JPS6248698A - 新規ペプチド物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胸腺から得られる物質およびこれらの合成法に
関するものである。

従来技術 動物体特に子牛の胸腺の器官または細胞から得られた抽
出物およびこれらの免疫的特性については最近２０年間
にわたって興味が増大しつ−あった０ 最近、Ａ１１ａｎ　Ｊ、　ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＪ
ｅｆｆｒｅｙ　Ｌ。

Ｒｏｓｓｉｏ氏の論文（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　
Ｔｈｅｒａｐｙ　４．４９−５７（１９７８）］にはテ
モシンに関連する物質の他に３つの他の胸腺因子につい
てよく調査されている。

これらにはチモボイエチン（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ
ｓ　）、血清胸腺因子（ＳＴＦ）および胸腺体液因子（
ＴＨＦ）がある。

チモボイエチン〔以前にはチミン（Ｔｈｙｍｉｎ　）と
呼称された〕およびこれらの製法、用途は０ｉｄｅｏｎ
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎによって例えばＮａｔｕｒｅ　２４
７　Ｆ、　１１−１４　（１９７４”）および米国特許
第４　、０５５　、６３３号；第４　、０７７　、９４
９号；第４，１２０，９５１号および第４，１２４，７
００号明細書に記滅しである。チモボイエテンはホモゲ
ナイズした子牛の胸腺から一連の透析、分子排除クロマ
トグラフィーおよび分別クロマトグラフィーによって得
られる。２つの活性な生成物はチモボイエチンｌおよび
■として得られた。これらの両者は４９個のアミノ酸残
基を有するポリペプチドである。しかしながら、これら
は１位置と４３位置の残基の性質において異なる。米国
特許第４．００２，７４０号明細書にはトリデカペプチ
ドの合成が記載してあり、マタチモボイエチンＨの多く
の性質が記載しである。米国特許第４，３６９．１３７
号明細書にはテモボイエチンペンタベプテドの製法に役
立つ特定の中間体が記載しである。米国特許第４．１９
０，６４６号、第４，２６１，８８６号および第４，３
９７．８４２号明細書にはチモボイエチン活性を有する
ペプチドが記載しである。

血清胸腺因子（５ＴＦ）およびその製法および性質はＪ
、　Ｆ、　ＢａｃｈらによってＮａｔｕｒｅ　２６６第
５５−５７頁（１９７７）および米国特許第４，０９８
．７７’７号、第４，１３３．８０４号および第４，１
４８．８１号明細書に記載しである。これは豚の血液か
ら一連の脱繊維素、透析、適当なフィルターによる濃化
、分子篩による分別、イオン交換樹脂によるクロマトグ
ラフィー、さらにははく層クロマトグラフィーによる分
別および電気泳動によって得られる。生成物は９個のア
ミノ酸残基含有するポリペプチドである。ＳＴＦに類似
の構造含有するペプチドは米国特許第４，３０１，０６
５号明細日に記載しである。

チモシンニツイテは、前記ノＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖ
ｅＴｈｅｒａｐｙの他に米国特許第４，０１０，１４８
号；第４，０７９゜１２７号；第４，０８２，７３７号
；第４，１１６，９５１号；第４゜１２８．６３７号お
よび第４，１４８，７８８号明細書に記載しである。米
国特許第４．０１０，１４８号明細書にはホモゲナイズ
された哨乳動物の胸腺からチモシン区分を作ることが記
載しである。この方法は多段精製技術であシ、各段階は
１フラクシヨン′と呼ばれている。この場合、ホモゲナ
イズした胸腺を単に遠心分離して得られた生成物はゝ７
ラクシヨン１′である。ホモゲナイズ、遠心分離、次の
熱、アセトンおよび硫酸アンモニウム処理、最終に硫酸
アンモニウム処理で得られた沈＃を超遠心分離し、生成
物ｆ：４℃で集め、セファデックスＧ−２５（５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　）　（精密）　力５　ム上ｆ脱塩ｔ、テ’　
ｙラクション５“とする。更に電気泳動で頂点に達する
までの処理、および第１蛋白質ピークの収集を１フラク
シヨン８′とする。′フラクション８Ｎは１０８個のア
ミノ酸残基金倉むポリペプチドである。米国特許第４，
１２８，６３７号明細書から上記技術によって分子ｉ　
１，２００−１４　、０００の各種ポリペプチドが得ら
れ、チモシン（ｔｈｙｍｏｓｉｎｓ　）　ト名ツけられ
たことがわかった。米国特許第４．０８２．７３７号明
細書にはテモシンフラクション５よりなるポリペプチド
混合物を含む固体の安定でしかも体内毒性のない組成物
の製造について記載しである。

上記の輸文Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ
ｉｖｅ　Ｔｈｅｒａｐｙにはチモシン７ラクション５か
ら得られたテモシンα、と呼ばれる特殊のポリペプチド
の性質が記載しである。２８個のアミノ酸残基含有しし
かも分子量３．１０８で等電点４．２のポリペプチドが
記載しである。これはまた米国特許第４，０７９，１２
７号明細書にも記載しである。チモシンα、の放射線免
疫分析は米国特許第４，２６４，５７１号および第４，
３３９゜４２７号明細書に記載しである。チモシンα、
フラグメントは米国特許第４，４４２，０３１号および
第４．４７０゜９２６号に記載しである。ビスーテモシ
ンα、は米国特許第４　、３９６　、６０５号明細書に
記載しである。２つの関連したポリペプチドであるチモ
シンβ３およびテモシンβ４はチモシンファクター５か
ら得た。第１物質は５０個のアミノ酸残基を有し、−方
第２物質は４３個のアミノ酸残基含有する。これは米国
特許第４　、２９７　、２７６号明ＷＩＦＫ記載しであ
る。チモシンβ３およびβ４の７ラグメントはｉｌｌ特
許第４　、３９５　、４０４号明細書に記載しである。

チモシンβ８８よびβ、は米国特許第４　、３８８　、
２３４号および第４，３８９，３４３号明細書に記載し
である。

更忙、胸腺から得られた生成物は同時に介在する免疫形
成ポリペプチド（ＵＢ　ＩＦ　）であ勺、米国特許第４
，００２，６０２号および第４，１６７．５５７号明細
１に記載してあり、またＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ
　ｔｈｅ　Ｎａ　−ｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ
ｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　７２第１１−１５頁（１９７５
）にも記載しである。その分子量は約８．５００で、７
４個のアミノ酸残基を含んでいる。

