JPH01156997A - 新規なペプチド物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胸腺から得られる物質およびこれらの合成法忙
関するものである。

従来技術 動物体特に子牛の胸腺の器官または細胞から得られた抽
出物およびこれらの免疫的特性については最近２０年間
にわたって興味が増大しつ＼あつたＯ 最近、Ａ１１ａｎ　Ｊ、　ＧｏｌｄａｔｅｉｎおよびＪ
ｅｆｆｒｅｙ　Ｌ。

Ｒｏｓｓｉｏ氏の論文（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　
Ｔｈｅｒａｐｙ　４．４９−５７（１９７８））Ｋはチ
モシンに関連する物質の他に３つの他の胸腺因子につい
てよく調査されている。

これらにはチモポイエチ７　（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉ
ｎ”ｓ　）、血清胸腺因子（８ＴＦ）および胸腺体液因
子（Ｔ）ＩＦ）がある。

チモボイエチン〔以前にはチミン（Ｔｈｙｍｉｎ　）と
呼称された〕およびこれらの製法、用途はＧｉｄｅｏｎ
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｋよって例えばＮａｔｕｒｅ　２
４７　Ｐ、　１１−１４　（１９７４）および米国特許
第４．０５５，６３３号；第４，０７７．９４９号；第
４．１２０．９５１号および第４．１２４，７００号明
細書に記載しである。チモポイエチンはホモゲナイズし
た子牛の胸腺から一連の透析、分子排除クロマトグラフ
ィーおよび分別クロマトグラフィーによって得られる。

２つの活性な生成物はチモポイエチンＩおよび■とじて
得られた。これらの両者は４９個のアミノ酸残基な有す
るポリペプチドである。しかしながら、これらは１位置
と４３位置の残基の性質において異なる。米国特許第４
、００２．７４０号ＦＪＡＩＲ書にはトリデカペプチド
の合成が記載し℃あり、またチモポイエチン■の多くの
性質が記載しである。米国特許第４，３６９，１３７号
明細書にはチモボイエチンペンタペプチドの製法に役立
つ特定の中間体が記載しである。米国特許第４、１９０
．６４６号、第４，２６１，８８６号および第４．３９
７，８４２号Ｆ！Ａａｗにはチモボイエチン活性を有す
るペプチドが記載しである。

血清胸腺因子（ＳＴＦ）およびその製法および性質はＪ
、　Ｆ、　ＢａｃｈらによってＮａｔｕｒｅ　２６６第
５５−５７頁（１９７７）および米国特許第４，０９８
，７７７号、第４．１３３，８０４号および第４，１４
８，８８６号＃！Ａ細書に記載し℃ある。これは豚の血
液から一連の脱繊維素、透析、適当なフィルターによる
濃化、分子篩による分別、イオン交換樹脂によるクロマ
トグラフィー、さらにははく層クロマトグラフィーによ
る分別および電気泳動によって得られる。生成物は９個
のアミノ酸残基な有するポリペプチドである。ＳＴＦに
類似の構造を有するペプチドは米国特許第４．３０１，
０６５号明細書に記載しである。

チモシンについては、前記のＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓ　１
ｖｅＴｈｅｒａｐｙの他忙米国特許第４，０１０，１４
８号：第４，０７９゜１２７号；第４，０８２，７３７
号；第４．１１６，９５１号；第４゜１２８、６３７号
および第４，１４８，７８８号明細書に記載しである。

米国特許第４．０１０．１４８号明細書にはホモゲナイ
ズされた曙乳動物の胸腺からチモシン区分を作ることが
記載しである。この方法は多段精製技術であり、各段階
は′７ラクシヨン′と呼ばれている。この場合、ホモゲ
ナイズした胸腺を単忙遠心分離して得られた生成物はゝ
７ラクシヨン１１テアル。ホモゲナイズ、遠心分離、次
の熱、アセトンおよび硫酸アンモニウム処理、最終に硫
酸アンモニウム処理で得られた沈澱を超遠心分離し、生
成物を４℃で集め、セファデックスＧ−２５（８ｅｐｈ
ａｄｅｘ　）　（精密）カラム上で脱塩して１フラクシ
ヨン５″とする。更に電気泳動で頂点に達するまでの処
理、および第１蛋白質ピークの収集を１７ラクシ旨ン８
１とする。′７２クション８１は１０８個のアミノ酸残
基を含むポリペプチドである。米国特許第４．１２８．
６３７号明細書から上記技術によって分子量１，２００
−１４．０００の各種ポリペプチドが得られ、チモシン
（ｔｈｙｍｏｓｉｎｓ　）と名づけられたことがわかっ
た。米国特許第４，０８２，７３７号明細書にはチモシ
ンフラクション５よりなるポリペプチド混合物を含む固
体の安定でしかも体内毒性のない組成物の製造について
記載しである。

上記の論文Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ
ｉｖｅ　ＴｈｅｒａｐｙＫはチモシンフラクション５か
ら得られたチモシンα、と呼ばれる特殊のポリペプチド
の性質が記載しである。２８個のアミノ酸残基な有しし
かも分子［３，１０８で等電点４，２のポリペプチドが
記載しである。これはまた米国特許第４，０７９，１２
７号明細書にも記載しである。チモシンα、の放射線免
疫分析は米国特許第４，２６４，５７１号および第４，
３３９゜４２７号明細書に記載しである。チモシンα　
フラグメントは米国特許第４，４４２，０３１号および
第４，４７０゜９２６号に記載しである。ピスーチモシ
ンα、は米国特許第４．３９６．６０５号明細書に記載
しである。２つの関連したポリペプチドであるチモシン
β、およびチモシンβ４はチモシンファクター５から得
た。第１物質は５０個のアミノ酸残基な有し、−方第２
物質は４３個のアミノ酸残基を有する。これは米国特許
第４，２９７，２７６号明１書に記載しである。チモシ
ンβ、およびβ４の７ラグメントは米国特許第４．３９
５．４０４号明細書に記載しである。チモシンβ、およ
びβ、は米国特許第４．３８８．２３４号および第４．
３８９．３４３号明細ｖＫ記載しである。

