JPH0422919B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胸腺から得られる物質およびこれらの
合成法に関するものである。 従来技術 動物体特に子牛の胸腺の器官または細胞から得
られた抽出物およびこれらの免疫的特性について
は最近20年間にわたつて興味が増大しつゝあつ
た。 最近、Allan J.GoldsteinおよびJeffrey L.
Rossio氏の論文〔Comprehensive Therapy
４，49−57（1978）〕にはチモシンに関連する物質
の他に３つの他の胸腺因子についてよく調査され
ている。 これらにはチモポイエチン（thymopoietins）、
血清胸腺因子（STF）および胸腺体液因子
（THF）がある。 チモポイエチン〔以前にはチミン（Thymin）
と呼称された〕およびこれらの製法、用途は
Gideon Goldsteinによつて例えばNature 247
P.11−14（1974）および米国特許第4055633号；第
4077949号；第4120951号および第4124700号明細
書に記載してある。チモポイエチンはホモゲナイ
ズした子牛の胸腺から一連の透析、分子排除クロ
マトグラフイーおよび分別クロマトグラフイーに
よつて得られる。２つの活性な生成物はチモポイ
エチンおよびとして得られた。これらの両者
は49個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであ
る。しかしながら、これらは１位置と43位置の残
基の性質において異なる。米国特許第4002740号
明細書にはトリデカペプチドの合成が記載してあ
り、またチモポイエチンの多くの性質が記載し
てある。米国特許第4369137号明細書にはチモポ
イエチンペンタペプチドの製法に役立つ特定の中
間体が記載してある。米国特許第4190646号、第
4261886号および第4397842号明細書にはチモポイ
エチン活性を有するペプチドが記載してある。 血清胸腺因子（STF）およびその製法および
性質はJ.F.BachらによつてNature 266第55−57
頁（1977）および米国特許第4098777号、第
4133804号および第4148886号明細書に記載してあ
る。これは豚の血液から一連の脱繊維素、透析、
適当なフイルターによる濃化、分子篩による分
別、イオン交換樹脂によるクロマトグラフイー、
さらにははく層クロマトグラフイーによる分別お
よび電気泳動によつて得られる。生成物は９個の
アミノ酸残基を有するポリペプチドである。
STFに類似の構造を有するペプチドは米国特許
第4301065号明細書に記載してある。 チモシンについては、前記のComprehensive
Therapyの他に米国特許第4010148号；第4079127
号；第4082737号；第4116951号；第4128637号お
よぴ第4148788号明細書に記載してある。米国特
許第4010148号明細書にはホモゲナイズされた哺
乳動物の胸腺からチモシン区分を作ることが記載
してある。この方法は多段精製技術であり、各段
階は“フラクシヨン”と呼ばれている。この場
合、ホモゲナイズした胸腺を単に遠心分離して得
られた生成物は“フラクシヨン１”である。ホモ
ゲナイズ、遠心分離、次の熱、アセトンおよび硫
酸アンモニウム処理、最終に硫酸アンモニウム処
理で得られた沈澱を超遠心分離し、生成物を４℃
で集め、セフアデツクスＧ−25（Sephadex）（精
密）カラム上で脱塩して“フラクシヨン５”とす
る。更に電気泳動で頂点に達するまでの処理、お
よび第１蛋白質ピークの収集を“フラクシヨン
８”とする。“フラクシヨン８”は108個のアミノ
酸残基を含むポリペプチドである。米国特許第
4128637号明細書から上記技術によつて分子量
1200−14000の各種ポリペプチドが得られ、チモ
シン（thymosins）と名づけられたことがわかつ
た。米国特許第4082737号明細書にはチモシンフ
ラクシヨン５よりなるポリペプチド混合物を含む
固体の安定でしかも体内毒性のない組成物の製造
について記載してある。 上記の論文Goldstein Comprehensive
Therapyにはチモシンフラクシヨン５から得られ
たチモシンα₁と呼ばれる特殊のポリペプチドの性
質が記載してある。28個のアミノ酸残基を有しし
かも分子量3108で等電点4.2のポリペプチドが記
載してある。これはまた米国特許第4079127号明
細書にも記載してある。チモシンα₁の放射線免疫
分析は米国特許第4264571号および第4339427号明
細書に記載してある。チモシンα₁フラグメントは
米国特許第4442031号および第4470926号に記載し
てある。ビスーチモシンα₁は米国特許第4396605
号明細書に記載してある。２つの関連したポリペ
プチドであるチモシンβ₃およびチモシンβ₄はチモ
シンフアクター５から得た。第１物質は50個のア
ミノ酸残基を有し、一方第２物質は43個のアミノ
酸残基を有する。これは米国特許第4297276号明
細書に記載してある。チモシンβ₃およびβ₄のフラ
グメントは米国特許第4395404号明細書に記載し
てある。チモシンβ₈およびβ₉は米国特許第
4388234号および第4389343号明細書に記載してあ
る。 更に、胸腺から得られた生成物は同時に介在す
る免疫形成ポリペプチド（UB IP）であり、米
国特許第4002602号および第4167557号明細書に記
載してあり、またProceedings of the National
Academy of Sciences 72第11−15頁（1975）
にも記載してある。その分子量は約8500で、74個
のアミノ酸残基を含んでいる。関連するペプチド