関連するペプチドは米国特許第４，２１５，１１１号お
よび第４，１９０，６４７号明細書に記載しである。

他の胸腺エキストラクトは米国特許第３，４３８，８５
９号；第３．４６６．３６７号；第３，６５７，４１７
号；第４．２３９　。

４９８号；第４，３７７．５１１号および第４，３９４
，３７４号明細書に記載されており、エキストラフ）？
生産するが、特定のポリペプチドの生産については記載
しである。米国特許第４，３７４，８２８号明細書には
特定のアミノ酸含量含有するが、いかなる特定のアミノ
酸配列をもたない胸腺エキストラクトが記載しである。

胸腺ホルモン様性質を有するヒト血清プレアルブミンは
米国特許第４　、０４６　、８７７号明細書に記載しで
ある。バクテリアＲＮＡからの免疫刺戟性物質の製法に
ついては米国特許第４，３８９，３９６号明細書に記載
しである。Ａ腺機能域において役立つものとして記載さ
れているペプチドは米国特許第４．２５０．０８６号；
第４，３２０，１１８号；第４，３６１，６７３号；第
４　、３８９　、３４２号および第４　、４２８　、９
３８−号明細書に記載しである。

これらの生成物のすべては免疫欠損の問題に一ついでの
会合においである用途が報告されている。

しかしながら、テモボイエテン、ＵＢＩＰおよび血清胸
腺因子は無烏の動物においては意味のある胸腺依存性免
疫・受容能力を誘起するのく効果がないことがＰｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ
ｒ　Ｂｃｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａ
ｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｌ　５９　、第１９５−２０
０頁（１９７８）に報告されている。

いかなる従来技術にも本発明の特定のペプチド組成物が
胸腺体液活性を有することが記載されていないしまｔ何
等の提案もされていない。

胸腺体液因子（ＴＨＦ）は例えばＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１３２
第８８５−８９７頁（１９７０）　；　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
１３８第１５２１−１５３２頁（１９７２）　、Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒＩｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ　１　ｇ第１５１−
１５７頁（１９７５）、米国特許第４　、２５０　、０
８４号明細書に記載しである。

これらのすべてはヒトのリン床試験結果で成功をおさめ
ている。リン床試験結果は１９７９年２月２６日におい
てニューヨークアカデミーオプサイエンスの会合で報告
された。従来の胸腺体液因子はＴＨＦＩと名づけられた
。

上記の文献および米国特許第４　、２５０　、０８４号
明細書に記載の従来法に従えば、リン床的に役立つＴＨ
ＦＩでは、精製方法で作った各活性区分を７つの異なっ
た生物検定について試験した。すべての７つの試料に対
して正反応を発揮する区分についてのみさらに精製と使
用とを行なった。ＴＨＦ　１区分の活性はｃＡＭＰ　、
　ＰＨＡ　、　ＣｏｎＡおよびＭＬＣの生物検定におけ
る活性に対して測定し、リン床的に投与できる微生物学
的活性区分を得た。

現在まで、米国特許第４　、２５０　、０８４号明細書
に記載されたＴＨＦ　ｘ試料は例えば簡単なポリペプチ
ドであったと考えられていた。その理由は、ＰＨ３，５
ではく層クロマトグラフィーおよびペーパー電気泳動で
単一のニンヒドリン−ポジティブスポットとして泳動し
たからである。更に、等電点５．６−５．９のポリアク
リルアミドゲル上を等電的に集合して単一バンドとして
泳動した。試料中に含まれたアミノ酸は芳香族でなかっ
た。ＴＨＦ　ｌ試料は典型的な芳香族を示す２８０　ｒ
ｉｍにおける紫外線を吸収することがわかった。この特
性は所望のＴＨＦ　１区分の分離に役立つことがわかっ
た。また、例えば上記の米国特許明細書に記載されｆｃ
ＴＨＦＩ試料は実質的に分子量約３２００の純粋なポリ
ペプチドであった。この従来公知のＴＨＦ　ｌ試料はさ
らに数区分に分離でき、簡単なゲル濾過手段によって分
子量は約３２００以下に変化するかまたは分子量約３２
００以下の新しい区分でしかも以前ＫＴＨＦＩとして報
告された同じ完全な生物検定プロヒルｆｔ保持した区分
に分離できることは考えられなかった。

以前に公知であった胸腺体液因子（ＴＨＦＩ）が事実単
一化合物ではなく、特定のゲル濾過をうけ次場合、生成
物の分離が起り、また所望の生物学的活性が現われ、特
定の因子であると確認されたことがわかつ友ことは驚く
べきことであった。

更に、所望の生物学的活性区分は２８０　ｎｍにおいて
実質的に紫外線吸収を示さない区分であることがわかっ
た。ゲル区分から溶出した区分は２８０ｎｍにおいて著
しい紫外線吸収を示した生成物に含まれた活性区分の前
後の区分であった。

先の米国出願第１５３，６４４号明ｍ書には、胸腺体液
型生物学的活性物質（ＴＨＦＩＩと名づけた）の分離に
ついて記載しである。該物質は見かけの分子量約１８０
０以下でしかも２８０　ｎｍにおいて実質的に紫外線吸
収が存在せずしかもｃＡＭＰ　、　ＰＨＡ　。

ＣｏｎＡおよびＭＬＣのすべての生物検定において活性
を有する特性がある。また従来の出願にはＴ　ｌ１Ｆｉ
ｌを得る方法が記載してあり、該方法はＴ　ＨＦＩをゲ
ル濾過し、約１　、８００ダルトンの排出限界を有する
ゲル濾過媒体を用い、しかも２８０１ｍで実質的に紫外
線吸収を欠きしかもｃＡＭＰ、　ＭＬＣｌＰＨＡおよび
ＣｏｎＡのすべての生物検定において活性を示す区分を
集めることである。ＴＨＦＩＩを得る念めの所望の区分
に対して有効であることがわかった特定のゲル禮過媒体
はポリアクリルアミドゲルビーズ型でしかも１　、８０
０ダルトンの排出限界を有するＢｉｏｇｅｌ　Ｐ　−２
樹脂である。この樹脂はリッチモンド力ルフオルニア９
４８０４のバイオ−ラードラボラトリ−から得られる。

得られた区分を分析する九めに使用したｃＡＭＰ生物検
定については例えば、ＫｏｏｋおよびＴｒａｉｎｉｎ；
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１３９第１９３頁（１９７
４）、ＫｏｏｋおよびＴｒａｉｎｉｎ　；　Ｊ、　Ｉｒ
ｒｍｕｎｏｌ、　ｌ　ｌ　４第１５７頁（１９７５）お
よびＫｏｏｋ、　ＵｍｉｅｌおよびＡｌｂａｌａ　；Ａ
ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　２４９第
３４９頁（１９７５）に記載しである。