更ＫＳ＃腺から得られた生成物は同時に介在する免疫形
成ポリペプチド（ＵＢ　ＩＦ　）であり、米国特許第４
．００２．６０２号および第４．１６７、５５７号Ｆ！
Ａ細存に記載してあり、またＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏ
ｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ　７２　ｍ　１１−１５頁（１９７５
）にも記載しである。その分子量は約８，５００で、７
４個のアミノ酸残基を含んでいる。関連するペプチドは
米国特許第４．２１５，１１１号および第４．１９０．
６４７号明細書に記載しである。

他の胸腺エキストラクトは米国特許第３，４３８，８５
９号；第３．４６６、３６７号；第３，６５７．４１７
号；第４．２３９゜４９８号；第４．３７７、５１１号
および第４．３９４，３７４号明細書忙記載されており
、エキストラクトを生産するが、特定のポリペプチドの
生産については記載しである。米国特許第４．３７４．
８２８号明細書には特定のアミノ酸含量を有するが、い
かなる特定のアミノ酸配列をもたない胸腺エキストラク
トが記載しである。ご腺ホルモン様性質を有するヒト血
清プレアルブミンは米国特許第４．０４６．８７７号明
細書に記載しである。バクテリアＲ，ＮＡからの免疫刺
戟性物質の製法については米国特許第４．３８９．３９
６号明細書に記載しである。胸腺機能域において役立つ
ものとして記載されているペプチドは米国特許第４，２
５０，０８６号；第４，３２０，１１８号；第４，３６
１．６７３号；第４．３８９．３４２号および第４，４
２８，９３８号ＲＡ細書に記載しである。

これらの生成物のすべては免疫欠損の問題についての会
合においである用途が報告されている。

しかしながら、チモポイエチン、ＵＢＩＰおよび血清胸
腺因子は無傷の動物においては意味のある胸腺依存性免
疫・受容能力を鰐起するの忙効果がないことがＰｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ
ｒ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａＩ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａ
ｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１５９　、、　ｍ　１９５−
２００頁（１９７８）に報告されている。

いかなる従来技術にも本発明の特定のペプチド組成物が
胸腺体液活性を有することが記載されていないしまた何
等の提案もされていない。

胸腺体液因子（ＴＨＦ）は例えばＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１３２
　ｔＪ　８８５−８９７　ｍ　（１９７０）；　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ　１３８第１５２１−１５３２頁（１９７２）
、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｒｎｕｎｏｌｏｇｙ　ｌ　９
第１５１−１５７頁（１９７５）　、米国特許第４．２
５０．０８４号明細書置装載しである。これらのすべて
はヒトのリン床試験結果で成功をおさめている。リン床
試験結果は１９７９年２月２６日においてニューヨーク
アカデミーオプサイエンスの会合で報告された。

従来の胸腺体液因子はＴＨＦ　Ｉと名づけられた。

上記の文献および米国特許第４．２５０．０８４号明細
書に記載の従来法に従えば、リン末的に役立つＴＨＦ　
Ｉでは、ｘ１１裏方法で作った各活性区分を７つの異な
った生物検定について試験した。すべての７つの試料に
対して正反応を発揮する区分についてのみさらに精製と
使用とを行なった。ＴＨＦ　Ｉ区分の活性はｃＡＭＰ　
、　ＰＨＡ　、　ＣｏｎＡおよびＭＬＣの生物検定にお
ける活性に対して測定し、リン末的に投与できる微生物
学的活性区分を得た。

現在まで、米国特許第４，２５０，０８４号明細書に記
載されたＴＨＦ　Ｉ試料は例えば簡単なポリペプチドで
あったと考えられていた。その理由は、ＰＨ３，５では
く層クロマトグラフィーおよびペーパー電気泳動で単一
のニンヒドリン−ポジティブスポットとして泳動したか
らである。更に、等電点５．６−５４９のポリアクリル
アミドゲル上を等電的に集合して単一バンドとして泳動
した。試料中に含まれたアミノ酸は芳香族でなかった。

ＴＨＦ　Ｉ試料は典型的な芳香族を示す２８Ｏｒｉｍに
おける紫外線を吸収することがわかった。この特性は所
望のＴＨＦ　Ｉ区分の分離に役立つことがわかった。ま
た、例えば上記の米国特許明細書に記載されたＴＨＦ　
Ｉ試料は実質的に分子量約３２００の純粋なポリペプチ
ドであった。この従来公知のＴＨＰＩ試料はさらに数区
分に分離でき、簡単なゲル濾過手段によって分子量は約
３２００以下に変化するかまたは分子量約３２００以下
の新しい区分でしかも以前Ｋ　ＴＨＦ　Ｉとして報告さ
れた同じ完全な生物検定プロヒルを保持した区分に分離
できることは考えられなかった。

以前に公知であった胸腺体液因子（ＴＨＦ　Ｉ　）が事
実単一化合物ではなく、特定のゲル濾過を５けた場合、
生成物の分離が起り、また所望の生物学的活性が現われ
、特定の因子であると確認されたことがわかったことは
驚くべきことであった。更に、所望の生物学的活性区分
は２８０　ｆｔｍにおいて実質的に紫外線吸収を示さな
い区分であることがわかった。ゲル区分から溶出した区
分は２８０　ｎｍにおいて著しい紫外線吸収を示した生
成物忙含まれた活性区分の前後の区分であった。

先の米国出願第１５３．６４４号明細書には、胸腺体液
型生物学的活性物質（ＴＨＦ…と名づけだ）の分離につ
いて記載しである。該物質は見かけの分子量約１８００
以下でしかも２８０　ｎｍにおいて実質的に紫外線吸収
が存在せずしかもｃＡＭＰ　５ＰＨｋ　、ＣｏｎＡおよ
びＭＬＣのすべての生物検定において活性を有する特性
がある。また従来の出願にはＴＨＦ　ｎを得る方法が記
載してあり、該方法はＴＨＥ　Ｉをゲル濾過し、約１．
８００ダルトンの排出限界を有するゲル濾過媒体を用い
、しかも２８０　ｎｍで実質的に紫外線吸収を欠きしか
もｃＡＭＰ　Ｘへ化Ｃ，ＰＨＡおよび０ｏｎＡのすべて
の生物検定において活性を示す区分を集めることである
。ＴＩ（ＦＩｆを得るための所望の区分に対して有効で
あることがわかった特定のゲル濾過媒体はポリアクリル
アミドゲルビーズ型でしかも１　、８００ダルトンの排
出限界を有するＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−２樹脂である。この
樹脂はリッチモンド力Ａ／７オルニア９４８０４のバイ
オ−ラードラボラトリ−から得られる。