は米国特許第4215111号および第4190647号明細書
に記載してある。 他の胸腺エキストラクトは米国特許第3438859
号；第3466367号；第3657417号；第4239498号；
第4377511号および第4394374号明細書に記載され
ており、エキストラクトと生産するが、特定のポ
リペプチドの生産については記載してある。米国
特許第4374828号明細書には特定のアミノ酸含量
を有するが、いかなる特定のアミノ酸配列をもた
ない胸腺エキストラクトが記載してある。胸腺ホ
ルモン様性質を有するヒト血清プレアルブミンは
米国特許第4046877号明細書に記載してある。バ
クテリアRNAからの免疫刺戟性物質の製法につ
いては米国特許第4389396号明細書に記載してあ
る。胸腺機能域において役立つものとして記載さ
れているペブチドは米国特許第4250086号；第
4320118号；第4361673号；第4389342号および第
4428938号明細書に記載してある。 これらの生成物のすべては免疫欠損の問題につ
いての会合においてある用途が報告されている。
しかしながら、チモポイエチン、UBIPおよび血
清胸腺因子は無傷の動物においては意味のある胸
腺依存性免疫・受容能力を誘起するのに効果がな
いことがProceedings of the Society for
Experimental Biology and Medicine 159、第
195−200頁（1978）に報告されている。 いかなる従来技術にも本発明の特定のペプチド
組成物が胸腺体液活性を有することが記載されて
いないしまた何等の提案もされていない。 胸腺体液因子（THF）は例えばJournal of
Experimental Medicine 132第885−897頁
（1970）；Journal of Experimental Medicine
138第1521−1532頁（1972）、Cellular
Immunology 19第151−157頁（1975）、米国特
許第4250084号明細書に記載してある。これらの
すべてはヒトのリン床試験結果で成功をおさめて
いる。リン床試験結果は1979年２月26月において
ニユーヨークアカデミーオブサイエンスの会合で
報告された。従来の胸腺体液因子はTHF Ｉと名
づけられた。 上記の文献および米国特許第4250084号明細書
に記載の従来法に従えば、リン床的に役立つ
THF では、精製方法で作つた各活性区分を
７つの異なつた生物検定について試験した。すべ
ての７つの試料に対して正反応を発揮する区分に
ついてのみさらに精製と使用とを行なつた。
THF 区分の活性はcAMP，PHA，ConAお
よびMLCの生物検定における活性に対して測定
し、リン床的に投与できる微生物学的活性区分を
得た。 現在まで、米国特許第4250084号明細書に記載
されたTHF 試料は例えば簡単なポリペプチ
ドであつたと考えられていた。その理由は、
PH3.5ではく層クロマトグラフイーおよびペーパ
ー電気泳動で単一のニンヒドリン−ポジテイブス
ポツトとして泳動したからである。更に、等電点
5.6−5.9のポリアクリルアミドゲル上を等電的に
集合して単一バンドとして泳動した。試料中に含
まれたアミノ酸は芳香族でなかつた。THF
試料は典型的な芳香族を示す280nmにおける紫外
線を吸収することがわかつた。この特性は所望の
THF 区分の分離に役立つことがわかつた。
また、例えば上記の米国特許明細書に記載された
THF 試料は実質的に分子量約3200の純粋な
ポリペプチドであつた。この従来公知のTHF
試料はさらに数区分に分離でき、簡単なゲル濾
過手段によつて分子量は約3200以下に変化するか
またはは分子量約3200以下の新しい区分でしかも
以前にTHF として報告された同じ完全な生
物検定プロヒルを保持した区分に分離できること
は考えられなかつた。 以前に公知であつた胸腺体液因子（THF ）
が事実単一化合物ではなく、特定のゲル濾過をう
けた場合、生成物の分離が起り、また所望の生物
学的活性が現われ、特定の因子であると確認され
たことがわかつたことは驚くべきことであつた。
更に、所望の生物学的活性区分は280nmにおいて
実質的に紫外線吸収を示さない区分であることが
わかつた。ゲル区分から溶出した区分は280nmに
おいて著しい紫外線吸収を示した生成物に含まれ
た活性区分の前後の区分であつた。 先の米国出願第153644号明細書には、胸腺体液
型生物学的活性物質（THF と名づけた）の
分離について記載してある。該物質は見かけの分
子量約1800以下でしかも280nmにおいて実質的に
紫外線吸収が存在せずしかもcAMP，PHA，
ConAおよびMLCのすべての生物検定において活
性を有する特性がある。また従来の出願には
THF を得る方法が記載してあり、該方法は
THF をゲル濾過し、約1800ダルトンの排出
限界を有するゲル濾過媒体を用い、しかも280nm
で実質的に紫外線吸収を欠きしかもcAMP，
MLC，PHAおよびConAのすべての生物検定に
おいて活性を示す区分を集めることである。
THF を得るための所望の区分に対して有効
であることがわかつた特定のゲル濾過媒体はポリ
アクリルアミドゲルビーズ型でしかも1800ダルト
ンの排出限界を有するBiogel Ｐ−２樹脂であ
る。この樹脂はリツチモンドカルフオルニア
94804のバイオーラードラボラトリーから得られ
る。 得られた区分を分析するために使用したcAMP
生物検定については例えば、Kookおよび
Trainin；J.Exp.Med.139第193頁（1974）、Kook
およびTrainin；J.Immunol.114第157頁（1975）
およびKook，UmielおよびAlbala；Ann.N.Y.