得られた区分全分析する罠めに使用したＭＬＣ生物検定
については例えばＵｍｉ　ｅ　１およびＴｒａｉｎｉｎ
　：Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　５　ＷＩ９５頁
（１９７５）およびＫｏｏｋ、　ＵｍｉｅｌおよびＡｌ
ｂａｌａ　；　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　２４９第３４９頁（１９７５）に記載しであ
る。

得られた区分全分析するために使用し′ｆｃＰＩ（Ａお
よびＣｏｎＡ生物検定については、例えばＲｏｔｔｅｒ
およヒＴｒａｉｎｉｎ　；　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、ｌ　５第４１３頁（１９７５）に記載されている。

先の米国出願第２２７　、２９９号明細誓には胸腺体液
型の生物活性物質（Ｔ）（Ｆ’ｌ）の分離について記載
しである。該物質は見かけの分子量約１５００以下でし
かもｃＡＭＰ　、　ＰＨＡ　、、ＣｏｎＡおよびＭＬＣ
のすべての生物検定について生物学的活性を示す特徴が
ある。この先の出願にはＴＨＦ　ｌを得る方法が記載さ
れ、該方法では逆相高速液体クロマトグラフィーカラム
に吸着され、吸着された物質はカラムから溶出され、ｃ
ＡＭＰ　、　ＰＨＡ　５ＣｏｎＡおよびＭＬＣのすべて
の生物検定に活性を示す区分を集めた。

先の米国出願第３００，３３０号および第３９４　、５
７１号明則書にはＡ腺体液型生物的活性物質（ＴＨＦ−
７）の分ｚｌについて記載しである。該物質の特徴は見
かけの分子量１５００以下でしり）もｃＡＭＰ、　ＰＨ
Ａ。

ＣｏｎＡおよびＭＬＣのすべてについての生物検定にお
いて活性である特徴があるっまた、先の出、′＠には、
ＴＨＦ−７′ｆ：得る方法について記載してあり、該方
法ではＴ、１（Ｆｉｌｅピリジンホーメイトで前取て平
衡てした逆相３速液体クロマトグラフィーカラムに吸着
させ、吸着され友物質全カラムからピリジンホーメイト
とノルマルプロパツールトノ混合液から溶出し、ｃＡＭ
Ｐ　、　ＰＨＡ　、　ＣｏｎＡおよびＭＬＣのすべての
生物検定で活性？示す区分を集めた。

先の米国出願第４７５，１７５号および第５３５　、５
３９号明細書にはＴ　ＨＦ　−７を更に逆相高速液体ク
ロマトグラフィーによって精製してＴＨＦ−８７区分と
して名づけられる生物的活性物質を作る。先の米国出願
第５５９　、３９３号明廁書には更に’ｆ’ＨＦ−８７
区分を７−２．７−４およびｆ　−５の数種の生物活性
物質に分離することが記載しである。π正ｒ−２、Ｔ　
ＨＦ　７−４、およびＴ　ＨＦ　７−５のアミノ酸配列
は先の出願に記載しである。更に、分析の結果、先に報
告されたＴＨＩ；’ｉ−２およびＴＨｋ’　１−４に対
するアミノ酸配列は誤りであった。

間愈点を解決するための手段 本発明は、Ｂゐ腺体液活性を有ししかも次のアミノ酸配
列 Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　＋ Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ　；および Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ から選ばれ几物質ｆｊｃ提供するにある。

これらの物質は天然の胸腺Ｕ管から分離でき、また合成
によシ製逍できる。

本発明の新規物質の製造に使用するＴｆ（Ｆ　ｌの原料
物質は上記の米国特許第４，２５０，０８４号明訓信に
概要が記載された方法で′！＃造する。その文献は本願
明細畜にも引用されている。

ＴＨＦ　Ｉを製造する九めＫは、凍結した胸腺、便宜上
子牛の胸腺を適当な液状媒体例えば緩衝液または塩水で
ホモゲナイズする。細胞ディプ１１スを除き、さらに好
咬しくない成分を超遠心分離機（例えば’）０．０００
−１５０，０００りで２−５時間）により除去した。次
に適当な濾過膜例えば細孔径０．８２−０１１ｍを通し
て濾過し、体内毒素を作る微生物を含まない液状物を作
る。次に得られ九減菌した液状物は透析し、得られ穴生
成物は凍結乾燥し、適当な液状媒体中で再溶解し九。透
析は実歴的には多量の水、塩水またはリン酸塩緩衝塩水
（ＰＢＳ　）Ｋ対して２４−６０時時間待ｔＣて実施す
る。分子量１０，０００以下の物質を通す適当な透析膜
が使用できる。適当な膜はセロファン透析バッグである
。

凍結乾燥した透析物は例えば蒸留水、重炭酸アンモニウ
ム、ＰＢＳまたはトリス−緩衝液に再溶解され、１　１
５ｑ、／ｌｅの適当なポリペプチドの溶媒濃度に稀釈し
、次に得られ念溶液をゲルｓｉする。

本発明のＴＨＦＩＨＦ−質を作るに当り、ゲル濾過に使
用する溶媒および所要工程数はある得度透析工程で使用
する予備処理、特に使用する溶媒の特性に左右される。

透析により比較的低分子量の物質のみを通す場合には、
ゲル濾過工程を最小限度にすることができる。しかしな
がら、いかなる場合でも、低分子量の物質を除くことが
必要である。数１００ダルトンの排出限界を有するカラ
ム例えばセファデックス（ｊ−１０（７アーマシア）（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラムのボイドボリウムを溶
出および保持することによってなしつる。セファデック
スＧ−１０は７００ダルトンの排出限界を有する。

更に、ＴＨＦＩＨＦ−質を作る九めの区分は排出限界的
ｓ、ｏｏｏダルトンを有するゲル濾過物質例えばセファ
デックスＧ−２５（ファーマシ力）ヲ用いてゲル濾過を
行なった。代表的には、カラムはＰ　）１８．０で１０
−’Ｍ重炭酸アンモニウムで溶出する。活性区分は上記
の４個の生物検定によって測定した。のぞむならば、更
なる区分は例えば０．１Ｍトリス−ＨＣｌまたはＯ，ｌ
　Ｍ　Ｎ）ｉ４ＨｅＯ，を用いてＰ）Ｉ８、　Ｏ−？？
ＤＪ４Ａｆｆ−セフ　７デツクスＡ−２５（７アーマシ
カ）を用いしかもＮａｃＪの直線的製置勾配を用いて展
開する。塩は低分子量の排出限界を有する物質例えばセ
ファデックス（ｊ−１０ｅ用いて濾過し次にボイドボリ
ウムを回収することによって除く。

