧＦは、まず３種類に分離される。これらを
それぞれ溶出順にｈ　−ＥＧＦ−１，ｈ−ＥＧＦ’−２
，ｈ−ＥＧ、Ｆ−３とする。

このうち、さらにｈ−ＥＧＦ−３について逆相り順にｈ
−ＥＧＦ−３−１，ｈ−ＥＧＦ−３−２及びｈ−ＥＧＦ
−３−３の３徨類に分離する。

この’）ち、ｈ−ＥＧＦ−３−２を含む分画を減圧濃縮
又は凍結乾燥すると白色粉末状で本発明に係るペプチド
が得られる。

コレを５ＤＢ−尿素−ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動（モノマー濃度１３．８チ）で分析するとき、
それぞれ単一バンドとして認められ。

その推定分子量はミオグロビン部分加水分解物（分子量
１６９４９，１４４０４，８１５９，６２１４゜２５１
２．１３６０）の混合物を標準とした分子↑マするのが
好ましい。アセトニトリル濃度が１８容量チ未満では、
全く溶出されないか溶出時間が長くなり、２８容量チを
越えると溶出先端付近に溶出されるため精製効果が低下
する傾向がある。また、アセトニトリル濃度に勾配をつ
けて溶出する場合、溶出後のアセトニ）　ＩＪルの初期
濃度は０〜１６容量チ及び最終濃度は２０〜３０容量チ
とするのが好ましい。なお、最終濃度は３０容量チを越
えてもさしつかえない。このようにアセトニトリル濃度
に勾配をつけて溶出を行う場合、アセトニトリル濃度が
２０〜２５容量チの時にペプチドを溶出させる。溶出に
際し、用いる有機溶媒は。

その極性が小さくなるに従い溶出力が増すため。

極性の大きなもの程、有機溶媒濃度を大きくする必要が
ある。例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル
、ｎ−プロパツールの順に極性が小さくなり、この順に
より低濃度でヒ）ＵＧを溶出することができる。以上の
溶出は、常圧下で行っても高圧下で行ってもよい。

逆相分配型クロマトグラフィーにおいて、カラーカーを
用いたとき約６０００に位置する。又。

ｐＨ勾配（ｐＨ４からｐＨ６，５）を有するポリアクリ
ルアミドゲルプレートを用いた等電点電気泳動を行うと
きそれぞれ異なる位置に単一バンドとして認められた。

表面電極を用いて測定した等電点け、４．６０である。

その他、前記した理化学的性質を示す。

上記電気泳動法による結果及び前記した高速クロマトグ
ラフィーが第２図に示すとおりであることから１本発明
に係る活性ペプチドが単一化合物であることがわかる。

本発明に係る活性ペプチドが前記したアミノ酸から構成
されることは、アミノ酸分析装置によって確認した。

また９本発明に係る活性ペプチドは、上皮細胞の成長を
促進する作用を示し、ｈ−ＥＧＦであることがわかり、
胃酸分泌抑制作用を併せて示す。

以上において、ｈ−ＥＧＦ分画の確認は、マウスの願下
線から得たマウスＥＧＦがマウス肝細胞膜上のＥＧＦレ
セプターに対してｈ−ＥＧＦと競争的に結合する性質を
利用して測定される。すなわち、ｈ−ＥＧＦ又はｈ−Ｅ
ＧＦを含む試料。

ＥＧＦレセプター及び放射性ヨウ素で標識したマウスＥ
ＧＦを水溶液中で混合して反応させ、　ＥＧＩ；’レセ
プターとマウスＥＧＦ又はｈ　−ＥＧＦ’との結合物を
生成させ、これを分離して、その放射活性を測定し、検
量線に照らし、ｈ−ＥＧＦ濃度を決定する〔以下、この
方法を、ラジオレセプターアッセイ（ＲＲ，Ａと略す）
という〕。

（実施例） 以下において、ｈ−ＥＧＦ量は、上記Ｒ，ＲＡ法により
求めたものであり、比活性は、２８０ｎｍの吸光度と試
料の液量（ｍｌ）の積あたりのｈ−ＥＧＦＪＩである。

実施例 （１）　　男子床３　ｋｌ！（ｈ　−ＥＧＦ：！１１６
０■、比活性１．６Ｘ１０−３）に４Ｎ塩酸を加えてｐ
Ｈ３，ＯＫ調整した。これを予め４Ｎ塩酸でカルボン酸
型にしたアクリル酸型カチオン交換樹脂（ＷＫ−２０゜
三菱化成工業■商品名）を充てんしたカラム（４０１）
に流速２００１７時間で流した。次いで、カラムを水１
００１！で洗浄し、１００１！の酢酸アンモニウム緩衝
液（塩化ナトリウム５０ｋｇ、酢酸アンモニウム７、７
　ｋｇおよびアンモニア水１５．５１に水を加えて１０
（ｌとしたもの）２次いで４１０４Ｎ苛性ソーダ溶液、
更に９０１！の水で溶出した。溶出後のｐＨは溶出時間
と共に増大する。このうち、溶出後のｐＨが１１以下の
分画を集めた。