Acad.Sci.249第349頁（1975）に記載してある。 得られた区分を分析するために使用したMLC
生物検定については例えばUmielおよび
Trainin：Eur.J.Immuno.５第85頁（1975）およ
びKook，UmielおよびAlbala；Ann.N.Y.Acad.
Sci.249第349頁（1975）に記載してある。 得られた区分を分析するために使用したPHA
およびConA生物検定については、例えばRotter
およびTrainin；Cell.Immunol.16第413頁
（1975）に記載されている。 先の米国出願第227299号明細書には胸腺体液型
の生物活性物質（THF ）の分離について記
載してある。該物質は見かけの分子量約1500以下
でしかもcAMP，PHA，ConAおよびMLCのす
べての生物検定について生物学的活性を示す特徴
がある。この先の出願にはTHF を得る方法
が記載され、該方法では逆相高速液体クロマトグ
ラフイーカラムに吸着され、吸着された物質はカ
ラムから溶出され、cAMP，PHA，ConAおよび
MLCのすべての生物検定に活性を示す区分を集
めた。 先の米国出願第300330号および第394571号明細
書には胸腺体液型生物的活性物質（THF−７）
の分離について記載してある。該物質の特徴は見
かけの分子量1500以下でしかもcAMP，PHA，
ConAおよびMLCのすべてについての生物検定に
おいて活性である特徴がある。また、先の出願に
は、THF−７を得る方法について記載してあり、
該方法ではTHF をピリジンホーメイトで前
以て平衡にした逆相高速液体クロマトグラフイー
カラムに吸着させ、吸着された物質をカラムから
ピリジンホーメイトとノルマンブロパノールとの
混合液から溶出し、cAMP，PHA，ConAおよび
MLCのすべての生物検定で活性を示す区分を集
めた。 先の米国出願第475175号および第535539号明細
書にはTHF−７を更に逆相高速液体クロマトグ
ラフイーによつて精製してTHF−8γ区分として
名づけられる生物的活性物質を作る。先の米国出
願第559393号明細書には更にTHF−8γ区分をγ
−２，γ−４およびγ−５の数種の生物活性物質
に分離することが記載してある。THFγ−２，
THFγ−４、およびTHFγ−５のアミノ酸配列は
先の出願に記載してある。更に、分析の結果、先
に報告されたTHFγ−２およびTHFγ−４に対す
るアミノ酸配列は誤りであつた。 問題点を解決するための手段 本発明は、胸腺体液活性を有ししかも次のアミ
ノ酸配列 His−Pro−Leu−Pro−Asp−Leu−Tyrを有
する物質を提供するにある。 これらの物質は天然の胸腺器管から分離でき、
また合成により製造できる。 本発明の新規物質の製造に使用するTHF
の原料物質は上記の米国特許第4250084号明細書
に概要が記載された方法で製造する。その文献は
本願明細書にも引用されている。 THF を製造するためには、凍結した胸腺、
便宜上子牛の胸腺を適当な液状媒体例えば緩衝液
または塩水でホモゲナイズする。細胞デイブリス
を除き、さらに好ましくない成分を超遠心分離機
（例えば90000−150000ｇで２−５時間）により除
去した。次に適当な濾過膜例えば細孔径0.8−
2.0μｍを通して濾過し、体内毒素を作る微生物を
含まない液状物を作る。次に得られた滅菌した液
状物は透析し、得られた生成物は凍結乾燥し、適
当な液状媒体中で再溶解した。透析は典型的には
多量の水、塩水またはリン酸塩緩衝塩水（PBS）
に対して24−60時間冷時にて実施する。分子量
10000以下の物質を通す適当な透析膜が使用でき
る。適当な膜はセロフアン透析バツグである。凍
結乾燥した透析物は例えば蒸留水、重炭酸アンモ
ニウム、PBSまたはトリスー緩衝液に再溶解さ
れ、１−15mg／mlの適当なポリペプチドの溶媒濃
度に稀釈し、次に得られた溶液をゲル濾過する。 本発明のTHF 原料物質を作るに当り、ゲ
ル濾過に使用する溶媒および所要工程数はある程
度透析工程で使用する予備処理、特に使用する溶
媒の特性に左右される。透析により比較的低分子
量の物質のみを通す場合には、ゲル濾過工程を最
小限度にすることができる。しかしながら、いか
なる場合でも、低分子量の物質を除くことが必要
である。数100ダルトンの排出限界を有するカラ
ム例えばセフアデツクスＧ−10（商品名フアーマ
シア（Pharmacia）社のカラムのボイドボリウ
ムを溶出および保持することによつてなしうる。
セフアデツクスＧ−10は700ダルトンの排出限界
を有する。 更に、THF 原料物質を作るための区分は
排出限界約5000ダルトンを有するゲル濾過物質例
えばセフアデツクスＧ−25（商品名フアーマシア
社）を用いてゲル濾過を行なつた。代表的には、
カラムはPH8.0で10^-3M重炭酸アンモニウムで溶
出する。活性区分は上記の４個の生物検定によつ
て測定した。のぞむならば、更なる区分は例えば
0.1Mトリス−HClまたは0.1M NH₄HCO₃を用い