このようにして得られた’Ｌ’ＨＦ　Ｉ原料物質は先の
米国出願第１５３，６４４号明細嘗の記載に従って約１
８００ダルトンの排出限界を有するゲル濾過物質の床を
通した。次に吸着物質は水で溶出し、溶出した物質は区
分に集めた。２８０　ｒｕｍにおける紫外線吸収が各区
分について監視され、各区分けｃＡＭＰ　、　Ｐ）ｉＡ
　、　ＣｏｎＡおよびＭＬＣノ生物検出について分析し
友。得られた最初の区分は実質的に２８０　ｎｍで紫外
線吸収を示したが、上記の４つの生物検出のすべてに生
物活性を示さなかった。

得られた区分の次のグループは実質的に２８０ｎｍにお
いて紫外１ｓｒＩｋ収を示さなかった。区分の後続する
グループは２９９　ｎｍにおいて実質的に紫外線吸収を
示したが、上記の４つの生物検定のすべてについて生物
活性を示さなかった。上記の４つの生物検定のすべてに
ついて生物活性を有する所望のＴＨＦ　Ｉｔ物質はゲル
濾過媒体のボイドボリウム（ｖＯ）に対する溶出液の容
量（Ｖｅ）の比が約１．１−１．４である区分に見出さ
れた。ゲル濾過媒体のボイドボリウムは公知の方法で測
定する。ボイドボリウムの測定法の一つではブルーデキ
ストラン２０００が使用される。これはブルー染料を含
む分子！　２，０００，０００　’ｅ有する高分子量デ
キストランであり、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、から得られる。ブルーデキ
ストラン２０００の０．１％（重量／容積比）の水溶液
がゲル濾過媒体の全容量を基準にして１％（容量）の量
をゲル濾過媒体のカラムに加えた。次に水をカラムに加
え、０゜９　ｓ　ｒｔｔ１５３−の速度で溶出した。５
．７５ミリリツターの溶出区分が集められた。６００　
ｎｍにおける吸収が各区分に対して監視された。全溶出
物を集め、６００ｎｍにおいて最大吸収を有する区分を
含み、ゲル濾過媒体のボイドボリウムを示した。

上記のようにして得られたＴＨＦ　ＩＩの生物活性区分
は合せて逆相高速液体クロマトグラフィー媒体に通した
。吸着壊れた内容物は適当な溶液で溶出し、上記の４つ
の生物検定のすべてにおいて生物活性を有する区分が吸
着された。この吸着された物質はＴＨＦ　ｍと名づけｆ
ｃ、つ ＴＨＦｖｔｔ作るのに役立つ適当なりロマトグラフイー
媒体はオクチル（Ｃ，）　ｔたはオクタデシル（Ｃ＋ｓ
　）を結合した相を有する市販の表面変件無機担体であ
る。逆相高速液体クロマトグラフィーに使用する疎水性
の他の結合相例えばビフェニルまたけヘキシル（Ｃ６）
ないしオクタデシル（Ｃ，ｃ）が使用できる。２つの有
用な物質はりクローソルプ几Ｐ　−３８（Ｌｉｃｈｒｏ
ｓｏｒｂ　ＲａＰ−１８）およびニュクレオシｐｙ　Ｃ
，、（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ，、）　ｏ商品名で市販
−されている。ニュクレオシルＣ＋ａ物質は粒径５およ
び１０ミクロンの物質で西独デュレン（Ｄｕｒｅｎ　）
所在のＭａｃｈｅｒｅｙ　−Ｎａｇｅｌｃｏから発売さ
れている。他の有用な物質は、カル７オルニア、バーク
レー所在のＡｌｔｅｘ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ
、から入手したＩ（ＰＬＣカラムである。

ＴＨＦ　Ｉ［物質はいかなる使用上の６度で上記のクロ
マトグラフィー媒体にデ１用できるが、約３ｒｒｔ９の
蛋白質を含む’Ｉ”）ＩＦ　ｌ［溶液を冷凍乾燥し、次
に冷凍乾燥し次物質を１ミリリツターの蒸留水に溶解し
７て作った溶液を使用するのが適当である。

上記のクロマトグラフィー媒体から吸着されたＴＨＦ　
ｌ［物質全溶出するのに投立つ水性液は例えばＰ　Ｈ３
，５−７，５のナトリウム、カリウム、アンモニウム贋
たはピリジニウムカチオンおよびアセテート、ホスフェ
ート″！！たけホルマートアニオンを有する塩を含む。

坂ｎ度は約５　Ｑ　ｍＭないし３００ｍＭである。次に
これらの水溶液は適当な有ｔ＠溶離剤例えばノルマルプ
ロパツール、イソプロパツール、エタノールまたはアセ
トニトリルを０−２０％ないし０−６０％の有機溶媒の
直線的または非直線的濃度勾配で混合した。ＴＨＦ！＋
１を傅るｆ’（＆）には、５０ｍＭのナトリウムマタは
アンモニウムアセテート中、ＰＨ６，５で０−５０％の
濃度勾配ヲ有スるノルマルプロパツールを用いるのが適
当である。

上記のようにし、て作られたＴＨＦＦｌの生物学的活性
区分は合併され、逆相高速液体クロマトグラフィー媒体
を通した。ＴＨＦ　ＩＩの製造に適する同一のクロマト
グラフィー媒体はＴＨＦ−７の分離および回収に役立つ
。クロマトグラフィー媒体は好ましくはピリジンホルマ
ートで例えば０．３　ｍＭの濃度およびＰ　Ｈ４，０で
予じめ平衡化する。カラムに吸着された物質はピリジン
ホルマートとノルマルプロパツールの混合物で溶出する
のが好ましい。７．５−２５％（容りのノルマルプロパ
ツールの濃度勾配を用いるのが最も適当である。上記４
つの生物検出のすべてにおいて生物活性を有する溶出物
質はＴＨＦ−７と名づけた。