この溶出液中のヒトＵＧは６０．４　ｍｇ　（回収率３
８チ、比活性０．０５）であった。

（２）溶出液２０１！　（ｐＨ４，５に調整）Ｋメタク
リレート系中性吸着樹脂（ＨＰ２ＭＧ：三菱化成工業■
商品名）　８００　ｍｌ！を加えて２時間攪拌してｈ−
ＥＧＦを吸着１次いで塩酸−メタノール混合液（６Ｎ塩
酸：）夕／−ル＝１　：ＩＺ５．容量比）８１で溶出し
た。これを中和後、減圧濃縮して５００　ｍｌとし架橋
デキストランゲル（セファデックスＧ−２５，ファルマ
シア・ファインケミカル・ＡＢ商品名）に負荷し、０．
０１Ｍ酢酸アンモニウムで展開して塩を含まない部分を
採取した。次いでｐＨ５，３の０．０１Ｍ酢酸アンモニ
ウム液で平衡化したジエチルアミンエチル（ＤＥＡＥ）
　　セルロース（ＤＥ−３２，ワットマン・ケミカル七
）くレーション社商品名）カラムに吸着させた。０．０
１Ｍ酢酸アンモニウム液で洗浄後、０．３Ｍ酢酸アンモ
ニウム液で溶出した。この溶出液中のｈ　−ＥＧＦ量は
１４．４ｍｇ（回収率３８％、比活性１．２）であった
。

（３）この溶出液を限外ろ過（分画分子量１０００）に
より脱塩し、６０ｍＪまで濃縮した後、架橋デキストラ
ンゲル（セファデックスＧ−５０，ファルマシア・ファ
イン・ケミカル・ＡＢ商品名）でゲルろ過した。展開液
は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で展開し、ＲＦＬＡ活
性分画を採取した。この溶出液中の１ｌ−ＥＧＦ量は１
０１０１ｌ１回収率７０％。

比活性５．６）であった。

（４）　　この溶出液をオクタデシルシリル化シリカゲ
ル（デベロジルＯＤＳ、野村化学■商品名）を充填した
カラム（３６，７ｍｍφ×５００閣、このカラムはＨＰ
ＬＣ装竹日立６３５Ａ型（■日立製作所酸アンモニウム
０．０５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（水ニアセトニ
トリル＝５：１．容量比）。

第２液には、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むアセト
ニトリル水溶液（水ニアセトニトリル＝５：１．６．容
量比）を用いた。第２液は第１液６００ｍ１に２５ｍＪ
／分で流入すると共に、第１液と第２液の混合液はカラ
ムに２５ｍＪ／分で流入するようにした。この結果、得
られたクロマトグラムを第３図に示す。

ＲＲＡ法で各溶出分画を測定すると三つの活性分画が現
われ、各分画のｈ−ＥＧＦには、それぞれ胃酸分泌抑制
作用が認められた。該活性分画はそれぞれ、保持時間が
４８〜５２分、５４〜６２分及び６２〜６８分に溶出し
、これらのａｈ　−ＥＧＦ量は８．５ｍｇ、それぞれの
分画のｈ　−ＥＧＦ量は、溶出順に２．０ｍｇ、　　１
．５■及び５．０＃であ汎各ｈ−ＥＧＦの比活性は溶出
順に１３０，２４０及び２９０であった。各分画を減圧
濃縮し、凍結乾燥して乾燥品を得、上記溶出順にｈ−Ｅ
ＧＦ−１、ｈ−ＥＯ，Ｆ−２及びｈ−ＥＧＦ−３とした
。

５ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（モノ
マー濃度１３．８％、標準物質：ミオグロビン部分加水
分解物で分子量が１６９４９，１４４０４゜８１５９．
６２１４，２５１２及び１３６０の混合物）によるとｈ
−ＥＧＦ−ｘについては２分子量約６０００と約７００
０のニバンド、ｈ−ＥＧＦ−２については２分子量約６
０００と約７０００のニバンド及びｈ−ＥＧＦ量−３に
ついては２分子量約６０００の一バンドが検出された。

第３図に、上記の溶出における各分画毎のＲＲＡ活性値
を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は４６〜４８分、４
８〜５０分、５０〜５２分、５４〜５６分、５６〜５８
分、５８〜６０分、６２〜６４分、６４〜６６分及び６
６〜６８分の分画に現われ、他の分画には現われなかっ
た。

（５）上記（４）で得られたｈ−ＥＧＦ−３を含む分画
をｈ−ＥＧＦ量で５００μ９を、デベロジルＯＤＳを充
填したカラム（８ｍφＸ２５０ａｎ、日立６３５型に装
着）に負荷し、酢酸アンモニウム０．０５　Ｍを含むア
セトニトリル水溶液（アセトニトリル：ｍｌ／分で溶出
した。得られたクロマトグラム（横軸に保持時間、縦軸
に２８０ｎｍの波長における吸光度）及びＲ几Ａ活性値
を示す斜線棒グラフを第４図に示す。この結果、ＲＲＡ
活性は、保持時間２２〜２６分、２７〜３０分及び４９
〜５５分の分画に現われた。これらの分画については。