てPH8.0でDEAE−セフアデツクスＡ−25（商品
名フアーマシア社）を用いしかもNaclの直線的
濃度勾配を用いて展開する。塩は低分子量の排出
限界を有する物質例えばセフアデツクスＧ−10を
用いて濾過し次にボイドボリウムを回収すること
によつて除く。 このようにして得られたTHF 原料物質は
先の米国出願第153644号明細書の記載に従つて約
1800ダルトンの排出限界を有するゲル濾過物質の
床を通した。次に吸着物質は水で溶出し、溶出し
た物質は区分に集めた。280nmにおける紫外線吸
収が各区分について監視され、各区分はcAMP，
PHA，ConAおよびMLCの生物検出について分
析した。得られた最初の区分は実質的に280nmで
紫外線吸収を示したが、上記の４つの生物検出の
すべてに生物活性を示さなかつた。得られた区分
の次のグループは実質的に280nmにおいて紫外線
吸収を示さなかつた。区分の後続するグループは
280nmにおいて実質的に紫外線吸収を示したが、
上記の４つの生物検定のすべてについて生物活性
を示さなかつた。上記の４つの生物検定のすべて
について生物活性を有する所望のTHF 物質
はゲル濾過媒体のボイドボリウム（Vo）に対す
る溶出液の容量（Ve）の比が約1.1−1.4である区
分に見出された。ゲル濾過媒体のボイドボリウム
は公知の方法で測定する。ボイドボリウムの測定
法の一つではブルーデキストラン2000（商品名）
が使用される。これはブルー染料を含む分子量
2000000を有する高分子量デキストランであり、
Pharmacia Fine Chemicals Inc.から得られる。
ブルーデキストラン2000の0.1％（重量／容積比）
の水溶液がゲル濾過媒体の全容量を基準にして１
％（容量）の量をゲル濾過媒体のカラムに加え
た。次に水をカラムに加え、0.95ml／分の速度で
溶出した。5.75ミリリツターの溶出区分が集めら
れた。600nmにおける吸収が各区分に対して監視
された。全溶出物を集め、600nmにおいて最大吸
収を有する区分を含み、ゲル濾過媒体のボイドボ
リウムを示した。 上記のようにして得られたTHF の生物活
性区分は合せて逆相高速液体クロマトグラフイー
媒体に通した。吸着された内容物は適当な溶液で
溶出し、上記の４つの生物検定のすべてにおいて
生物活性を有する区分が吸着された。この吸着さ
れた物質はTHF と名づけた。 THF を作るのに役立つ適当なクロマトグ
ラフイー媒体はオクチル（C₈）またはオクタデ
シル（C₁₈）を結合した相を有する市販の表面変
性無機担体である。逆相高速液体クロマトグラフ
イーに使用する疎水性の他の結合相例えばビフエ
ニルまたはヘキシル（C₆）ないしオクタデシル
（C₁₈）が使用できる。２つの有用な物質はリクロ
ソルブRP−18（Lichrosorb RP−18）およびニユ
クレオシルC₁₈（Nucleosil C₁₈）の商品名で市販
されている。ニユクレオシルC₁₈物質は粒径５お
よび10ミクロンの物質で西独デユレン（Duren）
所在のMacherey−Nagelcoから発売されている。
他の有用な物質は、カルフオルニア・バークレー
所在のAltex Scientific Inc.から入手したHPLC
カラムである。 THF 物質はいかなる使用上の濃度で上記
のクロマトグラフイー媒体に適用できるが、約３
mgの蛋白質を含むTHF 溶液を冷凍乾燥し、
次に冷凍乾燥した物質を１ミリリツターの蒸留水
に溶解して作つた溶液を使用するのが適当であ
る。 上記のクロマトグラフイー媒体から吸着された
THF 物質を溶出するのに役立つ水性液は例
えばPH3.5−7.5のナトリウム、カリウム、アン
モニウムまたはピリジニウムカチオンおよびアセ
テート、ホスフエートまたはホルマートアニオン
を有する塩を含む。塩濃度は約50mMないし
300mMである。次にこれらの水溶液は適当な有
機溶離剤例えばノルマンプロパノール、イソプロ
パノール、エタノールまたはアセトニトリルを０
−20％ないし０−60％の有機溶媒の直線的または
非直線的濃度勾配で混合した。THF を得る
ためには、50mMのナトリウムまたはアンモニウ
ムアセテート中、PH6.5で０−50％の濃度勾配を
有するノルマンプロパノールを用いるのが滴当で
ある。 上記のようにして作られたTHF の生物学
的活性区分は合併され、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー媒体を通した。THF の製造に適す
る同一のクロマトグラフイー媒体はTHF−７の
分離および回収に役立つ。クロマトグラフイー媒
体は好ましくはピリジンホルマートで例えば
0.3mMの濃度およびPH4.0で予じめ平衡化する。
カラムに吸着された物質はピリジンホルマートと
ノルマンプロパノールの混合物で溶出するのが好
ましい。7.5−25％（容量）のノルマンプロパノ
ールの濃度勾配を用いるのが最も適当である。上
記４つの生物検出のすべてにおいて生物活性を有
する溶出物質はTHF−７と名づけた。 次に上記のようにして作つたTHF−７の生物