次に上記のようにして作ったＴＨＦ−７の生物活性区分
は合され、逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを通
した。Ｔ　ＨＦ　−７の製造に適する同一のクロマトグ
ラフィー媒体はＴ）ＩＦ−８の分離および採取に役立つ
。適当な物質はニュクレオシルＣ１，（５ミクロン）で
ある。クロマトグラフィー媒体はＰＨｚＯで０．１％（
容量）のトリフルオロアセテートで予しめ平衡化するこ
とが適当である。カラムに吸着した物質はトリフルオロ
酢酸とノルマルプロパツールとの混合物で溶出すること
が適当である。８−３５％（容１１′）の濃度勾配を有
するノルマルプロパツールが最も適当である。

カラム上の吸着物質はトリフルオロアセテートおよびノ
ルマルプロパツールの混合物で溶出するのが適当である
。ＰＨＡ　、　ＣｏｎＡおよびＭＬＣの生物検定におい
て生物活性を有する溶出物質は’ｒ　ＨＦ−８と名づけ
た。

Ｔ）ＩＰ−８は数種のベプチツド物質よりなる。

これらのベブテツド物質はインクラティック分離によっ
て個々の成分に分離できる。これは上記のようにして製
造したＴＨＦ−８ｔ−ＴＨＦ−８の採取に使用し几同一
種類の逆相高速液体クロマトグラフィー媒体に通して実
施した。この場合、０．１Ｍナトリウムバークロレート
、０．１％オルトリン酸および２２％アセトニトリルの
混合液で予しめ平衡化する。カラムに吸着された物質は
予しめ平衡化した混合物と同一組成の溶媒で溶出するの
が適当である。この溶離パターンは２１０　ｎｍでの紫
外線吸収によって監視する。更に考察するため吸着され
るべき区分は２１０　ｎｍの吸収データでピークを示し
た区分である。まｍ１吸着物質はペプチドの存在のため
に試験されなけれＧｆｎらない。

またペプチド含有物質のみが更に処理場れるべきである
。次にペプチドである上記の採取した区分の各々は適当
な揮発性緩衝液で予しめ平衡イヒするのに使用したと同
じ種類の逆相高速液体クロマトグラフィー媒体におのお
のを通して個別に脱塩する。適当な緩衝液系はＰ　Ｈ７
，８で２ｍＭアンモニウムホルマートかまたは５％アセ
トニド、１】ル中で０．１％トリフルオロ酢酸の濃度で
ある。次に脱塩したペプチドは適当な揮発性緩衝剤およ
び溶ｉＬを用いｔカラムから脱塩する。脱塩は５−５０
％アセトニトリルの直線的濃度勾配を用いたアンモニウ
ムホルマートまたはトリフルオロアセテートで行なうの
が好ましい。次に溶離液、＜ターンは２１０ｎｍにおけ
る監視を行なつ九。更に考慮するため保持される区分は
吸収域において２１０　ｎｍにおけるピークで示される
区分である。得られた脱塩ペプチド区分はＰＨＡ　、　
ＣｏｎＡおよびＭＬＣ検定において生物活性を試験した
。上記の３桶の生物検定のすべてにおいて活性を有する
’ｒ　ｔ−ｉ　ｐ　−ｓ区分はそれぞれＴＨＥ’７−２
、Ｔ　ＨＦ　ｆ　−４および’Ｉ’ＨＦ７−５と名づけ
だ。

実施例 胸腺から本発明の新規ペプチドを製造する方法は次の実
施例に詳細に記載しである。

実施例１ 米国特許第４　、２５０　、０８４号の実施例に従って
調製したＴ　ＨＥ’　Ｉの生物学的活性区分は、ＴＨＦ
ＩＨＦ間始以前に最初のＹｉ４腺が凍結したことを除き
、組み合わせられ、１ｍ９のタンパク質を含有する液体
混合物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥した。凍
結乾燥物質を５１ｎｔの蒸留水に溶解し、カリフォルニ
ア、リッチモンドのＢｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓから得たＢｉｏＧｅｌＰ−２のカラムに充てん
した。

カラムは直径Ｚ　９　ｔｍで１３０ｃｒｎの深さであっ
た。

ブルーデキストラン２０００　′ｆ、用いてカラムの空
隙４−　（ＶＯ）′＆９７１１−／−７’、？、Ａ　ｋ
　Ａ　Ｉ−４！’、　ｋｆｒ　ｈ　ｈ　＋　−カラム内
容物を２倍希釈、発熱原物質の存在しない水で、０．９
５綾分の流出速度で溶出し、５．７５−の区分ｔ−４℃
で集めた。２３０及び２８０　ｎｍの紫外１ｓ吸収を各
区分で検出した。各区分をまたｃＡＭＰ　、　ＰＨＡ　
、　ＣｏｎＡ及びＭＬＣ生物検定における生物学的活性
を試験した。２つの明白なはっきり別れ迄吸収のピーク
を得た。溶出量（Ｍｅ）が２５０−から３３０−に及び
、溶出された区分に最初のピークを得た。（Ｖｅ／Ｖｏ
割合は０．９３から１．２２）。

溶出量が４９０−から５５０−に及び、溶出された区分
に第２のピークを得た。（Ｖｅ／ｖｏ割合は１．８２か
ら２．０４）。上記の４生物検定の全てにおける生物学
的活性を有する区分を主に溶出量３２２−から３４５ｄ
で得り（Ｖｅ／ＶＯ！Ｊ　合ｕ　Ｚ２９から１．２８　
）。実質上、望ましい生物学的活性を有するこれらの区
分の全てにｌ　８Ｑ　ｎｍでの吸収があるわけではない
。最初、約１８００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ　）の排
出限度を有するバイオゲルＰ　−２によシこの活性物質
を保持したので約１８００以下のはつきりした分子量ｆ
、得た。これらの区分にある活性物質をＴＨＦ　ｎとし
て示した。

上に記載したように調整されたＴＨＦ　ＩＩ区分を組み
合わせてタンパク質３〜を含有する液体混合物を提供し
次。この液体混合物を凍結乾燥した。

凍結乾燥物質を蒸留水ＩＷ１ｔに溶解し、カリ７オルエ
ア、バークレーのＡｌｔｅｘ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　
Ｉｎｃ、から得九逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）（Ｃ，、）カラムに充てんした。カラムは直径
４．６ｔａｘ　。