得られた区分を分析するために使用したｃＡＭＰ生物検
定については例えば、ＫｏｏにおよびＴｒａｉｎｉＨ；
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１３９第１９３頁（１９７
４）　、ＫｏｏｋおよびＴｒａｉｎｉｎ　；　Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　１１４＝第１５７頁（１９７５）およ
びＫｏｏｋ、　ＵｍｉｅｌおよびＡｌｂａｌａ　；　Ａ
ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　２４９　Ｋ　３４９頁（１９７
５）に記載してある。

得られた区分を分析するために使用した〜［、Ｃ生物検
定については例えばＵｍｉｅｌおよびＴｒａｉｎｉｎ　
：Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ。！第８５頁（１９７
５）およびＫｏｏｋ、　ＵｍｉｅｌおよびＡｌｂａｌａ
　；　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

５（Ｈｉ、　２１比第３４９頁（１９７５）に記載しで
ある。

得られた区分を分析するため忙使用したＰＨＡおよびＣ
ｏｎＡ生物検定については、例えばＦＬｏｔｔｅｒおよ
びＴｒａｉｎｉｎ　；　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
上亙第４１３頁（１９７５）　Ｋ記載されている。

先の米国出願第２２７，２９９号明細書には胸腺体液型
の生物活性物質（ＴＨＩｒ　ｌ［）の分離について記載
しである。該物質は見かけの分子量約１５００以下でし
かもｃＡＭＰ　５ＰＩ（Ａ　、　ＣｏｎＡおよびＲｉＬ
Ｃのすべての生物検定について生物学的活性を示す特徴
がある。この先の出願にはＴＨＦ　Ｉを得る方法が記載
され、該方法では逆相高速液体クロマトグラフィーカラ
ムに吸着され、吸着された物質はカラムから溶出され、
ｃＡＰ［’　、　Ｐｆ（Ａ、ＣｏｎＡおよびＭＬＣ〕す
べての生物検定に活性を示す区分を集めた。

先の米国出願！　３００，３３０号および第３９４．５
７１号明細書には胸腺体液型生物的活性物質（ＴＨＦ−
７）の分泣について記載しである。該ｖｌＪ質の時機は
見かけの分子ｉ　１５００以下でしかもｃｍｆＰ　、　
ＰＨＡ　。

ＣｏｎＡおよびＭＬＣのすべ”（Ｋついての生物検定に
おいて活性である特徴がある。また、先の出願には、Ｔ
ｈＦ−７を得る方法について記載してあり、該方法では
ＴＩ（Ｆ　Ｉｆｆをピリジンホーメイトで前取て平衡に
した逆相高速液体クロマトグラフィーカラムに吸着させ
、吸着された物質をカラムからピリジンホーメイトとノ
ルマルプロパノールトの混合液から溶出し、ＣＡＭＰ、
　Ｐ巳、（：：ｏｎＡおよび■］Ｃのすべての生物検定
で活性を示す区分を集めた。

先の米国出願第４７５．１７５号および第５３５．５３
９号明細書にはＴ）Ｉ［ｉ’　−７を更に逆相高速液体
クロマトグラフィーによって精製してＴＡＩＦ＋−８７
区分として名づけられる生物的活性物質を作る。先の米
国出頴第５５９．３９３号明馴書には更にＴ）ＩＦ　−
８７区分を７−２．７．−４およびｆ−５の数種の生物
活性物質に分離することが記載しである。ＴＨＦ　７−
２、Ｔ）ＩＦ７　４、およびＴＨＦ　ｆ　−５のアミノ
酸配列は先の出願に記載しである。更に、分析の結果、
先に報告されたＴＩ（Ｆ　７−２およびＴＨＦ　７−４
　Ｋ対するアミノ酸配列は誤りであった。

問題点を解決するための手段 本発明は、胸腺体液活性を有ししかも次のアミノ酸配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒを有する物質を提供するにある。

これらの物質は天然の胸腺雌管から分離でき、また合成
により製造できる。

本発明の新規物質の製造に使用するＴ）ＬＦ　ｌの原料
物質は上記の米国特許第４．２５０．０８４号明細書に
概要が記載された方法で製造する。その文献は本願明細
書にも引用されている。

ＴＨＦ　ｌを製造するためＫは、凍結した胸腺、便宜上
子牛の胸腺を適当な液状媒体例えば緩衝液または塩水で
ホモゲナイズする。細胞デイプリスを除き、さらに好ま
しくない成分を超遠心分離機（例えば９０，０００−１
５０．０００９で２−５時間）により除去した。次に適
当な濾過膜例えば細孔径０．８−２０μｍを通して濾過
し、体内毒素を作る微生物を含まない液状物を作る。次
に得られた滅菌した液状物は透析し、得られた生成物は
凍結乾燥し、適当な液状媒体中で再溶解した。透析は典
型的には多量の水、塩水またはリン酸塩緩衝塩水（ＰＢ
Ｓ　）に対して２４−６０時時間待にて実施する。分子
量１０，０００以下の物質を通す適当な透析膜が使用で
きる。適当な膜はセロファン透析バッグである。

凍結乾燥した透析物は例えば蒸留水、重炭敵アンモニウ
ム、ＰＢＳまたはトリス−緩衝液に再溶解され、１−１
５１％ｌ、匂の適当なポリペプチドの溶媒濃度に稀釈し
、次に得られた溶液をゲル濾過する。

本発明のＴＨＦ　Ｉ原料物質を作るに当り、ゲル濾過に
使用する溶媒および所要工程数はある程度透析工程で使
用する予備処理、特に使用する溶媒の特性に左右される
。透析により比較的低分子量の物質のみを通す場合には
、ゲル濾過工程を最小限度にすることができる。しかし
ながら、いかなる場合でも、低分子量の物質を除くこと
が心安である。数１００ダｙ）ンの排出限界を有するカ
ラム例えば七７アデツクスＧ−１０（ファーマシア）（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラムのボイドボリウムを溶
出および保持することによってたしうる。七ファデック
スＧ−１０は７００ダルトンの排出限界を有する。