活性区分は合され、逆相高速液体クロマトグラフ
イーカラムを通した。THF−７の製造に適する
同一のクロマトグラフイー媒体はTHF−８の分
離および採取に役立つ。適当な物質はニユクレオ
シルC₁₈（５ミクロン）である。クロマトグラフイ
ー媒体はPH2.0で0.1％（容量）のトリフルオロ
アセテートで予じめ平衡化することが適当であ
る。カラムに吸着した物質はトリフルオロ酢酸と
ノルマンプロパノールとの混合物で溶出すること
が適当である。８−35％（容量）の濃度勾配を有
するノルマンプロパノールが最も適当である。カ
ラム上の吸着物質はトリフルオロアセテートおよ
びノルマンプロパノールの混合物で溶出するのが
適当である。PHA、ConAおよびMLCの生物検
定において生物活性を有する溶出物質はTHF−
８と名づけた。 THF−８は数種のペプチツド物質よりなる。
これらのペプチツド物質はイソクラテイツク分離
によつて個々の成分に分離できる。これは上記の
ようにして製造したTHF−８をTHF−８の採取
に使用した同一種類の逆相高速液体クロマトグラ
フイー媒体に通して実施した。この場合、0.1M
ナトリウムパークロレート、0.1％オルトリン酸
および22％アセトニトリルの混合液で予じめ平衡
化する。カラムに吸着された物質は予じめ平衡化
した混合物と同一組成の溶媒で溶出するのが適当
である。この溶離パターンは210nmでの紫外線吸
収によつて監視する。更に考察するため吸着され
るでき区分は210nmの吸収データでピークを示し
た区分である。また、吸着物質はペプチドの存在
のために試験されなければならない。またペプチ
ド含有物質のみが更に処理されるべきである。次
にペプチドである上記の採取した区分の各々は適
当な揮発性緩衡液で予じめ平衡化するのに使用し
たと同じ種類の逆相高速液体クロマトグラフイー
媒体におのおのを通して個別に脱塩する。適当な
緩衡液系はPH7.8で2mMアンモニウムホルマー
トかまたは５％アセトニトリル中で0.1％トリフ
ルオロ酢酸の濃度である。次に脱塩したペプチド
は適当な揮発性緩衡剤および溶媒を用いてカラム
から脱塩する。脱塩は５−50％アセトニトリルの
直線的濃度勾配を用いたアンモニウムホルマート
またはトリフルオロアセテートで行なうのが好ま
しい。次に溶離液パターンは210nmにおける監視
を行なつた。更に考慮するため保持される区分は
吸収域において210nmにおけるピークで示される
区分である。得られた脱塩ペプチド区分はPHA、
ConAおよびMLC検定において生物活性を試験し
た。上記の３種の生物検定のすべてにおいて活性
を有するTHF−８区分はそれぞれTHFγ−２，
THFγ−４およびTHFγ−５と名づけた。 実施例 胸腺から本発明の新規ペプチドを製造する方法
は次の実施例に詳細に記載してある。 実施例 １ 米国特許第4250084号の実施例に従つて調製し
たTHF の生物学的活性区分は、THF 産
出開始以前に最初の胸腺が凍結したことを除き、
組み合わせられ、１mgのタンパク質を含有する液
体混合物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥
した。凍結乾燥物質を５mlの蒸留水に溶解し、カ
リフオルニア、リツチモンドのBio Rad
Laboratoriesから得たBio Gel Ｐ−２商品名の
カラムに充てんした。カラムは直径2.9cmで130cm
の深さであつた。ブルーデキストラン2000を用い
てカラムの空隙量（Vo）を270mlであるとあらか
じめ決めた。カラム内容物を２倍希釈、発熱原物
質の存在しない水で、0.95ml／分の流出速度で溶
出し、5.75mlの区分を４℃で集めた。230及び
280nmの紫外線吸収を各区分で検出した。各区分
をまたcAMP，PHA，ConA及びMLC生物検定
における生物学的活性を試験した。２つの明白な
はつきり別れた吸収のピークを得た。溶出量
（Ve）が250mlから330mlに及び、溶出された区分
に最初のピークを得た。（Ve／Vo割合は0.93から
1.22）。溶出量が490mlから550mlに及び、溶出さ
れた区分に第２のピークを得た。（Ve／Vo割合
は1.82から2.04）。上記の４生物検定の全てにお
ける生物学的活性を有する区分を主に溶出量322
mlから345mlで得た（Ve／Vo割合は2.29から
1.28）。実質上、望ましい生物学的活性を有する
これらの区分の全てに180nmでの吸収があるわけ
ではない。最初、約1800ダルトン（Daltons）の
排出限度を有するバイオゲルＰ−２によりこの活
性物質を保持したので約1800以下のはつきりした
分子量を得た。これらの区分にある活性物質を
THF として示した。 上に記載したように調整されたTHF 区分
を組み合わせてタンパク質３mgを含有する液体混
合物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥し
た。凍結乾燥物質を蒸留水１mlに溶解し、カリフ