長さ２５０■で５　Ｑ　ｍＭの酢酸ナトリウムでｐＨ６
，５にあらかじめ平衡にした。流出速度４ａｄＡＲ間で
１時間ｐＨ６，５で酢酸ナトリウム５ＱｍＭｉカラムに
通して、カラム内容物を溶出した。その後、流出速度を
４５分間同様に保ち、一方酢酸ナトリウムのいくらかは
容積でＯから５０％の直線的濃度勾配でｎ−プロパツー
ルで代用できる。各々２−の区分を室温（約２２℃）で
集めた。カラム溶出液を２３０　ｎｍの紫外線吸収及び
第１級アミノ基のけい光検出によって観測した（続いて
ｐＨ９，５で７０ロエスカミノによシアリフートの後カ
ラム反応を行った）。各７ラクシヨンについて生物学的
活性試験、即ちインビトロｃＡＭＰ　、　ＰＨＡ　、　
ＣｏｎＡ及びＭＬＣ生物検定を行った。

２つの明瞭な、而もよく分離した、吸収帯域が認められ
た。それらは更にフロロエスカミンとも反応した。第１
の吸収ピークは一つの緩衝液で得られ、溶離したところ
溶離液量は５−２５１Ｒｔであツタ。７０キ工スカミン
陽性部は同一帯域中ニ溶離した（５−４５ｍ）。第２の
紫外線吸収ピーク（フロロエスカミン陽性）を次工程で
プロパツールの直線的濃度勾配を用いて溶離した（溶離
容量４−１０ｍ、０−９％プロパツール）。゛上記の生
物検定で生物学的活性を示す区分け１０−１６％プロパ
ツールのみに見られた（１２−１６Ｗｔの一溶離量）。

所望の生物活性を有するこれらの区分のすべては実質的
に２３０　ｎｍにおいである吸収を有するが、フロロエ
スカミンに対しては陰性であった。これらの区分の活性
物質はＴＨＦ　ｌと名づけ九〇 上記のようにして作つ−ｆｃＴＨＦｍの区分は合されま
た冷凍乾燥される。次に冷凍乾燥物は蒸留水に溶解し、
逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを用い、Ｐ）Ｉ
４．０で０．３Ｍピリジンホルマートで前以て・平衡化
した。カラムの内容物はＰ　Ｈ４，０で０．３　Ｍピリ
ジンホルマート溶液１−２４　ｍ／時で１２分間通して
溶離した。次に流速を同一速度にして１２分間通した。

その間ピリジンホルマートの一部ヲノルマルプロパツー
ルで直線的に０〜７．５％（容量）の濃度勾配で置換し
た。次に流速を同一速度で５４分間維持した。その間、
ピリジンホルマート溶液の一部をノルマルプロパノール
テ直線的ＦＣ７，５−２５％（容ｉ＞の浅皿勾配で置換
した。

１ミリリツターづつの各区分は水温（約２２℃）で集め
た。次にノルマルプロパツールで溶出した各区分は加水
分解後全アミノ酸含量を分析した。

上記の４ａの生物検定法を行なつ几。１４−１８％ｌｔ
）のノルマルプロパツールを用いたカラムから溶出した
物質を含む区分は最大の全アミノ酸含量を示しまた上記
の４種の生物検定において陽性の結果を示した。これら
の区分の活性物質はＴＨＦ−７と名づけた。

ＴＳＫ　−ＧＥＬ　ＳＷ　２０００のカラム（東洋ソー
ダ製の市販吸着剤）上のＴ　ＨＦ　−７の高速ゲル濾過
はとのカラムによって得られる最小の分子量が１５００
ダルトンである友め１５００ダルトンまたはそれ以下の
見掛けの分子量を提案した。

上記の如くして作つ７ｊ　Ｔ　１１　Ｆ　−７の区分は
合せて減圧下で蒸発乾個した。次に乾燥物質は水中で溶
解シニュークレオシルＣ，，（ｓミクロン）を用い、逆
相高速液体クロマトグラフィーカラムに使用し次。カラ
ムは直径４．３　Ｍ＋　、長さ２５０閣であって、ＰＨ
２０で０，１％（容りのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で
前以て平衡化した。カラムの内容物はＰＨｚＯで０．１
　％ＴＦＡｔ−力９ムに２４−７時の流速で１２分間通
した。次に１２分間同一の流速を維持した。その間Ｔ　
Ｆ　Ａの一部を０〜８％（容量）の直線的濃度勾配を用
いて置換した。

次に流速を同一速度で８６分間維持した。その間、ＴＦ
Ａの一部を８−３５％（容量）の濃度勾配を用いてノル
マルプロパツールで置ｍした。１ｒ１１ｔノ各々の区分
を室温（約２２℃）で集めた。次にノルマルプロバノー
ルで溶出し友各区分は加水分解後全アミノ酸含量を分析
し、インビトロで生物検定＠　ＭＬＣ、ＰＨＡおよびＣ
ｏｎＡについて行なった。

１６−２２％（容量）のノルマルプロパツールを用いて
カラムから溶出した物質を含む区分は最大の全アミノ酸
含量を有し、上記３種の生物検出において陽性の結果を
示した。これらの区分における活性物質はＴＨＦ−８と
名づけた。

上記の如くして作ったＴＨＦ−８の区分は例えばエユー
クレオジルＣ，，（５ミクロン）の逆相高速液体クロマ
トグラフィーカラム（４３Ｘ２００噛）にて処理した。

該カラムは０．１Ｍのナトリウムバークロレート、０，
１％のオルトリン酸および２２％のアセトニトリルの溶
液で前置て平衡化し友。カラムの内容物は上記組成の液
で１．５　ｄ／分の流速で溶出した。１ミリリツターの
各区分は室温（約２５℃）で集め友。溶出物のパターン
は２１０　ｎｍにおける紫外線吸収によって監視した。

増加した吸収ピークを有する区分を保留した。この場合
、６個の主な区分を分離した。これらの区分はＴ　ＨＦ
　−９のα、βｔｆｌδ、ξおよび４区分と名づけた。

α区分を除く他のすべての区分はプロナーゼによって完
全に消化され、ま九プロティナーゼＫによって少なくと
も１部消化した。このα区分はペプチドでなく、他の区
分はすべてペプチドであることがわかった。

次ＫＴＨＦ−８のβ、ｌ、δ、ξおよび４区分はそれぞ
れ別々に減圧下で乾燥し、水に溶解し、これらを各々上
記組成の逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて脱塩
した。該カラムはＰ　Ｈ７，８で５％（容量）のアセト
ニトリルに２ｒｎＭのアレモニウムホルｉ−トを溶解さ
せた溶液で予しめ平衡化し次。脱塩し次物質は各カラム
から５−５−．０％アセトニトリルの直接的濃度勾配を
用い、２ｍＭアンモニウムホルメートにて流速１．５　
ｄ／分で溶出した。溶出物のパターンは２１　Ｑ　ｎｍ
の吸収゛を監視し念。各区分の１ミリリツターを集めた
。吸収ピークの増大し九区分を保留し友。β区分は２つ
の別個の脱塩したペプチド区分をあたえた。他の区分は
それぞれ１つの脱塩し次ペプチドをあ次えた。得られ７
’ｃ６個の脱塩したペプチド区分けＴＨＦ　−９のβ−
１，β−２，７，δ、ξおよび４区分として名づけた。