ＲＲＡ活性分画と２８０　ｎｍの波長における吸光度ピ
ークとが対応した。これらの分画のうち、第１の分画に
含まれるｈ−ＥＧＦが前記したβ−ＵＧに及び第３の分
画く含まれるｈ−ＥＧＦが前記したγ−ＵＧＫ等しいこ
とを確認した。

第２の分画を減圧濃縮し、凍結乾燥して本発明に係る活
性ペプチド（ｈ−ＥＧＦ）を得た。

（６）繊維芽細胞の増殖試験 ウシ胎児血清１０俤を含むダルベツコＭＥＭ培地１３．
９　ｍｌを加えた３５ｏｍφＸ１０ｍｍシャーレに前記
（５）で得た活性ペプチド及びヒト皮膚繊維芽細胞を含
む細胞液１．１　ｍｆ　（１，８Ｘ　１０’セル）を入
れ。

よく混合する。これを３７℃炭酸ガス５％、空気９５％
のインキュベータで単層培養する。培地交換は培養３日
目と６日目に行い、　　０．　３．　５．　７及び１０
０日目血球計算盤を用いて細胞数を測定した。活性ペプ
チドは１０　ｎ　ｇ／ｍｌになるように使用した。また
、活性ペプチドを使用しない場合についても同様に試験
した。この結果全第５図に示す。第５図中グラフ１は活
性ペプチドを使用した場合及びグラフ２は活性ペプチド
を使用しない場合を示す。

（力　胃酸分泌抑制試験 体重１３ｋｇのピーグル大（雄性）の幽門部から約５ｃ
ｍ離れた胃体部に胃瘍管を取りつけてインタクトフイス
チューラ犬とし、これに、ヒスタミン４〜６μｇ／ｋｇ
体重を１５分間隔で皮下注射し。

１５分間隔で胃液を胃屡管から採取した。胃液量がほぼ
一定になった時点で、前記（５）で得た活性ペプチドを
生理食塩水に溶解してｈ−ＥＧＦｉで０．２５μ９／′
に９体重だけ静脈内注射した。胃液量はいずれの場合も
１５〜３０分後から減少し、３０〜６０分後に胃液量が
最も少なくなった。

ヒスタミンの投与と胃酸分泌量の関係を示す棒グラフを
第６図に示す。

（発明の効果） 本発明の活性ペプチドは、上皮細胞の成長促進作用及び
胃酸分泌抑制作用を示す新規化学物質である。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明に係る活性ペプチドの紫外線吸収スペク
トル、第２図は本発明に係る活性ペプチドの高速液体ク
ロマトグラム、第３図は実施例の（４）項における逆相
分配型液体クロマトグラム、第４図は実施例の（５）項
における逆相分配型液体クロマトグラム、第５図は実施
例の（６）項における繊維芽細胞の増殖試験結果を示す
グラフ及び第６図は実施例の（力項における胃酸分泌抑
制試験を示す棒グラフである。 符号の説明 ｌ・・・活性ペプチドを使用したときの結果を示すグラ
フ ２・・・活性ペプチドを使用しないときの結果を示すグ
ラフ 代理人　弁理士　若　林　邦　彦 ｒ、、、　　　。 ／６０　　　２００　　　２４０　　　２３０　　　３
２Ｑ竿１図 ラ容土時Ｆ、’５　　（分、） 茅　２目 Ｂ＆ 竿５０ ８−・　；上柱ダ７黛ド 性、５−的！。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記（ａ）〜（ｇ）の理化学的性質により特定され
   、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑制作用を有す
   る活性ペプチド。 （ａ）紫外線吸収スペクトル　第１図に示す（活性ペプ
   チド濃度８０μｇ／ｍｌ、リン酸２ナトリウム水溶液） （ｂ）分子量　約６，０００（ＳＤＳ−尿素−ポリアク
   リルアミドゲルディスク電気泳動法） （ｃ）等電点　４．６０（ポリアクリルアミドゲル等電
   点電気泳動法） （ｄ）呈色反応　フォリン・ローリー法　＋ クーマシー・プリシヤント・プル法　＋ フェノール硫酸法　− フクシン法 （ｅ）溶解性　水に可溶（ただし、ｐＨ４．６０付近で
   は等電点沈殿をする）。 酸性メタノール、酸性アセトリトリル、塩基性メタノー
   ル及び塩基性アセトニトリルに可溶。 （ｆ）性状　白色粉末、水に溶かすと無色透明。 （ｇ）構成アミノ酸　Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＣｙＳ
   、Ｃｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、
   Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及び
   Ｖａｌ