オルニア、バークレーのAltex Scientific Inc.か
ら得た逆相高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）（C₁₈）カラムに充てんした。カラムは
直径4.6mm、長さ250mmで50mMの酢酸ナトリウム
でpH6.5にあらかじめ平衡にした。流出速度48
ml／時間で１時間pH6.5で酢酸ナトリウム50mM
をカラムに通して、カラム内容物を溶出した。そ
の後、流出速度を45分間同様に保ち、一方酢酸ナ
トリウムのいくらかは容積で０から50％の直線的
濃度勾配でｎ−プロパノールで代用できる。各々
２mlの区分を室温（約22℃）で集めた。カラム溶
出液を230nmの紫外線吸収及び第１級のアミノ基
のけい光検出によつて観測した。（続いてpH9.5
でフロロエスカミンによりアリコートの後カラム
反応を行つた）。各フラクシヨンについて生物学
的活性試験、即ちインビトロcAMP，PHA，
ConA及びMLC生物検定を行つた。 ２つの明瞭な、而もよく分離した、吸収帯域が
認められた。それらは更にフロロエスカミンとも
反応した。第１の吸収ピークは一つの緩衡液で得
られ、溶離したところ溶離液量は５−25mlであつ
た。フロロエスカミン陽性部は同一帯域中に溶離
した（５−45ml）。第２の紫外線吸収ピーク（フ
ロロエスカミン陽性）を次工程でプロパノールの
直線的濃度勾配を用いて溶離した（溶離容量４−
10ml、０−９％プロパノール）。上記の生物検定
で生物学的活性を示す区分は10−16％プロパノー
ルのみに見られた（12−16mlの溶離量）。所望の
生物活性を有するこれらの区分のすべては実質的
に230nmにおいてある吸収を有するが、フロロエ
スカミンに対しては陰性であつた。これらの区分
の活性物質はTHF と名づけた。 上記のようにして作つたTHF の区分は合
されまた冷凍乾燥される。次に冷凍乾燥物は蒸留
水に溶解し、逆相高速液体クロマトグラフイーカ
ラムを用い、PH4.0で0.3Mピリジンホルマート
で前以て平衡化した。カラムの内容物はPH4.0で
0.3Mピリジンホルマートを24ml／時で12分間通
して溶離した。次に流速を同一速度にして12分間
通した。その間ピリジンホルマートの一部をノル
マンプロパノールで直線的に０〜7.5％（容量）
の濃度勾配で置換した。次に流速を同一速度で54
分間維持した。その間、ピリジンホルマート溶液
の一部をノルマンプロパノールで直線的に7.5−
25％（容量）の濃度勾配で置換した。１ミリリツ
ターづつの各区分は室温（約22℃）で集めた。次
にノルマンプロパノールで溶出した各区分は加水
分解後全アミノ酸含量を分析した。上記の４種の
生物検定法を行なつた。14−18％（容量）のノル
マンプロパノールを用いたカラムから溶出した物
質を含む区分は最大の全アミノ酸含量を示しまた
上記の４種の生物検定において陽性の結果を示し
た。これらの区分の活性物者はTHF−７と名づ
けた。 TSK−GEL SW2000（商品名 東洋ソーダ(株)製
の市販吸着剤）のカラム上のTHF−７の高速ゲ
ル濾過はこのカラムによつて得られる最小の分子
量が1500ダルトンであるため1500ダルトンまたは
それ以下の見掛けの分子量を提案した。 上記の如くして作つたTHF−７の区分は合せ
て減圧下で蒸発乾涸した。次に乾燥物質は水中で
溶解しニユークレオシルC₁₈（５ミクロン）を用
い、逆相高速液体クロマトグラフイーカラムを使
用した。カラムは直径4.3mm、長さ250mmであつ
て、PH2.0で0.1％（容量）のトリフルオロ酢酸
（TFA）で前以て平衡化した。カラムの内容物は
PH2.0で0.1％TFAをカラムに24ml／時の流速で
12分間通した。次に12分間同一の流速を維持し
た。その間TFAの一部を０〜８％（容量）の直
線的濃度勾配を用いて置換した。次に流速を同一
速度で86分間維持した。その間、TFAの一部を
８−35％（容量）の濃度勾配を用いてノルマンプ
ロパノールで置換した。１mlの各々の区分を室温
（約22℃）で集めた。次にノルマンプロパノール
で溶出した各区分は加水分解後全アミノ酸含量を
分析し、インビトロで生物検定をMLC，PHAお
よびConAについて行なつた。16−22％（容量）
のノルマンプロパノールを用いてカラムから溶出
した物質を含む区分は最大の全アミノ酸含量を有
し、上記３種の生物検出において陽性の結果を示
した。これらの区分における活性物質はTHF−
８と名づけた。 上記の如くして作つたTHF−８の区分は例え
ばニユークレオジルC₁₈（５ミクロン）の逆相高速
液体クロマトグラフイーカラム（4.3×200mm）に
て処理した。該カラムは0.1Mのナトリウムパー
クロレート、0.1％のオルトリン酸および22％の
アセトニトリルの溶液で前以て平衡化した。カラ
ムの内容物は上記組成の液で1.5ml／分の流速で
溶出した。１ミリリツターの各区分は室温（約25
℃）で集めた。溶出物のパターンは210nmにおけ
る紫外線吸収によつて監視した。増加した吸収ピ
ークを有する区分を保留した。この場合、６個の