これらの脱塩ペプチド区分の各々は別々に減圧下で乾燥
され、水に溶解した。

次に各区分は酸加水分解後アミノ酸分析を行なつ７’Ｃ
ｏ　ｔ　タＭＬＣ（＠［）　、ＭＬＣ（牌＠）、ＰＨＡ
およびＣｏｎＡ生物検定をインビトロで行なった。ＴＨ
Ｆ−８７−区分は上記の４種の生物検定のすべてにおい
て最も活性であった。

上記のＴＨＥ’−８７−区分の生物的活性はＴＨＥ’−
１のものより約１０００倍大きいものであった。

これは上記生物検定がＴ　ＨＥ’　−８−７区分につい
てはナノグラムレベルでおこなわれ、一方Ｔ　ＨＦ−１
についての比較生物検定ではミクログラムレベルでおこ
なわれたことによってわかる。

ＴＨＦ−１３７−区分の臨床的利用も明らかになった。

正常なＴ−細胞の発育不良を起す欠損胸腺上皮原基にか
＼っているヒトの患者において免疫Ｔ−細胞機能を回復
させるのに使用された。

上記の如くして作ったＴＨＦ−８７−区分は保持時間約
２０分で脱塩以前にクロマトグラフィーカラムから溶出
した。子牛の胸腺を原料としてＴＨＦ−８１区分を作る
。上記の方法を数回繰返し、各試料からの７区分は約２
０分の保持時間で溶出し、別々に集めて保留した。次に
これらの集め念区分はそれぞれ減圧下で乾燥し、水に溶
解し、逆相高速液体クロマトグラフィー系統を用いて上
記の方法によって脱塩した。溶出物のパターンは２１０
　ｎｍにおける吸収を監視した。増大した吸収ピークを
有する区分を保留した。

この場合、ＴＨＦ−８７−区分の３つの各々のペプチド
が作られた。これらのペプチドについてアミノ酸含量お
よびアミノ酸配列を調べた。またこれらのペプチドにつ
いてＭＬＣ、ＰＨＡおよびＣＡｎＡ生物検定をおこなっ
た。これらのペプチドはＴＨＦ７−２　、　’Ｉ’ＨＦ
７−４およびＴＨＦ７−５と名。

づけた。その結果を次に示す。

ＴＨＥ’ｙ　　２：Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａａｐ−Ｇｌｙ−
Ｐｒ。

−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ Ｔ　ＨＦ　７−４　：　Ｉ（ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−
ｒ’ｒｏ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ ＴＨＦｉ−５：　　Ｐｈｅ−ｖａｌ　−ＬｅｕＡｓｐ　
：アスパラギン酸 Ｇｌｕ　：グルタミン酸 Ｇｕｙ　ニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｌｅｕ　：ロイシン Ｌｙａ　：リジン Ｐｈｅ　：　ｙエニルアラニン Ｐｒｏ　ニブロリン Ｔｙｒ　：チロシン ’Ｖａｌ：バリン これらの新規ペプチドのすべてはＭＬＣ、ＰＨＡおよび
ＣｏｎＡの生物検定の各々について生物活性金示した。

アミノ酸原料からのＴＨＦｉ−２、ＴＨＦｉ−４および
ＴＨＦｉ−５のペプチドの合成法を以下に示す。

実施例２ 実施例１から得られｆ５　Ｔ　ＨＦ　７−２　、　Ｔ　
ＨＦ　７−４およびＴ　ＨＦ　７−５のアミノ酸配列に
ついての情報を用いて、上記ペプチドの合成ＶよＪ、Ａ
＋ｎ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５第２１４９−２１５４頁（
１９６３）に概括的に記載てれたメリフィールド法（Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）の変法を用
いて行なった。各々の場合、アミノ基が第３級ブチルオ
キシカルボニル（Ｂｏｃ　）で保護された所望のペプチ
ドの末端カルボキシ残基はクロロメチル化したポリステ
レンジビニルベンゼン（１％）共重合体、２００−４０
０メツシユ（塩素含量０．７　ｍｅｑ、／り）と沸騰エ
タノール中で７２時間還流下でカップリングした。樹脂
状重合体は２−１０りを使用した。ｔ−Ｂｏｃ−アミノ
酸の最初の使用量は樹脂０．７　ミＩＪモル／、りであ
った。カップリング収率は重合体ダラム当シ０．１５−
０．３ミリモルＢｏｃ−アミノ酸であった。

Ｎ−保護アミノ酸樹脂は順次エタノール１００ミリリツ
ター、５０％（容量）のエタノールのジクロロメタン溶
液１００ミリリツターおよびジクロロメタン１００ミリ
リツターで洗滌した。洗滌されたＮ−保護アミノ酸樹脂
は内容２５０　ミＩＪ　ＩＪフッタのテフロン製びんに
移し、攪拌機またはシェーカーにのせるか、ｔ７ｔはペ
プチドシンセサイザー例えばｏｏｉｍペブタイダ−（Ｐ
ｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ
ｎｃ、、　Ｂｅｌｍｏｎｔ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ製
）にかける。後続の合成工程は同じびんで行なった。す
べての合成は室温で行なった。ペプチドに加えられるそ
れぞれの後続のアミノ酸分子はＮ−保護アミノ酸樹脂を
出発物質として次の操作サイクルで行なった。

（１）　　各洗滌毎に４０−８０ミリリツターのジクロ
ロメタン全周いて３回洗滌した。

（２）５０％（容量）のトリフルオロ酢酸のジクロロメ
タン溶液４０−８０ミリリツターを毎回使用して２回処
理して先に保護したＢｏｃ保護基を除去した。

（Ｓ）　　毎回４０−８０ミリリツターのジクロロメタ
ン４０−８０ミリリツターを使用して３回洗滌した。

（４）　　毎回５０％（容量）のエタノールのジクロロ
メタン溶液４０−８０ミリリツターを使用して３回洗滌
した。

（５）毎回ジクロロメタン４０−８０ミリリツターを使
用して３回洗滌し次。

（６）５％（容りのジイソプロピルエチルアミンのジク
ロロメタン溶液４０−８０ミリリツターを使用して２回
、各回５分間中性化した。

（７）毎回４０−８０ミリリツターのジクロロメタンを
使用して６回洗滌した。

（８）４−８ミリリツターのジメチルホルムアミドに次
に所望するＢｏａ−保護アミノ酸３当量を含む溶液を加
え、また３０−７２ミリリツターのジクロロメタンにＮ
　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドの３当ｉ
−金含む溶液を加えて２時間混合した。