更に、Ｔ′ｆ′（ＦＩ！原料物質を作るための区分は排
出限界的５．０００ダルトンを有するゲル韓過物質例え
ばセファデックスＧ−２５（ファーマシ力）を用いてゲ
ル濾過を行なった。代表的には、カラムはＰ　Ｈ８，０
で１０−’Ｍ重炭酸アンモニウムで溶出する。

活性区分は上記の４個の生物検定忙よって測定した。の
ぞむならば、更なる区分は例えば０．１　Ｍ　）リス−
ＨＣｌまたは０．１　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ，を用いてＰＨ
８，０でＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（７アーマ
シカ）を用いしかもＮａ　ｃｌの直線的濃度勾配を用い
て展開する。塩は低分子量の排出限界を有する物質例え
ばセファデックスＧ−１０を用いて濾過し次にボイドボ
リウムを回収することＫよって除く。

このよう処して得られたＴ）ＩＦ　１原料物質は先の米
国出願第１５３，６４４号明ｍ賽の記ａｌｃ従って約１
８００ダルトンの排出限界を有するゲル１過物質の床を
通した。次に吸着物質は水で溶出し、溶出した物質は区
分に集めた。２８０　ｎｍにおける紫外線吸収が各区分
について監視され、各区分はｃＡＭＰ　。

ＰＨＡＳＣＯｎ人および■℃の生物検出について分析し
た。得られた最初の区分は実質的に２８０　ｎｍで紫外
線吸収を示したが、上記の４つの生物検出のすべてに生
物活性を示さなかった。得られた区分の次のグループは
実質的Ｋ　２８０　ｎｍにおいて紫外線吸収を示さなか
った。区分の後続するグループは２８０　ｎｍにおいて
実質的に紫外線吸収を示したが、上記の４つの生物検定
のすべてについて生物活性を示さなかった。上記の４つ
の生物検定のすべてＫついて生物活性を有する所望のＴ
ＨＦ　Ｉｆ物質はゲル濾過媒体のボイドボリウム（Ｖｏ
）１７対する溶出液の容ｔ　（Ｍｅ　）の比が約１．１
−１．４である区分に見出された。ゲル濾過媒体のボイ
ドボリウムは公知の方法で測定する。ボイドボリウムの
測定法の一つではブルーデキストラン２０００が使用さ
れる。これはブルー染料を含む分子ｉ　２，０００．０
００を有する高分子量デキストランであり、ｉ′ｈａｒ
ｒｒＩａＣ１ａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ
、から得られる。ブルーデキストラン２０００００．１
％（重量／容積比）の水溶液がゲ／ｌ／濾過媒体の全容
量を基準にして１％（容りの量をゲル濾過媒体のカラム
に加えた。次に水をカラムに加え、０．９５　ｍｙ俤の
速度で溶出した。

５．７５　ミリリッターの溶出区分が集められた。６０
０ｎｍにおける吸収が各区分に対して監視された。

全溶出物を集め、６００　ｎｍにおいて最大吸収を有す
る区分を含み、ゲル濾過媒体のボイドボリウムを示した
。

上記のようＫして得られたＴＨＦ　ｌの生物活性区分は
合せて逆相高速液体クロマトグラフィー媒体に通した。

吸着された内容物は適当な溶液で溶出し、上記の４つの
生物検定のすべてにおいて生物活性を有する区分が吸着
された。この吸着された物質はＴＨＦ　Ｉと名づけだ。

１’ｌ（Ｆ’　ｊｌを作るのに役立つ適当なりロマトグ
ラフイー媒体はオクチ／Ｉ／（Ｃ，）またはオクタデシ
ル（Ｃ，、）を結合した相を有する市販の表面変性無線
担体である。逆相高速液体クロマトグラフィーに使用す
る疎水性の他の結合相例えばビフェニルまたはへキシ／
ｌ／（Ｃ，）ないしオクタデシル（Ｃ＋ｓ）が使用でき
る。２つの有用な物質はりクロソルプＢＰ−Ｉ　Ｂ　（
Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−１８）およびニュクＶ　
オシｐｖ　Ｃ，、（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ，、）の商
品名で市販されている。二二りレオシルＣ＋ａ物質は粒
径５および１０ミクロンの物質で西独デュレン（Ｄｕｒ
ｅｎ）所在のＭａｃｈｅｒｅｙ　−Ｎａｇｅ　Ｉｃｏか
ら発売されている。

他の有用な物質は、カル７オルニア・バークレー所在の
Ａｌｔｅｘ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、から入手
したＨＰＬＣカラムである。

π（ＦＵ物質はいかなる使用上の濃度で上記のクロマト
グラフィー媒体に適用できるが、約３１ｎ９の蛋白質を
含むＴＨＦ　Ｉ＋浴溶液冷凍乾燥し、次に冷凍乾燥した
物質を１ミリリツターの蒸留水に溶解して作った溶液を
使用する−のが適当である。

上記のクロマトグラフィー媒体から吸着されたＴＨＦ　
ｌ［物質を溶出するのに役立つ水性液は例えばＰ　Ｈ３
，５−７，５のナトリウム、カリウム、アンモニウムま
たはピリジニウムカチオンおよびアセテート、ホスフェ
ートまたはホルマートアニオンを有する塩を含む。塩濃
度は約５　Ｑ　ｍＭないし３００ｍＭである。次にこれ
らの水溶液は適当な有機溶離剤例えばノルマルプロパツ
ール、インプロパツール、エタノールまたはアセトニト
リルを０−２０％ないし０−６０％の有機溶媒の直線的
または非直線的・濃度勾配で混合した。ＴＨＦＩを得る
ためには、５０ｍＭのナトリウムまたはアンモニウムア
セテート中、Ｐ　Ｈ６，５で０−５０％の濃度勾配を有
するノルマルプロパツールを用いるのが適当である。