主な区分を分離した。これらの区分はTHF−８
のα，β，γ，δ，εおよびη区分と名づけた。
α区分を除く他のすべての区分はプロナーゼによ
つて完全に消化され、またプロテイナーゼＫによ
つて少なくとも１部消化した。このα区分はペプ
チドでなく、他の区分はすべてペプチドであるこ
とがわかつた。 次にTHF−８のβ，γ，δ，εおよびη区分
はそれぞれ別々に減圧下で乾燥し、水に溶解し、
これらを各々上記組成の逆相高速液体クロマトグ
ラフイーを用いて脱塩した。該カラムはPH7.8で
５％（容量）のアセトニトリルに2mMのアンモ
ニウムホルマートを溶解させた溶液で予じめ平衡
化した。脱塩した物質は各カラムから５−50％ア
セトニトリルの直接的濃度勾配を用い、2mMア
ンモニウムホルメートにて流速1.5ml／分で溶出
した。溶出物のパターンは210nmの吸収を監視し
た。各区分の１ミリリツターを集めた。吸収ピー
クの増大した区分を保留した。β区分は２つの別
個の脱塩したペプチド区分をあたえた。他の区分
はそれぞれ１つの脱塩したペプチドをあたえた。
得られた６個の脱塩したペプチド区分はTHF−
８のβ−１，β−２，γ，δ，εおよびη区分と
して名づけた。これらの脱塩ペプチド区分の各々
は別々に減圧下で乾燥され、水に溶解した。次に
各区分は酸加水分解後アミノ酸分析を行なつた。
またMLC（胸腺）、MLC（脾臓）、PHAおよび
ConA生物検定をインビトロで行なつた。THF−
8γ−区分は上記の４種の生物検定のすべてにお
いて最も活性であつた。 上記のTHF−8γ−区分の生物的活性はTHF−
１のものより約1000倍大きいものであつた。これ
は上記生物検定がTHF−８−γ区分については
ナノグラムレベルでおこなわれ、一方THF−
についての比較生物検定ではミクログラムレベル
でおこなわれたことによつてわかる。 THF−8γ−区分の臨床的利用も明らかになつ
た。正常なＴ−細胞の発育不良を起す欠損胸腺上
皮原基にかゝつているヒトの患者において免疫Ｔ
−細胞機能を回復させるのに使用された。 上記の如くして作つたTHF−8γ−区分は保持
時間約20分で脱塩以前にクロマトグラフイーカラ
ムから溶出した。子牛の胸腺を原料としてTHF
−8γ区分を作る。上記の方法を数回繰返し、各
試料からのγ区分は約20分の保持時間で溶出し、
別々に集めて保留した。次にこれらの集めた区分
はそれぞれ減圧下で乾燥し、水に溶解し、逆相高
速液体クロマトグラフイー系統を用いて上記の方
法によつて脱塩した。溶出物のパターンは210nm
における吸収を監視した。増大した吸収ピークを
有する区分を保留した。 この場合、THF−8γ−区分の３つの各々のペ
プチドが作られた。これらのペプチドについてア
ミノ酸含量およびアミノ酸配列を調べた。またこ
れらのペプチドについてMLC，PHAおよび
ConA生物検定をおこなつた。これらのペプチド
はTHFγ−２，THFγ−４およびTHFγ−５と名
づけた。 その結果を次に示す。 THFγ−２：Leu−Glu−Asp−Gly−Pro−
Lys−Phe−Leu THFγ−４：His−Pro−Leu−Pro−Asp−
Leu−Tyr THFγ−５：Phe−Val−Leu Asp：アスパラギン酸 Glu：グルタミン酸 Gly：グリシン His：ヒスチジン Leu：ロイシン Lys：リジン Phe：フエニルアラニン Pro：プロリン Tyr：チロシン Val：バリン これらの新規ペプチドのすべてはMLC，PHA
およびConAの生物検定の各々について生物活性
を示した。 アミノ酸原料からのTHFγ−２，THFγ−４お
よびTHFγ−５のペプチドの合成法を以下に示
す。 実施例 ２ 実施例１から得られたTHFγ−４のアミノ酸配
列についての情報を用いて、上記ペプチドの合成
はJ.Am.Chem.Soc.85第2149−2154頁（1963）に
概括的に記載されたメリフイールド法
（Merrifield technique）の変法を用いて行なつ
た。各々の場合、アミノ基が第３級ブチルオキシ
カルボニル（Boc）で保護された所望のペプチド
の末端カルボキシ残基はクロロメチル化したポリ
スチレンジビニルベンゼン（１％）共重合体、
200−400メツシユ（塩素含量0.7meq.／ｇ）と沸
謄エタノール中で72時間還流下でカツプリングし
た。樹脂状重合体は２−10ｇを使用した。ｔ−
Boc−アミノ酸の最初の使用量は樹脂0.7ミリモ
ル／ｇであつた。カツプリング収率は重合体グラ
ム当り0.15−0.3ミリモルBoc−アミノ酸であつ
た。Ｎ−保護アミノ酸樹脂は順次エタノール100
ミリリツター、50％（容量）のエタノールのジク
ロロメタン溶液100ミリリツターおよびジクロロ
メタン100ミリリツターで洗滌した。洗滌された
Ｎ−保護アミノ酸樹脂は内容250ミリリツターの
テフロン製びんに移し、撹拌機またはシエーカー
にのせるか、またはペプチドシンセサイザー例え
ば001型ペプタイダー（Peninsula Laboratories，
Inc.，Belmont，California製）にかける。後続