（９）　　毎回、５０％（容量）のエタノールを含むジ
クロロメタン溶液４０−８０ミリリツターを用い−０３
回洗滌した。

α０）毎回４０−８０ミリリッターのジクロロメタンを
使用して３回洗滌した。

（６）上記の（８）工程を一夜く勺かえした。

（ロ）毎回５０％（容量）のエタノールを含むジクロロ
メタン溶液４０−８０ミリリツターを使用して３回洗滌
した。

上記の１２工程のサイクルを所望のペプチド合成忙充分
な回数繰シ返した後保護したペプチド樹脂金上記第（１
）工程から第（５）工程まで繰υ返し使用して乾燥した
。次に液状の弗化水素酸（４ｓｆｔ／９）、アニソール
（１−７９）およびチオアニソシル（１，５ｒｎｔ／ｇ
）で０℃、３０分間処理して保護基金除き、樹脂からペ
プチドを分離した。次に弗化水素酸を蒸発した。ジエチ
ルエーテル１００−２００ミリリツターを０℃で加えて
粗製ペプチドを沈澱させた。沈澱はエーテル溶液から濾
過によシ分離して乾燥した。次に乾燥ペプチドの沈澱を
５０％（容量）の酢酸水溶液１００−３００ミリリツタ
ーを使用してＰＪｉｆｆｌした。不溶性部分子、濾別し
た。次に溶媒ｆｔ蒸発し、得られた残渣を水に溶解しセ
ファデックスＧ−１５（５ｅｐｈａｄｅｘ　）またはＢ
ｉｏｇｅｌ　Ｐ−２（Ｂｉｏｇｅｔ　）の濾過剤カラム
を通した。吸着されたペプチドは水で溶出し、溶出液を
２５４ｎｍの紫外線吸収によって監視し次。この吸収波
長域にペプチド吸収（ピーク）を有する区分を集め友。

次にこれらのペプチド区分をリクロソルブＲＰ−１８（
Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　）逆相高速液体りｏ　マ）　／
　５フイーカラム（１０Ｘ２５０■）で処理した。該カ
ラムは０．１　Ｍのナトリウムバークロレートおよび０
．１％（容量）のリン酸とを含む２３％（容量）のアセ
トニトリル水溶液で前以て平衡化した。次に物質は同一
溶媒を使用してアイソクラシック条件下で５ｍ／分の流
速でカラムから溶出した。溶出物のパターンは２１９　
ｎｍにおける吸“収を監視し次。７．５ミリリツターの
各区分を集めた。増大した吸収帯を有する区分を保留し
た。所望のペープチドを含む区分を減圧下で濃縮し、逆
相ＨＰＬＣカラムで処理した。該カラムは上記の如く、
５％（容量）のアセトニトリル水溶液に０．１％（容量
）のトリフルオロ酢酸を含む溶液で前以て平衡化し九。

次にペプチドは０．１％（容量）のトリフルオロ酢酸水
溶液を使用し、直線的濃度勾配を有する５−５０％（容
量）のアセトニトリル溶液を流速５峰努にて溶出した。

溶出物のパターンは２１０　ｎｍにおける吸収を監視し
た。７．５ミリリツターの各区分を集めた。増大した吸
収を有する区分は所望のペプチドを含むため保留した。

次に精製したペプチドはアミノ酸含量およびアミノ酸配
列を分析してその構造を明らかにした。

上記の方法により、合成ＴＨＦ７−２を樹脂にカップリ
ングした最初のアミノ酸分子の最初の量を基準にして１
１モル％の全体の収率を得た。合成工程の中、さらに３
官能性アミ７基、グルタミン酸およびアスパラギン酸は
ベンジルエステルで保護した。更にリジンはオルトクロ
ロベンジルオキシカルボニルで保護した。得られた合成
ペプチドは次のアミノ酸配列を有する。

Ｌｅｕ　　−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　−Ｇｌｙ　　−Ｐｒｏ
　　−Ｌｙｓ　　−Ｐｈｅ　　−Ｌｅｕ　　。

この物質はインビトロ生物検定において０．５５−５０
ｎ／−の範囲で生物的活性を有し、またイン２生物検定
において体重（ｋｐ）当ＤＩ　　８０ｎｇのｔ７囲で生
物活性を有する。インビボ生物検定により合成ＴＨＦ７
−２は出産直後の胸腺切除マウスの欠損した免疫機能を
回復するのに使用できることがわかった。

実施例３ 次の方法によって次記のアミノ酸配列を有ししかも全収
率２４モル％で合成ＴＨＦｆ−４（１’）Ｈａを行なっ
た。

Ｈｉ　ｓ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ　
−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ合成法では、アスパラギン酸はさら
にベンジルエステルで保護され友。またヒスチジンはざ
らにＮ−トシル−イミダゾールで保護された。この物質
はインビトロ生物検定では５８０ｎｇ／−の範囲で生物
活性であった。

実施例４ 上記の方法によって、次のアミノ酸配列を有し、しかも
全収率３５モル％で合成Ｔ　ＨＦ　１−５の製造を行な
った。

Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ この物質はインビトロ生物検定で５５０−２５０ｎ／Ｗ
ｒｔの範囲で生物活性であり′、またインビボ生物検定
で体重に１当り２　Ｑ　−１０００ｎｇの範囲で生物活
性であった。インビボ生物検定により出産直後の胸腺切
除マウスの欠損免疫機能を回復するのに合成ＴＩ”Ｉ　
Ｆ　７−５の使用ができることがわかった０

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ｌｅｕ； Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｙｒ：および Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ． を有するペプチドからなる群から選ばれしかも胸腺体液
   活性を有するペプチド物質。
2. （２）次のアミノ酸配列 Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ｌｅｕ． を有ししかも胸腺体液活性を有するペプチド物質。
3. （３）次のアミノ酸配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｙｒを有ししかも胸腺体液活性を有するペプチド物質。
4. （４）次のアミノ酸配列 Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ を有し、しかも胸腺体液活性を有するペプチド物質。
5. （５）自然胸腺から分離した前記第１項記載のペプチド
   物質。
6. （６）合成的に作られた前記第１項記載のペプチド物質
   。