上記のようにして作られたＴ）ＩＦ′Ｍの生物学的活性
区分は合併され、逆相高速液体クロマトグラフィー媒体
を通した。ＴＨＦ　３１の製造に適する同一のクロマト
グラフィー媒体はＴＨＦ　−７の分離および回収に役立
つ。クロマトグラフィー媒体は好ましくはピリジンホル
マートで例えば０．３　ｍＭの濃度およびＰ　Ｈ４，０
で予じめ平衡化する。カラムに吸着された物質はピリジ
ンホルマートとノルマルプロパツールの混合物で溶出す
るのが好ましい。７．５−２５％（容量）のノルマルプ
ロパツール（り　濃度勾配を用いるのが最も適当である
。上記４つの生物検出のすべてにおいて生物活性を有す
る溶出物質はＴＨＦ−７と名づけだ。

次に上記のようＫして作ったＴＨＦ　−７の生物活性区
分は合され、逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを
通した。ＴＨＦ−７の製造に適する同一のクロマトグラ
フィー媒体はＴＨＦ　−８の分離および採取に役立つ。

適当な物質はニュクレオシルＣｌ８（５ミクロン）であ
る。クロマトグラフィー媒体はＰＨＩＱで０．１％（容
量）のトリフルオロアセテートで予しめ平衡化すること
が適当である。カラムに吸着した物質はトリフルオロ酢
酸とノルマルプロパツールとの混合物で溶出することが
適当である。８−３５％（容量）の濃度勾配を有するノ
ルマルプロパツールが最も適当である。カラム上の吸着
物質はトリフルオロアセテートおよびノルマルプロパツ
ールの混合物で溶出するのが適当である。Ｐｋｌ）ｔ　
、ＣｏｎＡおよびＭＬＣの生物検定において生物活性を
有する溶出物質はＴＨＦ　−８と名づけだ。

ＴＨＦ　−８は数種のベプチツド物質よりなる。これら
のベプチツド物質はインクラティック分離忙よって個々
の成分に分離できる。これは上記のよ５ＫＬ、て製造し
たＴＨＦ−８をＴＨＦ　−ｆ３の採取に使用した同一種
類の逆相高速液体クロマトグラフィー媒体に通して実施
した。この場合、Ｑ、１Ｍナトリウムバークロレート、
０．１％オルトリン醒および２２％アセトニトリルの混
合液で予じめ平衡化する。カラムＫｇ＆着された物質は
予じめ平衡化した混合物と同一組成の溶媒で溶出するの
が適当である。この溶離パターンは２１０　ｎｍでの紫
外線吸収によって監視する。更に考察するため吸着され
るべき区分は２１０　ｎｍの吸収データでピークを示し
た区分である。また、吸着物質はペプチドの存在のため
に試験されなければならない。またペプチド含有物質の
みが更に処理されるべきである。

次にペプチドである上記の採取した区分の各々は適当な
揮発性緩衝液で予じめ平衡化するのに使用したと同じ種
類の逆相高速液体クロマトグラフィー媒体におのおのを
通して個別に脱塩する。適当な緩衝液系はＰ　Ｈ７，９
で２　ｍＭアンモニウムホルマートかまたは５％アセト
ニトリル中で０．１％トリフルオロ酢酸の濃度である。

次に脱塩したペプチドは適当な揮発性緩衝剤および溶媒
を用いてカラムから脱塩する。脱塩は５−５０％ア七ト
ニトリルの直線的濃度勾配を用いたアンモニウムホルマ
ートまたはトリフルオロアセテートで行なうのが好まし
い。次に溶離液パターンは２１０　ｎｍにおける監視を
行なった。更に考慮するため保持される区分は吸収域忙
おいて２１０　ｎｍにおけるピークで示される区分であ
る。得られた脱塩ペプチド区分はＰＨＡＳＣｏｎＡおよ
びＭＬＣ検定において生物活性を試験した。上記の３種
の生物検定のすべてにおいて活性を有するＴＨＦ　−ｆ
３区分はそれぞれＴＨＦｒ−２、ＴＨＦ　７−４および
ＴＨＦ　７−５と名づけた。

実施例 胸腺から本発明の新規ペプチドを製造する方法は次の実
施例に＃細に記載しである。

実施例１ 米国特許第４，２５０，０８４号の実施例に従ってａｔ
！製したＴＨＦ　Ｉの生物学的活性区分は、ＴＨＦ　ｌ
　ｆ１出開始以前に最初の絢腺が凍結したことを除き、
組み合わせられ、ｌｙのタンパク質を含有する液体混合
物を提供した。この液体混合物を凍結乾燥した。

凍結乾燥物質を５ｍの蒸留水に溶解し、カリフォ’Ｖ　
ニア　、’Ｉ）　’７　チモ７　）’のＢｉｏ　Ｒａｄ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得たＢｉｏ　Ｇｅｌ　
Ｐ　−２のカラム建売てんした。

カラムは直径２．９αで１３０ｃｍの深さであった。ブ
ルーデキストラン２０００を用いてカラムの空１ｔ（Ｖ
ｏ）を２７０　ｍｊであるとあらかじめ決めた。カラム
内容物を２倍希釈、発熱原物質の存在しない水で、０．
９５ｓｄ／Ｇの流出速度で溶出し、５．７５−の区分を
４℃で集めた。２３０及び２８０　ｎｍの紫外線吸収を
各区分で検出した。各区分をまたｃｍ’Ｕ？　、　ＰＨ
ｋ。

（：ｏｎＡ及びＭＬＣ生物検定における生物学的活性を
試験した。２つの明白なはっきり別れた吸収のピークを
得た。溶出ｉ　（Ｖｅ　）が２５０ｍ力ら３３０−に及
び、溶出された区分に最初のピークを得た。

（Ｖｅ／Ｖｏ割合は０．９３から１．２２　）。溶出量
が４９０−から５５０ｄｉＣ及び、溶出された区分に第
２のビー／　ヲ？’ｌ　？、：　ｏ　（Ｍｅ／Ｖｏ　＆
１合ハ１．８２から１０４　）　。上記の４生物検定の
全てにおける生物学的活性を有する区分を主に溶出量３
２２　ｍから３４５−で得た（Ｗｅ／ＶＯ割合は！２９
から１．２８　）。実質上、望ましい生物学的活性を有
するこれらの区分の全てに１８０ｎｍでの吸収があるわ
けではない。最初、約１８００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ
ｓ　）の排出限度を有するバイオゲルＰ−２によりこの
活性物質を保持したので約１８００以下のはつきりした
分子量を得た。これらの区分にある活性物質なＴＨＦ　
Ｉｔとして示した。