の合成工程は同じびんで行なつた。すべての合成
は室温で行なつた。ペプチドに加えられるそれぞ
れの後続のアミノ酸分子はＮ−保護アミノ酸樹脂
を出発物質として次の操作サイクルで行なつた。 (1) 各洗滌毎に40−80ミリリツターのジクロロメ
タンを用いて３回洗滌した。 (2) 50％（容量）のトリフルオロ酢酸のジクロロ
メタン溶液40−80ミリリツターを毎回使用して
２回処理して先に保護したBoc保護基を除去し
た。 (3) 毎回40−80ミリリツターのジクロロメタン40
−80ミリリツターを使用して３回洗滌した。 (4) 毎回50％（容量）のエタノールのジクロロメ
タン溶液40−80ミリリツターを使用して３回洗
滌した。 (5) 毎回ジクロロメタン40−80ミリリツターを使
用して３回洗滌した。 (6) ５％（容量）のジイソプロピルエチルアミン
のジクロロメタン溶液40−80ミリリツターを使
用して２回、各回５分間中性化した。 (7) 毎回40−80ミリリツターのジクロロメタンを
使用して６回洗滌した。 (8) ４−８ミリリツターのジメチルホルムアミド
に次に所望するBoc−保護アミノ酸３当量を含
む溶液を加え、また30−72ミリリツターのジク
ロロメタンにＮ，N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミドの３当量を含む溶液を加えて２時間
混合した。 (9) 毎回、50％（容量）のエタノールを含むジク
ロロメタン溶液40−80ミリリツターを用いて３
回洗滌した。 (10) 毎回40−80ミリリツターのジクロロメタンを
使用して３回洗滌した。 (11) 上記の(8)の工程を一夜くりかえした。 (12) 毎回50％（容量）のエタノールを含むジクロ
ロメタン溶液40−80ミリリツターを使用して３
回洗滌した。 上記の12工程のサイクルを所望のペプチド合成
に充分な回数繰り返した後保護したペプチド樹脂
を上記第(1)工程から第(5)工程まで繰り返し使用し
て乾燥した。次に液状の弗化水素酸（４ml／ｇ）、
アニソール（１ml／ｇ）およびチオアニソール
（1.5ml／ｇ）で０℃、30分間処理して保護基を除
き、樹脂からペプチドを分離した。次に弗化水素
酸を蒸発した。ジエチルエーテル100−200ミリリ
ツターを０℃で加えて粗製ペプチドを沈澱させ
た。沈澱はエーテル溶液から濾過により分離して
乾燥した。次に乾燥ペプチドの沈澱を50％（容
量）の酢酸水溶液100−300ミリリツターを使用し
て抽出した。不溶性部分を濾別した。次に溶媒を
蒸発し、得られた残渣を水に溶解しセフアデツク
スＧ−15（Sephadex）またはBiogel Ｐ−２
（Biogel）の濾過用カラムを通した。吸着された
ペプチドは水で溶出し、溶出液を254nmの紫外線
吸収によつて監視した。この吸収波長域にペプチ
ド吸収（ピーク）を有する区分を集めた。次にこ
れらのペプチド区分をリクロソルプRP−18
（Lichrosorb）逆相高速液体クロマトグラフイー
カラム（10××250mm）で処理した。該カラムは
0.1Mのナトリウムパークロレートおよび0.1％
（容量）のリン酸とを含む23％（容量）のアセト
ニトリル水溶液で前以て平衡化した。次に物質は
同一溶媒を使用してアイソクラシツク条件下で５
ml／分の流速でカラムから溶出した。溶出物のパ
ターンは210nmにおける吸収を監視した。7.5ミ
リリツターの各区分を集めた。増大した吸収帯を
有する区分を保留した。所望のペプチドを含む区
分を減圧下で濃縮し、逆相HPLCカラムで処理し
た。該カラムは上記の如く、５％（容量）のアセ
トニトリル水溶液に0.1％（容量）のトリフルオ
ロ酢酸を含む溶液で前以て平衡化した。次にペプ
チドは0.1％（容量）のトリフルオロ酢酸水溶液
を使用し、直線的濃度勾配を有する５−50％（容
量）のアセトニトリル溶液を流速５ml／分にて溶
出した。溶出物のパターンは210nmにおける吸収
を監視した。7.5ミリリツターの各区分を集めた。
増大した吸収を有する区分は所望のペプチドを含
むため保留した。次に精製したペプチドはアミノ
酸含量およびアミノ酸配列を分析してその構造を
明らかにした。 上記の方法により、合成THFγ−４を樹脂にカ
ツプリンングした最初のアミノ酸分子の最初の量
を基準にして24モル％の全体の収率を得た。合成
工程の中、さらに３官能性アミノ基、アスパラギ
ン酸はベンジルエステルで保護した。得られた合
成ペプチドは次のアミノ酸配列を有する。 His−Pro−Leu−Pro−Asp−Leu−Tyr 合成法では、アスパラギン酸はさらにベンジル
エステルで保護された。またヒスチジンはさらに
Ｎ−トシル−イミダゾールで保護された。この物
質はインビトロ生物検定では５−80nｇ／mlの範
囲で生物活性であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のアミノ酸配列 His−Pro−Leu−Pro−Asp−Leu−Tyrを有
   ししかも胸腺体液活性を有するペプチド物質。