上尾記載したように調整されたＴＨＦ　１１区分を組み
合わせてタンパク質３ηを含有する液体混合物を提供し
た。この液体混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥物質を蒸
留−水１ゴに溶解し、カリフォルニア、パークレーのＡ
ｌｔｅｘ　８ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、から得た逆
相局速液体クロマトグラフィー（Ｉ（ＰＬＣ）（Ｃ，８
）カラムに充てんした。カラムは直径４．６ｆｌ、長さ
２５０１１１で５０ｍＭの酢酸ナトリウムでｐＨ６，５
にあらかじめ平衡にした。流出速度４８−７時間で１時
間ｐＨ６，５で酢酸ナトリウム５９ｍＭをカラムに通し
て、カラム内容物を溶出した。その俊、流出速度を４５
分間同様に保ち、一方酢酸ナトリウムのい（らかは容積
で０から５０％の直線的濃度勾配でれ一プロパツールで
代用できる。各々２ゴの区分を室温（約２２℃）で集め
た。カラム溶出液を２３０１ｍの紫外線吸収及び第１級
アミノ基のけい光検出によって観測した（続いてｐＨ９
，５で７０ロエスカミン忙よりアリコートの後カラム反
応を行った）。各７ラクシヨン忙ついて生物学的活性試
験、即ちインビトロｃＡＭＰ　、　ＰＨＡ　、　Ｃｏｎ
Ａ及びＭＬ、Ｃ生物検定を行った。

２つの明瞭な、而もよく分離した、吸収帯域が認められ
た。それらは更に７０ロエスカミンとも反応した。第１
の吸収ピークは一つの緩衝液で得られ、溶離したところ
溶離液量は５−２５１Ｒｔであった。７０ロ工スカミン
陽性部は同−帯域中忙溶離した（５−４５ｍ）。第２の
紫外線吸収ピーク（７０ロエスカミン陽性）を次工程で
グロパノールの直線的濃度勾配を用いて溶離した（溶離
容量４−１０ｍ、０−９％プロパツール）。上記の生物
検定で生物学的活性を示す区分は１０−１６％プ筒パノ
ールのみに見られた（１２−１６１Ｒｔの溶離量）。所
望の生物活性を有するこれらの区分のすべては実質的Ｉ
’ｍ　２３０　ｎｍにおいである吸収を有するが、フロ
ロエスカミンに対しては陰性であった。これらの区分の
活性物質はＴＨＦ　ｌ［と名づけだ。

上記のようにして作った１ｒｌＨＦＩＩ［の区分は合さ
れまた冷凍乾燥される。次に冷凍乾燥物は蒸留水に溶解
し、逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを用い、Ｐ
Ｈ４，０で０．３Ｍピリジンホルマートで前以て平衡化
した。カラムの内容物はＰ　Ｈ４，Ｑで０．３Ｍピリジ
ンホルマートを２４崎旬で１２分間通して溶離した。次
に流速を同一速度にして１２分間通した。その間ピリジ
ンホルマートの一部をノルマルプロパツールで直線的に
０〜７．５％（容量）の濃度勾配で置換した。次に流速
を同一速度で５４分間維持した。その間、ピリジンホル
マート溶液の一部をノルマルプロパツールで直線的に７
．５−２５％（容量）の濃度勾配で置換した。１ミリリ
ツターづつの各区分は室温（約２２℃）で集めた。次に
ノルマルプロパツールで溶出した各区分は加水分解後全
アミノ酸含量を分析した。上記の４ｍの生物検定法を行
なった。１４−１８％（容量）のノルマルプロパツール
を用いたカラムから溶出した物質を含む区分は最大の全
アミノ酸含量を示しまた上記の４種の生物検定において
陽性の結果を示した。これらの区分の活性物質はＴＨＦ
　−７と名づけだ。

ＴＳＫ　−ＧＥＬＳＷ　２０００　ツカラム（東洋ソー
ダ製の市販吸着剤）上のＴＨＦ−７の高速ゲル濾過はこ
の方ラムによって得られる最小の分子量が１５００ダＡ
／）ンであるため１５００ダルトンまたはそれ以下の見
掛けの分子量を提案した。

上記の如くして作ったＴＨＦ　−７の区分は合せて減圧
下で蒸発乾個した。次に乾燥物質は水中で溶解しニュー
クレオシルＣｌ８（５ミクロン）を用い、逆相高速液体
クロマトグラフィーカラムを使用した。カラムは直径４
．３　ｍ　、長さ２５０１１１１１であって、ＰＨ２，
０で０．１％（容量）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ　）
で前以て平衡化した。力２ムの内容物はＰＨ２，０で０
．１％ＴＦＡをカラムに２４−層の流速で１２分間通し
た。次ＶＣｌ２分間同一の流速を維持した。その間ＴＦ
Ａの一部な０〜８％（容量）の直線的濃度勾配を用いて
置換した。次に流速を同一速度で８６分間維持した。そ
の間、ＴＦＡの一部を８−３５％（容量）の濃度勾配を
用いてノルマルプロパツールで置換した。１−の各々の
区分を室温（約２２℃）で集めた。次にノルマルプロパ
ツールで溶出した各区分は加水分解後全アミノ酸含量を
分析し、インビトロで生物検定を獣。

ＰＨＡおよびＣ０ｎＡｌＣついて行なった６１６−２２
％１ｉｔ）のノルマルプロパツールを用いてカラムから
溶出した物質を含む区分は最大の全アミノ酸含量を有し
、上記３種の生物検出において陽性の結果を示した。こ
れらの区分における活性物質はＴＨＦ−８と名づけだ。

上記の如くして作ったＴＨＦ　−８の区分は例えばニュ
ークレオジルＣ＋ｓ　（５ミクロン）の逆相高速液体ク
ロマトグラフィーカラム（４，３Ｘ　２００　ｍ　）に
て処理した。該カラムは０．１　Ｍのナトリクムバーク
ロレート、０．１％のオルトリン酸および２２％のアセ
トニトリルの溶液で前以て平衡化した。

カラムの内容物は上記ｍＷ、の液で１．５　ａｔ／９の
流速で溶出した。１ミリリツターの各区分は室温（約２
５℃）で集めた。溶出物のパターンは２１０　ｎｍ忙お
ける紫外ｍ吸収化よって監視した。増加した吸収ピーク
を有する区分を保留した。この場合、６個の主な区分を
分離した。これらの区分はＴＨＦ−８のα、βｐ　Ｉ　
ｔδ、ξおよびダ区分と名づけた。α区分を除く他のす
べての区分はプロナーゼによって完全に消化され、また
ブロテイナーゼＫｋよって少なくとも１部消化した。こ
のα区分はペプチドでなく、他の区分はすべてペプチド
であることがわかった。

次にＴＨＦ　−８のβｌ　Ｉ　ｊδ、ξおよび４区分は
それぞれ別々に減圧下で乾燥し、水に溶解し、これらを
各々上記組成の逆相高速液体クロマトグラフィーを用い
て脱塩した。該カラムはＰ　Ｈ７，８で５％（容量）の
アセトニトリルに２　ｍＭのアンモニウムホルマートを
溶解させた溶液で予しめ平衡化した。脱塩した物質は各
カラムから５−５０％アセトニトリルの直接的濃度勾配
を用い、２ｍＭアンモニウムホルメートにて流速１．５
ψ勢で溶出した。溶出物のパターンは２１０　ｎｍの吸
収を監視した。各区分の１ミリリツターを集めた。吸収
ピークの増大した区分を保留した。β区分は２つの別個
の脱塩したペプチド区分をあたえた。他の区分はそれぞ
れ１つの脱塩したペプチドをあたえた。

得られた６個の脱塩したペプチド区分はＴＨＦ−８のβ
−１１β−２，ｒ、δ、ξおよび４区分として名づけだ
。これらの脱塩ペプチド区分の各々は別々に減圧下で乾
燥され、水に溶解した。次に各区分は酸加水分解後アミ
ノ酸分析を行なった。またＭＬＣ（胸腺）、■、Ｃ（牌
ＩＩ）、ＰＨＡおよびＣｏｎＡ生物検定をインビトロで
行なった。ＴＨＦ−８ｒ　−区分は上記の４種の生物検
定のすべてにおいて最も活性であった。

上記のＴＨＦ−８７−区分の生物的活性はＴＨＦ　−１
のものより約１０００倍大きいものであった。これは上
記生物検定がＴＨＦ　−８−１区分についてはナノグラ
ムレベルでおこなわれ、一方ＴＨＦ−１についての比較
生物検定ではミクログラムレベルでおこなわれたことく
よってわかる。

ＴＨＰ　−８７−区分の臨床的利用も明らかになった。

正常なＴ−細胞の発育不良を起す欠損胸腺上皮原基Ｋか
−っているヒトの患者において免疫Ｔ−細胞機能を回復
させるのに使用された。

上記の如くして作ったＴＨＦ　−１３７−区分は保持時
間約２０分で脱塩以前にクロマトグラフィーカラムから
溶出した。子牛の胸腺な原料として’ｒＨＦ−８７区分
を作る。上記の方法を数回繰返し、各試料からの７区分
は約２０分の保持時間で溶出し、別々に集めて保留した
。次にこれらの集めた区分はそれぞれ減圧下で乾燥し、
水に溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィー系統を用
いて上記の方法によって脱塩した。溶出物のパターンは
２１０ｎｍＫおける吸収を監視した。増大した吸収ピー
クを有する区分を保留した。

この場合、ＴＨＦｌ−８ｒ−区分の３つの各々のペプチ
ドが作られた。これらのペプチドについてアミノ酸含量
およびアミノ酸配列を調べた。またこれらのペプチドに
ついてＭＬＣ、ＰＨＡおよびＣｏｎＡ生物検定をおこな
った。これらのペプチドはＴＨＦｌ−２、Ｔ）ＴＦ　１
−４およびＴＨＦ　１−５と名づけだ。

その結果を次に示す。

Ｔ）（Ｆ　７−２　：　Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　
−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ ＴＨＦ　７−４　：　Ｈｉｓ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−Ｐ
ｒｏ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ ＴＨＦ　７−５　：　Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　−ＬｅｕＡｓ
ｐ　：アスパラギン酸 Ｇｌｕ　：グルタミン酸 Ｇｌｙニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｌｅｕ　：ロイシン Ｌｙｓ　：リジン Ｐｈｅ　：フェニルアラニン Ｐｒｏ　ニブロリン Ｔｙｒ　：チロシン Ｖａｌ　：バリン これらの新規ペプチドのすべてはＭＬＣ、ＰＨＡおよび
ＣｏｎＡの生物検定の各々について生物活性を示した。

アミノ酸原料からのＴＨＦ　ｆ　−２、ＴＨＦ　、−−
４およびＴＨＦ　７−５のペプチドの合成法を以下に示
す。

実施例２ 実施例１から得られたＴＨＦ　７−４のアミノ酸配列に
ついての情報を用いて、上記ペプチドの合成はＪ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　ｇ　５第２１４９−２１
５４頁（１９６３）に概括的に記載されたメリフィール
ド法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）の
変法を用いて行なった。各々の場合、アミノ基が第３級
ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ　）で保饅された所望
のペプチドの末端カルボキシ残基はクロロメチル化した
ポリスチレンジビニルベンゼン（１％）共重合体、２０
０−４００メツシユ（塩素含量０．７　ｍｅｑ、／９）
と沸騰エタノール中で７２時間還流下でカップリングし
た。樹脂状重合体は２−１０９を使用した。ｔ　−Ｂｏ
ｃ−アミノ酸の最初の使用量は樹脂０．７　ミＩＪモル
／ｇであった。カップリング収率は重合体ダラム当り０
．１５−〇、３ミリモルＢｏｃ−アミノ酸であった。Ｎ
−保護アミノ醜樹脂は順次エタノール１００１リリツタ
ー、５０％（容量）のエタノールのジクロロメタン溶液
１００ミリリツターおよびジクロロメタン１００ｔＶリ
ツターで洗滌した。洗滌されたＮ−保諾アミノ酸樹脂は
内容２５０ミリリツターのテフロン製びんに移し、撹拌
機またはシェーカーにのせるか、またはペプチドシンセ
サイザー例えば００１型ペプタイダ−（Ｐｅｎ１ｎｓｕ
ｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅ
ｌ−ｍｏｎｔ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ製）にかける。

後続の合成工程は同じびんで行なった。すべての合成は
室温で行なった。ペプチドに加えられるそれぞれの後続
のアミノ酸分子はＮ−保護アミノ酸樹脂を出発物質とし
て次の操作サイクルで行なった。

（１）各洗滌毎［４０−８０ミリリツターのジクロロメ
タンを用いて３回洗滌した。

（２１５０％（容量）のトリフルオロ酢酸のジクロロメ
タン溶液４０−８０ミリリツターを毎回使用して２回処
理して先に保護したＢｏｃ保護基を除去した。

（８）　　毎＠４０−８０ミリリッターのジクロロメタ
ン４０−８０ミリリツターを使用して３回洗滌した。

（４）毎回５０％（容量）のエタノールのジクロロメタ
ン溶液４０−８０ミリリツターを使用して３回洗滌した
。

（５）　　毎回ジクロロメタン４０−８０ミリリツター
を使用して３回洗滌した。

（６）５％（容量）のジイソプロピルエチルアミンのジ
クロロメタン溶液４０−８０ミリリッターを使用して２
回、各回５分間中性化した。

（７）毎回４０−８０ミリリツターのジクロロメタンを
使用して６回洗滌した。

（ｓ）４−８ミリリツターのジメチルホルムアミドに次
に所望するＢｏｃ−保護アミノ酸３当量を含む溶液を加
え、また３０−７２ミリリツターのジクロロメタンにＮ
　、　Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの３当量
を含むＳ液を加えて２時間混合した。

（０）毎回、５０％（容量）のエタノールを含むジクロ
ロメタン溶液４０−８０ミリリツターを用いて３回洗滌
した。

αｄｌ　　毎回４０−８０ミリリツターのジクロロメタ
ンを使用して３回洗滌した。

（１υ　上記の（８）工程を一夜くりかえした。

（ロ）毎回５０％（容量）のエタノールを含むジクロロ
メタン溶ａ４０−８０ミリリッターを使用して３回洗滌
した。

上記の１２工程のサイクルを所望のペプチド合成に充分
な回数繰り返した後保護したペプチド樹脂を上記第（１
）工程から第（５）工程まで繰り返し使用して乾燥した
。次に液状の弗化水素酸（４ｒｎｔ／９　）、アニソー
ル（１−レ’ｌ　）およびチオアニソ−／Ｉ／（１，５
ｔｎｌ／９　）で０℃、３０分間処理して保護基を除き
、樹脂からペプチドを分離した。次に弗化水素酸を蒸発
した。ジエチルエーテ＃　１００−２００　ミリリッタ
ーを０℃で加えて粗製ペプチドを沈澱させた。

沈澱はエーテル溶液から濾過により分廂して乾燥した。

次に乾燥ペプチドの沈澱を５０％（容量）の酢酸水溶液
１００−３００　”リリッターを使用して抽出した。不
溶性部分を濾別した。次に溶媒を蒸発し、得られた残渣
を水に溶解し七ファデックスＧ−１５（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　）またはＢｉｏｇｅｌ　Ｐ　−２（Ｂｉｏ−ｇｅｌ
　）の濾過用カラムを通した。吸着されたペプチドは水
で溶出し、溶出液を２５４　ｎｍの紫外線吸収によって
監視した。この吸収波長域にペプチド吸収（ピーク）を
有する区分を集めた。次忙これらのペプチド区分をリク
ロソルプＲＰ−１８（Ｌｉｃｈ−ｒｏｓｏｒｂ　）逆相
高速液体クセマドグラフィーカラム（１０Ｘ２５０ｍ１
１１）で処理した。該カラムは０．１Ｍのナトリウムバ
ークロレートおよび０．１％（容量）のリン酸とを含む
２３％（容量）のアセトニトリル水溶液で前取て平衡化
した。次に物質は同一溶媒を使用してアイソクラシック
条件下で５１ｎｔ／分の流速でカラムから溶出した。溶
出物のパターンは２１０ｎｍにおける吸収を監視した。

７．５ミリリツターの各区分を集めた。増大した吸収帯
を有する区分を保留した。所望のペプチドを含む区分を
減圧下で濃縮し、逆相ＨＰＬＣカラムで処理した。該カ
ラムは上記の如く、５％（容量）のアセトニトリル水溶
液Ｋ　Ｏ，１％（容量）のトリフルオロ酢酸を含む溶液
で前取て平衡化した。次にペプチドは０．１％（容量）
のトリフルオロ酢酸水溶液を使用し、直線的濃度勾配を
有する５−５０％（容ｆｋ）のアセトニトリル溶液を流
速５４分にて溶出した。溶出物のパターンは２１０　ｎ
ｍにおける吸収を監視した。７．５　ミ！Ｊリッターの
各区分を集めた。

増大した吸収を有する区分は所望のペプチドを含むため
保留した。次に精製したペプチドはアミノ酸含量および
アミノ酸配列を分析してその構造を明らかＫした。

上記の方法により、合成ＴＩ（ＩＩ’　１−４を樹脂に
カップリングした最初のアミノ酸分子の最初の量を基準
にして２４モル％の全体の収率な得た。合成工程の中、
さらに３官能性アミン基、アスパラギン酸はベンジルエ
ステルで保護した。得られた合成ペプチドは次のアミノ
酸配列を有する。

Ｈｉ　ｓ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ　
−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ合成法では、アスパラギン酸はさら
にベンジルエステルで保護された。またヒスチジンはさ
らにＮ−トシル−イミダゾールで保護された。この物質
はインビトロ生物検定では５−８０ｎＶ−の範囲で生物
活性であった。

代理人　三　宅　正　夫　他１名

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｙｒを有ししかも胸腺体液活性を有するペプチド物質。
2. （２）自然胸腺から分離した前記第１項記載のペプチド
   物質。
3. （３）合成的に作られた前記第１項記載のペプチド物質
   。